一種酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥及其制備方法和應(yīng)用。所述磷脂酰納米前藥由含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物和磷脂類化合物在磷脂酶D的催化作用下通過磷氧鍵鍵合形成。本發(fā)明還提供了一種該酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥將抗腫瘤藥物靶向釋放到腫瘤組織中的應(yīng)用。本發(fā)明創(chuàng)造性地利用腫瘤組織中高表達(dá)的磷脂酶D的水解/轉(zhuǎn)脂雙向反應(yīng)特性，在體外利用磷脂酶D生物催化合成雙親性的磷脂酰納米前藥，當(dāng)前藥靶向積累到腫瘤中響應(yīng)磷脂酶D觸發(fā)水解，特異性釋放抗腫瘤藥物，同時解決了靶向藥物安全穩(wěn)定性和有效釋放的問題。
【專利說明】
一種酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及一種酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]化療藥物通常是一類具有顯著細(xì)胞毒性的化合物，隨著血液循環(huán)分布到全身后，這類藥物不僅作用于腫瘤細(xì)胞，也同時作用于正常細(xì)胞，因而引起很大的嚴(yán)重的毒副作用，降低患者的生存質(zhì)量，這也是癌癥化療的困境所在，如何降低化療藥物的毒副作用是化療藥物研究的一個重要問題。為了解決這一瓶頸問題，人們致力于研究能靶向病變組織的藥物傳遞系統(tǒng)研究，讓化療藥物長上“眼睛”，定位到腫瘤組織，起到定點殺傷的作用，靶向藥物傳遞成為腫瘤藥物研究的一個重要途徑。隨著納米藥物在抗腫瘤領(lǐng)域顯現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，越來越多的國家、制藥公司、高校和科研院所將目光投向納米藥物這一領(lǐng)域，大量生物相容性高、免疫原性低、生物可降解的納米藥物載體被開發(fā)和應(yīng)用。特別是兩親聚合物，由于其獨特的表面性能，一定條件時在水溶液中可高度分散形成有序聚集體而受到了越來越多科研人員的重視。但大多載體材料由于其靶向性及其降解速率的不同，可濃集于某種細(xì)胞中，從而會產(chǎn)生難以預(yù)料的潛在毒性和免疫源性?；谏鲜霭踩院头€(wěn)定性問題，藥質(zhì)體理論(Pharmacosomes)被提出，即將含有羧基的藥物和甘油酯、磷脂的輕基共價鍵合成兩親性前藥，自組裝形成納米前藥。納米前藥形式解決了儲存和體內(nèi)運輸時安全、穩(wěn)定的要求，但達(dá)到效應(yīng)部位后，前藥必須及時釋放活性藥物并達(dá)到有效生物活性濃度，才有臨床應(yīng)用意義。目前已報到的腫瘤納米藥物響應(yīng)釋放模式有兩類:一類為外源觸釋，利用熱、光、磁性、超聲波等物理方法刺激藥物在效應(yīng)部位釋放。另一類為腫瘤組織內(nèi)源性觸釋，即利用腫瘤組織內(nèi)源性生理病理特性觸發(fā)藥物釋放。研究已報道的內(nèi)源性響應(yīng)釋放技術(shù)包括:pH響應(yīng)釋放，缺氧介導(dǎo)的釋放，酶觸發(fā)響應(yīng)釋放等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥及其制備方法和應(yīng)用，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中靶向藥物安全穩(wěn)定性和有效釋放的問題。
[0004]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0005]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥，所述磷脂酰納米前藥是由含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物和磷脂類化合物在磷脂酶D的催化作用下通過磷氧鍵鍵合形成。
[0006]本發(fā)明針對納米前藥的酶觸發(fā)響應(yīng)釋放進(jìn)行研究，選擇了腫瘤組織內(nèi)特異性高表達(dá)的磷脂酶D(ph0Sph0lipaSe D，PLD)作為研究的切入點，利用它催化磷脂類化合物轉(zhuǎn)脂合成和水解的雙向特征，作為磷脂酰納米前藥中載體和藥物鍵和的“鑰匙”，通過磷脂酰的“開關(guān)，，，解決革G向藥物安全穩(wěn)定性和有效釋放的問題。
[0007]根據(jù)本發(fā)明提供的磷脂酰納米前藥以前藥的形式在體內(nèi)轉(zhuǎn)運，靶向積累到腫瘤部位，再通過腫瘤組織中高表達(dá)的磷脂酶D的水解釋放出原藥，特異性殺滅腫瘤細(xì)胞。
