Sec的應(yīng)用及抗病毒疫苗佐劑和復(fù)合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域，涉及疫苗佐劑，具體涉及金黃色葡萄球菌腸毒素C2(Staphylococcus enterotoxin,SEC2)作為疫苗佐劑和用于制備疫苗復(fù)合物的用途及方法。本發(fā)明將SEC2作為疫苗佐劑，經(jīng)實驗證實，所述的SEC2可作為口蹄疫疫苗佐劑。本發(fā)明利用SEC2作為佐劑，與現(xiàn)有商品疫苗對比，能顯著提高抗體滴度和細胞因子IL-4、IFN-γ的表達，更有效地刺激體液免疫和細胞免疫反應(yīng)。同時本發(fā)明的佐劑便于生產(chǎn)、運輸、成本低、用于疫苗制備方便、易于推廣。
【專利說明】
SEC的應(yīng)用及抗病毒疫苗佐劑和復(fù)合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑及其制備方法，涉及一種新型的生物蛋白佐劑及其制備 方法，其主要成分為金黃色葡萄球菌腸毒素 C2,用于不同類型抗原的疫苗制備，用于不同種 偶蹄目動物免疫接種所需疫苗佐劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著抗生素濫用導(dǎo)致越來越嚴重的問題，和新型耐藥細菌和病毒的不斷出現(xiàn)，感 染性疾病重新受到醫(yī)藥工作者們的密切重視。在感染性疾病的防控領(lǐng)域，接種疫苗依然是 最有效的手段之一，在這一過程中，佐劑的添加，能夠使疫苗復(fù)合物誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更強的免 疫應(yīng)答，提高抗體滴度，增強細胞因子的分泌水平，因此佐劑的應(yīng)用對于增強機體免疫系統(tǒng) 對疫苗抗原的應(yīng)答，提高疫苗的保護效果至關(guān)重要。而傳統(tǒng)疫苗中，大都為無佐劑添加或添 加的佐劑誘導(dǎo)免疫應(yīng)答單一，或其誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答效果不佳，因此已經(jīng)越來越不能 滿足對新型感染性疾病的防治需求，亟需具有更好免疫保護效果的新型佐劑問世。
[0003] 傳統(tǒng)佐劑中，僅鋁佐劑被應(yīng)用于人用疫苗，而獸用疫苗中最常用的佐劑為油乳佐 劑。其中鋁佐劑免疫機體，以體液免疫應(yīng)答為主，不能很好的誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，并且在大 部分病毒性感染中，細胞免疫應(yīng)答發(fā)揮了關(guān)鍵性作用；油乳佐劑雖然能夠很好的誘導(dǎo)機體 產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答，但其副作用也是顯著的，主要是在注射部位常發(fā)生肉 芽腫、紅腫等現(xiàn)象。
[0004] 金黃色葡萄球菌腸毒素 C2作為一種超抗原能夠顯著性地提高機體的免疫應(yīng)答效 果，刺激CD4+T和CD8+T淋巴細胞的大量增殖，促進細胞因子幾-2、幾-4、TNF- α和IFN- γ 等的分泌。因此SEC2作為疫苗佐劑在提升疫苗抗原免疫應(yīng)答方面具有很好應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了一種新型疫苗佐劑，另一個目的在于提供了該新型疫苗 佐劑的制備方法及應(yīng)用，所述疫苗佐劑為獸用口蹄疫疫苗佐劑。
[0006] 金黃色葡萄球菌腸毒素 C2(SEC2)作為活性成份在制備抗病毒疫苗佐劑中的應(yīng) 用。
[0007] 所述的疫苗佐劑采用金黃色葡萄球菌腸毒素 C2為活性成份。
[0008] 所述的抗病毒疫苗是口蹄疫疫苗。
[0009] 所述的疫苗為DNA苗（NA疫苗所謂的DNA，是編碼"外源性抗原"的，舉例來說，口 蹄疫的DNA疫苗，其中所表述的DNA就是編碼口蹄疫抗原的）、亞單位疫苗或滅活疫苗。 [0010] 所述的疫苗為獸用疫苗。
[0011] -種抗病毒疫苗佐劑復(fù)合物，所述的疫苗佐劑復(fù)合物的活性成份為金黃色葡萄球 菌腸毒素 C2和滅活病毒。
[0012] 所述的抗病毒疫苗是口蹄疫疫苗，滅活病毒為口蹄疫滅活病毒。
[0013] 所述的疫苗佐劑復(fù)合物的活性成份中SEC2在疫苗復(fù)合物中的質(zhì)量分數(shù)為1/3。
[0014] 所述的疫苗佐劑可以應(yīng)用于各種偶蹄目動物的預(yù)防或治療口蹄疫疫苗。
[0015] 其制備步驟包括：將50微克的SEC2與100微克的口蹄疫滅活病毒混合，溶解于 200微升生理鹽水中，配制成最終疫苗。
