一種含青蒿素和紫杉醇的聯(lián)合用藥物及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種聯(lián)合用藥物，含有第一活性成分青蒿素或其衍生物，和第二活性成分紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，以及任選的藥學(xué)可接受的輔料。青蒿素或其衍生物與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用可以用于治療和/或預(yù)防黑色素瘤，二者具有很好的協(xié)同作用，同時大大降低了紫杉醇的用量。
【專利說明】
一種含青蒿素和紫杉醇的聯(lián)合用藥物及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種含青蒿素和紫杉醇的聯(lián)合用藥物，該聯(lián)合用藥物可以用于治療和 /或預(yù)防黑色素瘤。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑色素瘤是臨床上較為常見的皮膚黏膜和色素膜惡性腫瘤，是一種十分危險的致 命皮膚癌，其發(fā)病率雖較基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌低，但惡性度大，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，死亡率高。
[0003] 根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN)指南，一線治療推薦達卡巴嗪（Dacarbazine， DTIC)單藥、替莫唑胺（Temozolomide，TMZ)或TMZ/DTIC單藥為主的聯(lián)合治療（如聯(lián)合順 鉑或福莫斯?。?；2008年新增二線治療一般推薦紫杉醇聯(lián)合卡鉑方案。長期以來，達卡巴嗪 是晚期黑色素瘤內(nèi)科治療的"金標(biāo)準(zhǔn)"，單藥治療有效率為7. 5%~12. 2%，目前其他化療 藥物在總生存上均未超越達卡巴嗪?，F(xiàn)階段，化療對于中國黑色素瘤患者來說還是一項重 要的治療手段。因此，研發(fā)出有效、毒副作用較低的抗黑色素瘤藥物意義重大，也很迫切。
[0004] 青蒿素是我國中國醫(yī)藥學(xué)工作者1971年從菊科植物黃花蒿（Atemisia annua L.) 葉中提取分離得到的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，其結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)抗瘧藥完 全不同，能迅速殺滅紅細(xì)胞內(nèi)期瘧原蟲，為WHO認(rèn)定的全球控制瘧疾流行的有效藥物，也是 我國具有安全知識產(chǎn)權(quán)的藥物。經(jīng)過化學(xué)改造可生成多種衍生物，如青蒿琥酯、雙氫青蒿 素、蒿甲醚等均是治療瘧疾的高效低毒的單體。
[0005] 隨著研究的深入，青蒿素及其衍生物在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗血吸蟲等方面均有一 定的療效。尤其在抗腫瘤方面，青蒿素及其衍生物主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制自由基的產(chǎn) 生、抑制血管生成等作用發(fā)揮抗腫瘤作用。而且青蒿素類藥物作用并不是單一靶點，能有效 克服多藥耐藥，與傳統(tǒng)化療藥無交叉耐藥，又安全、低毒。
[0006] 紫杉醇（Taxol)是從紫杉（紅豆杉）的樹皮、樹干或針葉中提取或半合成的二萜 類化合物，通過促進微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白穩(wěn)定，抑制細(xì)胞有絲分裂，臨床 上常作為治療乳腺癌、卵巢癌和肺癌的一線藥物使用，另外也用于聯(lián)合用藥治療膀胱癌、食 管癌、腎癌等。但是，化療時紫杉醇導(dǎo)致的過敏反應(yīng)、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、心臟毒性等發(fā) 生率較高。
[0007] 本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)紫杉醇與青蒿素及其衍生物有良好的協(xié)同抗黑色素瘤作用， 而且聯(lián)合用藥能大大減少紫杉醇的用量，降低其毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一方面提供一種聯(lián)合用藥物，含有第一活性成分青蒿素或其衍生物， 和第二活性成分紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，以及任選的藥學(xué)可接受的輔料。
[0009] 本發(fā)明的第二方面提供本發(fā)明第一方面所述的聯(lián)合用藥物在制備用于治療和/ 或預(yù)防黑色素瘤的藥物中的用途。
