一種新型VEGFR-3受體顯像劑^99mTc-HYNIC/EDDA-TMVP1在腫瘤診斷中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型VEGFR-3受體顯像劑99mTc-HYNIC/EDDA-TMVP1在腫瘤診斷中的應(yīng)用，該發(fā)明涉及一種核醫(yī)學(xué)科新型腫瘤分子顯像劑，特別是涉及針對(duì)VEGFR-3分子的放射性核素核素99mTc標(biāo)記的多肽。VEGFR-3在許多腫瘤新生淋巴管和新生血管中高表達(dá)顯示了其在腫瘤分子診斷中的應(yīng)用前景，但目前針對(duì)VEGFR-3的顯像劑甚少且存在背景高靶向效應(yīng)差等不足之處，TMVP1(核心序列為L(zhǎng)ARGR)能夠特異性的結(jié)合VEGFR-3，本發(fā)明第一次將TMVP1標(biāo)記放射性核素評(píng)估其在各種腫瘤模型中對(duì)腫瘤的顯像效果。由于天然性多肽在體內(nèi)半衰期短，本發(fā)明將TMVP1通過(guò)成環(huán)增加其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。多肽TMVP1標(biāo)記放射性核素99mTc(99mTc-HYNIC/EDDA-E-G-Cyclic(CGLARGRGC))能夠靶向于高表達(dá)VEGFR-3腫瘤組織并且對(duì)腫瘤進(jìn)行SPECT顯像。
【專利說(shuō)明】
-種新型 VEGFR-3 受體顯像劑 99mTc-HYN IC/EDDA-TMVP1 在 腫瘤診斷中的應(yīng)用 一、
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型VEGFR-3受體顯像劑99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl在腫瘤診斷 中的應(yīng)用，該藥物包括LARGR多肽、雙功能螯合劑、共配體和放射性核素 99mTc。所述多肽的 結(jié)構(gòu)為E-G-Cyclic (CGLARGRGC)，該多肽成環(huán)方式為半胱氨酸二硫鍵成環(huán)；所述雙功能螯 合劑為 HYNIC(6_Hydrazinonicotinic acid);所述共配體為 EDDA(Ethylenediamine-N， f -diacetic acid);所述放射性核素為99mTc。綜上所述，本新型VEGFR-3受體顯像劑的 結(jié)構(gòu)式為嚴(yán)Tc-HYNIC/EDDA-E-G-Cyclic (CGLARGRGC)。該發(fā)明所述領(lǐng)域涉及一種核醫(yī)學(xué)科 新型腫瘤分子顯像劑，特別是涉及針對(duì)VEGFR-3分子的放射性核素核素 99mTc標(biāo)記的多肽。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，惡性腫瘤已成為威脅人類健康的首要疾病，2014年《世界癌癥報(bào)告》中國(guó) 新診斷癌癥病例為307萬(wàn)，占全球總數(shù)的21. 8%。癌癥死亡人數(shù)約220萬(wàn)，占全球癌癥死亡 人數(shù)的26. 9%。目前實(shí)體腫瘤患者治療方式仍以手術(shù)切除為主，輔以化療、放療和分子靶向 治療，而影響癌癥患者治療效果和預(yù)后最為關(guān)鍵的是早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早干預(yù)?，F(xiàn)有的CT/ MR/B超等影響學(xué)檢查已經(jīng)很好的應(yīng)用于腫瘤的診斷，但其診斷的準(zhǔn)確度取決于醫(yī)生是否具 有豐富的經(jīng)驗(yàn)和扎實(shí)的理論知識(shí)，并且其鑒別診斷良惡性腫瘤仍然存在著不足之處。因此， 尋找到一種特異的診斷方法或診斷劑依然是每一位科研工作者不懈追求的目標(biāo)。
[0003] CT/MR/B超對(duì)腫瘤診斷的理論基礎(chǔ)是腫瘤組織的密度和腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)械性行為。 近年來(lái)，腫瘤生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤細(xì)胞具有異于正常細(xì)胞的生物學(xué)特性，如基因組的 不穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)譜的改變等，科學(xué)家們針對(duì)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)一些特定的表面分子蛋白 (整合素受體、表皮生長(zhǎng)因子受體、抑制素受體等）開發(fā)出一種新的診斷方法：腫瘤分子診 斷?，F(xiàn)已應(yīng)用于臨床的分子診斷劑及治療藥物大致可分為單克隆抗體、重組蛋白、小分子信 號(hào)通路抑制劑和多肽，其中多肽因具有分子量小，體內(nèi)代謝快和無(wú)免疫原性而受到研究者 的關(guān)注。