基因工程菌vnp20009-m在制備預(yù)防和治療癌癥轉(zhuǎn)移的藥物上的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因工程菌VNP20009?M在制備預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移后癌癥的藥物上的應(yīng)用，基因工程菌VNP20009?M對(duì)癌細(xì)胞具有腫瘤靶向性以及顯著的抑制轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)的效應(yīng)，可以用于制備預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移后腫瘤的藥物。
【專利說(shuō)明】
基因工程菌VNP20009-M在制備預(yù)防和治療癌癥轉(zhuǎn)移的藥物上的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因工程菌VNP20009-M在制備預(yù)防和治療癌癥的藥物上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤是當(dāng)今社會(huì)威脅人類健康和患者生存的重大疾病病種。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，2012年全世界新患癌癥的病人約1400萬(wàn)，死于癌癥約820萬(wàn)人。我國(guó)腫瘤登記中心發(fā)布的2012年數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)每年新增癌癥病例約350萬(wàn)，約有250萬(wàn)人因此死亡。其中，腫瘤轉(zhuǎn)移則是癌癥患者死亡的最主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是一種復(fù)雜的、多步驟的生物學(xué)過(guò)程，腫瘤患者體內(nèi)的癌細(xì)胞發(fā)展到一定程度會(huì)通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處并存活下來(lái)，形成與原發(fā)瘤同樣類型的腫瘤。轉(zhuǎn)移作為腫瘤的主要惡性表現(xiàn)，嚴(yán)重影響了腫瘤患者的療效和預(yù)后。當(dāng)臨床診斷出原發(fā)腫瘤時(shí)，約50%的患者已產(chǎn)生了轉(zhuǎn)移。腫瘤的轉(zhuǎn)移是威脅腫瘤患者生存的最大殺手，也是腫瘤治療的最大瓶頸。在當(dāng)今種類繁多的抗癌藥物市場(chǎng)中，臨床一線的化療藥物(如阿霉素、多柔比星、紫杉醇等)大多作用于腫瘤的生存、增殖、血管生存等領(lǐng)域，以腫瘤轉(zhuǎn)移為特異性靶點(diǎn)的藥物較為少見(jiàn)，并且僅有的幾種抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物因其副作用大，患者耐藥性等原因而導(dǎo)致藥效有限。因此，抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物長(zhǎng)期處于市場(chǎng)嚴(yán)重缺乏狀態(tài)，開(kāi)發(fā)治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物具有極為重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2是多梳抑制復(fù)合物2(PRC2)中具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性成分，主要通過(guò)將三個(gè)甲基基團(tuán)加到組蛋白3的27號(hào)賴氨酸(H3K27)參與染色質(zhì)凝聚，從而抑制相關(guān)基因(例如抑癌基因)的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2及組蛋白H3K27甲基化與癌癥密切相關(guān)。EZH2首先被發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤、轉(zhuǎn)移性前列腺癌和乳腺癌中高表達(dá)，和乳腺癌的浸潤(rùn)相關(guān)。除此之外，EZH2在肺癌、淋巴癌、白血病、胰腺癌、宮頸癌、腸癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌等許多人類惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)，而且其表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移的腫瘤中顯著升高，與癌癥病人的預(yù)后不良密切相關(guān)。靶向EZH2藥物的臨床前模型顯示其能夠抑制腦癌及前列腺癌的進(jìn)展。因此，EZH2可以作為治療癌癥轉(zhuǎn)移的潛在藥物靶點(diǎn)，通過(guò)降低EZH2的表達(dá)和活性，從而減少組蛋白的甲基化，增強(qiáng)抑癌基因的表達(dá)來(lái)治療腫瘤。
[0004]隨著細(xì)菌以及病毒的靶向性和基因工程技術(shù)的發(fā)展，20世紀(jì)90年代中期以來(lái)，細(xì)菌治療腫瘤的研究急速增多。研究人員發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌可以作為一種很好的基因載體，在小鼠體內(nèi)能夠定向并有效地殺死腫瘤細(xì)胞。沙門(mén)菌屬是一群在人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的革蘭氏陰性、侵襲性細(xì)胞內(nèi)兼性厭氧菌。VNP20009為msb B,pur I基因缺失的減毒鼠傷寒沙門(mén)菌株，遺傳穩(wěn)定，對(duì)抗生素敏感。msb B基因?yàn)橹|(zhì)?；癁閮?nèi)毒素所必需，其缺失使類脂質(zhì)A末端不能?；?，降低了毒性;pur I基因參與嘌呤代謝，其缺失使細(xì)菌的繁殖需要外源性腺嘌呤。VNP20009還降低了自身誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)，從而降低炎性反應(yīng)。因此，它的低致病性提高了用于臨床治療的安全性。