[0016] 本發(fā)明提供了金黃色葡萄球菌腸毒素 C2的新用途，具體涉及SEC2作為疫苗佐劑 和用于制備疫苗復(fù)合物中的用途及其制備方法；本發(fā)明利用SEC2作為口蹄疫疫苗佐劑，能 顯著地增強疫苗免疫效果，顯著性地提高抗體滴度和細胞因子IL-4、IFN-γ的分泌水平。
[0017] 本發(fā)明將SEC2作為疫苗佐劑，經(jīng)實驗證實，所述的SEC2可以作為疫苗佐劑用于制 備抗病毒疫苗，尤其用于制備口蹄疫疫苗，其中所述的疫苗為DNA疫苗或滅活疫苗。
[0018] 本發(fā)明所述的口蹄疫疫苗中，所述的DNA疫苗，可以通過基因工程手段將SEC2表 達基因和病毒抗原基因克隆到大腸桿菌表達系統(tǒng)中，表達出融合蛋白質(zhì)，提取純化后確定 其蛋白質(zhì)濃度，即制備成疫苗。
[0019] 本發(fā)明所述的口蹄疫疫苗中，所述的滅活疫苗，可以使用商品疫苗中的抗原成分， 通過檢測蛋白質(zhì)濃度而確定其中滅活病毒含量，再與SEC2佐劑進行配伍而制成疫苗。
[0020] 本發(fā)明中所述的口蹄疫疫苗復(fù)合物中，口蹄疫滅活病毒含量根據(jù)文獻報道確定。
[0021] 本發(fā)明的疫苗佐劑與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：
[0022] (1)本發(fā)明利用金黃色葡萄球菌腸毒素 C2作為口蹄疫疫苗佐劑，可有效地增強口 蹄疫疫苗的免疫應(yīng)答。
[0023] (2)本發(fā)明所用的SEC2作為口蹄疫疫苗佐劑，能顯著地提高抗原免疫后的抗體滴 度和細胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平，增強免疫應(yīng)答效果。
[0024] (3)本發(fā)明的疫苗佐劑，具有使用方便、便于運輸、工藝簡單、成本低、免疫效果好、 適用于各種偶蹄目動物和易于推廣等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0025] 圖1為本發(fā)明實施例4中，終濃度分別為Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000 ng/ mL、10000ng/mL 的 SEC2 刺激小鼠的外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC)的增殖，以MTS染色法檢測增殖（橫坐標為終濃度為Ing/mL、10ng/mL、IOOng/ mL、1000ng/mL、10000ng/mL的本發(fā)明超抗原佐劑SEC2,縱坐標為增殖指數(shù)（Proliferation Index，PI)表示刺激小鼠的PBMC增殖能力，PI =實驗組吸光值/陰性對照組吸光值）。
[0026] 圖2為本發(fā)明實施例5中，終濃度分別為Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、 lOOOOng/mL的SEC2刺激小鼠的脾淋巴細胞的增殖，以MTS染色法檢測增殖（橫坐標為終濃 度為 lng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL 的本發(fā)明超抗原佐劑 SEC2,縱坐 標為增殖指數(shù)）。
[0027] 圖3為本發(fā)明實施例6中，ELISA法檢測免疫后各實驗組小鼠血清中細胞因子 IL-4的分泌水平（橫坐標為各采血時間點，分別為第一次免疫后的第0天、5天、10天、14 天、28天、42天、56天和70天，縱坐標為血清中IL-4的分泌水平）。
[0028] 圖4為本發(fā)明實施例6中，ELISA法檢測免疫后各實驗組小鼠血清中細胞因子 IFN-γ的分泌水平（橫坐標為各采血時間點，分別為第一次免疫后的第0天、5天、10天、14 天、28天、42天、56天和70天，縱坐標為血清中IFN- γ的分泌水平）。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1 :制備金黃色葡萄球菌腸毒素 C2
[0030] 陽性克隆大腸桿菌及金黃色葡萄球菌腸毒素 C2純化蛋白由本實驗室保存（表達 純化方法參照徐明愷，張成剛，周亞鳳，張先恩.2005.金黃色葡萄球菌腸毒素 C2的基因 克隆、表達及其生物學(xué)活性.生物化學(xué)與生物物理進展（SCI). 32(3) :275-281)。
[0031] 實施例2 :SEC2免疫BALB/c小鼠
[0032] 35只小鼠（6-8周齡雌性SPF級BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司）分 為5組，分別為SEC2給藥組、口蹄疫滅活病毒（FMDV Antigen)給藥組、SEC2+Antigen給藥 組、商品疫苗（豬口蹄疫0型滅活疫苗0/MYA98/BY/2010株，購自中農(nóng)威特生物科技股份有 限公司）給藥組和生理鹽水陰性對照組。間隔兩周免疫兩次，以左后肢肌肉注射，注射劑量 為200 μ L/只。配伍疫苗中SEC2劑量為50 μ g/支，口蹄疫滅活病毒劑量為100 μ g/支。