[0010] 本發(fā)明的第三方面提供一種治療和/或預(yù)防黑色素瘤的方法，該方法是將第一活 性成分青蒿素或其衍生物和第二活性成分紫杉醇聯(lián)合施用到需要治療的個體中，或者是將 本發(fā)明第一方面所述的聯(lián)合用藥物施用到需要治療的個體中。其中第一活性成分和第二活 性成分同時、分別或者依次施用到需要治療的個體中。
[0011] 本發(fā)明中，所述的青蒿素或其衍生物選自青蒿素、青蒿琥酯、雙氫青蒿素、蒿甲醚 或其可藥用的鹽、水合物，優(yōu)選為青蒿琥酯、雙氫青蒿素。
[0012] 本發(fā)明中，雙氫青蒿素的結(jié)構(gòu)式如式1所示，青蒿琥酯的結(jié)構(gòu)式如式2所示，紫杉 醇的結(jié)構(gòu)式如式3所示。
[0014] 本發(fā)明所述的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分與第二活性成分的摩爾比為1:1~ 4:1，優(yōu)選為1:1~7:3,更優(yōu)選為3:2~7:3,進一步優(yōu)選7:3。
[0015] 在一個具體實施方案中，本發(fā)明所述的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分為雙氫青 蒿素或其可藥用鹽、水合物，第二活性成分為紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，第一活性成分 與第二活性成分的摩爾比為3:2~7:3,進一步優(yōu)選7:3。
[0016] 在另一個具體實施方案中，本發(fā)明所述的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分為青蒿 琥酯或其可藥用鹽、水合物，第二活性成分為紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，第一活性成分 與第二活性成分的摩爾比為1:1~7:3,優(yōu)選為3:2~7:3,進一步優(yōu)選7:3。
[0017] 本發(fā)明所述的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分和第二活性成分在同一種制劑單元 中，或者第一活性成分和第二活性成分分別在不同的規(guī)格制劑單元中。
[0018] 在應(yīng)用本發(fā)明所述的聯(lián)合用藥物時，其中第一活性成分和第二活性成分可以同 時、分別或者依次給藥。
[0019] 發(fā)明的有益效果
[0020] 本發(fā)明分別進行了青蒿素或其衍生物與紫杉醇聯(lián)合抑制B16(小鼠黑色素瘤細(xì) 胞）增殖的試驗。結(jié)果顯示，本發(fā)明青蒿素或其衍生物與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對黑色素瘤細(xì)胞 的抑制作用有很好的協(xié)同效應(yīng)，大大減少了紫杉醇的用量，并且提高了療效，在達到相同的 治療效果的情況下，有效降低了紫杉醇的毒副作用。
【附圖說明】
[0021] 圖1為雙氫青蒿素與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對B16黑色素瘤細(xì)胞作用的Fa-CI值曲線 圖。
[0022] 圖2為青蒿琥酯與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對B16黑色素瘤細(xì)胞作用的Fa-CI值曲線圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0024] 試劑和方法
[0025] 細(xì)胞株：B16黑色素瘤細(xì)胞，購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC)，細(xì)胞編號：CX0036。
[0026] 藥品：雙氫青蒿素（DHA，重慶華立武陵山制藥有限公司，純度99. 1% )，注射用青 蒿琥酯（ATS，桂林南藥，批號ZA111202)，紫杉醇（Taxol，上海龍翔生物醫(yī)藥開發(fā)有限公司， 批號 120703)。
[0027] 藥物配制：① 100 μ M青蒿琥酯（ATS)藥液的配制：用ImLO. 5 %碳酸氫鈉溶液溶 解60mg青蒿琥酯，藥物濃度為60000 μ g/mL。取10 μ L60000 μ g/mL的ATS至含有5990 μ L RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco,貨號：11875-093,下同）的IOmL刻度離心管中，濃度即為 100 μ g/mL ;取 3. 84mL 至 6. 16mL RPMI-1640 培養(yǎng)基中，即可配成 100 μ M (38. 4 μ g/mL)的 ATS母液，其中碳酸氫鈉濃度為0. 003%。
[0028] ②100 μ M雙氫青蒿素（DHA)藥液的配制：用十萬分之一天平稱取DHAO. OlOOgJ 200 μ L二甲基亞砜（DMSO)進行溶解，藥物濃度為50000 μ g/mL。取10 μ L50000 μ g/mL的 0擬至含有499(^1^?]\〇-1640培養(yǎng)基的1〇1^刻度離心管中，8卩為10(^8/111匕取2.841^ 至7. 16mL RPMI-1640培養(yǎng)基中，即可配成100 μ M(28. 4 μ g/mL)的DHA母液，其中DMSO濃 度為0.06%。
