Fats作為黑色素瘤免疫治療的靶點及應用
【專利摘要】本發(fā)明創(chuàng)造提供了FATS基因或其表達產物在黑色素瘤免疫環(huán)境中發(fā)揮的作用，能夠作為黑色素瘤相關疾病的功能產品的靶點，還可以用于黑色素瘤相關疾病的功能產品的體外篩選。
【專利說明】
FATS作為黑色素瘤免疫治療的靶點及應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明創(chuàng)造屬于生物技術領域，具體涉及FATS作為黑色素瘤免疫治療的靶點及應 用。
【背景技術】
[0002] 黑色素瘤是一種惡性腫瘤，起源于黑色素細胞，在所有的皮膚腫瘤中最具侵襲性。 這些產生色素的細胞在體內可以來源于不同的組織包括皮膚，黏膜以及結膜等。幾十年以 來，許多用于惡性腫瘤的化療藥物與方法被不斷的開發(fā)，但是轉移性黑色素瘤病人的生存 率卻沒有增加。2015年黑色素瘤在美國發(fā)病人數(shù)大約是73,870人次。盡管黑色素瘤沒有其 他皮膚癌癥常見，例如基底細胞癌以及鱗狀細胞癌，但是黑色素瘤引起的死亡在皮膚癌癥 中占巨大的比例。根據(jù)腫瘤程度的不同，黑色素瘤病人的存活率有著明顯的差別，早期病人 只需要手術切除，轉移病人的5年生存率僅為16.6%。
[0003] 幸運的是，近些年來，對黑色素瘤的了解為臨床提供了有利的信息。隨著強大的分 子診斷工具的出現(xiàn)，許多基因突變，放大或者刪除在腫瘤生長，存活以及對小分子抑制劑的 敏感反應中被發(fā)現(xiàn)，這使高效的信號轉導靶點以及免疫治療靶點得以發(fā)展，先前不良的預 后在系統(tǒng)治療出現(xiàn)之后有了改觀。自從2011年，美國食品和藥物管理局(FDA)批準了6種藥 物（易普利姆瑪，維羅非尼，達拉非尼，曲美替尼等），這些藥物可以通過4種不同的機制(抑 制CTL相關抗體抑制劑，抑制BRAF，抑制MEK以及抑制Η)-1受體)對黑色素瘤進行治療。
[0004] 研究所發(fā)現(xiàn)的致癌的BRAF的突變在高達50%的黑色素瘤中促進著腫瘤的生長， BRAF以及其他基因，例如KIT的突變的發(fā)現(xiàn)，為系統(tǒng)治療引入了不同的方法。靶點治療，包括 BRAF和MEK抑制劑，改變了 BRAF V600突變的黑色素瘤病人總的存活率。在過去的5到10年 里，黑色素瘤的治療也由于新的一類免疫調節(jié)因子的發(fā)現(xiàn)而有了很大的變化，免疫檢查點 的抑制極大的改變了治療現(xiàn)狀。免疫調節(jié)檢查點的失活限制了黑色素瘤中T細胞的免疫應 答，這都是癌癥免疫治療的靶點。免疫檢查點抑制劑易普利姆瑪以及抗I 3D-I抗體，以CTLA-4 和ro-1/PD-Ll為靶點治療的成功，在臨床治療中有了深遠的意義。
[0005] 大量的研究表明，腫瘤的免疫治療是晚期腫瘤病人的一種治療選擇。目前，腫瘤的 免疫治療可以破壞腫瘤細胞，免疫系統(tǒng)的功能水平與腫瘤的預后以及腫瘤的臨床治療效果 密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，靶定腫瘤微環(huán)境(TME)已經成為目前抗腫瘤治療的重要策略。目前已 知，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞可以影響腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，侵襲與最終的結果。
[0006] 染色體脆性位點是正?；蚪M中位點特異的不穩(wěn)定區(qū)域，包括88個普通型脆性位 點(CFS)和39個稀有型脆性位點，CFS為染色體上的正常組成結構。但在細胞分裂中期出現(xiàn) 復制異常時，染色體中脆性位點為最易發(fā)生裂隙或斷點的部位。CFSs在進化過程中的高度 保守性。ClOorfOO是最近被確定的一種通用脆性位點，最初發(fā)現(xiàn)，在幾種腫瘤細胞系中過表 達C10orf90后表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用，因而將C10orf90命名為脆性位點相關的腫瘤抑制因 子(Fragile-site associated tumor suppressor，F(xiàn)ATS)。有報道指出，CFSs與免疫也具有 相關性。然而，目前對于FATS基因的研究非常有限，F(xiàn)ATS基因在腫瘤免疫中的作用尚沒有報 道。我們的前期研究結果提示，F(xiàn)ATS基因可能是一種重要的免疫調節(jié)因子，在自身免疫疾病 以及腫瘤免疫中可能具有潛在的作用。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明創(chuàng)造的目的在于提供FATS作為黑色素瘤免疫治療的靶點的應用。
[0008]在本發(fā)明的一個方面，提供FATS基因或其表達產物(FATS基因的編碼蛋白）在： [0009] i)開發(fā)、篩選黑色素瘤功能產品方面的應用;或 [0010] ii)制備治療或預防黑色素瘤的功能產品方面的應用。
[0011] 在本發(fā)明的另一個方面，提供一種作用于FATS基因或其表達產物的用于治療或預 防黑色素瘤的功能產品。
[0012] 在本發(fā)明的另一個方面，提供一種：
[0013] i)開發(fā)、篩選黑色素瘤功能產品的方法;或
[0014] ii)制備治療或預防黑色素瘤的功能產品的方法。
[0015] 其中，所述功能產品包括藥品（或藥物、藥劑等）、抑制劑(或抑制物等)等能夠對黑 色素瘤的發(fā)生、發(fā)展產生治療、緩解、抑制、調節(jié)等有益作用的產品或潛在物質;所述功能產 品可以為單一制劑，也可以為包含有效量制劑成分的組合物，所述組合物中可以包括藥劑 學上能接受的載體。
[0016] 其中，所述功能產品包括下調FATS基因的表達、轉錄或其表達產物的功能;所述方 法包括下調FATS基因的表達、轉錄或其表達產物的步驟。本領域技術人員可知的能夠下調 FATS基因的表達、轉錄或其表達產物的手段包括但不限于以下一種或多種，均可以用于本 發(fā)明：（i )DNA水平上：降低FATS基因拷貝數(shù)、轉染FATS基因低表達載體；（i i)轉錄水平上:阻 礙或抑制FATS基因的表達、阻礙或失活調控FATS基因表達的啟動子、激活負調控FATS基因 表達的轉錄因子、采用RNA干擾技術對FATS基因表達進行干擾；（iii)轉錄后水平上:激活促 進FATS基因mRNA降解的microRNA轉錄表達、導入抑制FATS基因表達的microRNA;(iv)翻譯 后水平上：導入抑制FATS基因編碼蛋白的分子、促進負調控FATS基因表達的蛋白、抑制FATS 基因表達的銀子及蛋白的表達。
[0017] 在一些優(yōu)選方案中，所述功能產品用于:增加腫瘤組織中炎性細胞的浸潤。
[0018] 在另一些優(yōu)選方案中，所述功能產品用于:在外周免疫器官或腫瘤免疫微環(huán)境中， 促進抗腫瘤免疫和/或抑制促腫瘤的免疫反應。
[0019] 在另一些優(yōu)選方案中，所述功能產品用于:在巨噬細胞定向分化中，促進向Ml型巨 噬細胞極化，和/或抑制M2型巨噬細胞的極化。
[0020] 在另一些優(yōu)選方案中，所述功能產品用于以下一種或優(yōu)選的多種作用：
[0021] i)提高細胞毒性T淋巴細胞，NK細胞，γδτ細胞和/或Ml型巨噬細胞的比例；
[0022] ii)降低調節(jié)性T淋巴細胞和/或M2型巨噬細胞的比例；
[0023] iii)提高T細胞增殖相關細胞因子IL-2和/或Ml型巨噬細胞分泌細胞因子IL-12的 表達；
[0024] iv)提尚巨卩策細胞殺傷能力；
[0025] V)提高T細胞的增殖能力；
[0026] vi)降低巨噬細胞表達VEGF;
[0027] vii)抑制腫瘤組織血管生成；
[0028] viii)骨髓細胞在巨噬細胞定向分化中，促進向Ml型巨噬細胞極化，和/或抑制M2 型巨噬細胞的極化；
[0029] ix)促進M2型巨噬細胞的凋亡；
[0030] X)激活NF-κΒ信號通路。
[0031 ]在一些優(yōu)選方案中，所述功能產品選自或含有:核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配 體，蛋白水解酶，蛋白結合分子，F(xiàn)ATS基因缺陷或沉默的免疫相關細胞(如巨噬細胞）、其分 化細胞或構建物中的一種或多種，能夠在基因或蛋白水平上下調FATS基因的表達或其表達 產物。
[0032] 在另一些優(yōu)選方案中，所述功能產品選自或含有：以FATS基因或其轉錄本為靶序 列、且能夠抑制FATS基因表達產物的表達或基因轉錄的小干擾1?^、(181^^、8111?^、微小1^^、 反義核酸;或能表達或形成所述小干擾RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反義核酸的構建物。
[0033] 在另一些優(yōu)選方案中，所述功能產品選自或含有以下任一種：
[0034] i)以SEQ ID NO: 1或其轉錄本為靶序列，且能夠抑制FATS基因表達產物的表達或 基因轉錄的小干擾RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反義核酸；
[0035] ii)能表達或形成i)中所述小干擾1?嫩、(181?財、8111?財、微小1?嫩、反義核酸的構建 物；
[0036] iii)含有SEQ ID N0:1或其互補序列，且能夠在轉入體內后形成抑制FATS基因表 達產物的表達或基因轉錄的干擾分子的構建物；
[0037] iv)抑制或敲除SEQ ID NO: 1基因序列后的免疫相關細胞、其分化細胞或構建物；
[0038] V)以根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的SEQ ID NO: 1的同源序列或其轉 錄本為靶序列，且能夠抑制FATS基因表達產物的表達或基因轉錄的小干擾RNA、dsRNA、 shRNA、微小RNA、反義核酸；
[0039] vi)能表達或形成V)中所述小干擾1?嫩、(181?財、8111?財、微小1?嫩、反義核酸的構建 物；
[0040] vii)含有根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的SEQ ID NO: 1的同源序列或 其互補序列，且能夠在轉入體內后形成抑制FATS基因表達產物的表達或基因轉錄的干擾分 子的構建物；
[00411 Viii)抑制或敲除根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的SEQ ID N0:1的同 源基因序列后的免疫相關細胞、其分化細胞或構建物。
[0042]所述構建物可以為細胞(如轉染細胞)或表達載體。所述同源序列的同源性優(yōu)選地 大于70%。
[0043]其中，所述FATS基因或其表達產物應理解為包括：
[0044] i)FATS基因或其表達產物的原始序列或片段；
[0045] ii)FATS基因或其表達產物的保守性變體、生物活性片段或衍生物；
[0046] iii)根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的FATS基因或其表達產物的原始 序列或片段；
[0047] iv)根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的FATS基因或其表達產物的保守性 變體、生物活性片段或衍生物。
[0048] 本發(fā)明創(chuàng)造具有如下優(yōu)勢：（1)揭示了FATS基因或其表達產物與黑色素瘤密切相 關，從而可以作為藥物靶點開發(fā)黑色素瘤的相關藥物；（2)揭示了FATS基因或其表達產物在 黑色素瘤中作用的細胞機制以及分子機制，為黑色素瘤的相關藥物的開發(fā)提供了有效的目 標手段或重大依據(jù)。
【附圖說明】
[0049] 圖1是FATS基因缺陷抑制B16細胞小鼠皮下荷瘤黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。2 X IO5個 B16細胞皮下注射到小鼠右后背部(野生型小鼠，n=16;FATS基因缺陷小鼠，n=15)，觀察并 測量腫瘤大小至荷瘤第20天，處死小鼠，檢測小鼠黑色素瘤的體積以及重量;其中，A圖為野 生型小鼠與FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤的生長曲線;B圖為野生型小鼠與FATS基因缺陷小 鼠腫瘤典型代表結果；C圖為兩組小鼠的最終腫瘤重量；圖D為兩組小鼠的未成瘤率（P = 0.0083); E圖為兩組小鼠的典型代表結果(*，P〈0.05; **，P〈0.01; ***，P〈0.001)。
[0050] 圖2是FATS基因缺陷增加了炎性細胞向小鼠黑色素瘤中的浸潤。B16細胞皮下注射 到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠黑色素瘤的 部分腫瘤組織，石蠟包埋切片（切片厚度為5μπι)，對切片進行H&E染色;后面兩列分別是第一 列圖片方框內的組織放大圖，綠色箭頭所指的是浸潤的炎癥細胞。
[0051 ]圖3是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾臟中T細胞和γδτ細胞的比例。Β16細 胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠 的脾臟，分離脾臟單個核細胞，流式細胞術檢測免疫細胞亞群（總T細胞以及γδΤ細胞)變 化。A圖為總的T細胞在兩組黑色素瘤小鼠脾臟中比例的典型流式圖；B圖是兩組小鼠脾臟總 T細胞比例的統(tǒng)計圖；C圖為γ δΤ細胞在兩組黑色素瘤小鼠脾臟中比例的典型流式圖；D圖是 兩組小鼠脾臟γδΤ細胞比例的統(tǒng)計圖（*，Ρ〈0.05;#，Ρ〈0.01;#*，Ρ〈0.001)。
[0052] 圖4是FATS基因缺陷對黑色素瘤小鼠脾臟中NK細胞的影響。Β16細胞皮下注射到野 生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠的脾臟，分離脾 臟單個核細胞，流式細胞術檢測NK細胞的比例與活化。A圖為NK細胞在兩組黑色素瘤小鼠脾 臟中比例的典型流式圖；B圖是兩組小鼠NK細胞比例的統(tǒng)計圖；C圖左側為NK細胞活化的典 型流式圖，右側為NK細胞活化情況的統(tǒng)計圖，縱坐標表示平均熒光強度（MFI) (*，P〈 0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)〇
[0053] 圖5是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾臟中CTL的比例與活化程度。Β16細胞 皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠的 脾臟，分離脾臟單個核細胞，流式細胞術檢測CTL細胞比例與活化。A圖為CTL細胞在兩組黑 色素瘤小鼠脾臟中比例的典型流式圖；B圖是兩組小鼠CTL細胞比例的統(tǒng)計圖；C圖CTL細胞 活化情況的典型流式圖；D圖為CTL高度活化的高陽性⑶44比例的統(tǒng)計圖（*，P〈0.05 ;**，P〈 0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0054] 圖6是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠脾臟中IFN-γ+CTL和Thl細胞的比例。 Β16細胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩 組小鼠的脾臟，分離脾臟單個核細胞，流式細胞術檢測IFN- γ +CTL和Thl細胞比例。A圖為 IFN-Y+CTL細胞在兩組黑色素瘤小鼠脾臟中比例的典型流式圖和統(tǒng)計圖；B圖是兩組小鼠 脾臟Thl細胞比例的典型流式圖和統(tǒng)計圖（*，Ρ〈0.05 ;#，Ρ〈0.01;#*，Ρ〈0.001)。
[0055] 圖7是FATS基因缺陷對黑色素瘤小鼠脾臟中Treg和MDSC的影響。B16細胞皮下注射 到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠的脾臟，分 離脾臟單個核細胞，流式細胞術檢測免疫細胞亞群(Treg，MDSC)變化。A圖為Treg細胞在兩 組黑色素瘤小鼠脾臟中比例的典型流式圖；B圖是兩組小鼠Treg細胞比例的統(tǒng)計圖；C圖 MDSC 細胞的比例統(tǒng)計圖（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0056] 圖8是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠血清中T細胞活化因子的表達。Β16細胞 皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，對兩組小鼠進行眼球取 血，在血漿中加入肝素鈉，靜置后離心，取血清，進行多細胞因子ELISA檢測(Bi 0-Plex)。圖 為兩組小鼠血清中IL-2，IFN- γ，IL-12，IL-1 β，TNF-α以及IL-10的表達情況的統(tǒng)計圖（*，P〈 0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)〇
[0057] 圖9是FATS基因缺陷促進了腫瘤免疫微環(huán)境中的T細胞比例。Β16細胞皮下注射到 野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠的腫瘤組織， 分離單個核細胞，流式細胞術檢測總T細胞和CTL的比例變化。A圖為總的T細胞在兩組黑色 素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中比例的典型流式圖;B圖是兩組小鼠腫瘤微環(huán)境中總T細胞比例的統(tǒng) 計圖；C圖為CTL在兩組黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中比例的典型流式圖；D圖是兩組小鼠腫瘤 微環(huán)境中 CTL比例的統(tǒng)計圖（*，P〈0.05;**，P〈0.01;***，P〈0.001)。