VNP20009已被廣泛用于癌癥研究，它可作用于多種小鼠實(shí)體瘤模型，包括黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌。VNP20009作為腫瘤基因治療載體的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是它能夠高度靶向聚集于腫瘤部位。研究人員在多種實(shí)體腫瘤的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，VNP20009在腫瘤內(nèi)的數(shù)量較肝臟等主要器官內(nèi)高200?1000倍。VNP20009能在腫瘤組織缺氧壞死區(qū)優(yōu)先聚集并繁殖，相同時(shí)間內(nèi)腫瘤組織內(nèi)細(xì)菌的擴(kuò)增代次顯著高于正常組織，使得減毒沙門(mén)菌成為新型抗瘤制劑和腫瘤靶向治療的載體成為可能。沙門(mén)菌導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)減慢可能機(jī)制包括:腫瘤生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為細(xì)菌所消耗，細(xì)菌所產(chǎn)生的酶，如天冬酰胺酶，可耗竭腫瘤生長(zhǎng)必需氨基酸;細(xì)菌向胞外微環(huán)境分泌的局部毒素或者產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α，都可影響腫瘤血管形成;此外，在細(xì)菌生長(zhǎng)部位的非特異性炎癥反應(yīng)可潛在激活抗腫瘤T細(xì)胞。但尚未發(fā)現(xiàn)VNP20009對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用。
[0005]腫瘤細(xì)胞為了維持其高增殖率，需要足夠的營(yíng)養(yǎng)。除了糖之外，對(duì)甲硫氨酸(Meth1nine，Met)、谷胺酰氨、精氨酸等需要量尤其大。研究證實(shí)甲硫氨酸依賴性是絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的共同特征，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎癌、膀胱癌、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，而正常細(xì)胞不存在Met依賴性。一些體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)相繼證實(shí)，直接食用甲硫氨酸缺乏的膳食可以延緩腫瘤細(xì)胞的增殖。但是若膳食中Met長(zhǎng)期缺乏或不足，將會(huì)引起機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良、代謝障礙，還可因DNA長(zhǎng)期處于低甲基化狀態(tài)加劇癌變。那么，通過(guò)甲硫氨酸酶(L-meth1ninase)特異性地將Met分解，從而降低體內(nèi)甲硫氨酸，則能更加有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或使之消退。但是，由于哺乳動(dòng)物本身不表達(dá)甲硫氨酸酶，所以外源性給予的方式有一定的副作用，往往引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。甲硫氨酸屬必需氨基酸，在甲硫氨酸腺甘轉(zhuǎn)移酶催化下，生成S-腺甘甲硫氨酸(S-adenosy Imeth1nine，SAM)。SAM又稱為活性甲硫氨酸，是體內(nèi)最重要的甲基直接供體，參與體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)等多種不同物質(zhì)的甲基轉(zhuǎn)移催化反應(yīng)。其中，EZH2可以將SAM的活性甲基轉(zhuǎn)移到組蛋白的特定氨基酸上，從而參與染色體的表觀修飾，抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。我們前期已經(jīng)制備了表達(dá)甲硫氨酸酶的減毒沙門(mén)氏菌VNP20009-M，對(duì)乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌都能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有很好的抗腫瘤效果。我們已遞交專利申請(qǐng)書(shū)(專利號(hào) 201310062253.7、201310688936.3、201410183149.8)，其中201310062253.7已經(jīng)獲得授權(quán)。甲硫氨酸酶分解降低體內(nèi)甲硫氨酸含量，不僅能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且有可能通過(guò)減少SAM含量有效的抑制ΕΖΗ2的活性，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因工程菌VNP20009-M在制備預(yù)防和治療癌癥轉(zhuǎn)移的的生物藥物上的應(yīng)用。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0008]基因工程菌VNP20009-M在制備預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移后癌癥的藥物上的應(yīng)用，其中，所述基因工程菌為克隆有L-meth1ninase基因的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009。
[0009]所述的基因工程菌VN P 2 O O O 9 - M優(yōu)選為攜帶了質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，其中，所述質(zhì)粒上克隆有L-meth1ninase基因。
[0010]其中，所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法構(gòu)建得到:將L-meth1ninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒，將L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，即得。