[0029] ③100 μΜ紫杉醇（Taxol)藥液的配制：用十萬分之一天平稱取TaxolO. OlOOg， 用200 μ LDMSO進行溶解，藥物濃度為50000 μ g/mL。取20 μ L50000 μ g/mL的Taxol至含 有9980 μ L RPMI-1640培養(yǎng)基的IOmL刻度離心管中，即為100 μ g/mL，取8. 54mL至I. 46mL RPMI-1640培養(yǎng)基中，即可配成100 μ M(85. 4 μ g/mL)的Taxol母液，其中DMSO濃度為 0· 17%〇
[0030] 將各自配成的100 μ M母液于-20°C保存，使用時用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋 到相應(yīng)濃度。
[0031] 實驗方法：
[0032] 取對數(shù)生長期的B16黑色素瘤細(xì)胞接種到96孔板中，細(xì)胞接種密度約為 1.0 X 105/mL，每孔90 μ L，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24小時。然后取出培養(yǎng)板， 將各藥液稀釋到工作濃度后加入各孔，每孔加10 μ L藥液。藥物終濃度具體見表1和表2， 各濃度設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)置對照組（含有細(xì)胞的培養(yǎng)液）和空白組（空白培養(yǎng)液），置于 37°C、5% (：02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0033] 藥物處理 48 小時后，每孔加入 Cell Counting Kits-8(CCK-8, D0JIND0,批號： EQ829)試劑10 yL，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱孵育4小時，在酶標(biāo)儀檢測波長為450nm，參 考波長為630nm的條件下檢測吸光度OD值。計算腫瘤細(xì)胞生長抑制率（％)時，計算公式 如下：
[0034] 抑制率（％) =(對照組平均OD值-給藥組平均OD值）/對照組平均OD 值 X 100% ο
[0035] 聯(lián)合用藥分析方法：根據(jù)Chou T. C.和Talalay Ρ.提出的合并指數(shù)定理（The Combination Index Theorem)和質(zhì)量作用中效定理（The Median-Effect Equation As the Unified Theory)進行分析（參考文獻為：Am J Cancer Res 2011 ;1 (7) :925-954)〇
[0036] 藥物質(zhì)量作用中效定理公式為：Dx= Dm[fa/(l_fa)]1/m，
[0037] 藥物合并指數(shù)定理公式為：Cl = (D)Z(Dx)J(D)^(Dx)2，其中：
[0038] Cl (Combo index)是藥物聯(lián)合用藥指數(shù)，（Dx)1是第一個藥物（D)淨(jìng)獨作用時抑制 率為X%的劑量，（D x)2是第二個藥物（D) 2單獨作用時抑制率為X%的劑量，而（D) JP (D) 2 分別是在兩藥聯(lián)合使用時抑制率也為X%時第一個藥物和第二個藥物的劑量。Dni是藥物的 中效劑量濃度（IC 5。)，m表示質(zhì)量作用中效定理曲線的斜率，fa是抑制率。
[0039] 當(dāng)Cl = 1時，表示相加作用；當(dāng)Cl > 1時，表示詰抗作用；當(dāng)Cl < 1時，表示協(xié)同 作用。
[0040] 使用CompuSyn 1.0電腦軟件輸入各單藥及其聯(lián)合用藥在各劑量濃度的抑制率 (即fa值），則可以自動演算m、r及Dj直，并模擬出fa-CI圖形（Chou-Talalay Plot)，自 動掃描測定藥物的拮抗、相加或協(xié)同作用。其中r表示質(zhì)量作用中效定理曲線的線性相關(guān) 系數(shù)，r值不小于0. 95表示模擬的參數(shù)線性良好。實驗重復(fù)3次，每次數(shù)據(jù)單獨處理，根據(jù) 3次試驗的均值土標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計Dm、m和r的值。
[0041 ]表 1
[0045] 實施例1雙氫青蒿素（DHA)與紫杉醇（Taxol)聯(lián)合應(yīng)用對B16黑色素瘤細(xì)胞的抑 制性試驗（η = 3)，實驗結(jié)果見表3。
[0046] 表 3
[0048] 根據(jù)以上實驗結(jié)果，使用Compusyn L 0軟件對數(shù)據(jù)進行運算可得參數(shù)Dm、m以及 質(zhì)量作用中效定理曲線的線性相關(guān)系數(shù)r (η = 3)，結(jié)果見表4,并模擬DHA與Taxol藥物聯(lián) 合對Β16黑色素瘤細(xì)胞作用的Fa-CI值曲線圖，如附圖1所示。
[0049] 表 4