[0058] 圖10是FATS基因缺陷增加了黑色素瘤小鼠腫瘤免疫微環(huán)境中γ δΤ以及NK細胞的 比例。Β16細胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠， 取兩組小鼠的腫瘤組織，分離單個核細胞，流式細胞術檢測免疫細胞亞群(ΝΚΤ以及γδΤ細 胞)變化。A圖為NK細胞在兩組黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中比例的典型流式圖；B圖是兩組小 鼠腫瘤微環(huán)境NK細胞比例的統(tǒng)計圖；C圖為γ δΤ細胞在兩組黑色素瘤小鼠脾臟中比例的典 型流式圖；D圖是兩組小鼠腫瘤微環(huán)境中γ δΤ細胞比例的統(tǒng)計圖（*，Ρ〈0.05;**，Ρ〈 0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0059] 圖11是FATS基因缺陷增強了黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中CTL的活化。Β16細胞皮下注射 到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠的腫瘤組 織，分離單個核細胞，流式細胞術檢測CTL的活化。A圖為活化的CTL細胞在FATS基因缺陷也 野生型小鼠黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中比例的典型流式圖；B圖是兩組小鼠腫瘤微環(huán)境活化的 CTL 細胞比例的統(tǒng)計圖（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0060] 圖12是FATS基因缺陷增加了黑色素腫瘤微環(huán)境中IFN-γ+CTL以及Thl的比例。Β16 細胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小 鼠的腫瘤組織，分離單個核細胞，流式細胞術檢測IFN- γ +CTL以及Thl的比例。A圖為CTL細 胞分泌IFN-γ在FATS基因缺陷與野生型小鼠黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中比例的典型流式圖與 統(tǒng)計圖；B圖為兩組黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中Thl細胞比例的典型流式圖與統(tǒng)計圖（*，Ρ〈 0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)〇
[0061 ]圖13是FATS基因缺陷對黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中Treg和MDSC的影響。Β16細胞 皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠的 腫瘤組織，分離單個核細胞，流式細胞術檢測免疫細胞亞群(Treg以及MDSC)的變化。A圖為 Treg細胞在兩組黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中比例的典型流式圖；B圖是兩組小鼠腫瘤微環(huán) 境中Treg細胞比例的統(tǒng)計圖；C圖MDSC細胞的比例統(tǒng)計圖（*，Ρ〈0·05 ;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈 ο.οοι)〇
[0062] 圖14是FATS基因缺陷促進了腫瘤微環(huán)境中Ml型巨噬細胞，抑制了 M2型巨噬細胞。 B16細胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩 組小鼠的腫瘤組織，部分組織甲醛固定，剩余組織分離單個核細胞，流式細胞術檢測免疫細 胞亞群(Ml，M2型巨噬細胞)變化以及免疫熒光檢測腫瘤組織切片中⑶206的表達。A圖為Ml 型巨噬細胞在兩組黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中比例的典型流式圖；B圖為Ml型巨噬細胞在 兩組黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中比例的統(tǒng)計圖；C圖為M2型巨噬細胞在兩組黑色素瘤小鼠 腫瘤微環(huán)境中比例的典型流式圖；D圖為M2型巨噬細胞在兩組黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中 比例的統(tǒng)計圖；E圖為腫瘤組織切片中⑶206的表達情況，紅色箭頭所指為染上⑶206的細胞 (*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0063] 圖15是FATS基因缺陷增加了Ml型巨噬細胞，抑制了M2型巨噬細胞相關因子的基因 表達。B16細胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠， 取兩組小鼠的腫瘤組織，分離單個核細胞，流式細胞術分選巨噬細胞，提取巨噬細胞RNA，檢 測Ml和M2型巨噬細胞表達，極化相關因子的基因水平。A圖為腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞表達的 Ml型巨噬細胞相關因子（IL-12，TNFa和N0S2)的基因水平;B圖為腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞表 達的M2型巨噬細胞相關因子（幾-10 48^，1代1(00206)以及(：(^22)的基因水平（*，？〈 0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)〇
[0064] 圖16是FATS基因缺陷抑制了黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中的血管生成。Β16細胞皮下注 射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠的腫瘤組 織，甲醛固定，切片，免疫熒光檢測腫瘤組織切片中⑶31的表達。圖為FATS基因缺陷小鼠腫 瘤組織中⑶31表達情況，白色箭頭所指為染上⑶31的細胞，藍色背景為DAPI染色。
[0065] 圖17是FATS基因缺陷并沒有影響T細胞體外增殖。磁珠分選未荷瘤的野生型以及 FATS基因缺陷小鼠的脾臟CD3+T細胞，CFSE染色后，培養(yǎng)在提前過夜抗體包被的48孔細胞培 養(yǎng)板中，培養(yǎng)上清為還有10%FBS的1640培養(yǎng)基或者是B16細胞培養(yǎng)上清，培養(yǎng)4天后，流式 細胞術檢測T細胞的增殖情況。圖左側為B16細胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)的兩組小鼠的T細胞的增殖 指數(shù)統(tǒng)計圖；圖右側為含有I〇 %I7BS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的FATS基因缺陷小鼠與野生型小鼠 的T細胞的增殖指數(shù)統(tǒng)計圖。
[0066]圖18是FATS基因缺陷增強了黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的提呈能力。B16細 胞皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠 的腫瘤組織，分離單個核細胞，流式細胞術分選巨噬細胞，絲裂霉素C處理巨噬細胞后與磁 珠分選出的CD3+T細胞1:4混合，共培養(yǎng)，流式檢測T細胞的增殖變化。A圖為共培養(yǎng)后T細胞 的增殖指數(shù)統(tǒng)計圖；B圖為培養(yǎng)上清中IL-2的表達情況（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈 ο.οοι)〇
[0067]圖19是FATS基因缺陷小鼠腫瘤中的巨噬細胞具有更強的細胞殺傷功能。B16細胞 皮下注射到野生型以及FATS基因缺陷小鼠皮下進行荷瘤，20天后，處死小鼠，取兩組小鼠的 腫瘤組織，分離單個核細胞，流式細胞術分選巨噬細胞，與B16細胞40:1混合，共培養(yǎng)，1天 后，流式檢測B16細胞的凋亡情況。A圖為共培養(yǎng)后B16細胞的凋亡典型流式圖；B圖為B16細 胞早期凋亡比例統(tǒng)計圖；C圖為共培養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清中NO的表達情況（*，P〈0.05 ; ，P〈 0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0068] 圖20是FATS基因缺陷促進了巨噬細胞向Ml型巨噬細胞的極化，抑制了 M2型巨噬細 胞的極化。分離FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓細胞，加入M-CFS使其定向分化為 MO型巨噬細胞，隨后加入IFN-γ和LPS或者IL-4使MO型巨噬細胞向Ml型巨噬細胞或M2型巨 噬細胞極化，16小時后收取細胞，流式細胞染色檢測Ml型和M2巨噬細胞的比例。圖A為MO型 巨噬細胞向Ml型極化后，Ml型巨噬細胞的比例的典型流式圖；圖B為極化后Ml型巨噬細胞比 例的統(tǒng)計圖；圖C為MO型巨噬細胞向M2型極化后，M2型巨噬細胞的比例的典型流式圖；圖D為 極化后M2型巨噬細胞比例的統(tǒng)計圖（*，P〈0.05 ;#，P〈0.01;#*，P〈0.001)。
[0069] 圖21是FATS基因缺陷促進了 Ml型巨噬細胞中IL-12，TNF-a和N0S2的基因表達。分 離FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓細胞，加入M-CFS使其定向分化為MO型巨噬細 胞，隨后加入IFN-γ和LPS使MO型巨噬細胞向Ml型巨噬細胞極化，收取細胞，實時定量PCR檢 測Ml型巨噬細胞相關因子的表達。圖為MO型巨噬細胞向Ml型極化后，Ml型巨噬細胞中TNF-〇，從^2以及11^-12的基因表達的統(tǒng)計圖（*，？〈0.05 ;**，？〈0.01;***，？〈0.001)。
[0070] 圖22是FATS基因缺陷抑制了M2型巨噬細胞中Argl，Mrcl，Retnla和CCL22的基因表 達。分離FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠的骨髓細胞，加入M-CFS使其定向分化為MO型巨 噬細胞，隨后加入IL-4使MO型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化。收取細胞，實時定量PCR檢測 M2型巨噬細胞相關因子的表達。圖為MO型巨噬細胞向M2型極化后，M2型巨噬細胞中Argl， 1代1，1^加 1&和〇0^2的基因表達的統(tǒng)計圖（*，？〈0.05;**，？〈0.01;***，卩〈0.001)。
[0071]圖23是FATS基因缺陷促進了 M2型巨噬細胞凋亡。分離FATS基因缺陷小鼠以及野生 型小鼠的骨髓細胞，加入M-CFS使其定向分化為MO型巨噬細胞，隨后加入IL-4使MO型巨噬細 胞向M2型巨噬細胞極化。收取細胞，凋亡試劑盒檢測兩組小鼠M2型巨噬細胞凋亡情況以及 免疫印跡檢測凋亡相關蛋白表達。圖A為M2型巨噬細胞凋亡典型流式圖；圖B為M2型巨噬細 胞早期凋亡的比例統(tǒng)計圖；C圖為M2型巨噬細胞凋亡信號Cleaved-caspase3和Bcl2的表達 水平(*，Ρ〈0·05 ;**，Ρ〈0·01;***，Ρ〈0·001)。
[0072]圖24是FATS基因缺陷激活了巨噬細胞NF-κΒ信號通路。分離FATS基因缺陷小鼠以 及野生型小鼠的骨髓細胞，加入M-CFS使其定向分化為MO型巨噬細胞。以上方法所得的兩組 小鼠的巨噬細胞用LPS刺激后提取蛋白，免疫印跡技術檢測細胞內NF-κΒ信號通路。圖A為骨 髓定向分化的MO型巨噬細胞p65的表達情況；圖B為骨髓MO型巨噬細胞ΙκΒα信號的表達情 況。
[0073]圖25是FATS基因缺陷的骨髓來源巨噬細胞過繼治療能明顯抑制腫瘤生長。選取10 只C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，體重18-20g，皮下注射Β16細胞，2 X 105/只，構建小鼠皮下黑 色素瘤移植瘤模型，隨機將小鼠分成兩組，每組5只。分別在小鼠荷瘤第2天和第7天，將野生 型小鼠和FATS基因敲除小鼠骨髓來源的定向分化為MO型的巨噬細胞(LPS刺激12小時)過繼 輸注到小鼠體內，連續(xù)監(jiān)測小鼠腫瘤大小。荷瘤16天后，將處死小鼠，分離腫瘤組織，稱量腫 瘤重量并拍照。圖A為過繼輸注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓來源巨噬細胞后，小鼠黑 色素瘤的生長曲線；圖B為過繼輸注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓來源巨噬細胞后，小 鼠黑色素瘤腫瘤的典型代表結果；圖C為過繼輸注野生型以及FATS基因缺陷小鼠骨髓來源 巨噬細胞后小鼠腫瘤的最終重量(*，P〈〇 · 05; **，P〈0 · 01; ***，P〈0 · 001)。圖26是過繼輸注 FATS-siRNA轉染的骨髓來源的巨噬細胞能明顯抑制腫瘤的生長。分離野生型小鼠骨髓細 胞，加入M-CFS使其定向分化為MO型巨噬細胞，隨后分別轉染FATS-siRNA和NC-siRNA，24小 時后，加入LPS( lμg/ml) 12h刺激巨噬細胞，收集細胞，調整細胞濃度為I X lOVml，尾靜脈注 射到小鼠體內，每只小鼠注射1〇〇μ1。分別在荷瘤第2天和第7天進行兩次過繼治療，連續(xù)監(jiān) 測小鼠腫瘤生長情況。圖A為轉染FATS/NC-siRNA 24小時后，RT-PCR檢測FATS基因的mRNA水 平的表達水平。圖B為兩組si-RNA治療后小鼠黑素素瘤的腫瘤生長曲線。（*，P〈0.05;**，P〈 0.01;*林，P〈0.001)。以上各圖中，WT表示野生型小鼠，KO表示FATS基因缺陷小鼠。
【具體實施方式】
[0074] 下面通過結合具體實施例對本發(fā)明創(chuàng)造進行進一步說明。
[0075] 本說明書和權利要求書中使用的下列術語，除非另外說明具有下述一般含義，且 下述含義被認為在本領域技術人員的知識范圍之內：
[0076] "保守"指所涉及的氨基酸序列或核酸序列與原始序列具有較高的相似性或同一 性，能夠維持其原始序列基本的結構、生物學活性或功能，一般可以通過相似的氨基酸殘基 替換或等位基因（簡并密碼子)替換等獲得。
[0077] "變體"指具有一個或多個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或核酸序列，所述改 變可包括氨基酸序列或核酸序列中氨基酸或核苷酸的插入、缺失或替換。變體可具有保守 性改變，其中替換的氨基酸與原氨基酸具有相似的結構或化學性質，如亮氨酸和異亮氨酸 之間的替換，也可具有非保守性改變。
[0078] "同源"包括完全同源和部分同源，在描述多肽、蛋白質或氨基酸序列時，指具有相 同或相似的結構或功能，或具有相似的氨基酸序列;在描述核酸序列時，指具有相似性或互 補的核酸序列，也包括根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的核酸序列；"同源"在本 發(fā)明具有相對較為廣泛的含義，例如，包括具有一定百分比的相同性的序列(氨基酸序列或 核酸序列），或包括序列的變體。
[0079] "衍生物"在描述多肽、蛋白質或氨基酸序列時，指由原多肽、蛋白質或氨基酸序列 衍生而來的關聯(lián)多肽、蛋白質或氨基酸序列，其具有與原始多肽、蛋白質或氨基酸序列相似 的性質、活性或功能，例如，本發(fā)明中多肽、蛋白質或氨基酸序列包括這樣的衍生物：（i)成 熟多肽與另一種化合物融合，或者（ii)在氨基酸序列中融合或插入附加的氨基酸序列 (linker、蛋白質純化標識序列、酶切位點等）；等;在描述核酸序列時，指由原始序列衍生未 來的關聯(lián)序列，其具有與原始核酸序列相似的性質、活性或功能，可以包括：（i)序列或基因 中連續(xù)或間隔地插入、缺失、替換一個或多個堿基(優(yōu)選為等位基因的替換），且所述一個或 多個氨基酸殘基的插入、缺失、替換在同一序列或基因中可同時或不同時存在；（ii)序列或 基因中一個或多個堿基被修飾；（iii)序列或基因中融合或插入編碼附加的氨基酸序列的 基因;等。
[0080] "抑制劑"包括了拮抗劑、下調劑、阻滯劑、阻斷劑、核酸抑制物等。
[0081 ] "下調"指降低FATS基因或其表達產物的活性、降低FATS基因或其表達產物的穩(wěn)定 性、降低FATS基因表達產物的表達、減少FATS基因或其表達產物的有效作用時間、抑制FATS 基因的轉錄和/或翻譯等。
[0082] "干擾分子"是指能夠下調FATS基因或其表達產物的物質的總稱，包括所述的小干 擾RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反義核酸等。
[0083]根據(jù)特定的靶序列來設計干擾分子是本領域技術人員已知且能夠實現(xiàn)的。這些干 擾分子也可以通過本領域已知的多種手段(例如采用適當?shù)脑噭?被輸送到體內，從而發(fā)揮 其下調FATS基因或其表達產物的作用。
[0084]在通過本文得知了 FATS基因或其表達產物與黑色素瘤之間的相關性后，可以基于 該特征來篩選能夠作用于、尤其是能夠下調FATS基因或其表達產物的功能產品，所用的篩 選方法也也可以通過本領域已知的多種手段得到實現(xiàn)。
[0085]下面通過具體實驗及分析和討論詳細闡述FATS基因或其表達產物與黑色素瘤之 間的相關性。
[0086] -、FATS基因缺陷對小鼠黑色素瘤以及腫瘤免疫微環(huán)境的調節(jié)作用
[0087] 1.1對象和方法
[0088] 1.1.1主要材料、試劑與儀器設備
[0089] 1.1.1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)液 美國GIBCO公司 RPM丨 1640 怡芥液 .IiN GIBCO 公 I1J 胎牛血清（FBS) 美國GIBCO公司 雙抗（Pcnicniin-StrcptomyCiii) G丨BCO 公）i'J 0.25%胰蛋白酶+EDTA 美國GIBCO公司 磷酸鹽緩沖液（PBS) 上海索來寶公司 二甲基亞砜（DMSO) 美國Sigma公司 麻酉卒藥 美國Sigma公司 膠原酶IV 美國Sigma公司 小鼠淋巴細胞分離液 天津灝洋生物制品科技公司
[0090] 三聯(lián)刺激劑 美國Bio Legend公司 牛血清白蛋白（BSA) 美國GIBCO公司 Pcrmcabiiizalion wash buiTcr 〇]|上丨 eBiosciencc 公、丨J CytoΠx/Cytopcrm buITcr .? I i(i cBioscience 公!，.J Fixation buffer ..Ii I 丨;:丨 eBioscience 公丨j CFSE 美國 Invitrogen.公司 TRIZOL 美國 Invitrogen 公司 M-MLV Reverse Transcriptase 戈|丨::丨丨nvitrogen 公 ReaUimePCR定量試劑盒 上海星漢生物科技有限公司 多聚甲醛（PFA) 美國Sigma公司
[0091] 1.1.1.2細胞系
[0092] B16細胞
[0093] 1.1.1.3抗體 Anli-mousc CD3- PE .:? 丨丨;:丨 cBiosciencx 公），.J Anli-mouso CD8a- APC eBiosciencc 公.i，.j Anti-mouse NKI. I - APC 11;:丨 cBiosciencx 公，.J Anti-mouse γδ- APC eBiosciencc 公.i，.j Anti-mouse CD3- PE-CY7 .)2 丨丨::丨 cEiioscicnce 公-丨丨.j Anti-mouse CD25- FITC N Biolegcnd 公丨 Anti-mouse Foxp3- PE .無丨丨::丨 Biolcgcnd 公.!丨J Anti-mouse CD4- APC ..λ?Ι 丨;:丨 eBioscience 公 Anti-mouse Ly6C- PE .? 丨丨;:丨 eBioscience 公）i.J
