作為疫苗佐劑和治療試劑的短寡核苷酸的設(shè)計(jì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了通過(guò)施用有效量的核苷、短寡核苷酸化合物或其類似物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體，來(lái)治療受試者中的微生物感染的方法和改善受試者中針對(duì)疾病、狀況、感染或病毒的免疫系統(tǒng)應(yīng)答的方法。另外，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防受試者(例如人)中的病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染或真菌感染的方法。本發(fā)明的化合物包括例如如本文提供的二和三核苷酸化合物。本發(fā)明的化合物可用于不同治療應(yīng)用，包括例如預(yù)防劑和治療劑。本發(fā)明還提供了化合物的設(shè)計(jì)和合成，所述化合物可用于如本文提及的多種治療應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】作為疫苗佐劑和治療試劑的短寡核苷酸的設(shè)計(jì)
[0001 ]與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本發(fā)明要求于2013年2月18日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/766,011的優(yōu)先 權(quán)利益，所述美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 先天性免疫在機(jī)體針對(duì)原核生物和真核生物病原體例如病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng) 等的防御中起關(guān)鍵作用。事實(shí)上，通過(guò)病毒引起的急性和慢性感染構(gòu)成主要的全世界的公 共衛(wèi)生危機(jī)，具有明顯未滿足的醫(yī)學(xué)需要（1，2)。除傳染病之外，病毒引起全世界所有癌癥 的15-20%，包括肝癌、宮頸癌和胰腺癌，各自導(dǎo)致顯著的死亡率和發(fā)病率。
[0005] 除人類痛苦之外，病毒性疾病導(dǎo)致壓倒性的衛(wèi)生保健費(fèi)用和生產(chǎn)力喪失。例如，全 世界500，000，000至600，000，000人由HBV和HCV慢性感染，并且由于病毒誘導(dǎo)的肝硬化和肝 癌，每年發(fā)生1，〇〇〇,〇〇〇至2,000,000例死亡。全世界數(shù)以萬(wàn)計(jì)的患者迫切需要肝移植。人乳 頭狀瘤病毒感染導(dǎo)致宮頸癌，并且與HIV感染相關(guān)的卡波濟(jì)肉瘤的發(fā)生率均有據(jù)可查。大流 行性感冒的特征在于在人中高水平的發(fā)病率和死亡率，并且與由于缺乏針對(duì)其新型抗原亞 型的預(yù)存免疫而增加水平的感染和發(fā)病機(jī)制相關(guān)?？共《緞┎粌H潛在減慢大流行性感冒的 傳播，還可能最終是解決方案。當(dāng)今，由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis) (Mtb)引起的肺結(jié)核殺死比任何其他細(xì)菌感染更多的人。在超過(guò)90個(gè)國(guó)家，接近三分之一的 人群被Mtb感染，并且2，000，000人每年死于該疾病。
[0006] 盡管疫苗可作為針對(duì)有限數(shù)目的病毒的預(yù)防藥獲得，但它們對(duì)于已經(jīng)感染的那些 人沒(méi)有實(shí)際的治療利益。此外，由于在新人類菌株已鑒定后生成足夠劑量的針對(duì)其的合適 疫苗所需的時(shí)間，針對(duì)某些病毒的疫苗(例如流感疫苗)不太可能對(duì)大范圍流行中的死亡率 造成顯著影響。佐劑的使用可以增大疫苗的效力，且提供針對(duì)廣泛范圍的病毒的保護(hù)。
[0007] 因此，我們的抗病毒防御幾乎專一地依賴抗病毒藥物的使用。不幸的是，許多醫(yī)學(xué) 上重要的病毒，特別是RNA病毒是危險(xiǎn)的，不能在模型系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)試，或不能繁殖用于測(cè) 試潛在的候選藥物。
[0008] 目前的抗病毒藥物中的許多已作為病毒聚合酶、蛋白酶、整合酶和進(jìn)入抑制劑開(kāi) 發(fā)。然而，設(shè)計(jì)為抑制病毒生長(zhǎng)的藥物也可以不利地影響宿主細(xì)胞，因?yàn)椴《旧芷阢暯?正常宿主細(xì)胞功能。順應(yīng)抗病毒干預(yù)的有限的病毒靶進(jìn)一步阻礙抗病毒藥物開(kāi)發(fā)。因此，盡 管近50年的抗病毒研究，我們的抗病毒藥物庫(kù)仍少到危險(xiǎn)的程度，在國(guó)際市場(chǎng)上僅具有約 34種抗病毒藥物，大部分針對(duì)HIV和皰疹病毒。
[0009] 進(jìn)一步地，幾種慢性病毒性疾病包括HCV和HBV的目前治療選項(xiàng)仍是非常有限且有 挑戰(zhàn)性的。事實(shí)上，在療法停止后的病毒反彈、藥物造成的毒性和在抗病毒藥物的選擇壓力 下的抗性株出現(xiàn)仍是目前抗病毒療法中的嚴(yán)重問(wèn)題。病毒的徹底根除很少達(dá)到，并且充其 量在極小的患者隊(duì)列中，因?yàn)槟壳暗目共《警煼óa(chǎn)生不足夠和不可持續(xù)的抗病毒應(yīng)答。靶 向宿主編碼功能的藥物的開(kāi)發(fā)提供了抗微生物開(kāi)發(fā)的替代策略。
[0010] 病毒也已繼續(xù)進(jìn)化出更聰明的逃避宿主免疫應(yīng)答的策略，并且通過(guò)多種機(jī)制發(fā)展 針對(duì)藥物的抗性。細(xì)胞經(jīng)由細(xì)胞傳感器使自身免于微生物感染，所述細(xì)胞傳感器包括維甲 酸誘導(dǎo)基因（RIG-I)及其他RIG樣蛋白質(zhì)(RLR)、MDA5、核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)-2(N0D2及 其他Nod樣蛋白質(zhì)(NLR)。經(jīng)由病原體識(shí)別受體與微生物核酸或肽的相互作用活化這些蛋白 質(zhì)引起干擾素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致使細(xì)胞免于感染的IFN產(chǎn)生。事實(shí)上，認(rèn)識(shí)至IjDNA和RNA病 毒兩者均抑制I型干擾素（IFN)產(chǎn)生，從而提示控制IFN應(yīng)答是廣泛范圍的病毒存活必需的 (3,4)。因此，有效的抗病毒療法的開(kāi)發(fā)必須涉及新藥物類別的組合的使用，所述新藥物類 別各自具有新型多重作用機(jī)制，包括刺激宿主免疫應(yīng)答用于根除病毒的那些機(jī)制。類似地， 細(xì)菌已進(jìn)化出導(dǎo)致對(duì)抗菌劑抗性的獨(dú)特機(jī)制。因此，有效的抗菌療法的開(kāi)發(fā)必須涉及新藥 物類別的組合的使用，所述新藥物類別各自具有新型多重作用機(jī)制，包括刺激宿主免疫應(yīng) 答用于根除細(xì)菌的那些機(jī)制。許多不同類型的癌癥已進(jìn)化出發(fā)展針對(duì)抗癌劑的抗性的不同 機(jī)制。因此，有效的抗癌療法的開(kāi)發(fā)必須涉及新藥物類別的組合的使用，所述新藥物類別各 自具有新型多重作用機(jī)制，包括刺激宿主免疫應(yīng)答用于根除癌癥的那些機(jī)制。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用作預(yù)防試劑的核苷、短寡核苷酸化合物或其類似物， 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體(下文被稱 為"本發(fā)明的化合物"）。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用作疫苗佐劑的核苷、短寡核苷酸化 合物或其類似物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變 異構(gòu)體。
[0013] 本發(fā)明的化合物包括例如式(I)的化合物：
[0014]
[0023] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是式(I I)的化合物：
[0024]
[0025] 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體，
[0026] 其中：
[0027] X =不存在、〇、NH、NR 或 S;
[0028] X1 =不存在、0 或 NH;
[0029] A =不存在、芳基或芳烷基；
[0030] n = 0、l、2、3、4或 5;
[0031 ] R =烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、雜環(huán)、0-烷基、0-雜芳基或甾 體；
[0032] RjPR2各自獨(dú)立地是Η、0Η、0-烷基、烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷 基、雜環(huán)、0-芳基、0-雜芳基芳基或雜環(huán)；
[0033] R3選自氫、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C(O) NH-烷基和C(O)NH-芳基；
[0034] Y和Z各自獨(dú)立地是0或S;
[0035] BjPB2各自獨(dú)立地是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或經(jīng)修飾的核苷；
[0036] m = 1-6 ；
[0037] R4獨(dú)立地是H、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C (O)NH-烷基和C(O)NH-芳基、單磷酸、二磷酸或三磷酸基。
[0038]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是具有下述結(jié)構(gòu)的化合物：
[0039]
[0040] 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0041] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是具有下述結(jié)構(gòu)的化合物：
[0042]
[0043]或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0044] 本發(fā)明還提供了通過(guò)給鑒定為有此需要的受試者(或宿主)施用有效量的本發(fā)明 的化合物，來(lái)治療受試者(或宿主）中的微生物感染的方法。
[0045] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了改善受試者(或宿主）中針對(duì)疾病、狀況、感染或病毒 的免疫系統(tǒng)應(yīng)答的方法。該方法包括給受試者施用有效量的作為疫苗佐劑的本發(fā)明的化合 物。