[0052] 在考察DHA與Taxol不同配比的組合物對B16黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用的試驗 中，質(zhì)量作用中效定理曲線的線性相關(guān)系數(shù)r的均值均大于0.95,表示參數(shù)擬合良好。單 獨用藥時，DHA和Taxol的D ni均值（半數(shù)抑制濃度）分別為11. 672 μΜ和I. 001yM;DHA 和Taxol組合物在摩爾比為3:2和7:3時，Dni均值（半數(shù)抑制濃度）分別為0. 865 μ M和 0. 472 μ Μ，比DHA或者Taxol單獨用藥時的Dni均值要低，當(dāng)DHA和Taxol的摩爾比為7:3時 Dm均值降低的更為明顯。
[0053] 由附圖1所示的Fa-CI曲線圖可以發(fā)現(xiàn)，DHA和Taxol的摩爾比為3:2和7:3時， CI值均小于1，表明二者聯(lián)合應(yīng)用時具有較好的協(xié)同作用，其中DHA和Taxol的摩爾比為 7:3時，二者的協(xié)同作用最為明顯。
[0054] 實施例2青蒿琥酯（ATS)與紫杉醇（Taxol)聯(lián)合應(yīng)用對Β16黑色素瘤細(xì)胞的抑制 性試驗（η = 3)，實驗結(jié)果見表5。
[0055] 表 5

[0058] 根據(jù)以上實驗結(jié)果，使用Compusyn I. 0軟件對數(shù)據(jù)進行運算可得參數(shù)Dm、m以及 質(zhì)量作用中效定理曲線的線性相關(guān)系數(shù)r (η = 3)，結(jié)果見表6,并模擬ATS與Taxol藥物聯(lián) 合對Β16黑色素瘤細(xì)胞作用的Fa-CI值曲線圖，如附圖2所示。
[0059] 表 7
[0061] 在考察ATS與Taxol不同配比的組合物對Β16黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用的試驗 中，質(zhì)量作用中效定理曲線的線性相關(guān)系數(shù)r的均值均大于0.95,表示參數(shù)擬合良好。單 獨用藥時，ATS和Taxol的D ni均值（半數(shù)抑制濃度）分別為2. 573 μ M和0· 772 μ M ;ATS與 Taxol的摩爾比為1:1、3:2和7:3時，D"(半數(shù)抑制濃度）均值分別為0.711 μM、0.497 μM 和0. 359 μ Μ，比ATS或者Taxol單獨用藥時的Dni均值都要低，而且ATS與Taxol的摩爾比 為7:3時Dm均值降低的更為明顯。
[0062] 由附圖2所示的Fa-CI曲線圖可以發(fā)現(xiàn)，ATS與Taxol的摩爾比為1:1、3:2和7:3 時，CI值均小于1，表明二者聯(lián)合應(yīng)用時具有較好的協(xié)同作用，其中ATS和Taxol的摩爾比 為7:3時，二者的協(xié)同作用最為明顯。
【主權(quán)項】
1. 一種聯(lián)合用藥物，含有第一活性成分青蒿素或其衍生物，和第二活性成分紫杉醇或 其可藥用鹽、水合物，以及任選的藥學(xué)可接受的輔料。2. 權(quán)利要求1的聯(lián)合用藥物，其中所述的青蒿素或其衍生物選自青蒿素、青蒿琥酯、雙 氫青蒿素、蒿甲醚或其可藥用鹽、水合物。3. 權(quán)利要求1的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分與第二活性成分的摩爾比為1:1~ 4:1〇4. 權(quán)利要求1的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分與第二活性成分摩爾比為1:1~7:3。5. 權(quán)利要求1的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分與第二活性成分摩爾比為3:2~7: 3。6. 權(quán)利要求1的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分為雙氫青蒿素或其可藥用鹽、水合物， 第二活性成分為紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，第一活性成分與第二活性成分的摩爾比為 3:2 ~7:3〇7. 權(quán)利要求1的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分為青蒿琥酯或其可藥用鹽、水合物， 第二活性成分為紫杉醇或其可藥用鹽、水合物，第一活性成分與第二活性成分的摩爾比為 1:1 ~7:3〇8. 權(quán)利要求1-7任一項的聯(lián)合用藥物，其中第一活性成分和第二活性成分在同一種制 劑單元中，或者第一活性成分和第二活性成分分別在不同的規(guī)格制劑單元中。9. 權(quán)利要求1-8任一項所述的聯(lián)合用藥物在制備用于治療和/或預(yù)防黑色素瘤的藥物 中的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK105982888SQ201510098908
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月3日
【發(fā)明人】宋健平, 徐勤, 李國銘, 鄧長生, 王振華, 周玖瑤, 關(guān)業(yè)枝, 王琪, 張紅英, 鄭紹琴, 高巖, 胡艷山, 黃博
【申請人】廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技產(chǎn)業(yè)園有限公司