[0011]其中，所述質(zhì)粒包括但不限于pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)?；騪ET23a質(zhì)粒。
[0012]最為優(yōu)選的是，在構(gòu)建基因工程菌VNP20009-M的過(guò)程中，當(dāng)選用pSVSPORT質(zhì)粒時(shí)，將L-meth1ninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到1^-!1161:11；[011；[1^86表達(dá)質(zhì)粒，然后將L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009中得到基因工程菌。
[0013]其中，所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400V，電阻400 Ω，電容25yF，放電時(shí)間4ms。
[0014]其中，所述的癌癥包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、食道癌、喉癌、白血病、淋巴癌、黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、支氣管癌、細(xì)支氣管癌、尿道癌、腎癌、口腔癌、陰道癌、膽管癌、膀胱癌或鼻咽癌。
[0015]上述癌癥預(yù)防和治療的給藥方式可通過(guò)多種途徑進(jìn)行給藥，包括但不限于:口服給藥、局部給藥、注射給藥(包括但不限于經(jīng)靜脈、腹膜、皮下、肌肉、瘤內(nèi)給藥)等。
[0016]減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌的基因工程菌VNP20009-M在制備組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2抑制劑中的應(yīng)用，所述基因工程菌為克隆有L-meth1ninase基因的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009o
[0017]所述的基因工程菌VNP2 O O O 9 -M優(yōu)選為攜帶了質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，其中，所述質(zhì)粒上克隆有L-meth1ninase基因。
[0018]其中，所述的L-meth1ninase以及基因工程菌VNP20009-M按照如下方法構(gòu)建得至丨J:將L-meth1ninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到1^-!1161:11；[011；[1138 6表達(dá)質(zhì)粒，將L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中純化可得甲硫氨酸酶蛋白，或電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，即得VNP20009-M。
[0019]其中，所述質(zhì)粒包括但不限于pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pBR322質(zhì)?；騪ET23a質(zhì)粒。
[0020]最為優(yōu)選的時(shí)，在構(gòu)建基因工程菌VNP20009-M的過(guò)程中，當(dāng)選用pSVSPORT質(zhì)粒時(shí)，將L-meth1ninase基因通過(guò)Kpn I和Hind 111酶切位點(diǎn)亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒，然后將L_me th i on i nas e表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009中得到基因工程菌。
[0021]其中，所述的電轉(zhuǎn)化條件為電壓2400V，電阻400 Ω，電容25yF，放電時(shí)間4ms。
[0022]上述組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2抑制劑的給藥方式可通過(guò)多種途徑進(jìn)行給藥，包括但不限于:口、局部、注射(包括但不限于經(jīng)靜脈、腹膜、皮下、肌肉、瘤內(nèi)給藥)等。
[0023]有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(shì):
[0024](I)基因工程菌VNP20009-M不僅具有抗腫瘤效果，而且能夠有效的抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。
[0025](2)本發(fā)明提供的表達(dá)甲硫氨酸酶的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌(VNP20009-M)通過(guò)抑制甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的表達(dá)和活性，成為甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的抑制劑，降低組蛋白H3K27甲基化水平，從而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。在預(yù)防和治療惡性腫瘤，特別是癌癥的轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用中有廣闊的前景。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是質(zhì)粒pSVSPORT-L-meth1ninase酶切鑒定I %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0027]圖2是Westernblot鑒定meth1ninase表達(dá)結(jié)果圖。
[0028]圖3是檢測(cè)沙門(mén)氏菌中meth1ninase活性結(jié)果圖。
[0029]圖4是Transwells檢測(cè)基因工程菌VNP20009-M抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲(#*，p〈