[0046]在該方法的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是式（I)的短寡核苷酸化合物或其 類似物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0047] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是式（II)的短寡核苷酸化合物或其類似物， 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0048] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是
[0049]
[0050] 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0051] 本發(fā)明還提供了用于預(yù)防和治療宿主(或受試者)包括人中的病毒感染的方法。該 方法包括施用有效量的本發(fā)明的化合物。
[0052] 在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和治療宿主(或受試者)包括人中的細(xì)菌 感染的方法，其包括施用有效量的本發(fā)明的化合物。
[0053]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了用于預(yù)防和治療宿主(或受試者)包括人中的寄生蟲(chóng)感染 的方法，其中所述方法包括施用有效量的本發(fā)明的化合物。
[0054] 再進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了通過(guò)給宿主施用有效量的本發(fā)明的化合物，用于預(yù)防 和治療宿主(或受試者)包括人中的真菌感染的方法。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的化合物可以連同疫苗(例如BCG疫苗)或者一種或多 種另外試劑一起施用。即，根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或者與疫苗或另外 一種或多種試劑組合或順次施用。
[0056] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物和疫苗施用用于治療或預(yù)防微生物感染。
[0057] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物與其他抗微生物劑組合施用，用于治療或 預(yù)防微生物感染。
[0058] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和化合物針對(duì)病毒使用。
[0059] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，方法和化合物用于治療或預(yù)防癌癥。
[0060] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于治療或預(yù)防本文描述的狀況、疾病、感染或病毒的藥物 組合物和試劑盒。藥物組合物包括治療有效量的本發(fā)明的化合物，和藥學(xué)可接受的賦形劑。 本發(fā)明的試劑盒包括治療有效量的本發(fā)明的化合物，和關(guān)于施用化合物用于治療或預(yù)防本 文描述的狀況、疾病、感染或病毒的書(shū)面說(shuō)明書(shū)。本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防本文的狀 況、疾病、感染或病毒的包裝藥劑和物品。
[0061] 此外，本發(fā)明還提供了可用于如本文提及的多種治療應(yīng)用的化合物的設(shè)計(jì)和合 成。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)詳述和權(quán)利要求將是顯而易見(jiàn)的。
[0062] 附圖簡(jiǎn)述
[0063]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的下述更具體描述，本發(fā)明的前述及其他目的、特點(diǎn) 和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的，如附圖中舉例說(shuō)明的，其中在不同視圖自始至終，相似的參考符號(hào) 指相同部分。附圖不一定按比例繪制，相反重點(diǎn)放在舉例說(shuō)明本發(fā)明的原理上。
[0064] 圖1顯示了在未經(jīng)處理的(UT)和SMNH化合物處理的人肺上皮細(xì)胞(HLE A549細(xì)胞） 中，干擾素調(diào)節(jié)因子_3(IRF3)_螢光素酶報(bào)道基因的活化。
[0065] 圖2證實(shí)了通過(guò)SMNH化合物（SB 40和SB 1B[SB 44-1])的IRF3活化經(jīng)由N0D2活化 而介導(dǎo)。
[0066] 圖3顯示了在HLE細(xì)胞中通過(guò)SB 44活化RIG-I后的IRF3誘導(dǎo)。
[0067] 圖4證實(shí)了在通過(guò)SB 44活化RIG-I和N0D2后，轉(zhuǎn)錄因子NF-KB的誘導(dǎo)。
[0068]圖5顯示了 IRF3的誘導(dǎo)導(dǎo)致磷酸化的IRF3的形成，所述磷酸化的IRF3是IFN信號(hào)傳 導(dǎo)級(jí)聯(lián)中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物。
[0069] 圖6顯示了通過(guò)SB IB的IRF3誘導(dǎo)經(jīng)由N0D2活化而介導(dǎo)；SB 40是SB 44的活性代謝 產(chǎn)物。
[0070] 圖7顯示了SMNH化合物（SB 44和SB 302，a，草酸鹽形式)誘導(dǎo)來(lái)自人肺上皮A549細(xì) 胞的干擾素-iKlFN-β)生產(chǎn)。
[0071] 圖8顯示了 SB 1B(顯示為"SB-44-1-D"）處理導(dǎo)致來(lái)自人肺上皮A549細(xì)胞的IFN-β 生產(chǎn)。
[0072] 圖9顯示了通過(guò)SB 1B(顯示為"SB-44-1-D"）的應(yīng)答者基因 RIG-I和N0D2誘導(dǎo)；SB 50不活化N0D2且用作陰性對(duì)照。
[0073]圖10(a-d)顯示了SMNH化合物增強(qiáng)在巨噬細(xì)胞中的肽抗原-85B的體外呈現(xiàn)，這與 增加的MHC-II表達(dá)關(guān)聯(lián)(SB 44顯示為SB 1A)。
[0074]圖ll(a-e):a)顯示了在小鼠中的疫苗實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；b-e)是顯示作為增強(qiáng)BCG疫苗針 對(duì)小鼠中的肺結(jié)核的功效的佐劑，N0D2活化化合物SB IA(也顯示為SB 44)和SB IB比胞壁 酰二肽(MDP)更佳的圖表。
[0075]圖12顯示了通過(guò)巨噬細(xì)胞中的半胱天冬酶依賴性機(jī)制，N0D2活化化合物SB IA(也 顯示為SB 44)和SB 1B(SB 44的Rp異構(gòu)體)僅與MDP或完整BCG桿菌組合而誘導(dǎo)IL-Ιβ。
[0076] 圖13(a-b)顯示了與BCG疫苗組合的N0D2活化SB IA(也顯示為SB 44)和SB 1B(SB 44的Rp異構(gòu)體)在小鼠中誘導(dǎo)針對(duì)肺結(jié)核的再攻擊的保護(hù)，提示長(zhǎng)期保護(hù)。
[0077] 圖14顯示了開(kāi)發(fā)為驗(yàn)證SB IA(也顯示為SB 44)和SB 1B(SB 44的Rp異構(gòu)體)誘導(dǎo) 的MPEC，可以通過(guò)在小鼠中再生為強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞致使長(zhǎng)期保護(hù)的模型。
[0078] 圖15(a-b)顯示了具有BCG疫苗的SB IA(也顯示為SB 44)或SB 1B(SB 44的Rp異構(gòu) 體)組合保留產(chǎn)生針對(duì)用肺結(jié)核的再攻擊的更佳回憶應(yīng)答的能力。
[0079]圖16顯示了在肺結(jié)核再攻擊的小鼠的肺中，與BCG疫苗組合的N0D2活化SB IA(也 顯示為SB 44)和SB 1B(SB 44的Rp異構(gòu)體)化合物誘導(dǎo)抗原特異性⑶8T細(xì)胞的強(qiáng)勁擴(kuò)增。
[0080] 圖17顯示了當(dāng)與本發(fā)明的化合物組合時(shí)，用BCG處理的PBMC中的干擾素誘導(dǎo)。
[0081] 發(fā)明詳述
[0082] 在一個(gè)方面，本發(fā)明特征在于本文描述的化合物和使用此類化合物用于治療受試 者中的微生物感染的方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于改善受試者中針對(duì)疾病、狀況、 感染或病毒的免疫系統(tǒng)應(yīng)答的化合物、組合物和方法。
[0083] 本發(fā)明還提供了通過(guò)給宿主(或受試者)施用有效量的本發(fā)明的化合物，來(lái)預(yù)防和 治療宿主(或受試者)包括人中的病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染或真菌感染的方法。 [0084]多藥抗性Mtb(MDR-Mtb)對(duì)目前的抗TB藥物中的許多是有抗性的，所述抗TB藥物包 括異煙肼、利福平、卡那霉素等。WHO估計(jì)全世界高達(dá)50,000,000人可能被MDR-Mtb感染。由 于藥物治療/抗性中的困難，預(yù)防或限制肺結(jié)核的疫苗接種變得越來(lái)越重要。目前，BCG疫苗 是針對(duì)兒童期TB的唯一可變保護(hù)，并且不提供針對(duì)成人疾病的保護(hù)。因此，需要更有效的 BCG疫苗。加強(qiáng)BCG效力的一種方法是將其與佐劑組合。佐劑是可以促進(jìn)、調(diào)節(jié)且改善疫苗免 疫原性的化合物。佐劑還可以降低所需靶抗原劑量且以定量方式調(diào)節(jié)抗原特異性免疫應(yīng) 答，例如Thl和Th2應(yīng)答。先天性免疫中的近期進(jìn)展已顯示TLR、RIG-I和NLR，特別是N0D2識(shí)別 多種核酸配體，其刺激先天性免疫應(yīng)答且促進(jìn)佐劑樣活性。
[0085]脊椎動(dòng)物系統(tǒng)不斷地處于被侵入微生物的攻擊下，并且已進(jìn)化出免疫介導(dǎo)的用于 消除病原體的防御。哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)包含先天性和獲得性免疫的組分。先天性免疫系統(tǒng) 經(jīng)由有限數(shù)目的種系編碼的病原體識(shí)別受體(PRR)來(lái)識(shí)別微生物(3,4)。吞噬細(xì)胞例如巨噬 細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。獲得性免疫應(yīng)答的特征在于涉及淋巴細(xì)胞的特異 性，所述淋巴細(xì)胞攜帶通過(guò)諸如基因重排的機(jī)制生成的抗原特異性受體。先天性免疫在調(diào) 節(jié)肝損傷、纖維化和再生中起重要作用。例如，通過(guò)干擾素活化天然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)可以 是治療肝纖維化的新型策略。這是因?yàn)镹K細(xì)胞的活化可以殺死特別活化的肝星狀細(xì)胞 (HSC)，從而改善肝纖維化和肝腫瘤形成。因此，本發(fā)明中公開(kāi)的寡核苷酸類似物可以在抑 制肝纖維化和肝癌進(jìn)展中具有效用。