[0008]所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物不限分子結(jié)構(gòu)，作為舉例而非限制地，可包括鹽酸阿霉素和鹽酸米托蒽醌，實際上只要是含有伯醇，同時具有親水性的抗腫瘤藥物均可適用于本發(fā)明。
[0009]所述磷脂類化合物可選自:二癸?；字Ｄ憠A(DDPC)，二月桂?；字Ｄ憠A(DLPC)，二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(DMPC)，二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)，二硬脂酰基磷脂酰膽堿(DSPC)，二油酰基磷脂酰膽堿(DOPC)，二芥酰基磷脂酰膽堿(DEPC)，1-肉豆蔻?；?2-硬脂?；字Ｄ憠A(MSPC)，1-肉豆蔻?；?2-棕櫚?；字Ｄ憠A(MPPC)，1-硬脂?；?2-肉豆蔻?；字Ｄ憠A(SMPC)，1-硬脂?；?2-棕櫚酰基磷脂酰膽堿(SPPC)，1-棕櫚?；?2-硬脂酰基磷脂酰膽堿(PSPC)，1-肉豆蔻?；?2-油酰基磷脂酰膽堿(MOPC)，1-棕櫚?；?2-油?；字Ｄ憠A(POPC)，1-硬脂?；?2-油?；字Ｄ憠A(SOPC)，即碳鏈長度不一，不同飽和度的磷脂類化合物均可適用于本發(fā)明。
[0010]如圖7所示，為根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施提供的磷脂酰阿霉素納米前藥的合成示意圖。
[0011]親水性抗腫瘤藥物與磷脂類化合物的摩爾比為1:1，相比現(xiàn)有技術(shù)降低了載體材料的使用量;此外，磷脂為生物細(xì)胞膜的組成部分，對動物體無副作用，生物相容性好;抗腫瘤藥物與磷脂類化合物為化學(xué)鍵合，穩(wěn)定性高。
[0012]所述磷脂酰納米前藥由于具有兩親性，在水相中發(fā)生分子自組裝形成膠束，當(dāng)所述膠束通過腫瘤的增強(qiáng)滲透與滯留效應(yīng)(EPR effect)被動靶向性的進(jìn)入腫瘤組織后，所述膠束在磷脂酶D的催化作用下水解釋放出所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物。
[0013]磷脂酰納米前藥在生理條件下以前藥形式穩(wěn)定存在，在磷脂酶D存在的情況下，膠束能迅速被水解并釋放出活性原藥。表明磷脂酰納米前藥給藥系統(tǒng)具有磷脂酶D可控釋放的特點，可解決抗腫瘤革G向藥物的穩(wěn)定性和響應(yīng)觸發(fā)釋放問題。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，還提供一種如上所述的酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥的制備方法，所述制備方法包括:將含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物和磷脂類化合物分別溶解，然后混合，向其中加入磷脂酶D，30?50°C下反應(yīng)4?24h，所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物與磷脂類化合物通過磷氧鍵結(jié)合生成一種雙親性的磷脂酰納米前藥。
[0015]所述制備方法具體包括:以乙酸-乙酸鈉緩沖液和異丙醇的混合液為溶劑溶解所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物，以及通過有機(jī)溶液溶解所述磷脂類化合物。
[0016]所述有機(jī)溶劑包括正己烷，正庚烷，二氯甲烷，三氯甲烷，乙酸乙酯。
[0017]所述制備方法更具體地包括以下步驟:I)藥物溶液的配置:以乙酸-乙酸鈉緩沖液和異丙醇為溶劑，配置抗腫瘤藥物溶液，超聲溶解;2)磷脂酰膽堿溶液的配置:以正庚烷為溶劑，配置磷脂酰膽堿溶液，超聲溶解;3)混合步驟I)和2)的溶液，加入磷脂酶D酶液，在30?50 °C下，搖床中反應(yīng)4?24h; 4)溶劑萃取:將步驟3)中獲得的反應(yīng)液用正己烷萃取;5)分離純化:用柱層析法將步驟4)獲得的混合溶液進(jìn)行分離，流動相為氯仿:無水乙醇:三乙胺:水=10: 11.3:11.7:2.7，固定相為硅膠粉;6)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā):將步驟5)中分離后的溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，條件為25?35°C，2?5小時；7)溶劑除鹽:用無水乙醇將步驟(6)中少量的無機(jī)鹽除去，揮干;8)冷凍干燥:將步驟7)所獲得的固體進(jìn)行冷凍干燥。