[0094] Anli-mousc Ly6G- PcCy^.5 ..XiN eBioscience 公 Anti-niousc CD44- PE .))1.1(1 eBiosciencc 公."1 Anti-mouse 丨FM-γ- PE .美國 eBioscience 公）i'J Anli-mousc CDl lb- FITC .))1.1(1 eBiosciencc 公."1 Anli-mousc CDl lb- PE -X:丨丨、;i eBioscience 公-"J Anli-mousc F4/80- APC .Ji I ":| Biolcgcnd 公.)，.j Anli-mousc CD206- Fl I C .'.Xl 11;:丨 Biolcgend 公！ Anti-mouse MHC-II - PE 'eBiosciencc 公.i，.j Ant.i-m.ou:se CD31..- PE 美國 eBioscience 公司
[0095] 1.1.1.4引物序列
[0097] 1.1.1.5主要儀器 超凈工作臺 蘇凈安泰公司 倒置顯微鏡 日本Olympus公司 細胞培養(yǎng)板 美國C oming公司 細胞培養(yǎng)皿 美國Coming公司 細胞凍存管 美國Coming公司 一次性15ml/50ml離心管 美國Coming公司 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 Sanyo公司 數(shù)顯游標卡尺 國產中性公司 Iml注射器 上海治宇醫(yī)療器械有限公司 細胞過濾器（40μηι) 美國BD公司
[0098] Eppendorl:5804 丨丨',，丨速離心帆 ：? i 丨(丨 Eppendorl'公… Eppendorf5804 迷你/4心機 .U.丨(I Eppendorf 公） FACSC6流式細胞儀 美國BD公司 超微量核酸蛋白含量測定儀 美國Thermo Scientific公司 凝膠成像系統(tǒng) BIORAD %孔O.lmL的實時定量PCR板 ABI公司 丈時)11 丨丨丨.:PCR 儀 7500 Fast Applied Biosystcms 全自動包埋機 德國Leica公司 輪轉式切片機 德國Leica公司 展片機. 德國Leica公司 烤片機 德國Leica公司
[0099] 1.1.2試劑配制
[0100] 1.1.2.1 0.01M PBS：
[0101] 分別稱取 Na2HP〇4(1.54g)，KH2P〇4(0.2g)，NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，加入到超純水 中，充分溶解，定容至100mL，調節(jié)PH值(7.2-7.4)。高壓滅菌，于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0102] 1 · 1.2.2流式染色緩沖液（SB，Stainning Buffer)
[0103] 1)38的組成成分為2%卩83,0.1%恥吣，1倍卩83;
[0104] 2)將10ml FBS和5ml濃度為10%的NaN3加入到500ml的PBS中，充分混勻，于4°C冰 箱保存?zhèn)溆谩?br>[0105] 1.1.2.3抗體稀釋液：
[0106] 1)抗體稀釋液的組成成分為0.2 %牛血清白蛋白（BSA)，0.1 %疊氮鈉 (NaN3)以及1 倍 PBS;
[0107] 2)將稱取的0.2mg BSA和吸取的Iml 10%的NaN3加入到IOOrnl的PBS中，攪拌，使其 完全溶解，于4 tC冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0108] 1.1.2.4 4%多聚甲醛：
[0109] 1)稱取2g多聚甲醛加入到45ml超純水中，加入lmol/L的NaOH;
[0110] 2)56°C過夜使其完全溶解；
[0111] 3)冷卻至室溫后，加入5ml 10XPBS
[0112] 4)加入 lmol/L 的 CaCl2 和 MgCl2 各 50ul;
[0113] 5)將PH值調至7.3，4°C避光保存。
[0114] 1.1.2.5流式細胞染色封閉液
[0115] 1)封閉液的組成成分為BSA和大鼠血清；
[0116] 2)取800ul的10%BSA加入200ul的大鼠血清，混合均勻，4°C避光保存。
[0117] 1.1.2.6細胞分選用的緩沖液(0.5%BSA/PBS):
[0118] 1)分選用緩沖液組成成分為BSA和HfPBS
[0119] 2)配制10%BSA，用1倍PBS稀釋20倍，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0120] 1.1.2.7抗原熱修復液：
[0121 ] 1)修復液組成成分為梓檬酸鈉和梓檬酸；
[0122] 2)取檸檬酸鈉41ml，檸檬酸9ml，加至450ml超純水中，混勻，常溫保存?zhèn)溆谩?br>[0123] 1.1.3實驗方法
[0124] 1.1.3.1 B16細胞復蘇、傳代和凍存
[0125] 1.1.3.1.1 細胞復蘇：
[0126] 1)細胞復蘇前，細胞房內以及細胞房超凈工作臺內需紫外照射15_20min;
[0127] 2)從液氮中取出來需要復蘇的細胞，立即放入37°C水浴鍋中，不斷晃動凍存管 Imin內使細胞液快速溶解；
[0128] 3)裝有細胞的凍存管在放入超凈工作臺前，需酒精仔細擦拭，在超凈臺中打開凍 存管，將其中的Iml細胞懸液吸到干凈無菌的15ml離心管中，加入加有胎牛血清(FBS)的 DMEM培養(yǎng)基(DMEM+20%FBS)，800rpm離心，5min;由于剛復蘇的細胞相對脆弱，所以適當?shù)?降低離心時的轉速；
[0129] 4)倒掉上清液，用Iml加有20 %FBS的DMEM培養(yǎng)基吹打離心管中沉淀的細胞，使細 胞懸浮起來，提前在IOcm2培養(yǎng)皿中加入9ml加有20 %FBS的DMEM培養(yǎng)基，吸取細胞懸液到培 養(yǎng)皿中，前后左右輕輕搖動，使細胞在培養(yǎng)皿中分布均勻；
[0130] 5)在培養(yǎng)皿上標注好所培養(yǎng)細胞的種類，復蘇日期以及培養(yǎng)人姓名，放入CO2細胞 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0131 ] 6) 24小時內更換新鮮的完全培養(yǎng)基。
[0132] 1.1.3.1.2 細胞傳代
[0133] 1)當B16(B16細胞為貼壁細胞)在培養(yǎng)皿中的匯合度達到了80%-90%時，即可進 行細胞傳代；
[0134] 2)用5ml槍吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)上清，隨后將無菌的1倍的I3BS 2-3ml輕輕的加入 培養(yǎng)皿中，前后左右輕輕搖動，隨后棄掉所加入的I3BS，吸取胰蛋白酶Iml，加入培養(yǎng)皿中進 行細胞消化，前后左右搖動，將培養(yǎng)皿放回細胞培養(yǎng)箱，Imin后取出，加入2-3ml加有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化；用Iml槍將培養(yǎng)皿中的細胞吹打下來，全部細胞懸液吸入到 15ml無菌的離心管中，1000 rpm，離心，5min;
[0135] 3)棄掉上清液，加Iml加有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，用Iml槍吹打，使沉淀的細胞完 全懸浮起來，根據(jù)實驗要求，將細胞傳到提前加入加有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中， 前后左右輕輕搖動，使細胞在培養(yǎng)皿中分布均勻；
[0136] 4)在培養(yǎng)皿上標注好培養(yǎng)細胞的種類，傳代日期以及培養(yǎng)人姓名，放入CO2細胞培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0137] 1.1.3.1.3 細胞凍存
[0138] 1)配制凍存液:90 % 的 FBS+10 % 的 DMSO;
[0139] 2)收集細胞并進行離心(與傳代步驟相同）；
[0140] 3)將配制好的凍存液(0.5ml)提前加入到凍存管中，用加有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基 重懸細胞，吸取0.5ml細胞懸液加入到凍存管中，使DMSO的終濃度保持在5% ;
[0141 ] 4)在凍存管寫明細胞種類與凍存日期；
[0142] 5)將凍存管放入室溫保存的盛有異丙醇的凍存盒中，隨后將凍存盒放在_80°C超 低溫冰箱中過夜，凍存管可于第二天取出，放入液氮中進行長期保存，凍存盒中異丙醇的使 用次數(shù)不能超過5次，5次使用后需更換新的異丙醇。
[0143] 1.1.3.2小鼠黑色素瘤模型構建
[0144] 1.1.3.2.1實驗動物
[0145] 1)FATS基因缺陷小鼠（品系為C57BL/6)由天津腫瘤醫(yī)院李政教授提供，飼養(yǎng)與天 津醫(yī)科大學實驗動物中心，小鼠房等級為SPF級別，飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度為20-25 °C，相對濕度 40%-60%;FATS基因缺陷小鼠被敲掉的FATS基因序列如SEQ ID N0:1所示；
[0146] 2)野生型小鼠為C57BL/6無特殊病原體(SPF級）小鼠，8周齡，體重為20g左右，購買 于北京維通利華實驗動物技術有限公司，小鼠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學實驗動物中心，小鼠房 等級為SPF級別，飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度為20-25°C，相對濕度40%-60%。
[0147] 1.1.3.2.2異位小鼠黑色素瘤模型構建
[0148] 1)將B16細胞培養(yǎng)于IOcm2培養(yǎng)皿中，用加有10%FBS，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)， 培養(yǎng)至對數(shù)生長期；
[0149] 2)收集細胞并進行離心(與傳代步驟相同）；
[0150] 3)棄掉上清液，細胞沉淀用1倍的I3BS吹打，lOOOrpm，離心，5min，棄上清，隨后再重 復1次；
[0151] 4)收集到的B16細胞用1倍的PBS重懸，計數(shù)，調整細胞濃度至2 X 106/ml;
[0152] 5)提前半天時間，用脫毛膏將小鼠右后背部的毛脫去，注射細胞懸液前用75%酒 精對小鼠注射部位進行消毒；
[0153] 6)在每只小鼠的右后背部，注射1 ΟΟμΙ 2 X 106/ml的B16細胞(共31只），即每只小 鼠注射Β16細胞的數(shù)量為2 X 105/只，進針后或出針前，可稍微改變針頭的方向，注射時動作 輕緩，出針后輕按針孔片刻，可避免細胞懸液漏出；
[0154] 7)每天對小鼠的腫瘤生長情況進行觀察，并用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長度與寬 度，做好記錄；
[0155] 8)荷瘤后20天，麻醉后脫頸處死小鼠，分離小鼠的脾臟與腫瘤，腫瘤組織，照相，稱 重，并測量其長度與寬度，計算腫瘤的終體積；
[0156] 9)小鼠的腫瘤體積計算公式為(長X寬2)/2(_3)
[0157] 1.1.3.3脾臟以及腫瘤組織單個核細胞的分離 [0158] 1.1.3.3.1脾臟單個核細胞的分離
[0159] I)準備：一次性細胞篩網(wǎng)，Iml注射器，培養(yǎng)皿，平頭剪刀，鑷子，75 %酒精，10倍 PBS，1倍PBS，超純水，無血清1640培養(yǎng)基，加10%FBS，1%雙抗的1640培養(yǎng)基；
[0160] 2)在培養(yǎng)皿中加入4ml無血清1640培養(yǎng)基；
[0161] 3)取小鼠脾臟組織，放入超凈工作臺，置于一次性細胞篩網(wǎng)中（浸泡于75%酒精中 的器械使用時需用1倍的PBS沖洗，以免殺傷細胞，篩網(wǎng)不可用手觸摸網(wǎng)面），用平頭剪刀剪 碎脾組織；
[0162] 4)取Iml注射器的針芯(不可用手觸摸針芯頂部，用鑷子抽出后再用手拿住中間部 分抽出），將針芯頭部輕沾皿中培養(yǎng)基后，研磨篩網(wǎng)中的脾臟組織；
[0163] 5)研磨完全后，棄掉針芯，用Iml槍吸取皿中1640培養(yǎng)基沖洗篩網(wǎng)，使細胞流入培 養(yǎng)皿中，再吸取干凈的無血清1640培養(yǎng)基2ml沖洗篩網(wǎng)1次；
[0164] 6)將培養(yǎng)皿中的細胞懸液轉移至15ml無菌離心管中，1300rpm，離心，5min;
[0165] 7)裂解紅細胞:棄上清，渦旋沉淀的細胞，可使細胞松散便于裂解，用900μ1的超純 水重懸細胞，然后迅速加入10倍的PBS ?οομL，混合后會出現(xiàn)裂解的紅細胞團塊，將團塊挑 出，加入無血清1640培養(yǎng)基至5-7ml，1300rpm，離心，5min(視沉淀細胞的多少可成比例加大 純水和PBS的量）；
[0166] 8)棄上清，用加有10%FBS，1 %雙抗的1640培養(yǎng)基重懸細胞，培養(yǎng)，備用。
[0167] 1.1.3.3.2腫瘤組織單個核細胞的分離
[0168] 1)準備:小鼠單個核細胞分離液，腫瘤消化酶，一次性細胞篩網(wǎng)，Iml注射器，培養(yǎng) 皿，平頭剪刀，鑷子，75%酒精，1倍PBS，加10%FBS，1%雙抗的1640培養(yǎng)基；
[0169] 2)剝離小鼠腫瘤組織，盡量不要破壞腫瘤組織，隨后將腫瘤組織置于無菌培養(yǎng)皿 中，放于超凈工作臺，用平頭剪剪碎組織至直徑約Imm的小塊，加入0.05mg/ml腫瘤消化酶 (0 · 05mg/ml 的膠原酶 IV+0 · 05mg/ml 的透明質酸酶+0 · 05mg/ml 的 DNA 酶I) 20ml 左右，37 °C 消 化1小時左右；
[0170] 3)腫瘤組織消化后轉移至一次性細胞篩中，用無菌的Iml注射器針芯的頭部對其 進行研磨，期間加入1倍PBS過濾研磨液，收集濾液至15ml無菌離心管中，1500rpm，離心， 5min，重復2次；
[0171] 4)棄上清，加入4ml 1倍PBS重懸，隨后加入等體積的小鼠淋巴細胞分離液，室溫離 心，提速擋和剎車擋均設為〇,2000rpm，室溫離心，20min，平穩(wěn)取出離心管；
[0172] 5)用5ml槍吸出白膜層上方的液體，僅留取至白膜層上方0.5ml處。用200μ1槍吸出 離心管中的白膜層，置于干凈的無菌15ml離心管中，加入3倍體積的1倍PBS，離心5min，3次， 轉速分別為 2000rpm，1800rpm 和 1500rpm;
[0173] 6)棄上清，加入含有10%FBS，I %雙抗的1640培養(yǎng)基重懸細胞，培養(yǎng)，備用。
[0174] 1.1.3.4流式細胞術檢測免疫細胞亞群：
[0175] 1)收取需要檢測的細胞，1500rpm，離心，5min;
[0176] 2)棄上清（棄上清時將流式管在干凈的濾紙或衛(wèi)生紙上輕沾，以免過多的上清液 流回），加入1ml 1倍的PBS，重懸細胞，1500rpm，離心，5min;
[0177] 3)棄上清，分出空白管，單染管以及同型對照檢測管，與檢測管一起，加入1倍PBS， 使每管內液體量大約在?〇〇μ1左右；
[0178] 4)封閉：每管加入25μ1的流式抗體封閉液，4°C避光，30min;
[0179] 5)表面染色:每管按照實驗設計分別加入大鼠抗小鼠熒光標記抗體，并按照實驗 要求，在同型對照管中加入配套的同型抗體，去除檢測時的假陽性：
[0180] ①總 T 細胞：CD3-PE
[0181] ②細胞毒性T淋巴細胞(CTL) :CD3-PE/CD8a-APC
[0182] ③ γδΤ細胞：0)3-ΡΕ/γδ-ΑΡ〇
[0183] ④自然殺傷T細胞(NKT) :CD3-PE/NK1 · 1
[0184] ⑤髓系抑制細胞(MDSC):CDllb-FITC/Ly6C-PE/Ly6G_PeCy 7
[0185] ⑥ Ml 型巨噬細胞：CDl lb-FITC/MHC-II-PE/F4/80-APC
[0186] CDllb-FITC/CDllc-PE/F4/80-APC
[0187] ⑦ M2 型巨噬細胞：CD206-FITC/CD1 lb-PE/F4/80-APC
[0188] ⑧活化的細胞毒性T淋巴細胞:CD3-FITC/CD44-PE/CD8-APC
[0189] ⑨活化的 1 型輔助性 T 細胞:CD3-FITC/CD44-PE/CD4-APC
[0190] 6)4°C 避光，30min;
[0191 ] 7)每管加入1ml的PBS重懸，1500rpm，離心，5min，洗滌2次；
[0192] 8)棄上清，每管加入4%多聚甲醛或者固定緩沖液50-100μ1固定；
[0193] 9)流式細胞儀上機檢測(可短時間保存于4°C)。
[0194] 1 · 1 · 3 · 5流式細胞儀檢測Treg細胞：
[0195] 1)收取脾臟或腫瘤細胞(不需要刺激，細胞直接用于流式檢測），分出空白管，單染 管，同型檢測管以及實驗管，表面染色:⑶25-FITC/⑶3-Pe-Cy 7/⑶4-APC
[0196] 2)4°C 避光孵育 30min;
[0197] 3)每管加入1ml染色緩沖液SB，1500rpm離心5min，2次（由于胞內染色破膜會對細 胞產生損傷所以要用在PBS加入FBS的SB對細胞加以保護）；
[0?98] 4)棄上清，加入250μ1/管Foxp3Cytof ix/Cytoperm緩沖液(事先按說明說稀釋），4 。(:避光透膜，15-20min;
[ΟΙ"] 5)每管加入l-2ml的Permeabilization wash緩沖液（商品化為10倍，使用前用超 純水稀釋為1倍），1800rpm，離心，7min，由于透膜后細胞體積變大，容易丟失，所以增加了細 胞離心的轉速與時間；
[0200] 6)封閉：每管加入25μ 1封閉液，4 °C避光，30min;
[0201] 7)加入大鼠抗小鼠熒光抗體Foxp3-PE，并按照說明書在同型管中加入配套的同型 抗體，室溫避光30min;
[0202] 8)每管加入1-21111的？61'1116&13；[112&1:;[011?^11緩沖液，1800印111，離心，7111；[11;
[0203] 9)棄上清，每管加入1ml的SB，1800rpm，離心，7min;
[0204] 10)每管加入4%多聚甲醛或者固定緩沖液50-100μ1固定；
[0205] 11)流式細胞儀上機檢測(可短時間內保存于4°C)。
[0206] 1.1.3.6流式細胞儀檢測細胞毒性T淋巴細胞胞內因子：
[0207] 1)需要檢測的細胞加入三聯(lián)刺激劑(包括PMA，鈣離子霉素和BFA)，置于CO2細胞培 養(yǎng)箱中，刺激4-5小時，收取細胞，1500rpm，離心，5min，棄上清；
[0208] 2)加入1ml 1倍的PBS，重懸細胞，1500rpm離心，5min;
[0209] 3)分出空白管，單染管，同型檢測管以及實驗管，表面染色：
[0210] ①細胞毒性T淋巴細胞：CD3-FITC/CD8a-APC