[0086]微生物也已進(jìn)化出更聰明的逃避免疫應(yīng)答的策略，所述免疫應(yīng)答使宿主細(xì)胞免于 感染。事實(shí)上，DNA和RNA病毒兩者均抑制細(xì)胞IFN產(chǎn)生（I型、IFN-cuIFN-β)。細(xì)胞內(nèi)IFN是有 力的抗病毒細(xì)胞因子，其表達(dá)/產(chǎn)生通過(guò)未感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中存在的轉(zhuǎn)錄因子IRF3(IFN 調(diào)節(jié)因子3)介導(dǎo)。一旦細(xì)胞被感染，并且病毒組分(也稱為病原體相關(guān)分子模式(PAMPS，例 如病毒基因組、病毒蛋白質(zhì)等）由專門(mén)的病毒傳感器或模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別，IRF3就被 活化。活化的IRF3易位至核，以反式活化IFN基因表達(dá)。IFN產(chǎn)生通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)保護(hù)性抗 病毒效應(yīng)(經(jīng)由旁分泌和自分泌活性），所述機(jī)制例如（i)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的活化， (ii)通過(guò)抗病毒和有利的促炎因子的產(chǎn)生，在細(xì)胞中誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)，和(iii)病毒感染細(xì) 胞的受控細(xì)胞凋亡。PRR因此是IFN應(yīng)答的必需組分。最近以來(lái)，N0D2,核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域 (NOD)蛋白質(zhì)的家族成員，已發(fā)現(xiàn)是檢測(cè)單鏈RNA(ssRNA)病毒包括RSV和A型流感的PRR。有 趣的是，如同病毒傳感器RIG-I，N0D2的活化還導(dǎo)致觸發(fā)IFN產(chǎn)生和NF-κβ誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí) 聯(lián)，其促進(jìn)受控的促炎應(yīng)答，以加強(qiáng)IFN的抗病毒作用。因?yàn)?，N0D2是檢測(cè)廣泛范圍的ssRNA 病毒例如RSV和A型流感的病毒傳感器，其呈現(xiàn)用于抗病毒開(kāi)發(fā)和對(duì)抗抗病毒抗性的獨(dú)特宿 主靶。
[0087]類似于N0D2，RIG-I是將雙鏈病毒RNA識(shí)別為PAMP的宿主細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)，其活化I 型干擾素免疫防御，從而抑制病毒復(fù)制以及壓制對(duì)于病毒感染的細(xì)胞允許性(6-15) AIG-I 是檢測(cè)廣泛范圍的RNA病毒的病毒傳感器，所述RNA病毒例如黃病毒包括丙型肝炎病毒、仙 臺(tái)病毒、流感病毒、以及水皰性口炎病毒、狂犬病毒和日本腦炎病毒，它呈現(xiàn)關(guān)于廣譜抗病 毒活性的獨(dú)特宿主靶。值得注意的是盡管HBV是DNA病毒，但它使用前基因組RNA模板用于起 始DNA合成，且潛在地因此RIG-I可以是HBV pgRNA的受體。
[0088]已發(fā)現(xiàn)某些二核苷酸組合物具有通過(guò)RIG-I途徑的活化，用于刺激先天性免疫和 誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生的潛力。此類化合物還可以是針對(duì)病毒感染預(yù)防上有用的，并且用作疫苗 中的佐劑。
[0089] 病毒傳感器RIG-I是由下述組成的多聚細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì):C末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(RD)、 兩個(gè)末端半胱天冬酶(caspase)活化和召募結(jié)構(gòu)域(CARDS)以及中央ATP酶結(jié)構(gòu)域。病毒雙 鏈RNA(dsRNA)和5'-三磷酸是兩個(gè)PAMP，其允許RIG-I區(qū)別病原體RNA(含和不含三磷酸的 dsRNA)與宿主RNA(其通常在末端處具有"帽"修飾）（6-14)。此外，RIG-I具有通過(guò)易位現(xiàn)象 感測(cè)病毒RNA的能力（Myong等人，Science 323，1070.2009)。在病毒基因組的dsRNA上的 RIG-I易位和反復(fù)改組是RIG-I的觸發(fā)物，以經(jīng)歷構(gòu)象變化，活化其ATP酶且暴露CARDS用于 遍在蛋白化。在下一步中，CARDS與線粒體抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)(MAVS)[也稱為干擾素 β刺激物 [(IPS-I)或VISA]]相互作用，以引發(fā)導(dǎo)致I型IFN表達(dá)(IFN-a、i3)的下游信號(hào)傳導(dǎo)。
[0090] N0D2和RIG-I是多聚蛋白質(zhì)，其在結(jié)構(gòu)和組構(gòu)上非常相似。因此，如同RIG-I，N0D2 含有CARD結(jié)構(gòu)域。另外，RIG-I和N0D2均具有位于NBD(核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域）（對(duì)于N0D2)和解 旋酶(對(duì)于RIG-I)結(jié)構(gòu)域中的核苷酸結(jié)合袋。分子建模研究顯示某些二核苷酸組合物與核 苷三磷酸(NTP)結(jié)構(gòu)具有結(jié)構(gòu)相似性，所述NTP結(jié)構(gòu)與NBD結(jié)合。我們假設(shè)短寡核苷酸充當(dāng) NTP模擬物，其與N0D2(和RIG-I)的NBD結(jié)合，且因此其活化用于下游抗病毒作用。
[0091] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的核苷、短寡核苷酸化合物或其類似物可以調(diào)節(jié)免疫途徑， 所述免疫途徑涉及Toll樣受體(TLR)、非TLR受體例如維甲酸誘導(dǎo)基因-I(RIG-I)和核苷酸 寡聚蛋白質(zhì)(NOD)，統(tǒng)稱為T(mén)LR、RLR和NLR。這些途徑通過(guò)其各自配體的活化可以誘導(dǎo)多種細(xì) 胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，例如白細(xì)胞介素、干擾素、NF-KB、TNF_a等，并且還引起具有抗微 生物活性的某些細(xì)胞蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)，從而提供抗微生物免疫。相反，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了用于引 起炎癥途徑抑制的化合物，導(dǎo)致在自身免疫疾病中的有利效應(yīng)。
[0092] 本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的核苷、短寡核苷酸化合物及其類似物可以用作 疫苗的佐劑。本發(fā)明的化合物具有針對(duì)由細(xì)菌和病毒因子引起的多種傳染病的治療效用。 本發(fā)明的化合物還可用于治療或預(yù)防自身免疫疾病，例如過(guò)敏、哮喘、炎性病癥、以及其他 疾病例如癌癥。
[0093] 因此，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防本文描述的多種狀況、疾病、感染或病毒的方 法。
[0094] 定義
[0095] 為了使本發(fā)明可以更容易得到理解，為了方便起見(jiàn)，某些術(shù)語(yǔ)首先在此處進(jìn)行定 義和收集。
[0096] 本發(fā)明的化合物包含來(lái)自"天然"核酸（即天然核苷間鍵，或核堿基6、(：、1\1]^等） 的一種或多種修飾。修飾包括例如核苷酸間鍵、堿基、或糖部分的修飾。
[0097] 核苷單位由國(guó)際公認(rèn)的線圖約定表示。在下文例子中，2'_取代的核糖核苷以常規(guī) 結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的線圖形式兩者表示。
[0098]
[0099]附著至產(chǎn)生α或βΝ或C核苷的也和出的糖單位包括但不限于呋喃糖、脫氧呋喃核糖、 核糖和阿拉伯糖。
[0100] 術(shù)語(yǔ)"施用(administration)"或"施用(administering)"包括將一種或多種化合 物引入受試者以執(zhí)行其預(yù)期功能的途徑。可以使用的施用途徑的例子包括注射(皮下、靜脈 內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)）、經(jīng)口、吸入、直腸和經(jīng)皮。藥物制劑當(dāng)然通過(guò)適合于每種施用途 徑的形式給予。例如，這些制劑以片劑或膠囊形式、通過(guò)注射、吸入、通過(guò)洗劑或軟膏局部施 用；以及通過(guò)栓劑直腸施用。經(jīng)口施用是優(yōu)選的。注射可以是推注，或可以是連續(xù)輸注。取決 于施用途徑，化合物可以以所選材料包被或在所選材料中沉積，以使其免于可能有害地影 響其執(zhí)行其預(yù)期功能的能力的天然條件。
[0101] 化合物可以單獨(dú)或與如上所述的另一種試劑(例如疫苗)或藥學(xué)可接受的載體或 兩者結(jié)合施用。化合物可以在另一種試劑施用前，與試劑同時(shí)，或在試劑施用后進(jìn)行施用。 此外，化合物還可以以前體形式施用，所述前體形式在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成其活性代謝產(chǎn)物、或更活 性的代謝產(chǎn)物。
[0102] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"芳基"指具有一個(gè)或兩個(gè)芳環(huán)的單環(huán)或多環(huán)碳環(huán)環(huán)系統(tǒng)，包 括但不限于苯基、萘基、四氫萘基、茚滿基、茚基(idenyl)等。