[0018]所述制備方法還優(yōu)選包括:9)膠束的制備，其中，磷脂酰阿霉素膠束的制備采用透析法，包括以下步驟:a.將磷脂酰阿霉素(DMSO)慢慢滴入有磁力攪拌的水中，滴入速度0.5?1.5ml/min，最終最優(yōu)選地達(dá)到磷脂酰阿霉素濃度為0.02mg/ml ;b.上述溶液攪拌半個小時后，將其裝入透析袋中進(jìn)行透析。透析過程中，剛開始每隔2h換水一次，反復(fù)3次，最后透析一天，取出獲得的目的溶液;c.透析后的溶液超聲10分鐘，0.45μπι過濾器過濾去除雜質(zhì)，即得所需要的磷脂酰阿霉素膠束溶液。
[0019]磷脂酰米托蒽醌膠束的制備采用滴入法，包括以下步驟:a.取Img的磷脂酰米托蒽醌，溶于少量的四氫呋喃中，慢慢滴入到有磁力攪拌的水中，最終達(dá)到lmg/ml ； b.在26?28°C，攪拌2?3小時，即得所需要的磷脂酰米托蒽醌膠束溶液。
[0020]磷脂酰納米前藥組分中還可配比合適的PEG化成分或透明質(zhì)酸(HA)，制備成長循環(huán)膠束，如甲氧基聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺，聚乙二醇單甲醚-膽固醇琥珀酸酯，磷脂酰聚乙二醇單甲醚等，長親水鏈的分子量范圍可從500到2000，減少膠束和血液中蛋白的吸附，降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的識別和吞噬概率，提高體內(nèi)循環(huán)時間。
[0021]磷脂酰納米前藥以磷脂類化合物為骨架，自組裝成類似于生物膜的膠束，具備脂質(zhì)體樣多功能修飾特性，還可進(jìn)行腫瘤表面特異性配體或抗體(葉酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、Sigma受體、R⑶多肽，單克隆抗體MAb或HER2等)修飾，實現(xiàn)膠束的主動靶向轉(zhuǎn)運。
[0022]磷脂酰納米前藥的制備可參考脂質(zhì)體制備處方和工藝，配比合適的脂膜穩(wěn)定性、流動性和電荷分布的組分，包括膽固醇、磷脂酰乙醇胺、去氧膽酸、膽固醇硫酸酯等，提高膠束的質(zhì)膜穩(wěn)定性和流動性。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，還提供一種如上所述的酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥將抗腫瘤藥物靶向釋放到腫瘤組織中的應(yīng)用。
[0024]所述磷脂酰納米前藥由于具有兩親性，在水相中發(fā)生分子自組裝形成膠束，當(dāng)所述膠束靶向性的進(jìn)入腫瘤組織后，所述膠束在腫瘤組織中高表達(dá)的磷脂酶D的催化作用下水解釋放出所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物。
[0025]所述膠束的粒徑一般小于Ιμπι，優(yōu)選為20nm?150nm。
[0026]如圖8所示，為根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施提供的磷脂酰阿霉素納米前藥自組裝成膠束以及在磷脂酶D的作用下水解釋放阿霉素的示意圖。
[0027]優(yōu)選地，該膠束表面電位在-30mV?_50mV，適合靜脈注射，穩(wěn)定性得到提高，通過EPR效應(yīng)被動靶向積累于腫瘤部位。
[0028]該應(yīng)用還包括將所述磷脂酰納米前藥本身作為藥物載體進(jìn)一步裝載具有協(xié)同作用的其他抗腫瘤藥物或相關(guān)基因，并靶向到腫瘤組織中進(jìn)行酶促響應(yīng)釋放，如:紫杉醇，維拉帕米或抗腫瘤基因等，從而產(chǎn)生“雞尾酒”療法。
[0029]本發(fā)明中，所得的雙親性的磷脂酰納米前藥分子可以通過NMR、FTIR、MS等手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的確證，得到的膠束可以通過TEM、粒徑、電位的研究來探討其聚集行為和形貌特征，所得產(chǎn)品的體內(nèi)外釋放情況可以通過HPLC確定。
[0030]本發(fā)明開創(chuàng)性地利用腫瘤組織特殊的生理病理機(jī)制造成的磷脂酶D過量表達(dá)、活性升高這一自然生理現(xiàn)象，由這種特異性地、高濃度地存在的磷脂酶D觸發(fā)納米藥物響應(yīng)性釋放，保障腫瘤內(nèi)的有效藥物濃度，減少對其他組織的毒副作用。一方面利用磷脂酶D具有的轉(zhuǎn)脂功能，合成了雙親性的磷脂酰納米前藥;另一方面利用磷脂酶D具有的水解功能，當(dāng)磷脂酰納米前藥靶向性的進(jìn)入腫瘤組織中，即可被磷脂酶D水解釋放出抗腫瘤藥物，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用。根據(jù)本發(fā)明提供的磷脂酰納米前藥分子提高腫瘤靶向性，為腫瘤納米藥物設(shè)計和開發(fā)提供一種新的思路。