0.001)o
[0030]圖5是TransweIIs檢測(cè)meth1ninase抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲(林*，ρ〈0.001) ο
[0031]圖6是Western blot鑒定高表達(dá)meth1ninase后前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞EZH2以及H3K27me3的表達(dá)結(jié)果圖。
[0032]圖7是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用定量分析前列腺癌腫瘤組織中游離甲硫氨酸含量的結(jié)果圖(*4〈0.05)。
[0033]圖8是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用定量分析前列腺癌腫瘤組織中腺苷甲硫氨酸(SAM)含量的結(jié)果圖(#，ρ〈0.01，*，ρ〈0.05)。
[0034]圖9是注射沙門(mén)菌對(duì)裸鼠體重的影響結(jié)果圖。
[0035]圖10是靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后活體成像觀察前列腺癌信號(hào)隨時(shí)間的變化。
[0036]圖11是靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后前列腺癌信號(hào)變化曲線圖。
[0037]圖12是靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后55天前列腺癌小鼠脊椎的腫瘤大小結(jié)果圖。
[0038]圖13是靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后55天前列腺癌小鼠脊椎HE病理切片結(jié)果O
[0039]圖14是靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后55天前列腺癌小鼠睪丸以及附睪HE病理切片結(jié)果圖。
[0040]圖15是靜脈給予數(shù)量為2*106CFU沙門(mén)菌后活體成像觀察胰腺癌信號(hào)隨時(shí)間的變化。
[0041]圖16靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后活體成像觀察乳腺癌信號(hào)隨時(shí)間的變化。
[0042]圖17是靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后乳腺癌小鼠信號(hào)變化曲線圖。
[0043]圖18是靜脈給予數(shù)量為2*106CFU沙門(mén)菌后乳腺癌小鼠肺部HE病理切片結(jié)果。箭頭所指小鼠肺部組織中有乳腺癌腫瘤的侵襲。
[0044]圖19靜脈給予數(shù)量為2*16CFU沙門(mén)菌后小鼠肺癌模型的生存率。
[0045]圖20靜脈給予數(shù)量為2*106CFU沙門(mén)菌后小鼠肺部腫瘤的結(jié)果圖。箭頭所示為小鼠肺部腫瘤。
[0046]圖21是靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后肝癌小鼠模型的腫瘤大小結(jié)果圖。
[0047]圖22是靜脈給予數(shù)量為2*105CFU沙門(mén)菌后肝癌小鼠模型的肺部病理切片結(jié)果。箭頭所指小鼠肺部組織中有肝癌腫瘤的侵襲。
【具體實(shí)施方式】
[0048]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0049]實(shí)施例1:基因工程菌的構(gòu)建。
[0050](I)構(gòu)建表達(dá)L-meth1ninase基因的質(zhì)粒。[0051 ] 先合成L-meth1ninase(GenBank: L43133.1)基因亞克隆至pUC57質(zhì)粒(金斯瑞公司)，接著通過(guò)Kpn I和Hind III酶切位點(diǎn)亞克隆至pSVSPORT質(zhì)粒(invitrogen)，得到pSVSPORT-L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒。具體構(gòu)建過(guò)程如下:
[0052]將pSVSPORT質(zhì)粒用Kpn I和Hind III雙酶切，酶切體系為:2yg質(zhì)粒DNA，3yL 1Xbuffer，1.5yL Kpn I酶，1.5yL Hind 111酶，加入(1詘20補(bǔ)足體積至3(^1^，37°(:溫浴311。然后將酶切體系在1%的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離，切出4.1kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA。
[0053]通過(guò)全基因合成得到1^1161:11；[011；[肪86編碼區(qū)域0嫩片段亞克隆至口1]057質(zhì)粒(金斯瑞公司)，用Kpn I和Hind III雙酶切，酶切體系為:3yg質(zhì)粒DNA，3yL 10 X buffer，1.5yLKpn I酶，1.5yL Hind III酶，加入ddH20補(bǔ)足體積至30yL，37°C溫浴3h。然后將酶切體系在I %的瓊脂糖凝膠中通過(guò)電泳分離，切出1.2kb大小的DNA條帶，用膠回收純化試劑盒純化DNA0
[0054]將pSVSP0RT(KpnI/Hind III)和L-meth1ninase編碼區(qū)域DNA片段(Kpn I/HindIII)連接，連接反應(yīng)中加入2yL載體、6yL插入片段、IyL T4DNA連接酶，16°C溫浴16h。
[0055]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a(Takara)的感受態(tài)細(xì)胞中。取一管50yL的DH5a感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待其融化后，向其中加入5yL上述連接產(chǎn)物，輕彈混勻，后于冰上孵育30min; 42 °C熱擊60s，后冰上靜置2min;加入500yL無(wú)抗性的LB液體培養(yǎng)基，37 °C震蕩培養(yǎng)Ih后涂布在含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板上，過(guò)夜培養(yǎng)。