[0103] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"雜芳基"指具有五至十個(gè)環(huán)原子的單環(huán)或多環(huán)（例如二環(huán)或 三環(huán)或更多環(huán))芳香族原子團(tuán)或環(huán)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子選自例如S、0和N;零個(gè)、一個(gè)或 兩個(gè)環(huán)原子是獨(dú)立地選自例如S、0和N的另外雜原子;并且剩余環(huán)原子是碳，其中環(huán)內(nèi)含有 的任何N或S可以任選是氧化的。雜芳基包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑 基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基、噻二唑、噁二唑基、苯硫基、呋喃基、喹啉基、異喹啉 基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。
[0104] 依照本發(fā)明，本文描述的芳基、取代芳基、雜芳基和取代雜芳基中的任何均可為任 何芳香族基團(tuán)。芳香族基團(tuán)可以是取代或未取代的。
[0105] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"烷基"指分別含有一至六個(gè)、或一至十二個(gè)碳原子的飽和、直 鏈或支鏈烴原子團(tuán)。C1-C6烷基原子團(tuán)的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁 基、叔丁基、新戊基和正己基原子團(tuán)；并且C1-C12烷基原子團(tuán)的例子包括但不限于乙基、丙 基、異丙基、正己基、辛基、癸基、十二基原子團(tuán)。
[0106] 術(shù)語(yǔ)"芳烷基(aralkyl)"或"芳烷基(arylalkyl)"包含芳基取代的烷基原子團(tuán)例 如芐基、二苯甲基、三苯甲基、苯乙基、和二苯乙基。
[0107] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)"指非芳香族5、6或7元環(huán)或者二環(huán)或三環(huán)基團(tuán)稠合系 統(tǒng)，其中（i)每個(gè)環(huán)含有獨(dú)立地選自氧、硫和氮的一至三個(gè)雜原子，（i i)每個(gè)5元環(huán)具有0至1 個(gè)雙鍵，并且每個(gè)6元環(huán)具有0至2個(gè)雙鍵，（iii)氮和硫雜原子可以任選是氧化的，（iv)氮雜 原子可以任選是季銨化的，（iv)上述環(huán)中的任何均可與苯環(huán)稠合，和(V)剩余環(huán)原子是碳原 子，其可以任選是氧基取代的。代表性雜環(huán)烷基包括但不限于[1，3 ]二氧戊環(huán)、吡咯烷基、吡 唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、噁唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、噻 唑烷基、異噻唑烷基、喹喔啉基、噠嗪基(pyridazinonyl)和四氫呋喃基。此類雜環(huán)基團(tuán)可以 是進(jìn)一步取代的。
[0108] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"環(huán)烷基"指示通過(guò)去除單個(gè)氫原子，衍生自單環(huán)或多環(huán)飽和 碳環(huán)環(huán)化合物的單價(jià)基團(tuán)。例子包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、二環(huán) [2.2.1]庚基和二環(huán)[2.2.2]辛基。
[0109]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"取代芳基"、"取代烷基"、"環(huán)烷基"指在其上的一個(gè)、兩個(gè)或 三個(gè)或更多個(gè)氫原子由取代基取代的先前定義的芳基、烷基和環(huán)烷基，所述取代基包括但 不限于_F、-C1、 -Br、-I、-0H、受保護(hù)的羥基、-1'102、 -01'1、-順2、受保護(hù)的氛基、-順-(]1-(]12 -燒 基、-NH-C2-C12-嫌基、 -NH-C2-C12-嫌基、-NH -C3-C12-環(huán)掠基、-NH-芳基、 -NH-雜芳基、-NH-雜環(huán)烷基、-二烷基氛基、 _二芳基氛基、_二雜芳基氛基、_0_C1_C 12-烷基、-0-C2-C12-稀 基、《2-012-烯基、《3-(]12 -環(huán)烷基、-0-芳基、-0-雜芳基、 -0-雜環(huán)烷基、-(](0)-〇1-C12-烷基、-C (0) -C2-C12-烯基、-C (0) -C2-C12-烯基、-C (0) -C3-C12-環(huán)烷基、-C (0)-芳基、-C (0)-雜芳基、-C (0)-雜環(huán)烷基、-C0NH2、-CONH-Cl -Cl 2-烷基、-C0NH-C2-C12-烯基、-⑶NH-C2-C12-烯基、-C0NH-C3-C12-環(huán)烷基、-CONH-芳基、-CONH-雜芳基、-CONH-雜環(huán)烷基、-0C02-Cl-Cl 2-烷基、-0C02-C2-C12-烯基、-0C02-C2-C12-烯基、-0C02-C3-C12-環(huán)烷基、-0C02-芳 基、-0C02-雜芳基、-0C02-雜環(huán)烷基、-0C0NH2、-0 ⑶ NH-Cl -Cl 2-烷基、-0C0NH-C2-C12-烯 基、-0C0NH-C2-C12-烯基、-0C0NH-C3-C12-環(huán)烷基、-OCONH-芳基、-OCONH-雜芳基、-OCONH-雜環(huán)烷基、-NHC(0)-C1-C12-烷基、-NHC(0)-C2-C12-烯基、-NHC(0)-C2-C12-烯基、-NHC(O)-C3-C12-環(huán)烷基、-NHC(O)-芳基、-NHC(O)-雜芳基、-NHC(O)-雜環(huán)烷基、-NHC02-C1-C12-烷 基、-NHC02-C2-C12-烯基、-NH ⑶ 2-C2-C12-烯基、-NHC02-C3-C12-環(huán)烷基、-NH ⑶ 2-芳基、-NHC02-雜芳基、-NH ⑶ 2-雜環(huán)烷基、-NHC (0) NH2、-NHC (0) NH-Cl -Cl 2-烷基、-NHC (0) NH-C2-C12-烯基、-NHC(0)NH-C2-C12-烯基、-NHC(0)NH-C3-C12-環(huán)烷基、-NHC(O)NH-芳基、-NHC(O) NH-雜芳基、-NHC (0) NH-雜環(huán)烷基、NHC (S) NH2、-NHC (S) NH-CI-C12-烷基、-NHC (S) NH-C2-C12-烯基、-NHC(S)NH-C2-C12-烯基、-NHC(S)NH-C3-C12-環(huán)烷基、-NHC(S)NH-芳基、-NHC(S) NH-雜芳基、-NHC (S) NH-雜環(huán)烷基、-NHC (NH) NH2、-NHC (NH) NH-CI-C12-烷基、-NHC (NH) NH-C2_C12_ 烯基、-NHC(NH)NH-C2-Cl2-烯基、-NHC(NH)NH-C3-Cl 2-環(huán)烷基、-NHC(NH)NH-芳基、- NHC(NH)NH-雜芳基、-NHC(NH)NH-雜環(huán)烷基、-NHC(NH)-C1-C12-烷基、-NHC(NH)-C2-C12-烯 基、-NHC(NH)-C2-C12-烯基、-NHC(NH)-C3-C12-環(huán)烷基、-NHC(NH)-芳基、-NHC(NH)-雜芳 基、-NHC(NH)-雜環(huán)烷基、-C(NH)NH-C1-C12-烷基、-C(NH)NH-C2-C12-烯基、-C(NH)NH-C2-C12-烯基、-C(NH)NH-C3-C12-環(huán)烷基、-C(NH)NH-芳基、-C(NH)NH-雜芳基、-C(NH)NH-雜環(huán)烷 基、-S(0)-C1-C12-烷基、-S(0)-C2-C12-烯基、-S(0)-C2-C12-烯基、-S(0)-C3-C12-環(huán)烷 基、-S(O)-芳基、-S(O)-雜芳基、-S(O)-雜環(huán)烷基-S02NH2、-S02NH-C1-C12-烷基、-S02NH-C2-C12-烯基、-S02NH-C2-C12-烯基、-S02NH-C3-C12-環(huán)烷基、-S02NH-芳基、-S02NH-雜芳 基、-S02NH-雜環(huán)烷基、-NHS02-C1 -Cl 2-烷基、-NHS02-C2-C12-烯基、-NHS02-C2-C12-烯基、-NHS02-C3-C12-環(huán)烷基、-NHS02-芳基、-NHS02-雜芳基、-NHS02-雜環(huán)烷基、-CH2NH2、-CH2S02CH3、-芳基、-芳基烷基、-雜芳基、-雜芳基烷基、-雜環(huán)烷基、-C3-C12-環(huán)烷基、聚烷氧 基烷基、聚烷氧基、 _甲氧基甲氧基、-甲氧基乙氧基、-SH、-S-C1_C12-烷基、-S-C2-C12-稀 基、 -S-C2-C12-烯基、K3-C12-環(huán)烷基、-S -芳基、-S-雜芳基、-S-雜環(huán)烷基、或甲硫基甲 基。應(yīng)當(dāng)理解芳基、雜芳基、烷基等可以是進(jìn)一步取代的。
[0110]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"甾體"指具有眾多天然存在的或合成脂溶性有機(jī)化合物中的 任一種，其具有在四個(gè)環(huán)中排列的17個(gè)碳原子作為基礎(chǔ)，并且包括留醇和膽汁酸，腎上腺和 性激素，某些天然藥物例如洋地黃化合物，以及某些維生素的前體。留體結(jié)構(gòu)的例子包括但 不限于膽固醇、膽留烷醇、3α_環(huán)5-α-膽留烷-6-β-醇、膽酸、膽留醇甲酸酯、膽留烯甲酸酯。
[0111] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"經(jīng)修飾的核苷"指包括經(jīng)修飾的雜環(huán)堿基、經(jīng)修飾的糖部分 或其組合的任何核苷。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)修飾的核苷是非天然嘧啶或嘌呤核苷，如本文 描述的。經(jīng)修飾的核苷的例子包括但不限于2 ' -取代的核糖核苷、阿糖苷 (arabinonucleoside)或2'-脫氧_2'_氟阿拉伯糖苷、脫氮腺噪呤、脫氮鳥(niǎo)噪呤。
[0112] 為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)"一種或多種短寡核苷酸"指由1至約6個(gè)連接的核苷單位 形成的單、二或多核苷。此類短核苷酸可以得自現(xiàn)有核酸來(lái)源，包括基因組或cDNA，但優(yōu)選 通過(guò)合成方法產(chǎn)生。核苷殘基可以通過(guò)眾多已知的核苷間鍵中的任一種彼此偶聯(lián)。此類核 苷間鍵可以是經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的，并且包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基、乙 酰胺酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、嗎啉代、硼(borano)、硫醚、橋接氨基磷酸酯、橋接亞甲 基膦酸酯、橋接硫代磷酸酯和砜核苷間鍵。術(shù)語(yǔ)"短核苷酸"還涵蓋具有一個(gè)或多個(gè)立體特 異性核苷間鍵(例如(RP)-或（SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯鍵）的多核苷。本發(fā) 明的短核苷酸包括任何此類核苷間鍵，無(wú)論該鍵是否包含磷酸基。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中， 這些核苷間鍵可以是經(jīng)修飾的或未經(jīng)修飾的，并且包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯或 二硫代磷酸酯鍵或其組合。