[0211] ②1 型輔助性 T 細胞:CD3-FITC/CD4-APC
[0212] 4)4°C 避光孵育，30min;
[0213] 5)每管加入1ml染色緩沖液SB，1500rpm離心，5min，2次，棄上清；
[0214] 6)每管加入250μ1/管4%PFA或者固定緩沖液，4°C避光30min或者過夜，固定；
[0215] 7)離心棄上清，每管加入1ml 1倍的Permeabilization wash緩沖液，1800rpm，離 心，7min;
[0216] 7)棄上清，加入250μ1/管1倍的Permeabilization wash緩沖液，4°C避光透膜，15-20min；
[0217] 8)每管加入1ml 的Permeabi lizat ion wash 緩沖液，1800rpm，離心，7min，棄上清；
[0218] 9)封閉：每管加入25μ1封閉液，4°C避光30min;
[0219] 10)加入大鼠抗小鼠熒光抗體IFN-γ-ΡΕ，并按照說明書在同型管中加入配套的同 型抗體，4°C避光，30min;
[0220] 11)每管加入l_2ml的Permeabilization wash緩沖液，1800rpm，離心，7min;
[0221 ] 12)棄上清，每管加入1ml的SB，1800rpm，離心，7min;
[0222] 13)每管加入4%多聚甲醛或者固定緩沖液50-100μ1固定；
[0223] 14)流式細胞儀上機檢測(可短時間保存于4°C)。
[0224] 1.1.3.7細胞RNA提取
[0225] 1)將凍存于-80°C冰箱的加有Trizol的細胞取出，室溫融化，渦旋15s混合均勻，室 溫靜置，IOmin;
[0226] 2)每管中加入200μ1氯仿，渦旋后在冰上靜置5min(室溫亦可以）；
[0227] 3)4°C，12000rpm，離心，15min，小心取上清，移至新的無RNA酶的1.5ml EP管中（注 意不要碰到中間層，用200μ1的槍輕吸）；
[0228] 4)加入與上清同等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，在冰上靜置，IOmin;
[0229] 5)4°C，12000rpm，離心，lOmin，棄上清，加入無水乙醇Iml，上下顛倒混勾，4°C， 12000rpm，離心，5min，棄上清，用10μ1的槍吸出殘余液體，室溫瞭干，約5-10min;
[0230] 6)根據(jù)管底沉淀量，加入無RNA酶水，溶解RNA，可長期保存于-80°C ;
[0231 ] 7)提取的RNA檢測:瓊脂糖凝膠(1 % )電泳，180V，10分鐘；
[0232] 8)Nanodrop檢測RNA濃度，以便后續(xù)實驗。
[0233] 1.1.3.8 RNA反轉成cDNA
[0234] 1)反轉錄使用試劑盒，M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen?,by life technologies?)；
[0235] 2)主要反轉步驟為:測量所提RNA的濃度(Nanodrop)，用以計算反轉用量;RNA樣品 上樣量一般為2yg，加入隨機引物ΙμL，dNTP ΙμL，無RNA酶水補充至13μ1; 65°C，5min;取出， 加入4μ1 的5倍First緩沖液，2μ1 的DTT; 37 °C，2min;取出，冰上加入MLV酶ΙμL; 25°C，IOmin; 37°C，50min;70°C，15min;cDNA放置在-20°C保存。
[0236] 1.1.3.9 實時定量 PCR
[0237] 1)2(^1體系包括：1(^1的9?0?!^8七6^1^1，正反定量引物各0.541(1(^]\〇，。0嫩叫 1，R0X 0·4μ1，超純水7·6μ1;
[0238] 2)ABI 7500Fast進行實時定量PCR檢測。
[0239] 1.1.3.10 組織切片，H&E染色：
[0240] 1.1.3.10.1石蠟包埋，切片：
[0241 ] 1)去黑色素瘤小鼠腫瘤組織，簡稱直徑5_左右小塊；
[0242] 2)將腫瘤組織放置于包埋盒中，浸泡在4%多聚甲醛中過夜固定；
[0243] 3)組織脫水:從甲醛中取出包埋盒，流水沖洗30min;隨后浸泡于75 %酒精，30min; 85 %酒精，30min; 95 %酒精，過夜；無水酒精Ih 30min;
[0244] 4)組織透明：常溫將包埋盒浸泡于二甲苯中，35min;
[0245] 5)組織浸蠟:浸蠟溫度60°C，將包埋盒浸泡于蠟缸I中l(wèi)_2h，隨后換至蠟缸II中，繼 續(xù)浸蠟Ih;
[0246] 6)組織包埋:打開包埋盒，將組織取出，放入預熱好的模具中（模具內事先放入少 量溶蠟），包埋盒的蓋子放在模具上方，繼續(xù)添加石蠟，直至包埋盒的蓋子也完全浸沒于石 蠟中；
[0247] 7)組織冷卻:將模具放置4°C冷卻，等石蠟完全凝固后，取出模具中包埋好的組織， 常溫保存；
[0248] 8)石蠟切片:使用石蠟包埋組織切片機，將腫瘤組織切片，厚度為5μπι，隨后將切好 的蠟片放入45°C的溫水中，使其自然展開，展開后用玻璃載玻片將蠟片撈起，輕輕甩掉載玻 片上的水，65 °C烤片，3-4h，常溫保存。
[0249] 1.1.3.10.2 H&E染色
[0250] 1)切片脫蠟:石蠟切片放置于二甲苯中Ih;
[0251 ] 2)切片水化:將切片從二甲苯中取出，放入無水酒精中，2min ; 95 %酒精，2min ; 85 %酒精，2min; 75 %酒精，2min;蒸餾水沖洗Imin;
[0252] 3)切片染色:將切片放入蘇木精中，染色IOmin;自來水沖洗;0.5%伊紅染色Imin; 自來水沖洗2-5min;蒸餾水沖洗l-3s;鏡檢染色效果，如不理想可重復染色；
[0253] 4)切片脫水:將染好的切片放置在75%酒精中，10-308;85%酒精，10-30 8;95%酒 精，30s_lmin;無水酒精，2_3min;鏡檢；
[0254] 5)透明封藏：將脫水后的切片放置入二甲苯中，15min，取出，在二甲苯濕潤狀態(tài) 下，滴樹膠，加蓋玻片(注意不要有氣泡）；室溫晾干，照相，可長期室溫保存。
[0255] 1.1.3.11組織切片免疫熒光染色：
[0256] 1)組織包埋切片見1.1.3.10.1;
[0257] 2)切片脫蠟水化見1.1.3.10.2;
[0258] 3)在切片上滴加1-2滴的過氧化氫(3%)，室溫孵育lOmin，用于降低內源性過氧化 物酶；
[0259] 4)PBS 洗片 3次，3min/次；
[0260] 5)抗原熱修復:切片放入預熱的抗原修復液中，微波爐高火模式5min，隨后解凍模 式15min，室溫冷卻；
[0261] 6)封閉：封閉用1 %的BSA，37°C，30min，傾去血清，勿洗；
[0262] 7)滴加 CD206-FITC/CD31-PE(抗體 1:50 稀釋），4°C 避光，過夜；
[0263] 8)PBS 漂洗3次，5min/次；
[0264] 9)滴加DAPI;
[0265] 10)滴加PBS，加蓋玻片封片，照相。
[0266] 1.1.3.12多細胞因子ELISA檢測：
[0267] 黑色素瘤小鼠血清中的IFN-γ，TNF_a，IL-10，IL-1O，N0，IL_2以及IL-12由Bio-Plex細胞因子檢測系統(tǒng)進行檢測。
[0268] 1.1.3.13腫瘤組織巨噬細胞分選
[0269] 1)分離小鼠腫瘤單個核細胞(過程見1.1.3.3.2);
[0270] 2)細胞懸液中加入大鼠抗小鼠熒光標記抗體，F(xiàn)4/80-FITC，避光，30min;
[0271] 3)加入 1 倍的PBS lml，1500rpm，離心，5min;
[0272] 4)根據(jù)細胞數(shù)量，用分選緩沖液重懸細胞；
[0273] 3)ArisIII流式細胞儀對標記了 F4/80-FITC的細胞進行分選；
[0274] 4)分選出的細胞用1倍的PBS洗，1500rpm，5min，加入Trizol混勻，-80°C保存，備 用。
[0275] 1.1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
[0276] 本研究全部數(shù)據(jù)都來自至少三次獨立的實驗，實驗數(shù)據(jù)均用means 土 SD表示，均輸 入Excel建立數(shù)據(jù)庫，分析采用采用SpSS13.0統(tǒng)計軟件。組內比較采用概率計算應用 Student's unpaired t-test,以ρ〈0·05表示差異有統(tǒng)計學意義（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈 0·01;***，Ρ〈0·001)。統(tǒng)計圖均由GraphPad Prism Version 5.0(GraphPad Software Inc， San Diego CA)完成。流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6.1software(Tree Star，Inc，USA)進行分 析。
[0277] I. 2 結果
[0278] 1.2.1 FATS基因缺陷后抑制了 B16細胞皮下荷瘤小鼠黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展
[0279] 我們利用黑色素瘤細胞系，B16細胞對C57小鼠進行皮下荷瘤，構建小鼠黑色素瘤 模型，來探究FATS基因在黑色素瘤中的作用。
[0280]異位小鼠黑色素瘤模型：2 X IO5個B16細胞皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右后背 部，包括野生型小鼠（WT)(η = 16)和FATS基因缺陷小鼠（KO)(η = 15 )，每日對小鼠進行觀察 記錄出瘤情況并測量腫瘤大小至荷瘤第20天。結果顯示，F(xiàn)ATS基因缺陷的小鼠相較野生型 小鼠，黑色素瘤成瘤率明顯降低（圖1D，E，P〈0.01)，同時腫瘤的生長速度緩慢，野生型小鼠 最終所成的黑色素瘤體積顯著的大于FATS基因缺陷小鼠的黑色素瘤體積（圖1A，B，P〈 0.01)。相一致的，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠黑色素瘤的最終重量相較野生型小鼠的腫瘤重量也表 現(xiàn)出明顯的減少（圖IC，P〈0.01)。這些結果表明，F(xiàn)ATS基因缺陷顯著的抑制了B16細胞小鼠 皮下荷瘤所成的黑色素瘤的發(fā)生和發(fā)展。
[0281] 1.2.2 FATS基因缺陷后增加了小鼠黑色素瘤組織中的炎性細胞的浸潤
[0282] 基于以上所得結果，F(xiàn)ATS基因缺陷明顯抑制了黑色素瘤的生長，我們猜測，F(xiàn)ATS基 因缺陷也許會影響黑色素瘤的腫瘤微環(huán)境。因此，我們進一步對野生型小鼠以及FATS基因 缺陷小鼠的腫瘤組織進行了 H&E染色，來檢測兩組小鼠腫瘤組織中對腫瘤生長具有抑制作 用的炎性細胞的浸潤情況。染色如圖2所示，與預期結果相一致，F(xiàn)ATS基因缺陷后，B16荷瘤 小鼠的黑色素瘤中，腫瘤內部以及腫瘤邊緣炎性細胞浸潤都明顯的增加了。這一結果說明， FATS基因缺陷確實增加了小鼠黑色素瘤中炎性細胞的浸潤。
[0283] 1.2.3黑色素瘤小鼠外周免疫器官中，F(xiàn)ATS基因缺陷后影響了免疫細胞的比例
[0284] 以上結果表明，F(xiàn)ATS基因缺陷后抑制了小鼠黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展可能是通過影響 腫瘤相關的免疫細胞來實現(xiàn)的，為了驗證這一猜想，我們進一步檢測了兩組黑色素瘤小鼠 的外周以及腫瘤組織中的免疫細胞。首先是對黑色素瘤小鼠的外周免疫器官，脾臟進行了 檢測。B16荷瘤20天后，處死小鼠，分離小鼠脾臟細胞，流式細胞術分析脾臟細胞中的多種免 疫細胞的情況。結果如圖3A-D所示，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠相較野生型小鼠，外周免疫器官中總 的T細胞(⑶3+T細胞）以及γδΤ細胞（γ δ+/⑶3+)的數(shù)量明顯的增加。雖然自然殺傷(NK)細胞 (NK1. Γ)的數(shù)量沒有明顯的差別（圖4Α，B)，但是檢測NK細胞的活化(NK1.1+/CD44+)程度(平 均熒光強度，MFI)發(fā)現(xiàn)，NK細胞活化在FATS基因缺陷小鼠中明顯增加（圖4C) (CD44陽性是T 細胞和NK細胞活化的標志）。除此之外，在抗腫瘤過程中起主要作用的細胞毒性T淋巴細胞 (CTL)的比例在FATS缺陷小鼠的脾臟中明顯的增加（圖5Α，B)，并且其活化水平(CD44)顯著 增加，橫型框代表⑶44高表達的CTL比例，在FATS基因缺陷小鼠中顯著的多于野生型小鼠 (圖5C，D)。我們也發(fā)現(xiàn)，IFN- γ作為細胞殺傷的重要的效應因子，在FATS基因缺陷小鼠脾臟 中的CTL細胞中表達增加，同時Thl (⑶3+⑶4+IFN- γ +)細胞的比例在FATS缺陷小鼠脾臟中也 有所增加（圖6Α，Β)。這些結果提示，在黑色素瘤小鼠的外周免疫器官中，F(xiàn)ATS基因缺陷后增 加了抗腫瘤免疫。
[0285] 進一步檢測脾臟中對腫瘤生長具有促進作用的免疫細胞，調節(jié)性T細胞(Treg，CD3 +CD4+CD25+Foxp +)以及髓系抑制細胞(MDSC，CDllb+Ly6C+Ly6G+)，流式結果發(fā)現(xiàn)，雖然MDSC的 比例沒有明顯的差別（圖7C)，但是Treg的比例在FATS缺陷后有了顯著的下降（圖7A，B)。這 說明FATS基因缺陷對抑制性腫瘤免疫有著抑制作用。
[0286] 1.2.4黑色素瘤小鼠血清中，F(xiàn)ATS基因缺陷增加了促進腫瘤殺傷相關的細胞因子
[0287] 研究表明，IL-2可以有效的刺激效應T細胞和NK細胞的增殖，是T細胞增殖重要的 細胞因子，也是一個重要的生長因子，參與著抗原激活的淋巴細胞的增殖以及免疫記憶的 產生。同時，IL-12的產生可以促進T細胞的增殖和NK細胞的活化，誘導Th 1細胞極化以及CTL 的產生，還可以抑制血管生成。IL-12可由Ml型巨噬細胞產生，Ml型巨噬細胞也可以分泌IL-1β和TNF-α介導腫瘤細胞的溶解。亦有研究報道，IFN-γ產生的增加可以促進Ml型巨噬細 胞，也可以抑制血管生成并促進抗腫瘤免疫監(jiān)視。而抑制免疫的細胞因子(例如IL-10)可由 免疫抑制細胞(M2型巨噬，Treg等)產生，對腫瘤起到促進的作用?；谥T多已有的研究，為 了深入探究FATS基因在小鼠黑色素瘤中的作用，我們對Β16皮下荷瘤的野生型以及FATS基 因缺陷小鼠的血清進行了多細胞因子ELISA檢測，結果如圖8所示，IL-2，IL-12在FATS基因 缺陷的黑色素瘤小鼠血清中明顯升高，這與FATS基因缺陷后小鼠T細胞比例增加相一致。除 此，IL-li3，TNF_a以及IFN-γ也明顯增加，進一步的，參與促腫瘤的免疫抑制因子IL-10在 FATS基因缺陷小鼠血清中顯著減少。這些結果表明，F(xiàn)ATS基因缺陷可能影響了黑色素瘤小 鼠的免疫細胞的比例和功能，從而對黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展產生了抑制作用，這與我們已得 的實驗結果相一致。
[0288] 1.2.5 FATS基因缺陷顯著影響了黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞
[0289] 以上的研究結果表明，F(xiàn)ATS基因可能在免疫調節(jié)中具有重要的作用，從而影響了 腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。我們知道，除去外周免疫器官，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，起到更為關鍵 作用的，是腫瘤的免疫微環(huán)境。目前已知，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞可以影響腫瘤的發(fā)生， 發(fā)展，侵襲與最終的結果。免疫細胞從外周迀移進入腫瘤組織，在腫瘤環(huán)境中亦會產生一些 變化。腫瘤不僅可以通過多種機制逃避免疫系統(tǒng)，還可以改變浸潤在腫瘤微環(huán)境中的免疫 細胞的功能來創(chuàng)造一個有利于腫瘤生長的環(huán)境，例如巨噬細胞，在腫瘤環(huán)境中可被極化轉 變?yōu)镸2型巨噬細胞，喪失殺傷能力(Ml型巨噬細胞），產生免疫抑制作用(對腫瘤殺傷的效應 細胞產生抑制），促進腫瘤的生長。相反的，腫瘤環(huán)境中具有抗腫瘤的效應T細胞(例如CTL， Thl)可與具有抗原呈遞功能的細胞(例如Ml型巨噬細胞)相互作用，導致進一步的增值與活 化，同時也反過來促進Ml型巨噬細胞，產生抗腫瘤免疫。因此，為了深入全面的探究FATS基 因在小鼠黑色素瘤中的作用，我們進一步檢測了野生型小鼠和FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤 腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞變化。
[0290] B16細胞皮下荷瘤20天后，取兩組小鼠的腫瘤組織，分離出單個核細胞，流式細胞 術檢測多種免疫細胞在FATS基因缺陷小鼠以及野生型小鼠黑色素瘤的腫瘤微環(huán)境中的情 況。
[0291] 首先，我們對具有腫瘤抑制作用的免疫細胞，CTUNKT以及γ δΤ細胞的比例變化進 行了分析，結果如圖9-10所示:與野生型小鼠相比，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠黑色素瘤腫瘤微環(huán)境 中的總的T細胞（圖9Α，Β)，具有腫瘤殺傷功能的CTL(圖9C，D)顯著增加，同時，NK(圖10Α，Β) 以及γ對（圖l〇C，D)細胞比例也顯著的增加，且相較脾臟免疫細胞比例的增加更為明顯，除 此，NK T細胞的比例（圖10右上格)在FATS基因缺陷小鼠中也有了增加。由此可知，F(xiàn)ATS基因 缺陷增強了黑色素瘤小鼠腫瘤免疫微環(huán)境中的腫瘤免疫殺傷。
[0292] T細胞的活化在腫瘤過程中至關重要，活化的CTL細胞具有強大的直接腫瘤細胞殺 傷能力。我們以上的結果發(fā)現(xiàn)，在腫瘤環(huán)境中，CTL細胞的比例明顯的增加，在分析外周脾臟 時我們已經發(fā)現(xiàn)，CTL的比例和活化程度都在FATS基因缺陷后有了增加，那么，隨后我們思 考，CTL的活化是否也在FATS基因缺陷后增強?于是，我們利用⑶44染色分析了 CTL細胞在腫 瘤微環(huán)境中的活化程度。結果表明，在黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中，F(xiàn)ATS缺陷小鼠的CTL活化程 度明顯增加，橫型框代表⑶44高表達的CTL比例，在FATS基因缺陷小鼠中，CD44基本全部表 現(xiàn)出高的表達程度，這說明FATS基因缺陷后極大的活化了 CTL細胞（圖11A，B)。這一結果證 明，F(xiàn)ATS基因缺陷使得CTL的活化增強，這與FATS基因缺陷的小鼠所表現(xiàn)出的腫瘤抑制作用 相一致。亦有實驗研究證明，IFN-γ作為細胞殺傷的重要的效應因子參與腫瘤殺傷和免疫 監(jiān)視，所以我們進一步的，通過檢測CTL細胞中的IFN- γ的表達情況分析FATS基因缺陷小鼠 與野生型小鼠腫瘤微環(huán)境中的CTL對腫瘤細胞的殺傷能力，同時也對Thl (⑶3+⑶4+IFN-y+) 細胞進行了檢測。實驗結果顯示，在FATS基因缺陷小鼠腫瘤微環(huán)境中的CTL細胞表達的IFN-γ顯著增加（圖12A)，同時Thl(CD3+CD4+IFN-Y +)細胞的比例在FATS缺陷小鼠腫瘤微環(huán)境中 也了顯著增加（圖12B)，且比例增高的程度明顯高于脾臟中的比例。