目前奧曲肽和RGD多肽是臨床應(yīng)用最經(jīng)典的分子診斷及治療的多肽：奧曲肽標(biāo)記 放射性核素已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用階段， 99mTc-EDDA/HYNIC-T0C能夠很好的診斷神經(jīng)分泌型腫 瘤如胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤；RGD多肽能夠結(jié)合整合素受體α ν β 3和α ν β 5等（其在腫瘤新生血 管中特異性高表達(dá)），將RGD多肽標(biāo)記放射性核素99mTc、lsF和 111In等能夠特異性的對(duì)腫瘤 顯像，99m Tc標(biāo)記的RGD多肽（NC100692)和[lsF]Galact〇-RGD也已經(jīng)進(jìn)入臨床三期實(shí)驗(yàn)。 多肽衍生物已成為未來(lái)新型診斷性藥物和治療性藥物研發(fā)的重要領(lǐng)域。
[0004] 腫瘤新生淋巴管的形成是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞播散和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，特別是轉(zhuǎn) 移方式以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主的宮頸癌、乳腺癌和胃癌等。臨床上乳腺癌和宮頸癌等腫瘤患者 常規(guī)的要進(jìn)行淋巴結(jié)清掃，以提高患者的生存率、決定患者術(shù)后的化療的療程與方案和評(píng) 估患者的預(yù)后。大量的研究證明在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)前，淋巴結(jié)微環(huán)境已經(jīng)發(fā)生改變 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的迀移（種子土壤學(xué)說(shuō)），其中淋巴結(jié)內(nèi)微環(huán)境VEGFC大量增加促進(jìn)大量新 生淋巴管的形成（cancer research，2006)。基于新生淋巴管在腫瘤轉(zhuǎn)移及播散的重要性， 科學(xué)家們希望研發(fā)出一種針對(duì)腫瘤新生淋巴管的顯像劑，2010年Nardnen利用VEGFR-3單 克隆抗體mF4-3ICl標(biāo)記放射性核素 111In可以對(duì)腫瘤的原發(fā)灶及微淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶SPECT/CT 顯像（Nuclear Medicine and Biology 37(2010)957-964)，2007 年利用 VEGFR-3 scFv 抗 體標(biāo)記131Iodine對(duì)腫瘤進(jìn)行顯像（ONCOLOGY REPORTS 18:933-941,2007)。但由于抗體分 子量大，在體內(nèi)的代謝主要經(jīng)過(guò)肝臟等，在體內(nèi)的分布如脾臟、肺和肝等背景較高，顯像效 果欠佳。而多肽分子量小、體內(nèi)代謝主要經(jīng)過(guò)腎臟和免疫原性低等優(yōu)勢(shì)在腫瘤顯像應(yīng)用具 有良好的前景。但是現(xiàn)在針對(duì)淋巴管的多肽顯像劑甚少，國(guó)內(nèi)第四軍醫(yī)大學(xué)篩選出一個(gè)結(jié) 合VEGFR-3受體的多肽（CSDSWHYWC)，標(biāo)記放射性核素后顯像效果不佳（2010,第三軍醫(yī)大 學(xué)學(xué)報(bào)）。綜上所述，至今為止還沒(méi)有一種理想的靶向新生淋巴管放射性核素顯像劑。
[0005] VEGFR-3蛋白是一種酪氨酸激酶受體（FLT4)，其配體為VEGF-C和VEGF-D，在胚胎 的早期發(fā)育VEGFR-3在所有的內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)，但是隨著胚胎的成熟，其表達(dá)僅限制在淋 巴管內(nèi)皮細(xì)胞。近年來(lái)多項(xiàng)研究證實(shí)VEGFR-3在新生淋巴管的生成和維持中起到重要的作 用，并與腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移直接相關(guān)，可作為淋巴管標(biāo)志物之一。最新關(guān)于VEGFR-3的 研究顯示VEGFR-3不僅在淋巴管表達(dá)，在腫瘤新生的微血管表達(dá)亦上調(diào)，并能促進(jìn)腫瘤新 生血管的形成。關(guān)于VEGFR-3在腫瘤細(xì)胞是否表達(dá)至今仍存在爭(zhēng)議，一些文獻(xiàn)報(bào)道VEGFR-3 在很多腫瘤組織中高表達(dá)，尤其在以淋巴轉(zhuǎn)移為主的乳腺癌、胃癌和宮頸癌等，但是2008 年發(fā)表在《cancer cell》雜志上的文章《VEGFR-3 Expression Is Restricted to Blood and Lymphatic Vessels in Solid Tumors》研究證實(shí)VEGFR-3表達(dá)僅限于新生淋巴管和 血管，在腫瘤細(xì)胞基本上不表達(dá)。