[0113] 術(shù)語(yǔ)"一種或多種短核苷酸"還涵蓋另外的取代基，包括但不限于蛋白質(zhì)基團(tuán)、親 脂基團(tuán)、嵌入劑、二胺、葉酸、膽固醇和金剛烷。
[0114] 術(shù)語(yǔ)"一種或多種短核苷酸"還涵蓋任何其他含核堿基聚合物，包括但不限于肽核 酸(PNA)、具有磷酸基的肽核酸(PHONA)、鎖核酸(LNA)。
[0115] PNA和LNA的例子顯示于下文：
[0116]
[0117] "核苷酸"指核酸亞單位(無(wú)論是DNA還是RNA或其類似物，例如肽核酸(PNA)和鎖核 酸(LNA))，其包括核苷酸間鍵、糖基團(tuán)和雜環(huán)堿基，以及此類亞單位的類似物。"核苷"指包 括糖基團(tuán)和雜環(huán)核堿基的核酸亞單位。應(yīng)當(dāng)理解，如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"核苷"和"核苷酸"包 括這樣的部分，其不僅含有天然存在的核苷酸間鍵(就"核苷酸"而言），例如磷酸二酯核苷 酸間鍵;天然存在的糖部分例如核糖和脫氧核糖部分；以及天然存在的核堿基例如嘌呤和 嘧啶堿基，例如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、鳥(niǎo)嘌呤(G)或尿嘧啶(U)，還含有經(jīng)修 飾的核苷酸間鍵、經(jīng)修飾的糖部分以及經(jīng)修飾的嘌呤和嘧啶堿基或其類似物，或者經(jīng)修飾 的和未經(jīng)修飾的核苷酸間鍵、糖部分以及嘌呤和嘧啶堿基的任何組合。經(jīng)修飾的核苷的其 他例子包括無(wú)環(huán)核苷，其由開(kāi)環(huán)形式的核糖和脫氧核糖部分組成。相應(yīng)地，此類開(kāi)環(huán)核苷可 以用于形成經(jīng)修飾的核苷酸。經(jīng)修飾的核苷的其他例子包括C-核苷例如假異胞嘧啶，以及 核苷模擬物包括核苷電子等排物，例如肽核酸單體和鎖核酸單體。
[0118] 核堿基包括天然存在的嘌呤和嘧啶核堿基以及經(jīng)修飾的核堿基，其包括但不限于 甲基化嘌呤或嘧啶、?；堰驶蜞奏さ龋虮Ｗo(hù)基團(tuán)例如乙?；⒍阴；?、三氟乙酰基、 異丁酰基、苯甲酰基等的添加。嘌呤或嘧啶堿基還可以是前述的類似物;合適的類似物將是 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在有關(guān)課本和文獻(xiàn)中描述。常見(jiàn)類似物包括但不限于1-甲基 腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-異戊基腺嘌呤、2-甲基硫代-N-6-異戊基腺嘌 呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基 胞嘧啶、4-乙?；奏?、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、2，2_二甲基鳥(niǎo)嘌 呤、8-溴鳥(niǎo)嘌呤、8-甲氧基鳥(niǎo)嘌呤、8-甲氧基腺嘌呤、8-氯鳥(niǎo)嘌呤、8-氨基鳥(niǎo)嘌呤、8-甲基鳥(niǎo) 嘌呤、8-硫代鳥(niǎo)嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨基 甲基）尿嘧啶、5-(羧基甲基氨基甲基)-尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧 啶、Q核苷(queosine)、肌苷、1-甲基肌苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羥基氨基嘌呤、 6_硫代嘌呤、2，6-二氨基嘌呤-5-三氟甲基胸腺嘧啶、6-氯-腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤。其他例 子包括但不限于5-氟-尿嘧啶、5-三氟甲基胸腺嘧啶、6-氯-腺嘌呤、2-環(huán)戊氧基腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤。
[0119] 在某些實(shí)施方案中，堿基B可以是非天然核堿基，包括通用核堿基。堿基B的此類例 子包括但不限于二氟甲苯基、硝基吡咯基和硝基咪唑基等等。
[0120] 還應(yīng)當(dāng)理解"經(jīng)修飾的堿基"還被稱為"經(jīng)修飾的核堿基"，包括含氮化合物，其可 以是或不是雜環(huán)。此類優(yōu)選的含氮化合物包括但不限于-NHR18,其中R18是氫、丁氧羰基 (Boc)、芐氧羰基、烯丙基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的 芳烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、或者雜環(huán)。
[0121] 術(shù)語(yǔ)"經(jīng)修飾的核堿基"進(jìn)一步意欲包括雜環(huán)化合物，其在最通常的含義上不是核 苷堿基，但可以充當(dāng)核苷堿基。此類化合物包括如本領(lǐng)域已知的"通用堿基"。通用堿基可以 包括芳環(huán)部分，其可以含有或不含氮原子。在一些實(shí)施方案中，通用堿基可以共價(jià)附著至核 苷的戊糖的C-Γ碳。通用堿基的例子包括3-甲基丙烯基喹諾酮（PIM)、3_甲基異喹諾酮 (MICS)、和5-甲基異喹諾酮部分。另外的例子包括肌苷衍生物、吡咯甲酰胺類似物、硝基吡 咯和硝基咪唑。
[0122] 經(jīng)修飾的核苷酸和核苷糖部分的例子包括但不限于:海藻糖、阿拉伯糖、2'-脫氧-2 取代的戊糖部分、2 '-0-取代的戊糖部分、核糖、來(lái)蘇糖和木糖、或己糖基團(tuán)。為了本發(fā)明 的目的，命名糖基團(tuán)中的任何的術(shù)語(yǔ)"2 取代的"例如"2 取代的核糖核苷"或"2 取代的 阿拉伯糖苷"包括核糖核苷或阿糖苷，其中在戊糖部分的2'-位置上的羥基被取代，以產(chǎn)生 2取代或2 '-0-取代的核糖核苷或阿糖苷。優(yōu)選地，此類取代使用含有1-6個(gè)飽和或不飽和 的碳原子的低級(jí)烷基，或使用具有6-10碳原子的芳基，其中此類烷基或芳基可以是未取代 的，或可以是例如用鹵素、羥基、三氟甲基、氰基、硝基、?；?、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰 基或氨基取代的。2'-0_取代的核糖核苷或2'-0_取代的阿拉伯糖苷的例子包括但不限于 2 ' -0-甲基核糖核苷(本文也指示為2 ' -OMe)或2 ' -0-甲基阿拉伯糖苷和2 ' -0-甲氧基乙基核 糖核苷或2'-0_甲氧基乙基阿拉伯糖苷。術(shù)語(yǔ)"2'_取代的核糖核苷"或"2'_取代的阿拉伯糖 苷"還包括核糖核苷或阿糖苷，其中2'-羥基替換為含有1-6個(gè)飽和或不飽和的碳原子的低 級(jí)烷基，或者氨基或鹵素基團(tuán)。此類2'-取代的核糖核苷或2'-取代的阿拉伯糖苷的例子包 括但不限于2 氨基、2 氟、2 烯丙基和2 炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷。
[0123] 經(jīng)修飾的核苷酸間鍵的例子包括但不限于:取代的和未取代的硫代磷酸酯、二硫 代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰 基、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、嗎啉代、硼、硫醚、橋接氨基磷酸酯、橋接亞甲基膦酸酯、橋接硫 代磷酸酯和砜核苷間鍵。
[0124] 本發(fā)明的化合物含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心，并且因此可以作為外消旋物和外消 旋混合物、單一對(duì)映體，非對(duì)映體混合物和個(gè)別非對(duì)映體出現(xiàn)。本發(fā)明意欲包括對(duì)于五元呋 喃糖環(huán)具有β-D立體化學(xué)構(gòu)型的短核苷酸化合物，即其中在五元呋喃糖環(huán)的C-I和C-4處的 取代基具有β-立體化學(xué)構(gòu)型（"向上"取向，其通常由本文描述的一些化學(xué)式中的粗線指 示)。
[0125] 術(shù)語(yǔ)"前體藥物"包括具有可以在體內(nèi)代謝的部分的化合物。一般地，前體藥物在 體內(nèi)通過(guò)酯酶或通過(guò)其他機(jī)制代謝為活性藥物。前體藥物的例子及其用途是本領(lǐng)域眾所周 知的（參見(jiàn)例如Berge等人（1977)〃Pharmaceutical Salts"，J.Pharm. Sci ·66:1-19)。前體 藥物可以在化合物的最終分離和純化期間原位制備，或通過(guò)使以其游離酸形式的純化化合 物或羥基與合適的酯化劑分開(kāi)反應(yīng)進(jìn)行制備。羥基可以經(jīng)由用羧酸處理轉(zhuǎn)換成酯。前體藥 物部分的例子包括取代的和未取代的、支鏈或非分支低級(jí)烷基酯部分(例如丙酸酯）、低級(jí) 烯基酯、二低級(jí)烷基-氨基低級(jí)烷基酯（例如二甲基氨基乙酯）、酰基氨基低級(jí)烷基酯（例如 乙酰氧基甲酯）、酰氧基低級(jí)烷基酯（例如、新戊酰氧基甲酯）、芳基酯（苯酯）、芳基-低級(jí)烷 基酯(例如芐酯）、取代的（例如具有甲基、鹵素或甲氧基取代基)芳基和芳基-低級(jí)烷基酯、 酰胺、低級(jí)烷基酰胺、二低級(jí)烷基酰胺、和羥基酰胺。某些前體藥物部分是例如丙酸酯和酰 基酯。還包括在體內(nèi)通過(guò)其他機(jī)制轉(zhuǎn)換為活性形式的前體藥物。
[0126] 縮寫(xiě)
[0127] 可以用于下文方案和實(shí)施例的描述中的縮寫(xiě)是：
[0128] AcOH用于乙酸；
[0129] Boc2O用于二叔丁基二碳酸酯；
[0130] Boc用于叔丁氧羰基；
[0131] Bpoc用于1-甲基-1-(4-聯(lián)苯基）乙基羰基；
[0132] Bz用于苯甲?；?；
[0133] Bn用于芐基；
[0134] BocNHOH用于叔丁基N-羥基氨基甲酸酯；
[0135] t-BuOK用于叔丁醇鉀；
[0136] Bu3SnH用于三丁基氫化錫；
[0137] ⑶I用于羰基二咪唑；
[0138] CH2Cl2用于二氯甲烷；
[0139] CH3用于甲基；
[0140] CH3CN用于乙腈；
[0141] DMSO用于二甲亞砜；
[0142] EtOAc用于乙酸乙酯；
[0143] EtOH用于乙醇；
[0144] Et2O用于二乙醚；
[0145] HCl用于氯化氫；
[0146] MeOH用于甲醇；
[0147] MOM用于甲氧基甲基；
[0148] Ms用于甲磺?；?SO2-CH3;
[0149] Ms2O用于甲磺酸酐或甲磺?；狒?；
[0150] NaCl用于氯化鈉；