【附圖說明】
[0031]圖1A、圖1B分別是磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的紅外圖；
[0032]圖2A、圖2B分別是磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的質(zhì)譜圖；
[0033]圖3A、圖3B分別是用透射電鏡法觀察到的磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的膠束形貌；
[0034]圖4A、圖4B分別是磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌響應(yīng)磷脂酶D水解釋放原藥的結(jié)果；
[0035]圖5A是磷脂酰阿霉素分別對MCF-7和MCF-7/ADR的細(xì)胞毒性結(jié)果，其中，D0X代表游離阿霉素，PX代表磷脂酰阿霉素；
[0036]圖5B是磷脂酰米托蒽醌分別對MCF-7和MCF-7/ADR的細(xì)胞毒性結(jié)果，其中，MA代表游離米托蒽醌，PMA代表磷脂酰米托蒽醌；
[0037]圖6A、圖6B分別是激光共聚焦檢測MCF-7/ADR分別對游離藥物(阿霉素、米托蒽醌)和磷脂酰納米前藥(磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌)的攝入結(jié)果；
[0038]圖7是根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施提供的磷脂酰阿霉素納米前藥的合成示意圖；
[0039]圖8是根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施提供的磷脂酰阿霉素納米前藥自組裝成膠束以及在磷脂酶D的作用下水解釋放阿霉素的示意圖。
【具體實施方式】
[0040]以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0041]根據(jù)本發(fā)明，所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物不限分子結(jié)構(gòu)，實際上，只要是含有伯醇并且具有親水性的抗腫瘤藥物均可適用于本發(fā)明。作為舉例而非限制地，本發(fā)明分別以鹽酸阿霉素和鹽酸米托蒽醌作為抗腫瘤藥物進(jìn)行示例。
[0042]實施例1磷脂酰納米前藥的制備
[0043]1.1磷脂酰阿霉素及其膠束的制備
[0044](I)取0.3g阿霉素溶于7ml乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.2M)和Iml異丙醇中；0.2g磷脂酰膽堿溶于5ml正庚烷中；然后將上述溶液混合，超聲溶解后，加入100U磷脂酶D酶液；
[0045](2)在45°C，220rmp搖床中反應(yīng)8小時；
[0046](3)用氯仿對步驟(2)獲得的反應(yīng)液進(jìn)行反復(fù)萃?。?br>[0047](4)用柱層析法對步驟(3)中的混合溶液進(jìn)行分離純化，流動相為氯仿:無水乙醇:三乙胺:水(10:11.3:11.7:2.7)，固定相為硅膠粉(300-400目)；
[0048](5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā):將步驟(4)中分離后的溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，條件為30°C，2?5小時；
[0049](6)溶劑除鹽:用少量的無水乙醇將步驟(5)獲得的產(chǎn)物中的無機(jī)鹽去除；
[0050](7)冷凍干燥:將步驟(6)所獲得的磷脂酰阿霉素固體進(jìn)行冷凍干燥，-80°C預(yù)凍24小時，冷凍干燥24-48小時，即獲得磷脂酰阿霉素；
[0051 ] (8)制備膠束:
[0052]a.將0.2mg/ml的磷脂酰阿霉素(DMSO)慢慢滴入有磁力攪拌的水中，滴入速度lml/min，最終達(dá)到磷脂酰阿霉素濃度為0.02mg/ml;
[0053]b.上述溶液攪拌半個小時后，將其裝入透析袋中進(jìn)行透析，透析過程中，剛開始每隔2h換水一次，反復(fù)3次，最后透析一天，取出獲得的目的溶液；
[0054]c.透析后的溶液超聲10分鐘，0.45μπι過濾器過濾去除雜質(zhì)，即得所需要的膠束溶液。
[0055]1.2磷脂酰米托蒽醌及其膠束的制備