[0056]克隆生長(zhǎng)出來(lái)后，挑單克隆菌落至3mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震蕩培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒DNA，用Kpn I和Hind III酶切鑒定，陽(yáng)性克隆中可得到4.lkb、1.2kb的兩條DNA條帶，如圖1所示。再通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆的序列完全正確。
[0057](2)構(gòu)建攜帶質(zhì)粒的VNP20009菌和攜帶克隆有L-meth1ninase的基因的質(zhì)粒的VNP20009 菌。
[0058]將pSVSPORT 和 pSVSPORT-L-meth1ninase 表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至 VNP20009 菌株(YS1646，ATCC號(hào)202165)，分別命名為VNP20009-V和VNP20009-M。具體構(gòu)建過(guò)程如下:
[0059]將感受態(tài)細(xì)菌VNP20009置于冰上，待其融化后移入預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，向其中加入2yL質(zhì)粒，輕彈混勻，于冰上孵育lmin。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀，條件設(shè)置為電壓2400V，電阻400 Ω，電容25yF，放電時(shí)間4ms。電擊完立刻加入ImL SOC培養(yǎng)基，輕輕混勻。37°C震蕩培養(yǎng)Ih;用移液器將細(xì)菌沉淀吹打均勻后涂布在含氨芐青霉素抗性的LB-O培養(yǎng)基平板上。然后將平板置于37°C溫箱培養(yǎng)16ΚνΝΡ20009-ν和VNP20009-M用LB-O培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確。
[0060]取1X108沙門(mén)菌用蛋白裂解液提取蛋白，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，再穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，BSA室溫封閉Ih后，TBST漂洗3 X 5min，加入兔抗L-meth1ninase抗體(1:1000)，4°C孵育過(guò)夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP標(biāo)記的抗兔二抗(1: 10000)，室溫孵育Ih，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。結(jié)果如圖2所示，在分子量約43kD處有特異性條帶，說(shuō)明VNP20009-M與VNP20009、VNP20009-V相比，L-meth1ninase表達(dá)量顯著提尚O
[0061 ] 將L-甲硫氨酸和吡哆醛分別與VNP20009-V和VNP20009-M菌體混合，37°C孵育1min后用50%三氯乙酸終止，離心取上清，與3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物(MBTH)充分混勻，50°C孵育30min后，測(cè)定320nm處的吸光值，以每分鐘催化轉(zhuǎn)化Ιμπιο?α-酮丁酸的酶量定義為I個(gè)酶活性單位。結(jié)果顯示(圖3 )，沙門(mén)菌VNP20009-M的甲硫氨酸酶活性比 VNP20009-V 高 10 倍。
[0062]實(shí)施例2:基因工程菌VNP20009-M的抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果。
[0063]1、基因工程菌VNP20009-M對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌細(xì)胞PC_3(雄激素非依賴性)接種于6孔板中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%-80%左右，分別以1*106CFU/孔加入VNP20009-V和VNP20009-M，另設(shè)空白對(duì)照組。細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)30min后，用PBS清洗5遍，然后使用胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，并按照5*104/小室將細(xì)胞加入鋪有matrigel膠的transwell小室，上室使用無(wú)血清培養(yǎng)基，下室使用含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。PBS和培養(yǎng)基里都含12yg/mL青霉素、20yg/mL鏈霉素、10yg/mL的卡那霉素。細(xì)胞培養(yǎng)36h后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，對(duì)穿透過(guò)小室的細(xì)胞拍照計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖4，***為P〈0.001。結(jié)果顯示VNP20009-M與前列腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)之后，能穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量比PBS組、VNP20009-M組明顯減少，說(shuō)明VNP20009-M對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力有顯著性抑制。