[0151] NaH用于氫化鈉；
[0152] NaHCCb用于碳酸氛納（sodium bicarbonate)或碳酸氛納（sodium hydrogen carbonate)；
[0153 ] Na2CO3 碳酸鈉；
[0154] NaOH用于氫氧化鈉；
[0155] Na2SO4用于硫酸鈉；
[0156] NaHS〇3用于亞硫酸氫鈉 （sodium bisulfite)或亞硫酸氫鈉 （sodium hydrogen sulfite)；
[0157] Na2S2O3用于硫代硫酸鈉；
[0158] NH2NH2 用于肼；
[0159] NH4HCO3用于碳酸氫銨；
[0160] NH4Cl用于氯化銨；
[0161] OH用于羥基；
[0162] OMe用于甲氧基；
[0163] OEt用于乙氧基；
[0164] TEA或Et3N用于三乙胺；
[0165] TFA三氟乙酸；
[0166] THF用于四氫呋喃；
[0167] TPP或PPh3用于三苯基膦；
[0168] Ts用于甲苯磺?；?SO2-C6H4CH 3;
[0169] Ts2O用于甲苯磺酸酐或甲苯磺酰基酸酐；
[0170] TsOH用于對(duì)甲苯磺酸；
[0171] Ph用于苯基；
[0172] TBS用于叔丁基二甲基硅烷基；
[0173] TMS用于三甲基硅烷基；
[0174] TMSCl用于三甲基氯硅烷。
[0175] 本發(fā)明的化合物
[0176] 本發(fā)明提供了核苷、短寡核苷酸化合物或其類似物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消 旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。本發(fā)明還包括以其前體藥物和代謝產(chǎn) 物形式的化合物。
[0177] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了二和三核苷酸，包括但不限于3-dApsU2，-QMe、3' dApsA7??和3 '-dApsTpsC及其類似物，其中"ps"指硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
[0178] 本發(fā)明的化合物包括例如式(I)的化合物：
[0179]
[0180] 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體，
[0181] 其中：
[0182] RdPR2各自獨(dú)立地是Η、0Η、0-烷基、烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷 基、雜環(huán)、0-芳基、0-雜芳基芳基或雜環(huán)；
[0183] R3選自氫、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C(O) NH-烷基和C(O)NH-芳基；
[0184] Y和Z各自獨(dú)立地是0或S;
[0185] BjPB2各自獨(dú)立地是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或經(jīng)修飾的核苷；
[0186] m= 1~6〇
[0187] R4獨(dú)立地是H、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C (O)NH-烷基和C(O)NH-芳基、單磷酸、二磷酸或三磷酸基。
[0188] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物包括式(II)的化合物：
[0189]
[0190]或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體，
[0191] 其中：
[0192] X =不存在、〇、NH、NR 或 S;
[0193] X1 =不存在、0 或 NH;
[0194] A =不存在、芳基或芳烷基；
[0195] n = 0、l、2、3、4或 5;
[0196] R =烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、雜環(huán)、0-烷基、0-雜芳基或甾 體；
[0197] RdPR2各自獨(dú)立地是Η、0Η、0-烷基、烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷 基、雜環(huán)、0-芳基、0-雜芳基芳基或雜環(huán)；
[0198] R3選自氫、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C(O) NH-烷基和C(O)NH-芳基；
[0199] Y和Z各自獨(dú)立地是0或S;
[0200] BjPB2各自獨(dú)立地是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶或經(jīng)修飾的核苷；
[0201] m= 1-6 ；
[0202] R4獨(dú)立地是H、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C (O)NH-烷基和C(O)NH-芳基、單磷酸、二磷酸或三磷酸基。
[0203]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是具有下述結(jié)構(gòu)的化合物：
[0204]
[0205] 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0206] 在M-個(gè)賣施方鑾中，太發(fā)明的化合物是具有下述結(jié)構(gòu)的化合物：
[0207]
[0208] 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0209] 本發(fā)明的其他實(shí)施方案提供了下述化合物或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì) 映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體：
[0210]
[0211]進(jìn)一步地，本發(fā)明的化合物可以包含來(lái)自"天然"核酸的一種或多種修飾，即天然 核苷間鍵，或核堿基G、C、T、U、A等。修飾包括例如核苷酸間鍵、堿基、或糖部分的修飾。
[0212] 本發(fā)明還提供了本文描述的化合物的互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、光學(xué)異構(gòu)體、N-氧 化物、水合物、溶劑合物、多晶型物、藥學(xué)上可接受的酯、酰胺、鹽、前體藥物、和同位素衍生 物。
[0213] 本發(fā)明的化合物中的一些的結(jié)構(gòu)包括不對(duì)稱碳原子。相應(yīng)地，產(chǎn)生于于此類不對(duì) 稱的異構(gòu)體(例如所有對(duì)映體和非對(duì)映體)均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，除非另有說(shuō)明?？梢?通過(guò)常規(guī)分離技術(shù)和/或通過(guò)立體化學(xué)控制的合成，以基本上純的形式獲得此類異構(gòu)體。
[0214] 天然存在的或合成異構(gòu)體可以以本領(lǐng)域已知的幾種方式進(jìn)行分離。用于分離兩種 對(duì)映體的外消旋混合物的方法包括使用手性固定相的色譜法(參見(jiàn)例如"Chiral Liquid Chromatography，〃W. J.Lough，Ed.Chapman和Hall，New York( 1989))。對(duì)映體還可以通過(guò)常 規(guī)分辨技術(shù)進(jìn)行分離。
[0215] 獲得本發(fā)明的化合物的方法包括購(gòu)買、合成或以其他方式獲得化合物。合成本發(fā) 明的化合物在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的化學(xué)方法內(nèi)；用于制備本發(fā)明的化合物的示例性方法 在本文中得到描述。用于優(yōu)化反應(yīng)條件的方法，需要時(shí)使競(jìng)爭(zhēng)副產(chǎn)物降到最低的方法，是本 領(lǐng)域已知的。方法還可以另外包括在本文具體描述的步驟之前或之后的步驟，以添加或去 除合適的保護(hù)基團(tuán)，以便最終允許合成本文的化合物。另外，多個(gè)合成步驟可以以交替順序 或次序執(zhí)行，以獲得所需化合物。
[0216]方法和用途
[0217] 本發(fā)明的化合物可用于廣泛范圍的治療領(lǐng)域中，所述治療領(lǐng)域涉及宿主免疫組 分，包括但不限于:過(guò)敏、炎癥、自身免疫性疾病、C0PD、哮喘等等。由于這些化合物可以通過(guò) 許多機(jī)制來(lái)充當(dāng)免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑的事實(shí)，它們具有在自身免疫疾病中的治療用途。例如，因 為化合物具有刺激先天性免疫應(yīng)答的潛力，所以它們可以單獨(dú)或與其他試劑組合用于治療 多種癌癥，包括但不限于黑色素瘤、骨髓瘤、癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和肉瘤。例如，因?yàn)槟承┕押?苷酸組合物具有抑制免疫應(yīng)答的潛力，所以它們可以單獨(dú)或與其他試劑組合用于治療多種 自身免疫疾病，包括但不限于過(guò)敏、哮喘、coro和多發(fā)性硬化。
[0218] 因?yàn)樵S多干擾素相關(guān)基因產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，所以化合物可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的 選擇性細(xì)胞死亡。因此，本發(fā)明的組合物可以單獨(dú)或者與疫苗或另一種或多種其他試劑組 合或順次使用。
[0219] 本發(fā)明因此提供了通過(guò)給鑒定為有此需要的受試者(或宿主)施用有效量的本發(fā) 明的化合物，來(lái)治療受試者(或宿主）中的微生物感染的方法。
[0220]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了改善受試者中針對(duì)疾病、狀況、感染或病毒的免疫系 統(tǒng)應(yīng)答的方法。該方法包括給受試者施用有效量的作為疫苗佐劑的本發(fā)明的化合物。
[0221] 本發(fā)明還提供了通過(guò)施用有效量的本發(fā)明的化合物，來(lái)預(yù)防和治療宿主(或受試 者）中的病毒感染的方法。本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或者與疫苗或其他試劑組合或順次施 用。
[0222] 在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)施用有效量的本發(fā)明的化合物，來(lái)預(yù)防和治 療宿主(或受試者）中的細(xì)菌感染的方法。本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或者與疫苗或其他試劑 組合或順次施用。