[0056](I)取0.7g米托蒽醌溶于7ml乙酸-乙酸鈉緩沖液(0.2M)和Iml異丙醇;取0.2g磷脂酰膽堿溶于5ml正庚烷;然后將上述溶液混合，超聲溶解后，加入100U磷脂酶D酶液；
[0057](2)在45°C，220rmp搖床中反應(yīng)8小時；
[0058](3)用正己烷對步驟(2)獲得的反應(yīng)液進(jìn)行反復(fù)萃??；
[0059](4)用柱層析法對步驟(3)中的混合溶液進(jìn)行分離純化，流動相為氯仿:無水乙醇:三乙胺:水(10:11.3:11.7:2.7)，固定相為硅膠粉(300-400目)；
[0060](5)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā):將步驟(4)中分離后的溶液進(jìn)行，條件為30°C，2?5小時；
[0061](6)溶劑除鹽:用少量的無水乙醇將步驟(5)獲得的產(chǎn)物中的無機(jī)鹽去除；
[0062](7)冷凍干燥:將步驟(6)所獲得的磷脂酰米托蒽醌固體進(jìn)行冷凍干燥，-80°C預(yù)凍24小時，冷凍干燥24-48小時，即獲得磷脂酰米托蒽醌純品；
[0063]⑶制備膠束:
[0064]a.取Img的磷脂酰米托蒽醌，溶于少量的四氫呋喃中，慢慢滴入到有磁力攪拌的水中，最終達(dá)到lmg/ml ；
[0065]b.28°C，攪拌2小時，即得所需要的膠束溶液。
[0066]實施例2對磷脂酰納米前藥進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和膠束性質(zhì)鑒定
[0067]2.1采用紅外的方法分別對實施例1制備得到的磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的化學(xué)組成進(jìn)行確證，結(jié)果分別如圖1A和圖1B所示:PC的特征峰(l)2924cm—S長鏈上CH2伸展振動(2) 1736.lcm—⑶=0的-C = O的伸縮峰;阿霉素的特征峰圖(A)a: (I) 1617.lcm—S苯環(huán)上-C = O的峰(2)1582.6cm—1A = C的伸縮峰。由磷脂酰阿霉素的紅外譜圖(A)c可找到PC和阿霉素的特征峰(I)2924^1^(2) 1736.1cnf1(S) 1617.101^(4) 1582.6cm—1。同樣對于磷脂酰米托蒽醌，也可以找到PC和米托蒽醌的特征峰。
[0068]2.2采用質(zhì)譜分析方法分別對磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的分子量進(jìn)行確證，結(jié)果如圖2A和圖2B所示，磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的理論分子量分別為1225和1126，與圖2結(jié)果一致，證明新物質(zhì)的形成。
[0069]2.3采用透射電鏡法分別對磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌形成的膠束形貌進(jìn)行觀察。用鑷子夾住銅網(wǎng)插入到制樣系統(tǒng)內(nèi)，用移液槍移取約5yL樣品溶液滴到銅網(wǎng)上，通過兩側(cè)的濾紙拍打幾秒吸去多余的溶液制得一層薄膜，透射電鏡中(JE0LJEM — 1400TEM)觀察，操作電壓為120kV。結(jié)果如圖3A和圖3B所示，說明形成的膠束。
[0070]2.4磷脂酰阿霉素膠束和磷脂酰米托蒽醌膠束分別在模擬生理環(huán)境下和適量的PLD條件(1nm CaCl2)進(jìn)行水解反應(yīng)。反應(yīng)條件:pH: 7.2，溫度:37 °C，轉(zhuǎn)速:220rpm。在反應(yīng)的不同時間間隔點取水解后的反應(yīng)液0.2ml，HPLC定量水解后原藥的量，計算水解率。
[0071]水解率=水解后溶液中原藥摩爾量X 100 % /水解前溶液中前藥摩爾量
[0072]結(jié)果如圖4A和圖4B所示，前藥磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌在生理條件下穩(wěn)定存在;在PLD存在的條件下，隨著時間的延長，前藥被逐漸水解釋放出原藥，具有酶促響應(yīng)釋放特性。
[0073]2.5采用CCK-8法分別檢測磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌對MCF-7/ADR耐藥株的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，其中，MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，設(shè)置游離的阿霉素和磷脂酰阿霉素的終濃度(等當(dāng)量的阿霉素濃度)分別為0.5、