[0064]2、甲硫氨酸酶對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌細(xì)胞PC-3接種于6孔板中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%-80%左右，使用Roche轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒(vector)和高表達(dá)甲硫氨酸酶(meth1ninase)的質(zhì)粒，另設(shè)空白對(duì)照組(control)。轉(zhuǎn)染24h后，做transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，操作方法同上述I。結(jié)果如圖5所示，高表達(dá)甲硫氨酸酶之后，穿過(guò)小室的前列腺癌細(xì)胞減少，表明細(xì)胞侵襲能力下降。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白，做western blot檢測(cè)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后提取細(xì)胞核蛋白，做westernblot檢測(cè)EZH2下游靶分子組蛋白H3K27。結(jié)果如圖6所示，高表達(dá)甲硫氨酸酶后，甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的表達(dá)量減少，組蛋白H3K27甲基化水平降低，S卩EZH2活性顯著降低。
[0065]3、皮下注射2*106個(gè)人前列腺癌細(xì)胞PC-3。待腫瘤體積達(dá)到0.1?0.2cm3時(shí)，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組:？83組、￥即20009-￥組和￥即20009-1組，以2\10%?1]/只的劑量，采用瘤內(nèi)注射方式給藥，對(duì)照組注射同等體積PBS。在給藥后第10天，剝離裸鼠腫瘤，提取腫瘤組織蛋白，使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用定量分析腫瘤組織中游離甲硫氨酸含量和腺苷甲硫氨酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予沙門(mén)菌VNP20009-M后，腫瘤組織中的游離甲硫氨酸含量明顯降低，約為I3BS組和VNP20009-V組的3/4(圖7)，腺苷甲硫氨酸含量也顯著降低，約為I3BS組和VNP20009-V組的2/3(圖8)。這些結(jié)果提示我們，VNP20009-M可以作為一種很好的EZH2抑制劑，其能夠有效降低組織內(nèi)的甲硫氨酸和腺苷甲硫氨酸的含量，通過(guò)減少SAM含量有效的抑制EZH2的活性。
[0066]以上實(shí)驗(yàn)提示我們，VNP20009-M入侵腫瘤細(xì)胞后，表達(dá)甲硫氨酸酶，可能通過(guò)降低組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的表達(dá)及活性，使得腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力降低。
[0067]4、構(gòu)建表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞株。取狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293FT細(xì)胞接種六孔板培養(yǎng)過(guò)夜，37 °C，5 % CO2。次日，用Roche轉(zhuǎn)染試劑對(duì)293FT細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔共轉(zhuǎn)染 1.5yg PLJMl-luc、1.125yg psPAX2、0.375yg PMD2.G質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，4°C，3000r/min離心5min，-80°(:保存上清，即熒光素酶慢病毒。前列腺癌細(xì)胞PC-3，胰腺癌細(xì)胞CFPAC-1分別接種于6孔板中，次日，每孔加入Iml(約1.0 X 18感染滴度)熒光素酶慢病毒和終濃度8yg/ml的polybrenejAh后，在培養(yǎng)基里加入嘌呤霉素篩選，每2天換液一次，2周之后得到穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的腫瘤細(xì)胞株P(guān)C-3-luc，CFPAC-luc。
[0068]5、用含有10%胎牛血清的？-121(培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞?(:-3-111(3，以每只5\105個(gè)細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)。將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組，每組10只:PBS組、VNP20009-V組和VNP20009-M 組。
[0069]6、用LB-O培養(yǎng)VNP20009-V和VNP20009-M，當(dāng)OD ? 0.6時(shí)，收集菌體，然后用PBS重懸，以2X 15CFU/只的劑量，采用尾靜脈注射方式給藥，對(duì)照組注射同等體積PBS。給藥后，觀察裸鼠的活動(dòng)、進(jìn)食、體重。結(jié)果如圖9所示，注射細(xì)菌后，小鼠體重未受影響。而且裸鼠的進(jìn)食、糞便也無(wú)異常，說(shuō)明VNP20009-V和VNP20009-M對(duì)裸鼠無(wú)明顯毒性。