[0033] 將50微克的SEC2與100微克的口蹄疫滅活病毒混合，溶解于200微升生理鹽水 中，配制成最終疫苗。
[0034] 實施例3 :采集血清
[0035] 第一次免疫后的第0天、5天、10天、14天、28天、42天、56天和70天，以小鼠內(nèi)恥t 采血，血液樣品先置于4°C中靜置30分鐘，以4°C 5000rpm離心10分鐘分離血清，血清保存 于-70 °C用于ELISA檢測。
[0036] 實施例4 :檢測SEC2體外刺激小鼠的PBMC增殖
[0037] 小鼠斷頭取血，收集血液約10mL，1:1體積比加入稀釋液（含RPMI 1640細胞培養(yǎng) 基，購自Hyclone公司），混勾抗凝血，取15mL離心管，加入2mL淋巴細胞分離液（購自達 科為生物技術(shù)有限公司）于每支離心管，將稀釋過的血液覆蓋在分離液上層（保持液面分 界明顯），25°C下1500rpm離心30分鐘；取中間白膜層即為淋巴細胞層，再加入2mL RPMI 1640培養(yǎng)基于每支離心管，顛倒洗滌。25°C下1000 rpm離心10分鐘，收集細胞；每支離心 管內(nèi)加紅細胞裂解液（8. 9g NH4Cl, Ig KHCO3, 37. 2mg Na2EDTA, pH7. 2-7. 4,定容至 1L，過濾 除菌）lmL，同上離心，收集細胞；以含10%胎牛血清（購自Hyclone公司）的RPMI 1640培 養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度。以IX IO6Cells/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板中，再加入SEC2使終濃度為 Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL。在 CO2濃度為 5%、37°C下培養(yǎng) 48 小 時，MTS (購自Promega公司）染色法檢測PBMC增殖。
[0038] 小鼠的PBMC增殖指數(shù)如圖1所示。
[0039] 實施例5 :檢測SEC2體外刺激小鼠的脾淋巴細胞增殖
[0040] 無菌條件下摘取小鼠脾臟，剪碎研磨過200目細胞篩，紅細胞裂解液去除紅細胞， 再以無血清RPMI 1640清洗獲得小鼠的脾淋巴細胞。以含10%胎牛血清的RPMI 1640培 養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度，以5X IO6ceIls/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板中。再加入SEC2使終濃度為 Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL。在 CO2濃度為 5%、37°C下培養(yǎng) 48 小 時，MTS染色法檢測小鼠的脾淋巴細胞增殖。
[0041] 小鼠的脾淋巴細胞增殖指數(shù)如圖2所示。
[0042] 實施例6 :檢測血清中細胞因子E-4和IFN- γ
[0043] 檢測細胞因子采用ELISA法檢測（小鼠的細胞因子IL-4和IFN- γ的ELISA檢測 試劑盒購自達科為生物技術(shù)有限公司）。在96孔板上分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品 及酶標試劑，其余步驟相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標板上標準品準確加樣50 μ L，待 測樣品孔先加樣品稀釋液40 μ L，然后再加待測樣品10 μ L (樣品最終稀釋度為5倍）。將樣 品加于酶標板孔底部，盡量不接觸孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37°C孵育30分 鐘后，棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋好的洗滌液，靜置30秒后棄去洗滌液，如此重復(fù)5次， 拍干。再次孵育，后再次洗滌。每孔先加入顯色劑A 50 μ L，再加入顯色劑B 50 μ L，輕輕震 蕩混勻，37°C避光顯色10分鐘后，每孔加50 yL終止液終止反應(yīng)，以空白調(diào)零，450nm測OD 值（測定應(yīng)在終止液加入后的15分鐘以內(nèi)）。
[0044] 小鼠細胞因子IL-4和IFN-γ的分泌水平如圖3、4所示。
[0045] 實施例7 :檢測血清中抗體滴度