l、2、4、6、8、10、15yg/ml培養(yǎng)基，設(shè)置游離的米托蒽醌和磷脂酰米托蒽醌的終濃度(等當(dāng)量的米托蒽醌濃度)分別為1.25、2.5、5、10、20yg/ml，同時留有不加藥的空白對照組，每個藥物濃度3個復(fù)孔，然后去除96孔板孔中培養(yǎng)基，加含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。每孔加10ylCCK-8，4小時后，在酶聯(lián)免疫檢測儀0D450nm處測量各孔的吸光值，計算各藥物濃度對細(xì)胞的抑制作用效果。結(jié)果如圖5A和圖5B所示，由此計算出，逆轉(zhuǎn)耐藥系數(shù)分別為4.87和10.12，說明磷脂酰納米藥物對耐藥株存在逆轉(zhuǎn)效果。
[0074]2.6采用激光共聚焦檢測MCF-7/ADR分別對磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌的攝取情況，阿霉素和磷脂酰阿霉素的檢測條件:激發(fā)488nm波長發(fā)射光譜610?620nm;米托蒽醌和磷脂酰米托蒽醌的檢測條件:激發(fā)488nm，發(fā)射光譜650nm?700nm，步驟如下:
[0075](I)將MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞分別栽至玻璃底直徑為40mm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度在30萬左右，37°C，5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中貼壁過夜培養(yǎng)。
[0076](2)游離阿霉素(米托蒽醌)和磷脂酰阿霉素(磷脂酰米若蒽醌)分別設(shè)置3組實驗，一組為僅加藥培養(yǎng)兩小時的對照組，第二組和第三組實驗組為先加藥培養(yǎng)2h，然后分別在不含藥的EBSS緩沖液(主要由氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉等組成，不含鈣鎂，不含酚紅，PH值7.2)中繼續(xù)培養(yǎng)2h、4h用于細(xì)胞栗出藥物的實驗組。
[0077](3)對照組加藥培養(yǎng)2h后，立即用緩沖液洗滌三遍，最后用共聚焦顯微鏡觀察拍攝。而后面兩組栗出藥物實驗組加藥培養(yǎng)2h后，去除上清培養(yǎng)液，用冰PBS(pH=7.2)洗滌三遍，加不含藥的新鮮EBSS緩沖液500ul，37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h或者4h，用于細(xì)胞栗出藥物實驗組。2h或4h后兩組用冰PBS洗滌兩遍，共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0078]結(jié)果如圖6A和圖6B所示，第一行:MCF-7敏感株細(xì)胞添加阿霉素(或米托蒽醌)的實驗組;第二行:MCF-7/ADR耐阿霉素細(xì)胞株中添加阿霉素(或米托蒽醌)實驗組;第三行:MCF-7/ADR耐阿霉素細(xì)胞株中添加等當(dāng)量的磷脂酰阿霉素(或磷脂酰米托蒽醌)實驗組;第一列:癌細(xì)胞在含藥的EBSS中培養(yǎng)2h;第二列:在含藥的EBSS中培養(yǎng)2h后，然后在不含藥的EBSS緩沖液中繼續(xù)培養(yǎng)2h;第三列:在含藥的EBSS中培養(yǎng)2h后，然后在不含藥的EBSS緩沖液中繼續(xù)培養(yǎng)4h。上述結(jié)果表明，MCF-7/ADR對游離藥物阿霉素和米托蒽醌有栗出現(xiàn)象，可以提高并隨時間的延長，栗出量增加;MCF-7/ADR對磷脂酰阿霉素和磷脂酰米托蒽醌無明顯栗出現(xiàn)象，且比游離藥物的熒光強(qiáng)度強(qiáng)。由此說明，磷脂酰納米藥物能提高M(jìn)CF-7/ADR耐藥株細(xì)胞對藥物的攝取，同時能躲避MCF-7/ADR的藥物栗出作用。
[0079]以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的上述實施例還可以做出各種變化。即凡是依據(jù)本發(fā)明申請的權(quán)利要求書及說明書內(nèi)容所作的簡單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。本發(fā)明未詳盡描述的均為常規(guī)技術(shù)內(nèi)容。
【主權(quán)項】