[0293] 此外，我們還分析了黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中對腫瘤生長具有促進作用的免疫 細胞，Treg以及MDSC，結果如圖13所示，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中的Treg 細胞相較野生型小鼠顯著的減少，且減少成都明顯多于黑色素瘤小鼠外周免疫器官（圖 13A，B)，而MDSC的比例沒有顯著的差異（圖13C)。這一結果與脾臟檢測結果相一致，顯示了 FATS基因缺陷對于促進腫瘤的抑制性免疫具有明顯的抑制作用。
[0294] 腫瘤是由惡性細胞以及正常的基質細胞所組成的，微環(huán)境中包括了數(shù)量眾多的巨 噬細胞，這些巨噬細胞被稱之為腫瘤相關的巨噬細胞(ΤΑΜ)。這些巨噬細胞可以通過細胞毒 性，細胞溶解或者抗原呈遞激活腫瘤殺傷的T細胞來抑制腫瘤的生長。然而，在大多數(shù)情況 下，TAM會發(fā)生某一種改變來協(xié)助惡性的細胞生長，侵襲以及逃避凋亡。一些文獻已經報道， 巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中具有非常重要的作用，目前主要的TAM被認為是M2(⑶llb+F4/80 + CD206+)型的巨噬細胞。M2型巨噬細胞可以促進腫瘤的血管生成，侵襲和轉移。它們同時也 可以通過產生IL-IO來促進免疫抑制。M2型巨噬細胞表達CCL22,招募Treg細胞來抑制CTL的 功能。M2型巨噬細胞在維持腫瘤細胞生長，存活和轉移中起著至關重要的作用。而與之功能 相反的為Ml (⑶llb+F4/80+MHC-n + )型巨噬細胞，Ml型巨噬細胞表達MHC-II分子，表現(xiàn)出吞 噬以及抗原提呈的能力，產生iNOS2，IL-li3以及TNF-α等介導腫瘤細胞的細胞溶解，來發(fā)揮 著細胞殺傷的功能。Ml型巨噬細胞產生IL-12,促進腫瘤中T細胞的活化和增殖，抑制血管生 成，同時也可以將抗原交叉提呈給⑶8+T細胞。Ml型巨噬細胞也可以激活Thl型應答。也就是 說，Ml型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化最終會導致腫瘤生長的促進。因此，基于巨噬細胞不 同亞型在腫瘤中相反的作用，使得在腫瘤微環(huán)境中對巨噬細胞亞型的檢測顯得尤為重要。
[0295] 我們利用流式細胞染色分析了 FATS基因缺陷后黑色素瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中的巨 噬細胞分型情況。結果如圖14顯示，F(xiàn)ATS基因缺陷的小鼠黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中Ml巨噬細 胞的比例顯著的增加（圖14A，B)，而M2型巨噬細胞比例則顯著的減少（圖14C，D)。此外，我們 用⑶206-FITC(⑶206為M2型巨噬細胞的重要表面標記)對腫瘤組織切片進行了免疫熒光染 色，發(fā)現(xiàn)野生型小鼠腫瘤中的CD206顯著多于FATS基因缺陷小鼠（圖14E)。由此，我們的結果 表明，在黑色素瘤腫瘤微環(huán)境中，F(xiàn)ATS基因缺陷后，具有抑制腫瘤功能的Ml型巨噬細胞比例 顯著升高，而具有促瘤作用的M2型巨噬細胞的比例顯著下降，這些結果與FATS基因缺陷小 鼠腫瘤生長受抑制的現(xiàn)象相一致。
[0296] 為了進一步的驗證以上所得到的，關于巨噬細胞亞型在腫瘤微環(huán)境中顯著變化的 結果，我們流式分選了腫瘤組織中的巨噬細胞(F4/80陽性），提取RNA，利用實時定量PCR，檢 測了 Ml型和M2型巨噬細胞所表達的重要基因的表達情況，同時也對Ml型巨噬細胞極化重要 的細胞因子的基因表達進行了檢測。結果如圖15所示，Ml型巨噬細胞所表達基因，IL-12， TNFa和N0S2的基因表達在FATS基因缺陷小鼠的巨噬細胞中增加（圖15A )，而M2型巨噬細胞 表達基因幾-10 48^，1^1(〇)206)以及0(^22降低（圖158)。除此，我們還發(fā)現(xiàn)^六了3基因缺 陷小鼠腫瘤組織中巨噬細胞表達VEGF的量明顯下降。這些結果都進一步證明，F(xiàn)ATS基因缺 陷的小鼠巨噬細胞更傾向于分化為具有抑制血管生成，促進腫瘤殺傷的Ml型巨噬細胞，并 且FATS基因缺陷顯著抑制了促進血管生成，促進腫瘤生長的M2型巨噬細胞的轉化。
[0297] 1.2.6 FATS基因缺陷抑制了小鼠腫瘤組織中的血管生成
[0298] 由于血管生成在腫瘤的生長中有著極為重要的作用，血管的生成可以為腫瘤細胞 輸送營養(yǎng)，并且協(xié)助腫瘤的轉移。已有大量的研究報道，Ml型巨噬細胞可以分泌IL-12,抑制 血管生成，而M2型巨噬細胞則可以通過分泌VEGF促進血管生成，促進腫瘤的生長于轉移。我 們的實驗結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATS基因缺陷的小鼠腫瘤微環(huán)境中主要存在的巨噬細胞為Ml型巨噬細 胞，比例原大于野生型小鼠，同時巨噬細胞表達的VEGF的量也在FATS缺陷后顯著減少。由 此，我們猜測，F(xiàn)ATS基因缺陷后腫瘤的血管生成是否減少。于是我們利用免疫熒光，檢測了 FATS基因缺陷小鼠與野生型小鼠腫瘤組織中的⑶31的表達情況。與預期相一致，相比野生 型小鼠，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠腫瘤組織中的⑶31顯著的減少（圖16)，白色箭頭所指的紅色點 為⑶31陽性，藍色背景為DAPI染色顯示的細胞核。這一結果說明，F(xiàn)ATS基因缺陷后可能通過 影響巨噬細胞的極化，從而影響了腫瘤的血管生成，最終對腫瘤的生長產生了抑制作用。
[0299] 1.3討論
[0300] 近些年來，腫瘤免疫在腫瘤中的作用受到了越來越多的關注。腫瘤的免疫治療可 以特異的破壞腫瘤細胞，免疫系統(tǒng)的功能水平與腫瘤的治療以及預后有著密切的關系。諸 多研究結果顯示，腫瘤微環(huán)境已經成為目前抗腫瘤免疫治療的重要靶點。
[0301] 腫瘤微環(huán)境由腫瘤實質細胞和腫瘤間質細胞組成，其中，間質細胞中的免疫細胞 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著不可或缺的作用。不同的免疫細胞相互作用，例如抗原提呈以及 細胞間通過細胞因子協(xié)同或抑制，來影響腫瘤的生長。免疫細胞相互協(xié)調，發(fā)揮著抵抗病原 菌與腫瘤的作用，然而，腫瘤卻通過改變浸潤在腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞的功能來創(chuàng)造一 個有利于腫瘤生長的環(huán)境，逃避免疫監(jiān)視，產生腫瘤細胞的免疫逃逸。
[0302] 目前研究表明，免疫系統(tǒng)存在著促進腫瘤與抑制腫瘤的雙重作用。上文已經提到， NK細胞，中性粒細胞，γ δΤ細胞，NKT細胞，Th 1細胞，CTL和以及Ml型巨噬細胞，可以對腫瘤產 生強的殺傷作用。
[0303] NK細胞以及中性粒細胞是固有免疫應答細胞，分別通過穿孔素，顆粒酶以及Fas/ FasL以及活性氧等殺傷機制對腫瘤進行直接的抑制。同時，γ δΤ細胞以及NK T細胞也直接 或間接的對腫瘤細胞產生殺傷作用，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著作用。除此之外，諸多研究證 明，T細胞在腫瘤免疫中發(fā)揮著至關重要的作用，初始T細胞可以識別抗原提呈細胞表面的 MHC分子所提呈的短肽進而分化為不同的效應T細胞。CD4+T細胞可以識別MHC-II提呈的抗 原肽，CD8+T細胞可以識別MHC-I提呈的抗原肽。初始的CD4+T細胞經抗原提呈后，根據(jù)活化過 程中微環(huán)境里存在的細胞因子不同，分化為不同亞型的效應輔助性T細胞。輔助性T細胞分 化過程中所分泌的細胞因子又可以影響NK細胞，CTL細胞的細胞的活化。輔助性T細胞包括 Th l，Th 2和Th 17等，它們在腫瘤中有著不同的作用。Th 1細胞產生IFN-γ和幾種其他的 細胞因子可以顯著的促進細胞介導的免疫應答，發(fā)揮著細胞毒性作用，對腫瘤的生長起到 抑制的作用。越來越多的證據(jù)提示，Th 1細胞的活化可以促進CTL的增殖，NK細胞，Ml型巨噬 細胞以及其他具有潛在細胞毒性的效應細胞的活化。另外，CTL是抗腫瘤免疫中的重要的效 應細胞，經過抗原提呈，CTL細胞表現(xiàn)出直接的細胞介導的腫瘤細胞毒性反應。
[0304]我們的研究結果發(fā)現(xiàn)，B16細胞荷瘤后，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的腫瘤發(fā)生率低且成瘤 后腫瘤生長緩慢(圖1)，這提示我們，F(xiàn)ATS基因缺陷很可能影響了腫瘤中腫瘤相關的免疫細 胞。于是我們全面的分析了野生型小鼠與FATS基因缺陷小鼠外周免疫器官和腫瘤免疫微環(huán) 境中免疫細胞的變化。與已知的研究結果相一致，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠抗腫瘤免疫細胞的比 例顯著的增加，在腫瘤微環(huán)境中增加的最為明顯，這就說明，F(xiàn)ATS基因缺陷對腫瘤相關的免 疫細胞確實存在著重要的影響。FATS基因缺陷小鼠腫瘤浸潤的炎性細胞明顯增加（圖2 )，這 與流式檢測發(fā)現(xiàn)的腫瘤中總T細胞比例增加相一致（圖9)。進一步的，F(xiàn)ATS基因缺陷后，γ δΤ 細胞，NK細胞比例增加（圖10)。更為重要的，主要的效應T細胞，Th 1以及CTL的比例也顯著的 增加（圖9，圖12 )，同時，T細胞的活化標記⑶44以及主要效應細胞因子IFN- γ的比例在CTL 細胞中顯著的增加（圖11，圖⑵。這些結果提示，F(xiàn)ATS基因缺陷顯著的增加了腫瘤細胞毒性 應答，這與FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤抑制的結果相吻合。
[0305]我們進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠腫瘤微環(huán)境中Ml型巨噬細胞的數(shù)量顯 著的增多（圖14)。近些年來，隨著對巨噬細胞分型研究的深入，Ml型巨噬細胞腫瘤中的作用 被越來越重視。眾所周知，腫瘤相關的巨噬細胞是組成腫瘤微環(huán)境中的主要細胞之一，對腫 瘤的生長有著十分重要的影響作用。研究發(fā)現(xiàn)，Ml型巨噬細胞表達MHC-II分子，表現(xiàn)出吞噬 以及抗原提呈的能力。同時，Ml型巨噬細胞可以產生促炎性細胞因子，iN0S2，R0S，RNSJL-l β以及TNF-α介導腫瘤細胞的細胞溶解，來發(fā)揮著細胞殺傷的功能。Ml型巨噬細胞產生IL-2 以及IL-12，IL-2可以刺激活化的效應T細胞和NK細胞的增殖，是一個重要的生長因子，參與 著抗原激活的淋巴細胞的增殖以及免疫記憶的產生，而IL-12能夠促進表達IL-12受體的T， NK以及NK T細胞分泌IFN-γ，誘導Thl細胞極化以及CTL的產生，而IFN-γ的增加又可以正 反饋調節(jié)進一步促使Ml型巨噬細胞活性增強，同時IFN-γ可以促進抗腫瘤監(jiān)視，抑制癌基 因活化以及抑制血管生成，也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-12同樣表現(xiàn)出抗血管生成的活性。不僅如此， Ml型巨噬細胞也可以將抗原交叉提呈給⑶8+Τ細胞。由此，Ml型巨噬細胞極化在抗腫瘤免疫 中的作用極為重要，有效的結合了抗腫瘤免疫需要的固有免疫與適應性免疫應答。
[0306]除去對腫瘤具有殺傷的免疫細胞，腫瘤微環(huán)境中也存在著對腫瘤具有促進作用的 免疫細胞。M2型巨噬細胞，MDCS，Treg等免疫抑制細胞可以抑制抗腫瘤免疫反應，使得侵襲 性的腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，對抗腫瘤免疫應答形成了阻礙。
[0307] MDSC是由多種未成熟的髓系細胞組成，具有免疫抑制的功能。MDSC可以通過精氨 酸酶-1，抑制T細胞的功能。同時，MDSC含有的iNOS能抑制T細胞反應。此外，MDSC也可以通過 ROS來抑制T細胞的活化。除此，MDSC干擾IL-2受體信號，阻礙淋巴細胞運輸，促進Treg的活 化，同時可以產生IL-10和TGF-β，對Treg具有誘導作用。Treg在癌癥病人比例增加，研究發(fā) 現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中有大量的Treg細胞的浸潤。Treg細胞表達一系列的抑制分子，例如兒-10，TGF-β，LAG-3，GITR，CTLA-4和PD-1，這些因子可以直接抑制免疫細胞。并且，Tr eg可以抑 制效應T細胞的細胞毒性反應，促進效應T細胞的凋亡。IL-2是活化的效應T細胞存活所必須 的，Tr eg細胞頁可以耗盡局部的IL-2，間接的抑制效應T細胞。
[0308] 與Ml型細胞相對，M2型巨噬細胞促進腫瘤的血管生成，侵襲和轉移。M2型巨噬細胞 表達的CCL22對Treg細胞有招募作用，Treg進一步的抑制CTL的功能，同時，M2型巨噬細胞也 可以通過產生TGF-β和IL-10，將T細胞誘導為Treg或者其他不具有抗瘤活性的T細胞亞型。 M2型巨噬細胞特異性的表達精氨酸酶-1對T細胞的活化進行抑制。M2型巨噬細胞所表達的 精氨酸酶-I(Arg-I)，可以使精氨酸變?yōu)轼B氨酸，不再產生N0,降低了巨噬細胞的殺傷功能。 M2型巨噬細胞在維持腫瘤細胞生長，存活和轉移中起著非常重要的作用。
[0309] 基于以上理論，我們的實驗進一步檢測分析了腫瘤免疫微環(huán)境中免疫抑制細胞的 比例，對FATS基因缺陷調節(jié)腫瘤免疫有了更全面的研究。與已有的研究結果相一致，我們的 實驗結果顯示，在FATS基因缺陷小鼠的腫瘤微環(huán)境中，雖然MDSC的比例在兩組小鼠中沒有 顯著的差異，但是Treg細胞的比例顯著的降低（圖13)，這說明在FATS基因缺陷小鼠中，促進 腫瘤生長的免疫應答被抑制。有趣的是，M2型巨噬細胞的檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠M2型 巨噬細胞比例顯著的低于野生型小鼠的M2型巨噬細胞，免疫熒光染色也得到了一致的結果 (圖14)，這一結果提示，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的腫瘤微環(huán)境中，存在著巨噬細胞極化的不同， 也就是說，F(xiàn)ATS基因缺陷可能顯著的促進了抗腫瘤免疫的Ml型巨噬細胞的極化，抑制了 M2 型巨噬細胞的極化。
[0310] 我們知道，腫瘤免疫微環(huán)境中，巨噬細胞極化的不同(M1/M2)對腫瘤的發(fā)生發(fā)展中 有著深遠的影響。一些研究顯示，腫瘤中的巨噬細胞與無菌傷口中的巨噬細胞功能相似，并 沒有表現(xiàn)出殺傷活性，具有促進生長的作用。隨著研究的深入，最近的研究提示，巨噬細胞 根據(jù)免疫條件的不同，可以極化為不同表型的巨噬細胞，也就是說，微環(huán)境的刺激可以使巨 噬細胞極化為Ml型，也可以極化為M2型巨噬細胞，當腫瘤免疫微環(huán)境中的M2型巨噬細胞被 調節(jié)，轉變?yōu)镸l型巨噬細胞時，腫瘤生長就會受到明顯的抑制。在人類腫瘤與不同的小鼠腫 瘤模型的研究中均已經發(fā)現(xiàn)，將巨噬細胞表型由促腫瘤的M2型轉變?yōu)榭鼓[瘤的Ml型，可以 顯著的抑制腫瘤的生長。
[0311 ] 在本次研究中，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的巨噬細胞中Ml型巨噬細胞表達IL-12，TNF-α， N0S2明顯高于野生型小鼠，同時M2型巨噬細胞表達的六找-1，1代1以及〇(^22在野生型小鼠 中明顯高于FATS基因缺陷小鼠（圖15)。腫瘤小鼠的血清ELISA檢測也發(fā)現(xiàn)，Ml型巨噬細胞分 泌的IL-Ιβ，TNF-a，IL-12以及促進正反饋Ml巨噬細胞活化的IFN- γ在FATS基因缺陷小鼠中 顯著增加，同時，M2型巨噬細胞所分泌的IL-IO的含量下降（圖8)。這些結果都提示，F(xiàn)ATS基 因缺陷后，小鼠腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞更傾向于極化為對腫瘤有抑制作用的Ml殺傷型巨 噬細胞，Ml型巨噬細胞的增加，M2型巨噬細胞的減少是FATS基因缺陷后抑制黑色素瘤生長 的潛在的細胞機制。研究顯示，Ml型巨噬細胞通過多種機制對血管生成有著顯著的抑制作 用，而M2型巨噬細胞則會明顯的促進血管生成，這也是腫瘤能得以生長的必要因素，我們的 結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠腫瘤中巨噬細胞表達VEGF的量顯著下降，腫瘤切片CD31染色 顯示了一致的結果，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠腫瘤組織中⑶31表達極低（圖16)。這也就是說，F(xiàn)ATS 基因缺陷對黑色素瘤的抑制可能是通過促進Ml型巨噬細胞極化，直接殺傷腫瘤細胞，一致 腫瘤組織血管生成，并促進細胞毒性T細胞的增殖，對腫瘤進一步的抑制和殺傷。
[0312] 我們的結果提示，腫瘤效應的T細胞比例的增加與Μ1/Μ2型巨噬細胞極化的改變可 能是FATS基因缺陷后抑制小鼠黑色素瘤生長的可能原因，為我們進一步的FATS基因影響黑 色素瘤的機制研究提供了有力依據(jù)。
[0313] 二、FATS基因缺陷對小鼠黑色素瘤調節(jié)作用的細胞與分子機制
[0314] 2.1對象和方法
[0315] 2.1.1主要材料、試劑與儀器設備
[0316] 2.1.1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)液 美國GIBCO公司 RPMI 1640培養(yǎng)液 美國GIBCO公司 胎牛血清（FBS) 美國GIBCO公司 雙抗 rPeniciIIin-Strcptomycin) N GIBCO 公），'J 0.25%胰蛋白酶+EDTA 美國GIBCO公司 磷酸鹽緩沖液（PBS) 上海索來寶公司 二甲基亞砜（DMSO ) 美國Sigma公司 麻醉藥 美國Sigma公司 巰基乙醇酸鹽（TG) 美國BD公司 Permeabilizaiion wash 緩丨1Ii液 .Ail 丨、:i eBioscience 公）丨1