2012年Sagrario Ortega發(fā)表在PNAS上的《In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing， inflammation, and tumor metastasis》進(jìn)一步證明VEGFR-3在新生淋巴管的表達(dá)的特異性，尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移 發(fā)生過(guò)程中的前哨淋巴結(jié)和微量腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的亦高度表達(dá)。綜上所述，雖然VEGFR-3 在腫瘤是否表達(dá)仍存在爭(zhēng)議，但其在新生血管及新生淋巴管里高度表達(dá)已經(jīng)非常明確，尤 其VEGFR-3可作為淋巴管的標(biāo)志分子之一和腫瘤轉(zhuǎn)移的前哨淋巴結(jié)和微量腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴 結(jié)高度表達(dá)均表明VEGFR-3可作為腫瘤診斷和治療的靶向分子。
[0006] TMVPl (LARGR)是本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)細(xì)菌鞭毛肽庫(kù)展示技術(shù)篩選出含有五個(gè)氨基酸的 新型腫瘤靶向肽，其受體為新生淋巴管標(biāo)志分子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3 (VEGFR-3,亦成為 FLT4)，前期的實(shí)驗(yàn)研究顯示，TMVPl能夠特異性的與VEGFR-3相結(jié)合，靶向結(jié)合于腫瘤新生 淋巴管及高表達(dá)VEGFR-3的腫瘤組織。將TMVPl連接凋亡肽（KLAKLAK) 2,能夠抑制新生淋 巴管的形成及腫瘤的生長(zhǎng)。
[0007] -個(gè)良好的顯像劑應(yīng)該具備以下優(yōu)點(diǎn)：在體內(nèi)穩(wěn)定性好，不被體內(nèi)蛋白酶降解，靶 向器官以外的器官背景低，使疾患部位體內(nèi)顯像效果好。大多數(shù)天然的多肽在體內(nèi)的半衰 期較短，例如臨床應(yīng)用經(jīng)典的生長(zhǎng)抑制素（somatostatin)多肽，其天然存在的形式在體內(nèi) 的半衰期大約只有三分鐘，為了提高多肽在體內(nèi)代謝的穩(wěn)定性、減緩體內(nèi)各種蛋白酶系統(tǒng) 對(duì)多肽的降解和增加多肽藥物在體內(nèi)的半衰期，大多數(shù)天然多肽需要經(jīng)過(guò)多次的結(jié)構(gòu)改造 以達(dá)到臨床應(yīng)用的水平。對(duì)多肽結(jié)構(gòu)的改造有以下幾種方法：①多肽成環(huán)，限制多肽核心序 列的靈活性；②增加 D型氨基酸；③多肽氨基酸的修飾包括甲基化、醇化和醛化等。TMVPl 的核心序列為L(zhǎng)ARGR，根據(jù)以上理論基礎(chǔ)，本發(fā)明對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造使其在體內(nèi)更加穩(wěn)定和 半衰期更長(zhǎng)。迄今為止，應(yīng)用于臨床的多肽示蹤劑主要是放射性核素， 99mTC是核醫(yī)學(xué)應(yīng)用最 廣泛的放射性核素，其應(yīng)用率達(dá)到80 %。99mTc半衰期只有6小時(shí)，具有射程短安全性高等 優(yōu)點(diǎn)。所以本發(fā)明將改造后的LARGR多肽標(biāo)記放射性核素99mTc，應(yīng)用核醫(yī)學(xué)SPECT儀器對(duì) 高表達(dá)VEGFR-3分子的新生淋巴管進(jìn)行腫瘤原發(fā)灶及微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)顯像。
[0008] 本發(fā)明旨在開發(fā)一種新型VEGFR-3分子受體顯像劑MmTc-HYNIC/EDDA-TMVPl，利 用該顯像劑能夠?qū)δ[瘤原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶SPECT顯像，增加惡性腫瘤的早期原發(fā)灶及 前哨淋巴結(jié)的診斷率。此發(fā)明填補(bǔ)了腫瘤新生淋巴管多肽顯像劑的空白，改善了對(duì)腫瘤原 發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的SPECT顯像效果。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] ：