[0046] ELISA法（0型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸 醫(yī)研究所）檢測抗體滴度
[0047] 1)用包被緩沖液稀釋口蹄疫0型兔抗血清至工作濃度，在酶標板上加50 μ L/孔， 振蕩，封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。
[0048] 2)抗原抗體（陰陽性對照血清及待檢血清）反應(yīng)，稀釋血清：在96孔血清/病毒 抗原反應(yīng)板上，以50 μ L/孔的量用PBST兩倍連續(xù)稀釋被檢血清，從1 :4到1 :512。同時稀 釋陽性對照血清，從1 :8到1 :1024 ;稀釋陰性對照血清，從1 :2到1 :4 ;將病毒抗原用PBST 稀釋至工作濃度（1 :12)，以50 μ L/孔的量加入被檢血清、陰陽性對照血清的每一稀釋孔 內(nèi)，4孔病毒抗原對照孔僅加入100 μ L/孔稀釋至工作濃度的病毒抗原，振蕩，2-8°C過夜。 加入等量的病毒抗原后，血清的稀釋倍數(shù)加倍，變?yōu)? :8到1 :1024。
[0049] 3)用PBST連續(xù)洗酶標板5次，在吸水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從抗原抗體 反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至酶標板上的相對應(yīng)孔，50 μ L/孔，封板，37°C溫育60分鐘。
[0050] 4)同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋口蹄疫0型病毒豚鼠抗血清至 工作濃度（I :1〇〇〇)，加50 μ L/孔，封板，37°C溫育60分鐘。
[0051] 5)同上洗板5次，甩干。用PBST稀釋兔抗豚鼠血清IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物 至工作濃度（1 :500)，加50 μ L/孔，封板，37 °C溫育60分鐘。
[0052] 6)同上洗板5次，加50 μ L/孔底物溶液（底物溶液務(wù)必要加雙氧水，每ImL加 10 μ L本試劑盒配備的3%雙氧水），37°C溫育15分鐘。每孔再加50 μ L終止液終止反應(yīng)， 讀取OD492nni值。
[0053] 小鼠抗體滴度如表1所示。
[0054] 表1FMDV各組免疫小鼠血清中抗體滴度（mean土 sd)
[0056] 本發(fā)明將SEC2作為疫苗佐劑，經(jīng)實驗證實，所述的SEC2可作為口蹄疫疫苗佐劑。 本發(fā)明利用SEC2作為佐劑，與現(xiàn)有商品疫苗對比，能顯著提高抗體滴度和細胞因子IL-4、 IFN-γ的表達，更有效地刺激體液免疫和細胞免疫反應(yīng)。同時本發(fā)明的佐劑便于生產(chǎn)、運 輸、成本低、用于疫苗制備方便、易于推廣。
【主權(quán)項】
1. 金黃色葡萄球菌腸毒素 C2作為活性成份在制備抗病毒疫苗佐劑中的應(yīng)用。2. -種抗病毒疫苗佐劑，其特征在于：所述的疫苗佐劑采用金黃色葡萄球菌腸毒素 C2 為活性成份。3. 按照權(quán)利要求1所述的疫苗佐劑，其特征在于：所述的抗病毒疫苗是口蹄疫疫苗。4. 按權(quán)利要求2所述的疫苗佐劑，其特征在于：所述的疫苗為DNA苗、亞單位疫苗或滅 活疫苗。5. 按權(quán)利要求2、3或4所述的疫苗佐劑，其特征在于：所述的疫苗為獸用疫苗。6. -種抗病毒疫苗佐劑復(fù)合物，其特征在于：所述的疫苗佐劑復(fù)合物的活性成份為金 黃色葡萄球菌腸毒素 C2和滅活病毒。7. 按照權(quán)利要求6所述的疫苗佐劑復(fù)合物，其特征在于：所述的抗病毒疫苗是口蹄疫 疫苗，滅活病毒為口蹄疫滅活病毒。8. 按照權(quán)利要求7所述的疫苗佐劑復(fù)合物，其特征在于：所述的疫苗佐劑復(fù)合物的活 性成份中SEC2在疫苗復(fù)合物中的質(zhì)量分數(shù)為1/3。9. 按照權(quán)利要求7或8所述的疫苗佐劑復(fù)合物，其特征在于：所述的疫苗佐劑可以應(yīng) 用于各種偶蹄目動物的預(yù)防或治療口蹄疫疫苗。10. 按照權(quán)利要求7或8所述的疫苗佐劑復(fù)合物，其特征在于：其制備步驟包括：將50 微克的SEC2與100微克的口蹄疫滅活病毒混合，溶解于200微升生理鹽水中，配制成最終 疫苗。
【文檔編號】A61P31/14GK105983096SQ201510095597
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月4日
【發(fā)明人】徐明愷, 孟北乾, 張惠文, 張成剛
【申請人】中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所