[0317]固定緩沖液（Fixationbuffer) 美國 eBioscience 公司 細胞凋亡檢測試劑盒：AnnexinVM 中國三箭生物公司 assay kil NO檢測試劑盒 中國碧云天公司 IL-2 ELISA檢測試劑盒 中國聯(lián)科生物公司 CFSE 美國 Iiwitrogen 公司 TRIZOL 美國 Invitrogen 公司 M-MLV Reverse Transcriptase .? 丨丨;:丨 Irivitrogen 公nj Rca丨-丨 imePCR 定丨 i i: U 劑;?? BDI 003?? 德國美天旎公司 多聚甲酸（PFA) 美國Sigma公司 Radio-inimunoprecipilaiion assay burfer -X:丨丨、:丨 Sigma 公.丨丨I (RIPA) FJhcnyimclhancsulIbnyl iluoridc (PMSF) :I.丨;:丨 Sigma 公 Wj QPI 美國Sigma公司
[0318] 脂多糖（LPS ) 美國Sigma公司 脫脂奶粉 天津博美科生物技術有限公司 Bradford蛋白定量試劑盒 北京博邁德科技發(fā)展有限公司
[0319] 2.1.1.2 細胞系
[0320] B16 細胞
[0321] 2.1.1.3細胞因子
[0322] M-CSF 美國 R&D 公司
[0323] IL-4 美國 R&D 公司
[0324] IFN-γ 美國R&D公司
[0325] 2.1.1.4抗體 Clcavcd-caspase 3 戈 I i;:i Cell Signaling Technology 公 Be丨2 -.XiN Proicdi 公）丨I P65 ..λ? I 丨;:丨 Cell Signaling Techno丨ogy 公）ij !κΒα .? I 卜:丨 Cell Signaling Technologv 公i'J
[0326] β-actm 中國三箭生物公司 HistoneS 中國三箭生物公司 HRP-coniUgalccl goal anti-mouse IgG Ah 戈丨丨、:丨 Cell Signaling Technology 公）【.J HRP-conjugatcd goat anti-rabbit IgG Ab .Ji 11':丨 Cell Signaling Technology 公！「J
[0327] 2.1.1.5引物序列
[0329] 2.1.1.6主要儀器 超凈工作臺 蘇凈安泰公司 倒置顯微鏡 日本Olympus公司 細胞培養(yǎng)板. 美國Coming公司 細胞培養(yǎng)皿 美國Coming公司 一次性15ml/50ml離心管 美國Coming公司 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱 Sanyo公司 Iml注射器 上海治宇醫(yī)療器械有限公司 細胞過濾器（40 μπι) 美國BD公司
[0330] Eppendorf5804 高速離心機 美國 Eppendorf 公司 Eppendorf5804迷你離心機 美國Eppendorf公司 FACSC6流式細胞儀 美國BD公司 超微量核酸蛋白含量測定儀 美國Thermo Scientific公司 凝膠成像系統(tǒng) BIORAD 96孔O.lmL的實時定量PCR板 ABI公司 酶標儀 美國BiotekEpoch PVDF膜 瑞士 Roche公司 電泳儀DYY-6C型 北京市六一儀器廠
[0331] 2.1.2試劑配制
[0332] 2.1.2.1 0.01M PBS：
[0333] 分別稱取 Na2HP〇4(1.54g)，KH2P〇4(0.2g)，NaCl(8.0g)，KCl(0.2g)，加入到超純水 中，充分溶解，定容至100mL，調節(jié)PH值(7.2-7.4)。高壓滅菌，于4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0334] 2.1.2.2配制CFSE:
[0335] 1)CFSE是一種熒光染料，可以穿透細胞膜，經常被用來檢測細胞的增殖情況本身 并不帶有熒光的CFSE在標記細胞后，細胞內的醋酶將其分解，從而產生高強度的熒光。這種 熒光產物可以與細胞內的氨基結合，并長時間存留與胞內。隨著細胞的分裂，CFSE被平均分 配至子代細胞中，隨之子代細胞的熒光強度下降為母代細胞的一半。因此，CFSE熒光強度的 高低直接與細胞分裂的次數(shù)相關。
[0336] 2)將Img的CFSE溶解于1，800μ1的DMSO中，分裝并于-20°C進行保存。使用時，可用 無血清培養(yǎng)基，1倍PBS或其他緩沖液將其稀釋使用(具體濃度根據(jù)實驗要求而定）。
[0337] 2.1.2.3抗體稀釋液：
[0338] 1)抗體稀釋液的組成成分為0.2 %牛血清白蛋白（BSA)，0.1 %疊氮鈉(NaN3)以及1 倍 PBS;
[0339] 2)將稱取的0.2mg BSA和吸取的Iml 10%的NaN3加入到100mL的1倍PBS中，攪拌， 使其完全溶解，于4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0340] 2.1.2.4 4%多聚甲醛：
[0341] 1)稱取2g多聚甲醛加入到45ml超純水中，加入lmol/L的NaOH;
[0342] 2)56°C過夜使其完全溶解；
[0343] 3)冷卻至室溫后，加入5ml 10倍PBS;
[0344] 4)加入lmol/L的CaCl2和MgCl2各50ul;
[0345] 5)將PH值調至7.3，4°C避光保存。
[0346] 2 · 1 · 2 · 5細胞磁珠分選用的緩沖液(0 · 5%BSA/PBS):
[0347] 1)分選用緩沖液組成成分為BSA和HfPBS
[0348] 2)配制10%BSA，用1倍PBS稀釋20倍，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0349] 2.1.2.6 RIPA裂解液：
[0350] I )RIPA的組成成分為50mmol/L的Tris(Mff 121 · 14，PH7 · 5)，150mmol/L的NaCl，1 % Tr i tonX-100，I % 脫氧膽酸鈉以及0 · I % SDS;
[0351] 2)稱取Tris 3.02g，NaCl 4.38g，TritonX-100 5ml，脫氧膽酸鈉5g，SDS 0.5g，加 超純水至500ml，調節(jié)pH值，至7.5。充分混勻后，保存于4°C備用，長期保存則應存于_20°C ; [0352] 3)使用時，加入蛋白酶抑制劑cooktail。
[0353] 2.1.2.7蛋白酶抑制劑：
[0354] 1)蛋白酶抑制劑cooktail，所需母液成分：
[0355] ①lOOmmol/L的PMSF:稱取17 · 4mg的PMSF，加入1ml的異丙醇。充分溶解后，分裝于 1.5ml離心管中，于-20°C保存；
[0356] @抑肽素六口1'〇1:;[11；[11(211^/1111):保存于4<€;
[0357] 2)配制：
[0358] ①PMSF:終濃度為lmmol/L，即母液稀釋100倍使用；
[0359] ②Aprotinin :終濃度為lμg/ml，即母液稀釋2000倍使用。
[0360] 2.1.2.8免疫印跡上樣用試劑：
[0361 ] 1)濃縮上樣緩沖液(4倍）：
[0362] 將0.8g SDS，0.04g溴酚藍，4ml甘油以及 1.0mol/L的Tris-HC1(PH 6.8)加入到去 離子水中，定容至IOml，充分混勻后，分裝于1.5ml EP管中，保存于4°C，使用時需稀釋為1 倍。
[0363] 2) 1.0 mol/L的二硫蘇糖醇(DTT，10倍濃縮液）：
[0364] 將3.09g DTT溶解于20ml的O.OlmoVL乙酸鈉溶液(PH為5.2)中，分裝于1.5ml EP 管中，保存于_20°C，使用時需稀釋為1倍。
[0365] 2.1.2.9配膠用工作液
[0366] 1)濃縮膠緩沖液（1.0mol/L Tris-HCl，pH 6.8)
[0367] 將12.114g Tris(MW121.14)加入到100ml蒸餾水中，充分溶解后，加入濃鹽酸將PH 值調至6.8,保存于4°C備用；
[0368] 2)分離膠緩沖液（1.5mol/L Tris-HCl，pH 8.8):
[0369] 將18.671g Tris(MW121.14)加入到100ml蒸餾水中，充分溶解后，加入濃鹽酸將PH 值調至8.8,保存于4°C備用；
[0370] 3)10%十二烷基硫酸鈉（SDS):
[0371] 將IOg SDS加入到IOOrnl蒸餾水中，充分溶解，如溶解時困難，可于50°C下水浴溶 解，保存于室溫。長期保存過程中出現(xiàn)沉淀，只需水浴溶解，不影響使用。
[0372] 4) 10%過硫酸銨(AP):
[0373] 將0.1 g過硫酸胺加入到Iml蒸餾水中，充分溶解，分裝于0.2ml EP管中，保存于-20 cC。
[0374] 5)30%丙烯酰胺:保存于4°C。
[0375] 6)四甲基乙二胺原液(TEMED):保存于4°C。
[0376] 2.1.2.10免疫印跡所用緩沖液
[0377] 1)跑膠緩沖液：
[0378] 10倍濃縮電泳液緩沖液，稱取144g的甘氨酸，30.2g的Tris_base，10g的SDS，充分 溶解于超純水中，定容至1L，室溫保存，使用時稀釋為1倍。
[0379] 2)轉膜緩沖液：
[0380] 1倍轉膜緩沖液，稱取14.4g的甘氨酸和3.02g的Tris-base，充分溶解于超純水中， 定容至800ml，加入甲醇200ml使用。
[0381] 3) 10倍TBS緩沖液：
[0382] 10倍濃縮TBS緩沖液，稱取80g的NaCl和24.2g的Tris-base，充分溶解于超純水中， 定容至IL，使用濃鹽酸調節(jié)PH值，7.6,室溫保存。
[0383] 4)1倍TBST緩沖液：
[0384] 吸取100ml 10倍的濃縮TBS緩沖液，加入超純水，定容至1L，最后加入Tween-20,充 分混勻；由于Tween-20較為粘稠，吸取時應非常緩慢，防止產生氣泡，溶解時要不斷用玻璃 棒攪動，以防Tween-20迅速沉于燒杯底部;室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0385] 5)封閉液/抗體稀釋液(5%脫脂牛奶）：
[0386] 稱取脫脂奶粉5g，充分溶解于100mL的1倍TBST緩沖液中，一周內使用可保存于4 °C，長期保存可放于-20°c。
[0387] 2.1.3實驗方法
[0388] 2.1.3.1異位小鼠黑色素瘤模型構建(具體步驟詳見1.1.3.2.2)
[0389] 1)脫去小鼠右后背部的毛脫去，用75%酒精對小鼠注射部位進行消毒；
[0390] 2)將B16細胞懸液(2X106/ml)注射到小鼠右后背部（100μΙ/只）
[0391] 3)荷瘤后20天，麻醉后脫頸處死小鼠，分離小鼠的腫瘤組織，用于分選巨噬細胞。
[0392] 2.1.3.2巨噬細胞與T細胞混合細胞培養(yǎng)：
[0393] 2.1.3.2.1腫瘤組織巨噬細胞分選
[0394] 1)分離小鼠腫瘤單個核細胞(具體過程詳見1.1.3.3.2);
[0395] 2)細胞懸液中加入大鼠抗小鼠熒光標記抗體，F(xiàn)4/80-FITC;
[0396] 3)Aris III流式細胞儀對標記了F4/80-FITC的細胞進行分選；
[0397] 4)培養(yǎng)在含有10%血清的無菌1640培養(yǎng)基中，備用。
[0398] 2 · 1 · 3 · 2 · 2小鼠 CD3+T 細胞分選
[0399] 1)取正常野生型C57小鼠脾臟，分離單個核細胞(具體過程詳見1.1.3.3.1);
[0400] 2)細胞計數(shù)；
[04011 3)細胞中加入磁珠分選緩沖液3-5ml，300g離心，lOmin，完全吸除上清；
[0402] 4)加入磁珠分選緩沖液(是加入磁珠的10倍體積)和⑶3+磁珠（10μ1/IO7個細胞）， 混勻，4°C，靜置15min，中間取出來混勻一次；
[0403] 5)加入磁珠分選緩沖液20ml，300g離心，lOmin，完全吸除上清；
[0404] 6)每IO8個細胞加入500μ1的分選緩沖液，緩慢滴加到預先用分選緩沖液洗過的分 選柱；
[0405] 7)將分選柱放置在無菌的15ml離心管上，加入2ml含有10%FBS的1640培養(yǎng)基，快 速將粘附在柱子上的細胞洗出，計數(shù)，洗出的細胞即為CD3+的T細胞，培養(yǎng)備用。注:實驗全 程在冰上進行，可提高分選效率。
[0406] 2.1.3.2.3 CFSE染色
[0407] 1)重懸分選的⑶3+T細胞，調整細胞濃度為I X IOfVml;
[0408] 2)每ml細胞中加入2μ1 CFSE貯存液，混勻，終濃度為ΙΟμΜ;
[0409] 3)37°C 孵育，IOmin;
[0410] 4)取出，加入5倍體積的預冷的培養(yǎng)基，終止染色；
[0411] 5)冰上孵育，5min;
[0412] 6)1300rpm，離心，5min;
[0413] 7)用含有 10%FBS 的 1640培養(yǎng)基 1300rpm，離心，5min，洗3次；
[0414] 8)重懸細胞，根據(jù)實驗需求調整細胞濃度。
[0415] 2.1.3.2.4巨噬細胞與T細胞混合培養(yǎng)
[0416] 1)流式分選出的巨噬細胞用絲裂霉素C(5ygAU)處理，每IX IO6細胞加入絲裂霉 素12.5μ1，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min;
[0417] 2)加入含有10%FBS的1640培養(yǎng)基洗3次，細胞計數(shù)；
[0418] 3)與⑶3+T細胞共培養(yǎng)4天，巨噬細胞與T細胞比例為1:4,培養(yǎng)中間2-3天補液50-100μΙ；
[0419] 4)培養(yǎng)結束后收取細胞，與直接固定未經傳代的母帶T細胞一起，流式細胞儀上機 檢測CFSE表達情況。
[0420] 2.1.3.3巨噬細胞與Β16細胞混合培養(yǎng)：
[0421] 2 · 1 · 3 · 3 · 1腫瘤組織巨噬細胞分選：
[0422] 具體過程詳見2.1.3.2.1
[0423] 2 · 1 · 3 · 3 · 2巨噬細胞與Β16細胞混合培養(yǎng)
[0424] 1)流式分選出的巨噬細胞用絲裂霉素C(5ygAU)處理，每IX IO6細胞加入絲裂霉 素12.5μ1，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min;
[0425] 2)加入含有10%FBS的1640培養(yǎng)基洗3次，細胞計數(shù)；
[0426] 3)收B16細胞，計數(shù)；
[0427] 4)巨噬細胞與B16細胞共培養(yǎng)1天，巨噬細胞與B16細胞比例為40:1;
[0428] 5)培養(yǎng)結束后收取細胞，流式細胞儀上機檢測B16細胞的凋亡情況。
[0429] 2丄3.4 T細胞增殖實驗
[0430] 1)用抗CD3和CD28的抗體包被48孔板(濃度為抗CD3,5μg/ml;抗CD28，lμg/ml)，4°C 過夜；
[0431 ] 2)分選⑶3陽性T細胞(具體步驟詳見2.1.3.2.2);
[0432] 3)細胞計數(shù)，CFSE染色(具體步驟詳見2.1.3.2.3);
[0433] 4)培養(yǎng)于包被好的46孔板中，每孔IO6個T細胞；
[0434] 5)培養(yǎng)上清為混合了B16培養(yǎng)上清的1640培養(yǎng)基或者是普通1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 天，流式細胞術檢測CFSE的表達情況。
[0435] 2.1.3.4骨髓細胞分離：
[0436] 1)麻醉后，脫頸處死小鼠，用75%酒精消毒雙下肢，固定后剪開皮膚，分離肌肉組 織，暴露脛骨，保留兩側關節(jié)，將脛骨取出，迅速置于冷的1倍PBS中；
[0437] 2)去掉骨面上殘余的組織，置于超凈工作臺中，沿關節(jié)剪開股兩端，暴露出髓腔， 用Iml注射器吸取1倍的PBS，將骨髓沖至培養(yǎng)皿中，反復沖洗，直至脛骨全部變?yōu)榘咨?br>[0438] 3)用Iml的槍將骨髓吹散至單細胞狀態(tài)，隨后收集細胞懸液至無菌的15ml離心管 中，1000 rpm，離心，5min;
[0439] 4)棄上清，加入 Iml 1 倍的 PBS，1000rpm，離心，5min;
[0440] 5)棄上清，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)箱中。
[0441] 2.1.3.5巨噬細胞定向分化：
[0442] 1)分離出的骨髓細胞加入M-CSF (10ng/ml)培養(yǎng)5天，此時的細胞為MO型巨噬細胞 (培養(yǎng)第三天需半量換液）；
[0443] 2)M1型巨噬細胞極化:MO型巨噬細胞加入IFN-γ (20ng/ml)培養(yǎng)12h，隨后加入LPS (100ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h，即為Ml型巨噬細胞；
[0444] 3)M2型巨噬細胞極化:MO型巨噬細胞加入IL-4(20ng/ml)培養(yǎng)16h，即為M2型巨噬 細胞。
[0445] 2.1.3.6巨噬細胞分型檢測：
[0446] 1)收取待檢測的細胞，1500rpm，離心，5min;
[0447] 2)棄上清，加入1ml 1倍的PBS，重懸細胞，1500rpm，離心，5min;
[0448] 3)棄上清，分出空白管，單染管以及同型對照檢測管，與檢測管一起，加入1倍PBS， 使每管大約1〇〇μ1;
[0449] 4)封閉：每管加入25μ1的流式抗體封閉液，4°C避光，30min;
[0450] 5)表面染色:每管按照實驗設計分別加入大鼠抗小鼠熒光標記抗體和同型對照抗 體：
[0451 ]①M1 型巨噬細胞：CD 11 b-F ITC/MHC- II-PE/F4/80-APC
[0452] CDllb-FITC/CDllc-PE/F4/80-APC
[0453] ② M2 型巨噬細胞：CD206-FITC/CDllb-PE/F4/80-APC
[0454] 6)4°C 避光，30min;
[0455] 7)每管加入1ml的1倍PBS重懸，1500rpm，離心，5min，洗滌2次；
[0456] 8)棄上清，每管加入4%多聚甲醛或者固定緩沖液50-100μ1固定；
[0457] 9)流式細胞儀上機檢測(短時間可保存于4°C)。
[0458] 2.1.3.7細胞凋亡檢測
[0459] 細胞凋亡檢測使用的是細胞凋亡檢測試劑盒:Annexin V/PI assay kit，主要步 驟包括：
[0460] 1)將試劑盒中的Binding緩沖液用超純水稀釋10倍，備用；
[0461 ] 2)收細胞，用冷的1倍PBS洗一遍（1500rpm，離心，5min);
[0462] 3)棄上清，用Iml稀釋的Binding緩沖液重懸細胞，1500rpm，離心，5min;
[0463] 4)分出空白管和兩管單染管；
[0464] 5)每管加入5μ1 的Annexin V-FITC/APC，室溫避光IOmin;
[0465] 6)每管加入5μ1的PI-PE，室溫避光5min;
[0466] 7)每管加入200μ1的Binding緩沖液，流式細胞儀檢測（lh之內）。
[0467] 2 · 1 · 3 · 8細胞RNA提取(具體步驟詳見1 · 1 · 3 · 7)
[0468] 1)將凍存于-80°C冰箱的加有Trizol的骨髓定向分化的M1/M2型細胞取出，室溫融 化，渦旋15s混合均勻，室溫靜置IOmin;
[0469] 2)每管加入氯仿，靜置；
[0470] 3)離心，取上清，移至新的無RNA酶管中；
[0471] 4)加入與上清同等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，在冰上靜；
[0472] 5)離心，棄上清，加入無水乙醇，混勻，離心，棄上清，吸出殘余液體，室溫晾干；