[0010] 基于以上技術(shù)背景和VEGFR-3受體分子顯像劑的醫(yī)療需求，本發(fā)明將公開一種在 含有五個(gè)氨基酸的多肽TMVPl (LARGR)的基礎(chǔ)上進(jìn)行多肽結(jié)構(gòu)改造后的結(jié)構(gòu)式、標(biāo)記放射 性核素99mTc后的結(jié)構(gòu)式、制備方法和在腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶診斷中的應(yīng)用。利用該制備方 法可獲得針對(duì)VEGFR-3受體分子的腫瘤顯像劑" mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl，該顯像劑能夠靶 向于VEGFR-3高表達(dá)的腫瘤組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。利用核醫(yī)學(xué)科SPECT儀器，該顯像劑能 夠?qū)Π▽m頸癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤和肝癌等腫瘤VEGFR-3分子顯像，進(jìn)而達(dá)到對(duì) 腫瘤原發(fā)灶及微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的診斷和為后續(xù)TMVPl衍生物治療腫瘤提供理論依據(jù)，可以解 決目前腫瘤分子診斷技術(shù)和實(shí)踐中關(guān)鍵的不足之處。
[0011] 本發(fā)明達(dá)到了以下效果：
[0012] 1.將多肽標(biāo)記放射性核素 99mTc :放射性核素99mTc發(fā)射γ光子，臨床使用SPECT儀 器診斷各種疾病已成為醫(yī)療單位常用的診斷技術(shù)之一。本發(fā)明使用雙功能螯合劑HYNIC和 共配體EDDA將多肽標(biāo)記放射性核素 99mTc，人工合成多肽HYNIC-E-G-Cyclic (CGLARGRGC)， 利用本實(shí)驗(yàn)室已有的多肽標(biāo)記放射性核素99mTc的成熟方案將TMVPl標(biāo)記放射性核素 99mTc。 標(biāo)記成功后其結(jié)構(gòu)式為：
[0013] "mTTc-HYNIC/EDDA-E-G-Cyclic(CGLARGRGC)
[0014] 3.體外實(shí)驗(yàn)顯示99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl在生理鹽水、半胱氨酸和正常人的血清 中能夠穩(wěn)定存在達(dá)18小時(shí)之久，并且其能夠與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié) 合。利用慢病毒在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)VEGFR-3后，該新型藥物能夠特異性的與其相親和。 上述結(jié)果證實(shí)對(duì)多肽的結(jié)構(gòu)改造后并沒(méi)有影響其與VEGFR-3相結(jié)合的特異性， 99mTc-HYNIC/ EDDA-TMVP1能夠作為VEGFR-3受體分子顯像劑。
[0015] 4.使用該新型VEGFR-3受體分子顯像劑能夠?qū)m頸癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤 和肝癌等裸鼠皮下瘤模型SPECT顯像，皮下瘤顯像清晰，其顯像效果與腫瘤組織VEGFR-3表 達(dá)有關(guān)，并且該顯像劑經(jīng)過(guò)腎臟代謝，其余器官攝取率低。
[0016] 四、【附圖說(shuō)明】：
[0017] 圖1:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖。
[0018] 圖 2 :99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl 的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0019] 圖 3 :99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl 在體外穩(wěn)定性試驗(yàn)。
[0020] 圖4 :99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl與奇靜脈內(nèi)皮細(xì)胞親和性試驗(yàn)。
[0021] 圖5 :靜脈注射顯像劑后不同時(shí)間點(diǎn)4T1腫瘤模型SPECT顯像。
[0022] 圖 6 :4T1 皮下瘤模型 99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl 和 400 μ g TMVPl 聯(lián)合注射競(jìng)爭(zhēng)性 結(jié)合SPECT顯像。
[0023] 圖7 :各種皮下瘤動(dòng)物模型腫瘤SPECT顯像。
[0024] 圖8 :99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl在4T1荷瘤小鼠內(nèi)各個(gè)器官的分布情況。 圖9 :VEGFR-3各種腫瘤模型中腫瘤組織表達(dá)情況。 四、【具體實(shí)施方式】：
[0025] 1.多肽的合成
[0026] 人工合成 HYNIC-E-G-Cyclic (CGLARGRGC)多肽，純度為 98 %，通過(guò) RP-HPLC 和 MS 技術(shù)檢測(cè)其分子量和質(zhì)量。