1.一種酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥，其特征在于，所述磷脂酰納米前藥由含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物和磷脂類化合物在磷脂酶D的催化作用下通過磷氧鍵鍵合形成。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酰納米前藥，其特征在于，所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物選自:鹽酸阿霉素和鹽酸米托蒽醌。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磷脂酰納米前藥，其特征在于，所述磷脂類化合物選自二癸?；字Ｄ憠A，二月桂酰基磷脂酰膽堿，二肉豆蔻?；字Ｄ憠A，二棕櫚?；字Ｄ憠A，二硬脂?；字Ｄ憠A，二油酰基磷脂酰膽堿，二芥酰基磷脂酰膽堿，1-肉豆蔻酰基-2-硬脂?；字Ｄ憠A，1-肉豆蔻酰基-2-棕櫚?；字Ｄ憠A，1-硬脂?；?2-肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿，1-硬脂酰基-2-棕櫚?；字Ｄ憠A，1-棕櫚?；?2-硬脂?；字Ｄ憠A，1-肉豆蔻?；?2-油?；字Ｄ憠A，1-棕櫚?；?2-油?；字Ｄ憠A，1-硬脂?；?2-油?；字Ｄ憠A。4.一種根據(jù)權(quán)利要求1?3中任意一項所述的酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括:將含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物和磷脂類化合物分別進(jìn)行溶解，然后混合，向其中加入磷脂酶D，30?50°C下反應(yīng)4?24h，所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物與磷脂類化合物在磷脂酶D的催化下通過磷氧鍵結(jié)合生成一種雙親性的磷脂酰納米前藥。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法具體包括:以乙酸-乙酸鈉緩沖液和異丙醇的混合液為溶劑溶解所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物，以及通過有機(jī)溶液溶解所述磷脂類化合物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法更具體地包括以下步驟:1)藥物溶液的配置:以乙酸-乙酸鈉緩沖液和異丙醇為溶劑，配置抗腫瘤藥物溶液，超聲溶解;2)磷脂酰膽堿溶液的配置:以正庚烷為溶劑，配置磷脂酰膽堿溶液，超聲溶解;3)混合步驟I)和2)的溶液，加入磷脂酶D酶液，在30?50 °C下，搖床中反應(yīng)4?24h; 4)溶劑萃取:將步驟3)中獲得的反應(yīng)液用正己烷萃取;5)分離純化:用柱層析法將步驟4)獲得的混合溶液進(jìn)行分離，流動相為氯仿:無水乙醇:三乙胺:水=10:11.3:11.7:2.7，固定相為硅膠粉;6)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā):將步驟5)中分離后的溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，條件為25?35°C，2?5小時;7)溶劑除鹽:用無水乙醇將步驟(6)中少量的無機(jī)鹽除去，揮干;8)冷凍干燥:將步驟7)所獲得的固體進(jìn)行冷凍干燥。7.—種根據(jù)權(quán)利要求1?3中任意一項所述的酶促響應(yīng)釋放的磷脂酰納米前藥將抗腫瘤藥物靶向釋放到腫瘤組織中的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的磷脂酰納米前藥，其特征在于，所述磷脂酰納米前藥在水相中發(fā)生分子自組裝形成膠束，當(dāng)所述膠束靶向性的進(jìn)入腫瘤組織后，所述膠束在腫瘤組織中高表達(dá)的磷脂酶D的催化作用下水解釋放出所述含有伯醇的親水性抗腫瘤藥物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的磷脂酰納米前藥，其特征在于，所述膠束的粒徑為20nm?150nmo10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，包括:將所述磷脂酰納米前藥本身作為藥物載體進(jìn)一步裝載具有協(xié)同作用的其他抗腫瘤藥物或相關(guān)基因，被動靶向到腫瘤組織中響應(yīng)酶促水解釋放。
【文檔編號】A61K31/704GK105963708SQ201610399628
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】陶欣藝, 王風(fēng)清, 魏東芝, 賈寧, 陳能輝, 趙明
【申請人】華東理工大學(xué)