[0473] 6)加入無RNA酶水，溶解RNA，可長期保存于-80 °C ;
[0474] 7)瓊脂糖膠，跑膠鑒定；
[0475] 8)Nanodrop 測定 RNA 濃度。
[0476] 2.1.3.9RNA 反轉成 cDNA
[0477] 1)反轉錄使用試劑盒，M-MLV Reverse Transcriptase(InvitrogenTM,by life technologies?)；
[0478] 2)主要反轉步驟詳見I · I · 3 · 8。
[0479] 2.1.3.10 實時定量 PCR
[0480] 1)2(^1體系包括：1(^1的9?0?1^8七6^1丨1，正反定量引物各0.5以1(1(^]\〇，。0嫩叫 1，尺(^0.4以1，超純水7.641 ;
[0481 ] 2)ABI 7500Fast進行實時定量PCR檢測。
[0482] 2.1.3.11細胞蛋白提取
[0483] 1)收取細胞(不能使用胰蛋白酶），1200-1300rpm離心，5min，棄上清；
[0484] 2)加入1ml 1倍的PBS吹打沉淀細胞，轉移細胞懸液至1.5ml的EP管中，1300-1500rpm離心，5min，盡量干凈的棄掉上清；
[0485] 3)用加有PMAF和OPE的RIPA裂解液吹打細胞，根據(jù)細胞的多少調整RIPA裂解液的 用量，冰上靜置30min;
[0486] 4)14000印111，4°〇離心，15111；[11，吸取上清，分裝在0.2111]^/^?管中。
[0487] 2.1.3.12蛋白濃度檢測
[0488] 1)標準蛋白稀釋10倍使用；
[0489] 2)取8個0.2ml 的 EP管：
L〇491」3)配工作液:A液：B液為50:1，上卜難倒混習；
[0492] 4)在96孔板中加入200μ1/孔的工作液，隨后在工作液中加入配好的標準蛋白和稀 釋好的蛋白；
[0493] 5)37。(：放置3〇11^11;
[0494] 6)酶標儀檢測OD值(595nm)〇
[0495] 2.1.3.13免疫蛋白印記：
[0496] 1)10 %分離膠的配制（IOml): 超純水 4 ml 分離膠緩沖液 2.5 ml
[0497] 30 %丙烯酰胺溶液 3,3 ml 10 % SDS 0.1 nil 10 %過硫酸氨 CLlml.. TEMED 0.004 ml
[0498] 2) 12%分離膠的配制： 超純水 3.3 m! Γη,ηη? 分離膠緩沖液 2.5 mi
[0499] 30 %丙烯酰胺溶液 4 ml 10 % SDS 0.1ml F ^ 10 %過硫酸氨 0,1ml
[0500] TEMED 0.004 ml
[05011 3)5%濃縮膠的配制(6ml): 超純水 4.1 ml 濃縮膠緩沖液 0.75 mi 30 %丙烯酰胺溶液 I ml
[0502] 10% SDS 0.06 m! 10 %過硫酸氨 〇.〇() ml TEMED 0.006 ml
[0503] 4)電泳：
[0504] ①蛋白上樣:取25-30yg蛋白，加入濃縮上樣緩沖液和超純水(緩沖液最后稀釋為1 倍），混勻，99 °C變性，5min，取出后加到已經事先裝在電泳儀上的免疫印跡膠孔中，倒入跑 膠緩沖液；
[0505]②打開凝膠電泳儀的電源，設置電壓80V(當?shù)鞍着苤练蛛x膠時更換電壓至100V);
[0506]③當溴酚藍染料的前緣跑至分離膠的下緣結束電泳。
[0507] 5)轉膜：
[0508]①小心取出凝膠，將其浸泡于轉膜緩沖液中；
[0509]②剪大于膠塊的PVDF膜，在無水甲醇中活化30s后浸泡于轉膜緩沖液中待用；
[0510]③按順序在轉移夾內放置預先經轉移緩沖液浸泡的海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾 紙、海綿，夾好轉移夾，確保每層之間沒有氣泡；
[0511 ]④將轉移夾放入轉移槽，膜在正極、膠在負極，打開電源，89V穩(wěn)壓轉移60min。 [0512] 6)封閉：
[0513] 把PVDF膜浸入封閉液中，室溫搖動Ih。
[0514] 7)洗膜與雜交：
[0515] ①加入第一抗體:按照單抗說明書，稀釋于抗體稀釋液中，將有蛋白的PVDF膜放入 第一抗體中，4°C搖動過夜；
[0516] ②用 TBST 洗膜，5-10min，3次；
[0517] ③加入第二抗體:辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔或鼠IgG抗體（1:2000稀 釋），將有蛋白的PVDF膜放入第二抗體中，室溫搖動2h;
[0518] ④用TBST 洗膜，IOmin，3次。
[0519] 8)曝光：
[0520] ①將化學發(fā)光試劑盒中的兩種試劑按1:1的比例混勻，滴加在保鮮膜上；
[0521] ②用濾紙將PVDF膜上的TBST吸凈，蛋白面朝下，放置在反應液上，30s;在暗室中與 硝酸纖維素膜搖動孵育Imin;
[0522] ③用濾紙吸凈膜上的反應液，蛋白面朝上，用保鮮膜包好，放置在壓片盒中；
[0523] ④進入暗室，用感光膠片在壓片盒中曝光，曝光時間視具體實驗而定；
[0524]⑤曝光后的感光膠片在顯影液中顯影，隨后在定影液中定影，用水沖洗晾干；
[0525] 2.1.3.14 ELISA檢測
[0526] 1)樣品制備:收集共培養(yǎng)細胞(T細胞與巨噬細胞)與培養(yǎng)上清，1500rpm離心，取上 清；
[0527] 2)各取100μΙ的6個標準品，依次加入到包被好的微孔板中，做好標記；
[0528] 3)將處理過的樣品依次加入微孔板中，每孔100μΙ;
[0529] 4)在微孔板上覆膜，放置于37°C，孵育60min，棄掉微孔中的液體，并用衛(wèi)生紙吸凈 殘余液體；
[0530] 5)用事先按照說明書稀釋好的清洗液清晰微孔板5次；
[0531] 6)每孔加入底物I，每孔各50μ1，再加入底物II，每孔各50μ1，充分混勻，室溫下避 光，15min;
[0532] 7)每孔加入終止液50μ1，充分混勻，終止反應；
[0533] 8)酶標儀檢測OD值(450nm)〇
[0534] 2.1.3.15 NO檢測
[0535] 1)將標準樣品用培養(yǎng)基稀釋至lmM(原液為1M);
[0536] 2)取9個0.2ml 的 EP管：
[0538] 3)在96孔板中，加入標準品和樣品，每孔各加50μ1;
[0539] 4)以上每孔各加入溶液Ι50μ1，溶液ΙΙ50μ1;
[0540] 5)室溫，避光，放置30min;
[0541 ] 6)酶標儀檢測OD值（540nm)。
[0542] 2.1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計
[0543] 本研究全部數(shù)據(jù)都來自至少三次獨立的實驗，實驗數(shù)據(jù)均用means 土 SD表示，均輸 入Excel建立數(shù)據(jù)庫，分析采用采用SpSS13.0統(tǒng)計軟件。組內比較采用概率計算應用 Student's unpaired t-test,以ρ〈0·05表示差異有統(tǒng)計學意義（*，Ρ〈0·05;**，Ρ〈 0.01;***，Ρ〈0·001)。統(tǒng)計圖均由GraphPad Prism Version 5.0(GraphPad Software Inc， San Diego CA)完成。流式數(shù)據(jù)米用Modifit以及FlowJo 7.6. lsoftware(Tree Star，Inc， USA)進行分析。
[0544] 2.2 結果
[0545] 2.2.1 FATS基因缺陷小鼠T細胞體外增殖與野生型小鼠相比沒有明顯區(qū)別
[0546] 我們的體內研究結果發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤小鼠的外周免疫器官與腫瘤免疫微環(huán)境中， FATS基因缺陷明顯增加了 CTL細胞的比例，并且CTL的活化與功能都顯著的增強（圖5，9， 11)。同時也發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞亞型(Ml和M2型巨噬細胞)在FATS基因缺陷小鼠與野生型小鼠的 腫瘤免疫微環(huán)境中的變化顯著（圖14)。眾所周知，Ml型巨噬細胞在固有免疫殺傷和適應性 抗原呈遞中都有不可或缺的作用。由此我們猜測，F(xiàn)ATS基因缺陷可能通過增加Ml型巨噬細 胞比例，減少M2型巨噬細胞比例來影響巨噬細胞的抗原呈遞功能從而影響了腫瘤免疫微環(huán) 境中的T細胞的增值，也可能是FATS基因缺陷小鼠的T細胞本身存在著強的增殖能力，或者 這兩個因素在黑色素瘤腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用。
[0547] 為了深入的研究FATS基因可以直接的影響哪一種免疫細胞功能，即FATS基因缺陷 抑制黑色素瘤生長的細胞機制，我們首先對野生型小鼠以及FATS基因缺陷小鼠的T細胞進 行了增殖檢測。我們分離出野生型以及FATS基因缺陷小鼠的⑶3+T細胞，CFSE染色后，用B16 細胞培養(yǎng)上清或者含有10%FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，4天后用流式細胞術檢測T細胞的增殖 情況。如圖17所示，無論使用普通培養(yǎng)基還是Bl 6細胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的T 細胞的增殖指數(shù)(PI)與野生型小鼠均沒有明顯的差別，這一結果提示，F(xiàn)ATS基因缺陷可能 并沒有直接導致T細胞的增殖能力的增強，也就是說，F(xiàn)ATS基因缺陷后對黑色素瘤的抑制作 用可能是通過影響巨噬細胞分型轉變來實現(xiàn)的。
[0548] 2.2.2 FATS基因缺陷小鼠黑色素瘤中巨噬細胞促進了T細胞的增殖
[0549] 研究表明，M1型巨噬細胞表達MHC-II，具有抗原提呈的能力，參與固有以及適應性 免疫，促進腫瘤效應T細胞的增殖;相反的，M2型巨噬細胞在促進腫瘤的生長有著重要的作 用，其比例的增加會抑制T細胞的增殖。由于我們發(fā)現(xiàn)，雖然在腫瘤微環(huán)境中，F(xiàn)ATS基因缺陷 后T細胞的比例顯著的增加，但是FATS基因缺陷的T細胞在體外增殖實驗中卻沒有表現(xiàn)出強 的增殖能力，與野生型T細胞差別不大（圖17)，于是我們進一步檢測了腫瘤微環(huán)境中巨噬細 胞的提呈能力，探究FATS基因缺陷的巨噬細胞是否是引起T細胞在腫瘤環(huán)境中增多的一個 原因。我們將流式分選出的兩組小鼠腫瘤組織中的巨噬細胞與標記了 CFSE的沒有荷瘤野生 型小鼠的CD3+T細胞進行共培養(yǎng)。培養(yǎng)4天后流式檢測T細胞的增值情況。實驗結果顯示，相 比野生型小鼠腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞更加 顯著的促進了T細胞的增值（圖18A)，同時，我們對培養(yǎng)上清中的IL-2進行了檢測，發(fā)現(xiàn)與 FATS基因缺陷巨噬細胞共培養(yǎng)的上清中，IL-2的表達增高（圖18B)，這也進一步驗證了T細 胞增殖在與FATS基因缺陷的巨噬細胞共培養(yǎng)后增加。這些結果表明，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的 腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞相較野生型小鼠，表現(xiàn)出了強大的抗原呈遞能力，也進一步說明， FATS基因缺陷后，腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞主要為促進T細胞增殖的Ml型巨噬細胞。
[0550] 2.2.3 FATS基因缺陷小鼠腫瘤中的巨噬細胞對Bl6細胞具有更強的直接殺傷作用
[0551] 我們知道，Ml型巨噬細胞除去抗原呈遞，促進T細胞增殖功能外，在固有免疫中亦 有著重要的作用，它們可以產生N0,對細胞進行直接的殺傷。而M2型巨噬細胞不產生N0,對 細胞不再具有殺傷作用?；谖覀円呀浀玫降膶嶒灲Y果，我們進一步檢測了 FATS基因缺陷 后，巨噬細胞是否表現(xiàn)出Ml型的細胞殺傷能力。我們用流式分選出野生型以及FATS基因缺 陷小鼠黑色素瘤組織中的巨噬細胞，并將它們與B16細胞共培養(yǎng)，1天后檢測B16的凋亡。結 果如圖19所示，與FATS基因缺陷的巨噬細胞共培養(yǎng)的B16細胞凋亡增加（圖19A，B)，同時我 們對共培養(yǎng)上清中的NO進行了檢測，相一致的，F(xiàn)ATS基因缺陷巨噬細胞共培養(yǎng)上清中NO的 含量顯著的增加（圖19C)，進一步說明，F(xiàn)ATS基因缺陷的巨噬細胞具有更為強大的細胞殺傷 能力，也就是說明，F(xiàn)ATS基因缺陷的巨噬細胞更偏向于具有殺傷能力的Ml型巨噬細胞這與 我們的體內結果相統(tǒng)一。
[0552] 2.2.4 FATS基因缺陷促進了骨髓細胞向Ml型巨噬細胞分化，同時抑制了M2型巨噬 細胞分化
[0553] 我們以上的實驗結果表明，F(xiàn)ATS基因缺陷可能直接影響了巨噬細胞的分型，即抑 制了Ml型巨噬細胞向M2型巨噬細胞的轉化，來影響腫瘤免疫的。為了進一步驗證我們的實 驗結果，我們在體外實驗中，研究FATS基因缺陷是否對巨噬細胞的極化產生直接的影響。我 們分離出野生型小鼠以及FATS基因缺陷小鼠的骨髓細胞，加入M-CSF對其進行巨噬細胞的 定向分化，分化第7天，加入IFN-γ和LPS或者IL-4使其進一步向Ml型或者M2型巨噬細胞極 化，16個小時后收集細胞，流式細胞染色或者定量檢測，全面的分析了FATS基因缺陷對Ml以 及M2型巨噬細胞分化的影響。
[0554] 首先，我們利用流式細胞術檢測野生型小鼠與FATS基因缺陷小鼠中，Ml以及M2型 巨噬細胞的比例。如圖20所示，MO型巨噬細胞在向Ml型巨噬細胞極化后，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠 Ml型巨噬細胞的比例遠高于野生型小鼠的Ml型巨噬細胞的比例（圖20A，B)，這一結果提示， FATS基因缺陷后，巨噬細胞明顯傾向于分化為Ml型巨噬細胞。此外，與預期相一致的，在M2 型巨噬細胞極化中，F(xiàn)ATS基因缺陷則表現(xiàn)出M2型巨噬細胞極化的明顯受抑，F(xiàn)ATS基因缺陷 小鼠M2型巨噬細胞的比例顯著少于野生型小鼠的M2型巨噬細胞比例（圖20C，D)。這一結果 非常明顯的提示，F(xiàn)ATS基因缺陷可以直接對巨噬細胞產生影響，顯著的促進了 Ml型巨噬細 胞的極化，抑制了M2型巨噬細胞的極化。
[0555] 同時，我們也對野生型小鼠和FATS基因缺陷小鼠的Ml以及M2型巨噬細胞的基因表 達水平進行了實時定量PCR檢測。結果如圖21，22所示，與流式結果相一致，MO型巨噬細胞向 Ml型巨噬細胞極化后，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的Ml型巨噬細胞中，重要細胞因子，IL-12，TNF-a 以及N0S2的mRNA表達明顯的高于野生型小鼠（圖21)。而在MO型向M2型巨噬細胞極化后， FATS基因缺陷小鼠的巨噬細胞表達M2型細胞因子，六找1，1代1，1^加1 &以及0(^22的1111?嫩水 平明顯低于野生型小鼠（圖22)。這些結果表明，在MO型巨噬細胞極化的過程中，F(xiàn)ATS基因缺 陷使得巨噬細胞顯著易于分化為Ml型巨噬細胞，同時抑制了 M2型巨噬細胞的分化，這與我 們先前得到的體內研究的結果相一致。
[0556] 2.2.5 FATS基因缺陷促進了M2型巨噬細胞的凋亡
[0557] 以上實驗中，我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的M2型巨噬細胞顯著的減少，為了更加 全面的探究FATS基因對M2型巨噬細胞的影響以及潛在的機制，我們繼續(xù)檢測了野生型小鼠 以及FATS基因缺陷小鼠在巨噬細胞定向分化為M2型巨噬細胞中的細胞凋亡。我們分離小鼠 骨髓細胞，加入M-CSF誘導巨噬細胞定向分化，最后加入IL-4誘導M2型巨噬細胞極化，收集 M2型巨噬細胞，流式檢測其凋亡水平以及免疫印跡檢測細胞凋亡相關信號表達水平。流式 結果顯示，F(xiàn)ATS基因缺陷后，在誘導M2型巨噬細胞極化過程中，細胞的凋亡顯著的增加（圖 23A，B)，無論是早期凋亡還是晚期凋亡，F(xiàn)ATS基因缺陷的小鼠M2型巨噬細胞都顯著高于野 生型小鼠。這一結果顯示了，F(xiàn)ATS基因缺陷促進了M2型巨噬細胞的凋亡，這可能是FATS基因 缺陷小鼠中M2型巨噬細胞比例減少的一個原因。進一步的，我們檢測了兩組小鼠中，M2型巨 噬細胞中凋亡相關信號的表達，與流式結果相一致，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠的M2型巨噬細胞中， Cleaved_caspase3蛋白的表達量相較野生型小鼠增加，同時具有抑制細胞凋亡的蛋白， Be 12在FATS基因缺陷的巨噬細胞中受到抑制（圖23C)。這些結果提示了，F(xiàn)ATS基因缺陷促進 了M2型巨噬細胞的凋亡，從而減少了M2型巨噬細胞的比例，這與體內實驗中檢測的腫瘤微 環(huán)境中M2型巨噬細胞的比例減少以及體外實驗中M2型巨噬細胞極化后減少相一致。
[0558] 2.2.6 FATS基因缺陷促進了巨噬細胞中NF-kB信號通路的激活
[0559] 我們的研究證實，F(xiàn)ATS基因缺陷促進M2型巨噬細胞的凋亡，導致M2型巨噬細胞比 例的下降，同時我們也發(fā)現(xiàn)了在FATS基因缺陷時，Ml型巨噬細胞的比例顯著的增加，為了深 入探究我們體內體外實驗所得到結果的可能的機制，我們進一步檢測了 MO型巨噬細胞以及 腹腔富集的巨噬細胞中分化相關的信號通路。我們提取骨髓定向分化過程中MO型巨噬細胞 的蛋白，細胞免疫印跡檢測了巨噬細胞向Ml型巨噬細胞定向分化的重要信號通路，NF-kB信 號通路。結果如圖24所示，NF-kB信號通路中，p65的表達在FATS基因缺陷后被明顯激活，同 時與P65結合抑制其進入細胞核的ΙκΒα信號的表達受到了抑制（圖24A，B)。這一結果表明， FATS基因缺陷后激活了巨噬細胞中NF-kB信號通路，促進了MO型巨噬細胞向Ml型巨噬細胞 的分化，從而增加了Ml型巨噬細胞的比例。
[0560] 2.3討論
[0561] 我們在體內實驗中對黑色素瘤小鼠的腫瘤微環(huán)境里免疫細胞的分析中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATS 基因缺陷抑制了促進腫瘤的免疫抑制細胞，同時促進了對腫瘤具有殺傷的效應免疫細胞。 眾所周知，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞通過抗原提呈，分泌多種細胞因子等機制相互協(xié)同或 抑制，從而對腫瘤產生影響，其中巨噬細胞(M1型巨噬細胞）以及效應的T細胞(CTL，Th 1)對 于腫瘤的殺傷和生長抑制有著重要的作用。我們注意到，F(xiàn)ATS基因缺陷后，黑色素瘤小鼠中 具有主要細胞殺傷效應作用的Thl，CTL以及同時具有固有殺傷和抗原呈遞功能的Ml型巨噬 細胞的比例顯著增加。這些結果讓我們提出一個疑問，F(xiàn)ATS基因缺陷是直接對T細胞增殖產 生影響還是通過巨噬細胞間接影響T細胞的比例?于是我們對FATS基因缺陷的T細胞進行了 體外增殖檢測，結果發(fā)現(xiàn)，T細胞的增殖并沒有在FATS基因缺陷后增加（圖17)，接下來，我們 用黑色素瘤小鼠中的巨噬細胞與T細胞共培養(yǎng)檢測T細胞增殖，結果卻發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATS基因缺陷 的巨噬細胞顯著的促進了 T細胞的增殖，T細胞增殖指數(shù)增加，同時培養(yǎng)上清中T細胞增殖所 必須的細胞因子，IL-2的量也在FATS基因缺陷小鼠巨噬細胞混合培養(yǎng)上清中顯著增加（圖 18)，由此，我們推測，F(xiàn)ATS基因缺陷直接產生影響的細胞可能是巨噬細胞，也就是說，F(xiàn)ATS 基因缺陷可能是通過改變巨噬細胞的極化，進一步的，激活了效應T細胞并影響腫瘤免疫微 環(huán)境中免疫細胞的比例。