[0027] 2.多肽的放射性核素標(biāo)記
[0028]
標(biāo)記方法：10 μL HYNIC-E-G-Cyclic(CGLARGRGC) (lKg/KL ) / 10 mg EDDA 20 mg tricine I mL 0. 2M PBS (PH=7. 4) I mL Na99mTcO4 (8 mci) 20 μL Sncl2 (lmg/ml 溶于0· IN Hcl)
[0029] 自然冷卻到室溫
[0030] 3.脫鹽純化方案
[0031] 使用Sep-pak vac C-18反相柱純化（購(gòu)于美國(guó)waters公司）。依次過(guò)柱溶液： 5mL無(wú)水乙醇、5mL生理鹽水、5mL空氣、反應(yīng)混合液、5mL生理鹽水。200 yL 70%無(wú)水乙醇 洗脫產(chǎn)物，洗脫溶液每一滴分別放于I. 5ml的EP管，檢測(cè)每一滴的放射性活度及放射性化 學(xué)純度。
[0032] 使用此標(biāo)記方案和純化方案成功的將放射性核素99mTc標(biāo)記到 HYNIC-E-G-Cyclic(CGLARGRGC)上。純化前后均達(dá)到 99% 以上。
[0033] 4.放射性化學(xué)純度檢測(cè)
[0034] iTLC-SG應(yīng)用三種展開劑檢測(cè)合成產(chǎn)物的放射性化學(xué)純度：
[0035] ①，展開劑丙酮決定沒(méi)有結(jié)合多肽游離的99mTc量（Rf = 1. 0)
[0036] ②，0· IM 檸檬酸（PH = 5. 0)決定 99mTc-Coligand 和游離 99mTc 的量（Rf = 1. 0)
[0037] ③，甲醇：乙酸銨=I : I (v/V)決定 99mTc-Colloid(Rf = 0)
[0038] 99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl 在三種展開劑中的迀移率分別是 0· 0,0· 3,0· 7-1. 0，
[0039] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：99mTc-HYNIC/EDDA-TMTPl 標(biāo)記效率 99 % 以上，游離 99mTc、 99mTc-Coligand、99mTc-CoIloid 幾乎為零。
[0040] 5.體外穩(wěn)定性試驗(yàn)：
[0041] ①在生理鹽水中的穩(wěn)定性：lmci99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl在生理鹽水中放置lh、 3h、6h和18h后使用薄層色譜層析iTLC-SG檢測(cè)其穩(wěn)定性。
[0042] ②在半胱氨酸中的穩(wěn)定性：lmci"mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl加入ImL半胱氨酸溶液 中（lmg/mL)，室溫下孵育lh、3h、6h和18h后使用薄層色譜層析iTLC-SG檢測(cè)其穩(wěn)定性。
[0043] ③在正常血型中的穩(wěn)定性：將lmci99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl加入1ml正常人血清 中，37°C中孵育lh、3h、6h和18h，到了孵育時(shí)間后，分別吸出250 yL樣品血清與750 yL甲 醇/乙腈（I : 1)混合，充分混勻后3000rpm離心3分鐘，取上清檢測(cè)其放射性化學(xué)純度。
[0044] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)Tc-HYNIC/EDDA-TMVPl在生理鹽水中、半胱氨酸和正常血清中穩(wěn)定性 較好，18后分別仍達(dá)到86. 94%、94. 07%和96. 99%。
[0045] 6.細(xì)胞親和試驗(yàn)
[0046] 用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)人奇靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC (來(lái)源于ATCC)，待細(xì)胞密度達(dá)到 80 %時(shí)，胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種到24孔中（控制細(xì)胞密度約70 % )，第二天將 1 μ ci99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl加入到貼壁的細(xì)胞孔板中，分別在孵育30分鐘、1小時(shí)、2小 時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)和6小時(shí)后將每孔上清轉(zhuǎn)移至巴氏管中，并用冰冷的細(xì)胞用PBS洗 兩遍。然后加入500ul 0.1 M NaOH將細(xì)胞消化下來(lái)轉(zhuǎn)移至一新巴氏管，用r-counts計(jì)數(shù)。 為了避免非特異性結(jié)合，設(shè)置副孔將未標(biāo)記的99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl連同標(biāo)記的多肽一 起加入到孔板中，檢測(cè)其細(xì)胞攝取率。