[0070]7、給藥后分別在第1(1、11(1、24(1、44(1和56(1，使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)(0&1丨？郎)觀察小鼠腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)情況。每只小鼠腹腔注射150yg/kg D-熒光素鉀，與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的熒光素酶反應(yīng)后產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)，利用儀器顯示圖像，用以顯示腫瘤細(xì)胞所在部位和數(shù)量。結(jié)果如圖10所示，在給藥后I天，各組的腫瘤信號(hào)強(qiáng)度基本相同。但是在給藥后第11天開(kāi)始，PBS組和VNP20009-V組小鼠在脊椎、附睪處出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)，并且隨著時(shí)間的推移，這兩組小鼠全身信號(hào)呈線性增強(qiáng)(圖11)。從45天開(kāi)始，PBS組小鼠的脊椎處可見(jiàn)黃豆大小的突起，質(zhì)硬、活動(dòng)度差。在解剖后發(fā)現(xiàn)裸鼠脊椎處有腫瘤包塊形成，轉(zhuǎn)移腫瘤呈灰白色隆起于腰椎表面成團(tuán)塊狀，直徑約Icm(圖12)。而VNP20009-M組小鼠腫瘤細(xì)胞信號(hào)強(qiáng)度明顯低于PBS組和VNP20009-V組，部分小鼠幾乎無(wú)法檢測(cè)到光信號(hào)。小鼠組織的病理切片結(jié)果(圖13)與小動(dòng)物活體成像的結(jié)果一致，PBS組以及VNP20009-V組小鼠的脊椎髓腔有成群密集的未分化上皮腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂，異形性明顯，核大深染，核內(nèi)有多形的、數(shù)目不均的染色質(zhì)，有些腫瘤細(xì)胞已經(jīng)破壞了脊椎骨質(zhì)。同時(shí)，這兩組小鼠的睪丸和附睪中也發(fā)現(xiàn)有大量的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)(圖14)。但是，VNP20009-M組小鼠的脊椎、睪丸以及附睪僅觀察到少量的腫瘤細(xì)胞，甚至部分小鼠都沒(méi)觀察到腫瘤細(xì)胞。除此以外，各組小鼠的肺部、肝臟、腎臟等組織未見(jiàn)明顯腫瘤浸潤(rùn)。這些結(jié)果說(shuō)明，沙門(mén)菌VNP20009-M能夠顯著抑制該前列腺癌腫瘤向骨轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)。
[0071 ] 8、操作方法同上述5、6和7，尾靜脈注射相同數(shù)量的胰腺癌細(xì)胞CFPAC-luc。在造模后第3天，以2*106CFU/只的劑量，采用尾靜脈注射方式給藥，對(duì)照組注射同等體積PBS。同樣，定期進(jìn)行活體成像觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBS組以及VNP20009-V組均出現(xiàn)強(qiáng)的熒光信號(hào)，主要位于肺部。而VNP20009-M組基本觀察不到信號(hào)(圖15)。這些結(jié)果提示，沙門(mén)菌VNP20009-M同樣能夠有效抑制該胰腺癌腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)。
[0072]9、操作方法同上述5、6和7，尾靜脈注射1.25*105個(gè)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231-luc。在造模后第3天，以2*105CFU/只的劑量，采用尾靜脈注射方式給藥，對(duì)照組注射同等體積TOS。同樣，定期進(jìn)行活體成像觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBS組以及VNP20009-V組均出現(xiàn)強(qiáng)的熒光信號(hào)，主要位于肺部，并且隨著時(shí)間的推進(jìn)，信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(圖16、圖17)。小鼠的病理切片結(jié)果與活體成像結(jié)果一致，PBS以及VNP20009-V組的肺部有腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)，這些細(xì)胞核大深染，異型性明顯(圖18箭頭處為腫瘤細(xì)胞)。而VNP20009-M組基本觀察不到信號(hào)，且肺部的病理切片結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞明顯減少，甚至觀察不到腫瘤。此外，PBS組的小鼠的脊椎也有腫瘤轉(zhuǎn)移，其他組織未見(jiàn)異常。這些結(jié)果也提示我們，沙門(mén)菌VNP20009-M同樣能夠有效抑制該乳腺癌腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)。
[0073]10、操作方法同上述5、6，對(duì)B6小鼠尾靜脈注射5*105個(gè)肺癌細(xì)胞LLC。在造模后第3天，以2*106CFU/只的劑量，采用尾靜脈注射方式給藥，對(duì)照組注射同等體積PBS。在給藥之后，定期測(cè)量小鼠體重，觀察小鼠狀態(tài)，記錄小鼠死亡時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBS組小鼠38天后全部死亡，VNP20009組有40 %存活，而VNP20009-M還有60 %的小鼠存活。生存率實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示，VNP20009-M能顯著延長(zhǎng)患瘤小鼠的生存期(圖19)。解剖小鼠后發(fā)現(xiàn)，PBS組以及VNP20009-V組小鼠有嚴(yán)重的肺部腫瘤，而VNP20009-M組小鼠的肺部的轉(zhuǎn)移灶明顯比對(duì)照組小，且數(shù)量要少(圖20)。這些結(jié)果說(shuō)明，沙門(mén)菌VNP20009-M同樣能夠有效抑制該肺癌腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
[0074]11、皮下注射2*106個(gè)人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞HCCLM3。在造模后第3天，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分組:PBS組、VNP20009-V組和VNP20009-M組，以2* 15CFU/只的劑量，采用尾靜脈注射方式給藥，對(duì)照組注射同等體積PBS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠的腫瘤都正常生長(zhǎng)并增長(zhǎng)迅速，而給予沙門(mén)菌VNP20009-M后，腫瘤生長(zhǎng)停滯，部分小鼠腫瘤消失(圖21)。小鼠的肺部病理切片發(fā)現(xiàn)，PBS以及VNP20009-V組的肺部有腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)，這些細(xì)胞核大深染，異型性明顯。(圖22箭頭處為腫瘤細(xì)胞)。而VNP20009-M組的肺部的腫瘤細(xì)胞明顯減少，甚至觀察不到腫瘤。這些結(jié)果也提示我們，沙門(mén)菌VNP20009-M同樣能夠有效抑制該肝癌腫瘤的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)。