[0223] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了通過(guò)施用有效量的本發(fā)明的化合物，來(lái)預(yù)防和治療宿主 (或受試者）中的寄生蟲(chóng)感染的方法。本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或者與疫苗或其他試劑組合 或順次施用。
[0224] 還公開(kāi)了用于預(yù)防和治療宿主(或受試者）中的真菌感染的方法。該方法包括施用 有效量的本發(fā)明的化合物，其可以單獨(dú)或者與疫苗或另一種或多種其他試劑組合或順次施 用。
[0225] 在該方法的某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是式（I)的短寡核苷酸化合物或其 類似物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0226] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是式（II)的短寡核苷酸化合物或其類似物， 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0227] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物是
[0228]
[0229] 或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。
[0230] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了在下述圖表中提供的化合物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外 消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體的用途：
[0231；
[0232] 根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的化合物可以單獨(dú)或者連同疫苗（例如BCG疫苗)或一 種或多種另外試劑一起施用。
[0233] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物和疫苗施用用于治療或預(yù)防微生物感染。
[0234] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法針對(duì)病毒使用。
[0235] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該方法用于治療或預(yù)防癌癥。
[0236] 本發(fā)明的方法包括給受試者施用治療有效量或抑制量的本發(fā)明的化合物，其量和 時(shí)間為達(dá)到所需結(jié)果必需的。本發(fā)明的另外方法是用抑制量的本發(fā)明的組合物的化合物處 理生物樣品，其量和時(shí)間為達(dá)到所需結(jié)果必需的。
[0237] 本發(fā)明的另一個(gè)方面包括在治療中使用與用于治療疾病的一種或多種試劑組合 的本發(fā)明的化合物。例如，針對(duì)病毒活性的此類試劑包括拉米夫定(3TC)、阿德福韋、替諾福 韋、更昔洛韋、阿昔洛韋、干擾素、利巴韋林、替比夫定;針對(duì)coro、哮喘、過(guò)敏、過(guò)敏性鼻炎的 其他試劑包括但不限于茶堿、Alvesco (環(huán)索奈德）、Patanase (鹽酸奧洛他定）、Litair is (Ambresentan) (Gilead)、Xyzal(鹽酸左旋西替利嗪）、Brovana(酒石酸阿福特羅）、思力華 (噻托溴銨）、Clarinex、丙酸倍氯米松、Remoduni I (treprostenil)、Xopenex、Duoneb(沙丁 胺醇和噻托溴銨）、富馬酸福莫特羅、全可利（波生坦）、曲安奈德、布地奈德、順爾寧、施立 穩(wěn)、尼多米鈉(吸入器和霧化器）、Zyflo、安可來(lái)、先力騰、仙特明、赫賽汀。在抗癌劑中有例 如但不限于泰素、紫杉醇、順鉑、赫賽汀、格列衛(wèi)、干擾素等等。
[0238] 依照本發(fā)明的該方法，組合的個(gè)別組分可以在治療過(guò)程期間的不同時(shí)間分開(kāi)施 用，或者以分份或單一組合形式同時(shí)施用。本發(fā)明因此應(yīng)理解為包含所有此類同時(shí)或交替 治療方案，并且術(shù)語(yǔ)"施用"將相應(yīng)地被加以解釋。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的化合物與其他試劑的 組合的范圍原則上包括與用于治療病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌感染等等的任何藥物組合物的 任何組合。當(dāng)本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽與第二種治療試劑組合使用時(shí)，每種化 合物的劑量可以與化合物單獨(dú)施用時(shí)的劑量相同或不同。
[0239] 應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的化合物與其他試劑的組合的范圍原則上包括與用于治療coro、 哮喘、過(guò)敏性鼻炎、癌癥等等的任何藥物組合物的任何組合。當(dāng)本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)可 接受的鹽與第二種治療試劑組合使用時(shí)，每種化合物的劑量可以與化合物單獨(dú)施用時(shí)的劑 量相同或不同。
[0240] 為了本發(fā)明的目的，抗微生物劑意欲指示針對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)感染有效 的化合物。
[0241]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)本發(fā)明的化合物的"治療有效量"意指化合物的足夠量，以便 在生物樣品或受試者中產(chǎn)生有利的生物應(yīng)答。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域充分理解的，本發(fā)明的化合物的 治療有效量將處于可應(yīng)用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理利益/風(fēng)險(xiǎn)比。
[0242]本發(fā)明的化合物的抑制量或劑量范圍可以為約0. lmg/Kg-約500mg/Kg，備選地約 1-約50mg/Kg。抑制量或劑量還取決于施用途徑以及與其他試劑共同使用的可能性而改變。
[0243] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"一種或多種生物樣品"意指預(yù)期用于施用于受試者的生物來(lái) 源的物質(zhì)。生物樣品的例子包括但不限于血液及其組分例如血漿、血小板、血細(xì)胞亞群等； 器官例如腎、肝、心臟、肺、腦等;精子和卵子;骨髓及其組分;或干細(xì)胞。因此、本發(fā)明的另一 個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)使所述生物樣品與抑制量的本發(fā)明的化合物或藥物組合物接觸，來(lái)處理 生物樣品的方法。
[0244] 在受試者的狀況改善后，需要時(shí)，可以施用維持劑量的本發(fā)明的化合物、組合物或 組合。隨后，根據(jù)癥狀，施用劑量和頻率或兩者可以降低至在其下保持改善狀況的水平，當(dāng) 癥狀已減輕至所需水平時(shí)，治療應(yīng)停止。然而，在疾病癥狀的任何復(fù)發(fā)后，受試者可能需要 在長(zhǎng)期基礎(chǔ)上的間歇治療。然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的化合物和組合物的每日總使用將由主 治醫(yī)師在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)來(lái)決定。關(guān)于任何特定患者的具體抑制劑量將取決于多種 因素，包括待治療的病癥和病癥的嚴(yán)重性;采用的具體化合物的活性;采用的具體組合物； 患者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食;施用時(shí)間、施用途徑和所采用的具體化合物的排 泄速率的時(shí)間；治療的持續(xù)時(shí)間；與采用的具體化合物在組合中或同時(shí)使用的藥物;和醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域中眾所周知的類似因素。
[0245] 藥物組合物
[0246] 本發(fā)明提供了包含與藥學(xué)可接受的載體結(jié)合的，本發(fā)明的化合物及其衍生物的藥 物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)例子是通過(guò)將上述化合物中的任一種和藥學(xué)可接受的載體組合 制備的藥物組合物。
[0247] 本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽作為活 性成分，并且還可以含有藥學(xué)可接受的載體和賦形劑和任選的其他治療成分。"藥學(xué)可接受 的"意指載體、稀釋劑或賦形劑必須與制劑的其他成分相容，并且對(duì)其接受者無(wú)害。組合物 包括適合于經(jīng)口、直腸、局部、腸胃外（包括皮下、肌內(nèi)和靜脈內(nèi)）、眼部（眼）、肺(鼻或頰吸 入）、或鼻施用的組合物，盡管在任何給定情況下的最合適途徑取決于待治療的狀況的性質(zhì) 和嚴(yán)重性以及活性成分的性質(zhì)。它們可以方便地以單位劑型呈現(xiàn)，且通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域眾所周 知的方法中的任一種進(jìn)行制備。
[0248] 在實(shí)際使用中，根據(jù)常規(guī)藥學(xué)配制技術(shù)，本發(fā)明的化合物可以作為活性成分與藥 學(xué)載體在緊密混合物中組合。載體可以采取廣泛多樣的形式，取決于施用所需的制劑形式， 例如經(jīng)口或腸胃外(包括靜脈內(nèi)）。在制備用于經(jīng)口劑型的化合物中，可以采用通常的藥學(xué) 介質(zhì)中的任一種，在經(jīng)口液體制劑例如懸浮液、酏劑和溶液的情況下，例如水、乙二醇、油、 醇、調(diào)味劑、防腐劑、著色劑等；或在經(jīng)口固體制劑例如粉末、硬和軟膠囊以及片劑的情況 下，載體例如淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、成粒劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑等，其中固體經(jīng) 口制劑優(yōu)選超過(guò)液體制劑。