[0047] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，HUVEC細(xì)胞攝取"mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl劑量增加，6 小時(shí)時(shí)％ AD達(dá)到3%。說(shuō)明細(xì)胞的攝取是特異性的攝取，HUVEC細(xì)胞表達(dá)VEGFR-3,根據(jù)理 論依據(jù)99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl的受體為VEGFR-3,其能夠與高表達(dá)VEGFR-3細(xì)胞相結(jié)合。
[0048] 7.腫瘤模型的建立和SPECT顯像
[0049] 建立宮頸癌、卵巢癌和乳腺癌皮下瘤模型：
[0050] (1)準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞
[0051] 細(xì)胞宮頸癌細(xì)胞系C-33A、HeLa和SiHa和卵巢癌細(xì)胞系SK0V3用含有10 %血清的 DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，（37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)），小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1和人類乳腺癌細(xì)胞 系SKBR3用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)用0. 25%的胰酶消化，用完全培 養(yǎng)基終止消化后將細(xì)胞收集到15mL離心管中，800rpm離心5分鐘，棄去上清用細(xì)胞用PBS 重懸，再次800rpm離心5分鐘，棄去上清用細(xì)胞用PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)胞密度。
[0052] (2)皮下瘤模型
[0053] 3-4周的BALB/c-nude裸鼠和普通BALB/C購(gòu)買于北京華阜康生物科技股份有限公 司，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心SPF級(jí)動(dòng)物房。分別在每只BALB/c-nude 裸鼠腋窩脂肪墊處接種I X IO7個(gè)SK0V3、I X 10 7個(gè)SiHa、5 X 10 6個(gè)C-33A或3 X 10 6個(gè)HeLa 細(xì)胞，約接種20-27天后裸鼠皮下瘤長(zhǎng)到1-1. 5cm2。將I X IO6個(gè)4T1細(xì)胞接種于普通BALB/ C老鼠的右前乳腺原位處，約1-2周腫瘤生長(zhǎng)至1-1. 5cm2。
[0054] (3) SPECT 顯像
[0055] 按照本發(fā)明制備方法合成純化99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl，將Imci的該藥物通過(guò)尾 靜脈注射于荷瘤小鼠中，分別于不同時(shí)間點(diǎn)用3%戊巴比妥鈉麻醉，將麻醉好的荷瘤小鼠進(jìn) 行SPECT儀低能高分辨率準(zhǔn)直器采集前位顯像（采集參數(shù)：矩陣128X128、窗寬20%、放大 4倍、能峰140Kev、靜態(tài)采集10分鐘）。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)采取將 99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl與 400 μ g的TMVPl同時(shí)注射入荷瘤小鼠中SPECT顯像。
[0056] SPECT顯像實(shí)驗(yàn)結(jié)果：I) lmei99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl尾靜脈注射入4T1原位乳腺 癌模型中，隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤部位顯像越來(lái)越明顯，3小時(shí)、4小時(shí)和5小時(shí)的時(shí)候 顯像效果較好（如圖5)。2)400 μ g的TMTPl與顯像劑同時(shí)注射入4T1荷瘤小鼠內(nèi)后，競(jìng)爭(zhēng) 性結(jié)合組小鼠腫瘤模型部位顯像效果較實(shí)驗(yàn)組明顯差很多。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)SPECT顯像結(jié) 果證明該顯像劑對(duì)腫瘤的顯像是特異性的（圖6)。3) 99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl能夠?qū)Χ喾N 腫瘤模型顯像如宮頸癌皮下瘤模型（C33A、SiHa和HeLa)和卵巢癌模型（SK0V3和A2780)， 但是該顯像劑并不能對(duì)肝癌IfepG2皮下瘤模型顯像（圖7)。