[0562] 隨后，我們的體外實驗結果發(fā)現(xiàn)，骨髓定向分化過程中，F(xiàn)ATS基因缺陷的骨髓細胞 在同樣的極化條件下，比野生型小鼠更易于極化為Ml型巨噬細胞，并抑制M2型巨噬細胞（圖 20)。同時基因的檢測也得到了一致的結果，Ml型極化條件下，F(xiàn)ATS基因缺陷的巨噬細胞更 高的表現(xiàn)Ml型特異性的標記（圖21 )，其中包括分泌產生的IL-12，對T細胞的增殖和存活有 著重要的作用；而在M2型巨噬細胞極化條件下，M2型巨噬細胞特征的因子Arg-1，CCL22， Mrcl以及Retnla的表達在FATS基因缺陷巨噬細胞中明顯抑制（圖22)，其中CCL22招募Treg 抑制腫瘤效應細胞，對腫瘤的生長有著促進作用。這些與我們體內實驗分析腫瘤微環(huán)境中 免疫細胞比例變化得到的數(shù)據(jù)在理論上完全吻合。
[0563]我們知道，Ml型巨噬細胞除去提呈促進T細胞增殖的功能外，也在固有免疫中起著 關鍵作用，對腫瘤有著直接的殺傷作用。我們進一步的對FATS基因缺陷小鼠腫瘤組織中巨 噬細胞的殺傷作用進行檢測，與預期相一致，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞 對B16細胞的殺傷明顯強于野生型小鼠腫瘤中的巨噬細胞（圖19)。這一結果提示，F(xiàn)ATS基因 缺陷后黑色素瘤的腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞以Ml/殺傷型巨噬細胞居多，使得殺傷腫瘤細 胞的免疫應答顯著強于野生型小鼠。這也進一步驗證了，在FATS基因缺陷小鼠中，巨噬細胞 的極化發(fā)生了改變，Ml型巨噬細胞極化增加直接影響著腫瘤的免疫殺傷。
[0564]巨噬細胞的極化是非常復雜的。研究指出，脂肪組織相關巨噬向Ml型極化中需要 JNK信號。激活AKTl和2激酶調節(jié)PI3K信號?；蛳趯嶒烇@示，AKT 1和2在調節(jié)巨噬細胞Ml 和M2型上具有相互作用。JAK/STAT信號對Ml型巨噬有強的誘導作用，但是要是巨噬細胞完 全極化為Ml型巨噬需要激活TLR-4以及IFN-Y信號通路。亦有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以通過 Notch信號通路促進Ml型巨噬細胞，抑制M2型巨噬細胞可以抑制肝癌細胞的生長。
[0565]有研究表明NF-kB信號通路對巨噬細胞的極化有著重要的作用。Duygu Sag等人證 明Abcgl基因缺陷可以激活NF-kB信號通路，促進Ml型巨噬細胞極化，同時也將黑色素瘤中 的巨噬細胞從促進腫瘤的M2型轉變?yōu)橐种颇[瘤的Ml型巨噬細胞，最終導致了黑色素瘤的生 長的顯著抑制。
[0566] NF-κΒ是一種核轉錄因子，可以調控多種基因的表達。NF-κΒ信號通路中，IkB家族 成員（ΙκΒα，Ικβ等)與 P65(p65是NF-kB信號通路中的關鍵成員）結合，使p65處于沒有活性狀 態(tài)。各種激活信號通過對IkB降解來激活NF-κΒ信號通路。我們對骨髓定向分化的巨噬細胞 進行WB檢測，發(fā)現(xiàn)FATS基因缺陷小鼠MO型巨噬細胞中p65表達增加，ΙκΒα的表達下調，即NF-κΒ信號在FATS基因缺陷小鼠中要強于野生型小鼠（圖24)，這提示FATS基因缺陷可以通過激 活NF-κΒ信號通路來促進Ml型巨噬細胞極化。
[0567] 與此同時，我們發(fā)現(xiàn)了在M2型巨噬細胞極化條件極化后，F(xiàn)ATS基因缺陷小鼠M2型 巨噬細胞的凋亡比例增加，WB檢測后發(fā)現(xiàn)凋亡信號（cleaved-caspase-3)增加，而抑制凋亡 的信號(Bcl2)表達下降（圖23)，這說明FATS基因缺陷促進了 M2型巨噬細胞的凋亡，但是我 們也發(fā)現(xiàn)，凋亡的比例增加并沒有M2型巨噬細胞比例減少顯著，這也提示，F(xiàn)ATS基因缺陷小 鼠M2型巨噬細胞的減少可能并不僅僅由于凋亡數(shù)目的增加，也由于巨噬細胞更傾向于Ml型 巨噬細胞極化，抑制M2型巨噬細胞極化引起。
[0568] 三、FATS-KO小鼠骨髓來源巨噬細胞過繼治療實驗
[0569] 3.1對象和方法
[0570] 3.1.1實驗方法
[0571 ] 3.1.1.1小鼠黑色素瘤皮下移植瘤模型構建
[0572] 1)將B16細胞培養(yǎng)于IOcm2培養(yǎng)皿中，用加有10%FBS，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)， 培養(yǎng)至對數(shù)生長期；
[0573] 2)收集細胞并進行離心。
[0574] 3)棄掉上清液，細胞沉淀用1倍的I3BS吹打，lOOOrpm，離心，5min，棄上清，隨后再重 復1次；
[0575] 4)收集到的B16細胞用1倍的PBS重懸，計數(shù)，調整細胞濃度至2 X 106/ml;
[0576] 5)提前半天時間，用脫毛膏將小鼠右后背部的毛脫去，注射細胞懸液前用75%酒 精對小鼠注射部位進行消毒；
[0577] 6)在每只小鼠的右后背部，注射100μΙ 2 X 106/ml的B16細胞(共31只），即每只小 鼠注射Β16細胞的數(shù)量為2 X 105/只，進針后或出針前，可稍微改變針頭的方向，注射時動作 輕緩，出針后輕按針孔片刻，可避免細胞懸液漏出；
[0578] 7)每天對小鼠的腫瘤生長情況進行觀察，并用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長度與寬 度，做好記錄；
[0579] 8)荷瘤后20天，麻醉后脫頸處死小鼠，分離小鼠的脾臟與腫瘤，腫瘤組織，照相，稱 重，并測量其長度與寬度，計算腫瘤的終體積；
[0580] 9)小鼠的腫瘤體積計算公式為長X寬2/2(mm3)
[0581] 3.1.1.2小鼠骨髓細胞分離：
[0582] 1)麻醉后，脫頸處死小鼠，用75%酒精消毒雙下肢，固定后剪開皮膚，分離肌肉組 織，暴露脛骨，保留兩側關節(jié)，將脛骨取出，迅速置于冷的1倍PBS中；
[0583] 2)去掉骨面上殘余的組織，置于超凈工作臺中，沿關節(jié)剪開股兩端，暴露出髓腔， 用Iml注射器吸取1倍的PBS，將骨髓沖至培養(yǎng)皿中，反復沖洗，直至脛骨全部變?yōu)榘咨?br>[0584] 3)用Iml的槍將骨髓吹散至單細胞狀態(tài)，隨后收集細胞懸液至無菌的15ml離心管 中，1000 rpm，離心，5min;
[0585] 4)棄上清，加入 Iml 1 倍的 PBS，1000rpm，離心，5min;
[0586] 5)棄上清，用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，培養(yǎng)在細胞培養(yǎng)箱中。
[0587] 3.1.1.3小鼠骨髓來源巨噬細胞定向分化：
[0588] 1)分離出的骨髓細胞加入M-CSF (10ng/ml)培養(yǎng)5天，此時的細胞為MO型巨噬細胞 (培養(yǎng)第三天需半量換液）；
[0589] 2)M1型巨噬細胞極化:MO型巨噬細胞加入IFN-γ (20ng/ml)培養(yǎng)12h，隨后加入LPS (100ng/ml)繼續(xù)培養(yǎng)4h，即為Ml型巨噬細胞；
[0590] 3)M2型巨噬細胞極化:MO型巨噬細胞加入IL-4(20ng/ml)培養(yǎng)16h，即為M2型巨噬 細胞。
[0591] 3.1.2具體方法
[0592] 選取10只0578176小鼠，雌性，6-8周，體重18-2(^，皮下注射816細胞，2\10 5/只， 構建小鼠皮下黑色素瘤移植瘤模型(具體步驟見3.1.1.1)，然后將小鼠隨機分成兩組，每組 各5只。分別在小鼠荷瘤第2天和第7天，通過尾靜脈注射的方式分別將野生型小鼠和FATS基 因敲除小鼠骨髓來源的定向分化為MO型的巨噬細胞，過繼輸注到小鼠體內，注射前用LPS刺 激12個小時，連續(xù)監(jiān)測小鼠腫瘤大小。荷瘤16天后，將處死小鼠，分離腫瘤組織，稱量腫瘤重 量。然后利用小鼠腫瘤組織浸潤單個核細胞分離液分離腫瘤組織中的單個核細胞，流式檢 測腫瘤中巨噬細胞的比例及M2型巨噬細胞的比例。
[0593] 3.2結果
[0594] 3.2.1 FATS基因缺陷的骨髓來源巨噬細胞過繼治療能明顯抑制腫瘤生長
[0595] 以上的研究結果提示，F(xiàn)ATS基因缺陷的巨噬細胞可能在腫瘤的生長中具有中具有 重要的殺傷能力，從而抑制腫瘤的生長。為了進一步證實FATS基因缺陷或低表達的巨噬細 胞具有抑制黑色素瘤的生長作用，我們將野生型以及FATS基因缺陷的巨噬細胞或者沉默 FATS基因以及對照的野生型巨噬細胞尾靜脈注射到B16細胞荷瘤的小鼠體內對黑色素瘤進 行過繼治療。結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATS基因缺陷的巨噬細胞過繼治療后，顯著抑制了黑色素瘤的生長 (圖25A)，腫瘤最終的體積顯著減?。▓D25B)，同時腫瘤的腫瘤也明顯的下降（圖25C)。
[0596] 四、FATS-siRNA轉染W(wǎng)T小鼠骨髓來源巨噬細胞進行過繼治療實驗
[0597] 4.1對象和方法
[0598] 4.1.1主要材料、試劑與儀器設備
[0599] 4.1.1.1主要試劑
[0600] Lipofectamine RNAiMAX Reagent轉染美國Invitrogen公司 [0601 ] 試劑
[0602] FATS-siRNA 廣州瑞博公司合成
[0603] 4.1.2實驗方法
[0604] 4.1.2.1骨髓細胞向巨噬細胞定向誘導分化。
[0605] 主要材料：2-3只C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，體重18-20g; PBS; RPMI1640完全培養(yǎng) 基；IOcm細胞培養(yǎng)皿。
[0606]骨髓細胞向巨噬細胞定向分化的培養(yǎng)基：1640完全培養(yǎng)基20ng/ml M-CSF
[0607] 方法:脫頸處死小鼠，取股骨和脛骨，酒精浸泡2分鐘-超凈臺，無菌PBS漂洗-Iml 注射器沖出骨髓細胞，1500rpm離心，5min，棄上清，PBS洗一遍，RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸計 數(shù)-1.5 X 106細胞/皿，加入定向分化的培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-6天-棄去未貼壁細胞，細胞刮子收 獲貼壁細胞，即為巨噬細胞，計數(shù)，調整細胞濃度為2.5 X 106個/ml，備用。（中間需添加 5ml 完全培養(yǎng)基帶M-CSF)
[0608] 4丄2 · 2 ·巨噬細胞轉染FATS-siRNA
[0609] 主要材料:FATS-siRNA(廣州瑞博公司合成，其對應的DNA序列如SEQ ID NO: 2); Lipofectamine RNAiMAX Reagent轉染試劑;PBS; RPMI1640完全培養(yǎng)基；12孔板。
[0610] 方法:上述收獲的巨噬細胞，5 X IO6個/孔，接種到12孔板中，細胞匯聚60-80 % - 參照下表，用RPMI1640完全培養(yǎng)基，分別稀釋FATS-siRNA與Lipofectamine RNAiMAX Reagent轉染試劑-1:1混合，室溫靜置5分鐘-混合液與細胞共孵育1-3天-鏡下檢測轉染 效率-24小時后，定量PCR，進一步檢測轉染效率。
[0611]稀釋FATS-siRNA與Lipofectamine RNAiMAX Reagent轉染試劑
[0613] 1:1混合，室溫靜置5分鐘，
[0614] SiRNA-脂質混合液配制及細胞轉染
[0617] 混合液與細胞共孵育1-3天-鏡下檢測轉染效率-定量PCR，進一步檢測轉染是否 成功.
[0618] 4.1.2.3巨噬細胞向Ml型定向誘導極化
[0619] 轉染FATS-siRNA 24小時后，加入LPS(lμg/ml)誘導巨噬細胞向Ml型極化，12小時 后，收集細胞，計數(shù)，調整細胞濃度為I X IO7個/ml，流式檢測，確定巨噬細胞表型。注:空載 體-巨噬細胞作為對照。
[0620] 4.1.2.4 Ml型巨噬細胞過繼治療腫瘤
[0621] 動物:C57BL/6小鼠，雌性，6-8周，體重18-20g。
[0622] 腫瘤模型:B16小鼠黑色素瘤細胞2X IO5/只小鼠皮下注射荷瘤。
[0623] 方法:分別于小鼠皮下注射荷瘤后1、7天，將FATS-siRNA巨噬細胞I X 106/只小鼠 尾靜脈注射過繼治療，16天后，處死小鼠。荷瘤期間，隔天監(jiān)測腫瘤大小。注:轉染NC-siRNA 巨噬細胞作為對照。
[0624] 4.2結果
[0625] 4.2.1過繼輸注FATS-siRNA轉染的骨髓來源的巨噬細胞能明顯抑制腫瘤的生長
[0626] 通過應用siRNA沉默野生型巨噬細胞中的FATS基因，我們將FATS/NC-siRNA轉染到 野生型的巨噬細胞中，隨后用這兩種巨噬細胞對黑色素瘤小鼠進行過繼治療，結果如圖26 所示，F(xiàn)ATS基因沉默的巨噬細胞治療后顯著的抑制了黑色素瘤的生長。這些結果證實，巨噬 細胞缺陷或者沉默F(xiàn)ATS基因后對小鼠黑色素瘤具有治療作用。
[0627]以上所述僅為本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明創(chuàng)造，凡在本 發(fā)明創(chuàng)造的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明創(chuàng)造 的保護范圍之內。
【主權項】
1 .FATS基因或其表達產物(FATS基因的編碼蛋白）在下述任一方面的應用： i) 開發(fā)、篩選黑色素瘤功能產品方面； ii) 制備治療或預防黑色素瘤的功能產品方面。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品為能夠對黑色素瘤的發(fā)生、 發(fā)展產生治療、緩解、抑制、調節(jié)的有益作用的產品或潛在物質;所述功能產品為單一制劑 或包含有效量制劑成分的組合物。3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品包括下調FATS基因的表達、 轉錄或其表達產物的功能。4. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品用于：增加腫瘤組織中炎性 細胞的浸潤。5. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品用于:在外周免疫器官或腫 瘤免疫微環(huán)境中，促進抗腫瘤免疫和/或抑制促腫瘤的免疫反應。6. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品用于:在巨噬細胞定向分化 中，促進向Ml型巨噬細胞極化，和/或抑制M2型巨噬細胞的極化。7. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品用于以下一種或多種作用： i) 提高細胞毒性T淋巴細胞，NK細胞，γ δΤ細胞和/或Ml型巨噬細胞的比例； ii) 降低調節(jié)性T淋巴細胞和/或M2型巨噬細胞的比例； iii) 提高T細胞增殖相關細胞因子IL-2和/或Ml型巨噬細胞分泌細胞因子IL-12的表 達； iv) 提尚巨細胞殺傷能力； v) 提高T細胞的增殖能力； v i)降低巨噬細胞表達VEGF; vii)抑制腫瘤組織血管生成； vi i i)骨髓細胞在巨噬細胞定向分化中，促進向Ml型巨噬細胞極化，和/或抑制M2型巨 噬細胞的極化； ix)促進M2型巨噬細胞的凋亡； X)激活NF-kB信號通路。8. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品選自或含有:核酸抑制物，蛋 白抑制劑，抗體，配體，蛋白水解酶，蛋白結合分子，F(xiàn)ATS基因缺陷或沉默的免疫相關細胞、 其分化細胞或構建物中的一種或多種，能夠在基因或蛋白水平上下調FATS基因的表達或其 表達產物。9. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品選自或含有：以FATS基因或 其轉錄本為靶序列、且能夠抑制FATS基因表達產物的表達或基因轉錄的小干擾RNA、dsRNA、 shRNA、微小RNA、反義核酸;或能表達或形成所述小干擾卩嫩、(1通嫩、5^嫩、微小1^、反義核 酸的構建物。10. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述功能產品選自或含有以下任一種： i) 以SEQ ID ΝΟ:1或其轉錄本為靶序列，且能夠抑制FATS基因表達產物的表達或基因 轉錄的小干擾RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反義核酸； ii) 能表達或形成i)中所述小干擾RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反義核酸的構建物； iii) 含有SEQ ID NO:1或其互補序列，且能夠在轉入體內后形成抑制FATS基因表達產 物的表達或基因轉錄的干擾分子的構建物； iv) 抑制或敲除SEQ ID NO: 1基因序列后的免疫相關細胞、其分化細胞或構建物； v) 以根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的SEQ ID NO: 1的同源序列或其轉錄本 為靶序列，且能夠抑制FATS基因表達產物的表達或基因轉錄的小干擾1?^、(181^^、8111?^、微 小RNA、反義核酸； vi) 能表達或形成v)中所述小干擾RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反義核酸的構建物； vii) 含有根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的SEQ ID NO: 1的同源序列或其互 補序列，且能夠在轉入體內后形成抑制FATS基因表達產物的表達或基因轉錄的干擾分子的 構建物； viii) 抑制或敲除根據(jù)構建物的生物體的密碼子偏愛性體現(xiàn)的SEQ ID NO: 1的同源基 因序列后的免疫相關細胞、其分化細胞或構建物。
【文檔編號】A61K48/00GK105963699SQ201610315637
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】張榮信, 張凱, 張麗娟, 薛振毅, 李巖
【申請人】天津醫(yī)科大學