[0075]上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明所采用的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009-M能夠通過(guò)抑制EZH2的表達(dá)和活性來(lái)抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，具有良好的抗腫瘤效果。
[0076]本發(fā)明表明減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009-M可以用于制備治療抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，除了前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌和肝癌之外，對(duì)其他腫瘤，包括肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、食道癌、喉癌、白血病、淋巴癌、黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌。支氣管癌、細(xì)支氣管癌、尿道癌、腎癌、口腔癌、陰道癌、膽管癌、膀胱癌、鼻咽癌以及其他各種癌癥的轉(zhuǎn)移可能均有效果。上述質(zhì)粒并不局限于pSVSPORT質(zhì)粒，pTrc99A質(zhì)粒、PCDNA3.1質(zhì)粒、PBR322質(zhì)?；騪ET23a質(zhì)粒以及克隆有L-meth1ninase基因的上述質(zhì)粒同樣具有類似效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.基因工程菌VNP20009-M在制備預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移后癌癥的藥物上的應(yīng)用，其中，所述基因工程菌VNP20009-M為克隆有L-meth1ninase基因的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M為攜帶了質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，其中，所述質(zhì)粒上克隆有L-meth1ninase基因。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的癌癥包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、食道癌、喉癌、白血病、淋巴癌、黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、皮膚癌、支氣管癌、細(xì)支氣管癌、尿道癌、腎癌、口腔癌、陰道癌、膽管癌、膀胱癌或鼻咽癌。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法構(gòu)建得到:將L-meth1ninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒，將L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，即得。5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述質(zhì)粒包括但不限于pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A 質(zhì)粒、pcDNA3.1 質(zhì)粒、pBR322 質(zhì)?；?pET23a 質(zhì)粒。6.基因工程菌VNP20009-M在制備組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2抑制劑中的應(yīng)用，所述基因工程菌VNP20009-M為克隆有L-meth1ninase基因的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M為攜帶了質(zhì)粒的減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，其中，所述質(zhì)粒上克隆有L-meth1ninase基因。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基因工程菌VNP20009-M按照如下方法構(gòu)建得到:將L-meth1ninase基因亞克隆至質(zhì)粒中，得到L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒，將L-meth1ninase表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門(mén)氏菌VNP20009，即得。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述質(zhì)粒包括但不限于pSVSPORT質(zhì)粒、pTrc99A 質(zhì)粒、pcDNA3.1 質(zhì)粒、pBR322 質(zhì)?；?pET23a 質(zhì)粒。10.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的應(yīng)用，其特征在于，給藥方式包括但不限于口服給藥、局部給藥或注射給藥。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK105983103SQ201610081270
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2016年2月5日
【發(fā)明人】趙子建, 周素瑾, 林艷, 趙正剛, 李芳紅
【申請(qǐng)人】廣州華津醫(yī)藥科技有限公司