[0057]
[0058] 7.體內(nèi)分布試驗(yàn)
[0059] 皮下瘤模型按照上述方法建立，20 μ c i的99mTc-HYNIC/EDDA-TMVP1通過(guò)尾靜脈 于15只4T1皮下瘤小鼠，每三只一組，分別于60min、2h、4h和6h通過(guò)眼球靜脈竇取血并 頸椎離斷處死，將每只小鼠的腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、大腸、肌肉和腦取出并稱重， r-counts計(jì)數(shù)其放射性活度。取三次lmci99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl分別溶于100 μ L生理 鹽水中，裝入密封小管用于注射后衰變校正。計(jì)算每組老鼠各個(gè)器官的百分劑量率％ ID/g， graphpad prism分析統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0060] 體內(nèi)分布試驗(yàn)結(jié)果：99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl主要經(jīng)過(guò)泌尿系統(tǒng)排泄，其腎臟在 2小時(shí)百分劑量率為23. 7% ID/g，是其他器官的20倍多。其在4T1腫瘤的分布2小時(shí)為 0· 65% ID/g，T/B 和 T/Μ 分別為 2. 73 和 4. 24(圖 8)
[0061] 8.組織化學(xué)分析其腫瘤組織中VEGFR-3表達(dá)情況。
[0062] 將荷瘤小鼠的腫瘤組織甲醛固定并石蠟包埋切片，組織化學(xué)步驟如下：
[0063] ①石蠟切片脫水，石蠟切片68°C烤片2小時(shí)，立即轉(zhuǎn)入環(huán)保脫蠟液1中10分鐘，依 次浸泡在以下溶液中：環(huán)保脫蠟液210分鐘，無(wú)水乙醇5分鐘，95%乙醇5分鐘，80%乙醇5 分鐘，75 %乙醇5分鐘，最后放入組化用PBS中。
[0064] ② PBS 洗 3 X 5 分鐘。
[0065] ③3%過(guò)氧化氫37°C孵育30分鐘
[0066] ④ PBS 洗 3 X 5 分鐘。
[0067] ⑤檸檬酸抗原修復(fù)液高火煮沸低火修復(fù)10分鐘。自然冷卻至室溫。
[0068] ⑥ PBS 洗 3 X 5 分鐘。
[0069] ⑦5 %山羊血清37 °C封閉1小時(shí)。
[0070] ⑧ VEGFR-3 抗體 I :100 稀釋（biolegend clone9D9F9)4°C孵育過(guò)夜。
[0071] ⑨ PBS 洗 3X10 分鐘。
[0072] ⑩生物素標(biāo)記山羊抗兔37°C孵育30分鐘。
[0073] O PBS 洗 3 X 10 分鐘。
[0074] Θ辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈毒卵白素37°C孵育30分鐘。
[0075] Θ PBS 洗 3 X 10 分鐘。
[0076] Θ: DAB顯色，避光室溫孵育5min。
[0077] ?蘇木素染核10分鐘，1 %鹽酸酒精脫色，3%氨水返藍(lán)，在顯微鏡下觀察其細(xì)胞 核染色情況。
[0078] ?脫水，切片依次浸泡入一下溶液：75%酒精5分鐘，80%酒精5分鐘，95%酒精5 分鐘，無(wú)水乙醇5分鐘，環(huán)保脫蠟液210分鐘，環(huán)保脫蠟液110分鐘。晾干
[0079] ◎中性樹脂封片。
[0080] ?Leika顯微鏡下拍照觀察腫瘤組織VEGFR-3表達(dá)情況。
[0081] VEGFR-3組化結(jié)果：SPECT顯像明顯的腫瘤組織（如4T1和HeLa)表達(dá)VEGFR-3多， 而顯像不明顯的腫瘤組織如IfepG2表達(dá)較低。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新型VEGFR-3受體顯像劑99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl，包括核心序列LARGR多肽， 其特征是將LARGR多肽通過(guò)半胱氨酸二硫鍵成環(huán)，利用雙功能螯合劑6-肼基煙酸（HYNIC) 和共配體乙二胺二乙酸（EDDA)將E-G-Cycli c(CGLARGRGC)連接放射性核素99mTc。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl應(yīng)用于腫瘤的診斷，其特征是利用 99mTc-HYNIC/EDDA-TMVPl能夠靶向于高表達(dá)VEGFR-3腫瘤組織并且對(duì)腫瘤進(jìn)行SPECT顯像。
【文檔編號(hào)】A61K103/10GK105983108SQ201510072097
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日
【發(fā)明人】馬丁, 奚玲, 李飛, 馬湘, 馬湘一, 張振中
【申請(qǐng)人】珠海雅馬生物工程有限公司