[0249] 由于其容易施用，片劑和膠囊代表最有利的經(jīng)口劑量單位形式，在所述情況下，明 顯采用固體藥學(xué)載體。需要時(shí)，片劑可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)水性或非水性技術(shù)進(jìn)行包被。此類組合物 和制劑應(yīng)含有至少0.1百分比的活性化合物。在這些組合物中的活性化合物的百分比當(dāng)然 可以改變，并且可以方便地為約2百分比至約60百分比的單位重量。此類治療上有用的組合 物中的活性化合物的量是這樣的，使得將獲得有效劑量。活性化合物還可以作為例如液體 滴劑或噴霧劑鼻內(nèi)施用。
[0250] 片劑、丸劑、膠囊等還可以含有粘合劑例如黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠;賦 形劑例如磷酸二鈣;崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸;潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂;和甜 味劑例如蔗糖、乳糖或糖精。
[0251] 當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除上述類型的材料之外，它還可以含有液體載體例如 脂肪油。多種其他材料可以作為包衣存在，或修飾劑量單位的物理形式。例如，片劑可以用 紫草茸、糖或兩者進(jìn)行包被。除活性成分之外，糖漿劑或酏劑還可以含有蔗糖作為甜味劑， 對(duì)羥基苯甲酸甲酯和丙酯作為防腐劑，染料和調(diào)味料例如櫻桃或橙香料?？梢蕴砑佣喾N穩(wěn) 定劑，其將針對(duì)降解穩(wěn)定活性藥學(xué)成分，例如氨基酸或多胺。其他賦形劑可以包括但不限于 PEG 400、甘氨酸、維生素 E衍生物、脫水山梨醇單油酸酯、殼聚糖、檸檬酸膽堿、脫水山梨醇 單硬脂酸酯、Tween 80、Ig印al CA 630、Brij 35、NP-40及其類似的衍生物。
[0252] 本發(fā)明的化合物還可以腸胃外施用。這些活性化合物的溶液或懸浮液可以在水中 與表面活性劑例如羥丙基纖維素適當(dāng)?shù)鼗旌线M(jìn)行制備。分散體還可以在甘油、液體聚乙二 醇及其在油中的混合物中進(jìn)行制備。在普通貯存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以阻 止微生物的生長(zhǎng)。適合于可注射使用的藥學(xué)形式包括無(wú)菌水溶液或分散體，以及用于臨時(shí) 制備無(wú)菌可注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末。在所有情況下，形式優(yōu)選為無(wú)菌的并且優(yōu)選流 動(dòng)至存在容易可注射性的程度。它在制造和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須針對(duì)微生 物例如細(xì)菌和真菌的污染作用進(jìn)行防腐。載體可以是溶劑或分散體介質(zhì)，含有例如水、乙 醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇）、其合適的混合物、和植物油。
[0253] 任何合適的施用途徑均可用于為哺乳動(dòng)物尤其是人提供治療有效劑量的本發(fā)明 的化合物。術(shù)語(yǔ)化合物的"施用"和"施用"化合物應(yīng)理解為意欲給有需要的個(gè)體提供本發(fā)明 的化合物。施用途徑包括例如但不限于經(jīng)口、舌下、經(jīng)粘膜、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、局部、陰道 等。
[0254] 與所選的施用途徑無(wú)關(guān)，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，可以將以合適的 水合形式使用的一種或多種化合物和/或本發(fā)明的藥物組合物，配制成藥學(xué)可接受的劑型。
[0255] 本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分施用的實(shí)際劑量水平和時(shí)間過(guò)程可以這樣改 變，以便獲得這樣的活性成分量，其對(duì)于特定患者、組合物和施用模式有效達(dá)到所需治療應(yīng) 答，而對(duì)患者無(wú)毒。示例性劑量范圍為約〇. Iyg至20毫克/千克體重/天(mg/kg/天）（例如0.1 yg/kg至2mg/kg、0 · 3_3yg/kg、0 · 18-0 · 54mg/kg)。在其他實(shí)施方案中，該量從約0 · lmg/kg/天 到約100mg/kg/天不等。在另外其他實(shí)施方案中，該量從約0.001^8到約10(^8/1^(例如體 重)不等。對(duì)于上述值中間的范圍也預(yù)期為本發(fā)明的一部分。
[0256] 在單一、多重或分份劑量中施用于受試者的本發(fā)明的化合物的每日總抑制劑量可 以為例如0.01_50mg/kg體重的量，或更通常為0. l-25mg/kg體重的量。
[0257] 單一劑量組合物可以含有此類量或其約數(shù)，以構(gòu)成日劑量。多重劑量可以為在不 同時(shí)間間隔服用的單一劑量。一般地，根據(jù)本發(fā)明的治療方案包含以單一或多重劑量，每天 給需要此類治療的患者施用約IOmg至約1000 mg的本發(fā)明的一種或多種化合物。
[0258] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的化合物可以通過(guò)多重遞送途徑例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、舌下、鼻內(nèi)、 局部等等進(jìn)彳丁施用。
[0259]試劑盒
[0260]本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防本文描述的疾病、狀況或病癥的試劑盒。在一個(gè) 實(shí)施方案中，該試劑盒包括以單位劑型的含有有效量的本發(fā)明的化合物的治療或預(yù)防組合 物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物與疫苗或常規(guī)治療試劑組合提供。在其他實(shí)施方案 中，該試劑盒包含無(wú)菌容器，其含有治療或預(yù)防組合物;此類容器可以為盒、安瓿、瓶、小瓶、 管、袋、小袋、泡罩包裝或本領(lǐng)域已知的其他合適的容器形式。此類容器可以由塑料、玻璃、 層壓紙、金屬箱或適合于容納藥劑的其他材料制成。
[0261]需要時(shí)，本發(fā)明的化合物連同給受試者施用化合物的說(shuō)明書(shū)一起提供，所述受試 者具有本文描述的具體疾病、狀況或病癥，或者處于本文描述的具體疾病、狀況或病癥的危 險(xiǎn)中。說(shuō)明書(shū)一般包括關(guān)于使用組合物用于治療或預(yù)防疾病、狀況、病癥、感染或病毒的信 息。在其他實(shí)施方案中，說(shuō)明書(shū)包括下述中的至少一種：治療試劑的說(shuō)明；用于治療或預(yù)防 缺血或其癥狀的劑量計(jì)劃表和施用;注意事項(xiàng)；警告;適應(yīng)癥;禁忌癥;超劑量彳目息；不良反 應(yīng);動(dòng)物藥理學(xué)；臨床研究;和/或參考。說(shuō)明書(shū)可以直接印刷在容器（當(dāng)存在時(shí))上，或作為 應(yīng)用于容器的標(biāo)簽，或作為在容器中或與容器一起供應(yīng)的分開(kāi)的傳單、小冊(cè)子、卡或文件 夾。 實(shí)施例
[0262] 提出下述實(shí)施例以便為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備且使用本發(fā)明的測(cè)定 法、篩選和治療方法的完整公開(kāi)和說(shuō)明，并且不預(yù)期限制本發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍。
[0263] 化合物的合成
[0264] 在本發(fā)明中作為舉例說(shuō)明性實(shí)施例描述的核苷酸類似物的集中文庫(kù)如以前合成 (17-22)。固相合成和液相策略兩者以補(bǔ)充形式使用，以制備如舉例說(shuō)明的集中文庫(kù)。該方 法可以用于合成在糖、核堿基和核苷酸間鍵處具有修飾的文庫(kù)。我們的實(shí)驗(yàn)室中的幾種技 術(shù)革新促進(jìn)核苷酸文庫(kù)的合成:a)我們先前已開(kāi)發(fā)了使用固相亞磷酰胺和H-膦酸酯技術(shù)， 用于合成二核苷酸文庫(kù)的策略（17-22)。來(lái)自我們實(shí)驗(yàn)室的近期技術(shù)革新也用于二核苷酸 化合物和類似物的固相合成（17-22)。（1)使用微波輔助方法的氨基和羧基官能化固體支持 物的超快速制備，（ii)用于將核苷裝載到固體支持物上的新型方法。開(kāi)發(fā)了用于核苷裝載 支持物的大規(guī)模制備的改良過(guò)程，其涉及使用二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑。獲得80-300微 摩爾/g支持物的高核苷裝載，（iii)用于裝載固體支持物和固相合成的稱為L(zhǎng)OTUS?的 新型反應(yīng)器，其促進(jìn)二核苷酸的大規(guī)模合成。LOTUS?是配備用于反應(yīng)物的控制遞送的 氣動(dòng)閥的多用途反應(yīng)器(20-22)。
[0265] 實(shí)施例1
[0266] 使用與專門(mén)構(gòu)造的LOTUS反應(yīng)器⑩（Padmanabhan，S ·; Coughl in，J · E ·; Iyer， R.P. Tetrahedron Lett.2005,46,343；Iyer,R.P.；Coughlin,J.E.；Padmanabhan, S·Org·Prep ·Proc · Intl · 2005，37，205)結(jié)合的固相亞磷酰胺化學(xué)（Beaucage，S· L. ; Iyer， R.P. Tetrahedron 1993，49,1925)，大規(guī)模（1毫摩爾核苷裝載的可控孔度玻璃(CPG)支持 物)合成硫代磷酸酯類似物3-dAp SU2'-0Me(l)的Rp，Sp混合物。使用我們近期開(kāi)發(fā)的用于固 相支持物的超快速官能化和裝載過(guò)程，制備dA連接的CPG支持物。對(duì)于核苷酸間二核苷亞磷 酸酯偶聯(lián)的產(chǎn)物的硫化，采用3H-1，2_苯并噻吩-3-酮-I，1，-二氧化物(在干CH3CN中0.4M) (Iyer,R.P.；Regan,J.B.；Egan,ff.；Beaucage,S.L.J.Am.Chem.Soc.1990,112,1253)〇
[0267] 在加工、色譜純化和凍干后，獲得>96%純的Rp，Sp 5(~60:40混合物)鈉鹽，其通 過(guò)31P和1H匪R進(jìn)行表征。因此，容易地執(zhí)行二核苷酸化合物和類似物的集中文庫(kù)的固相合 成。在補(bǔ)充策略中，液相合成也用于1的合成。這些方法允許合成具有多種化學(xué)修飾的化合 物。
[0268] 實(shí)施例2:化合物3的合成
[0270]靶化合物3在兩步中進(jìn)行制備。
[0271 ] 步驟1。碘甲基異丙基碳酸酯的制備：向無(wú)水碘化鈉（6g，40mmol)的無(wú)水乙腈 (20mL)溶液中，經(jīng)過(guò)20分鐘逐滴加入氯甲基異丙基碳酸酯（2.9g，19mmol)的無(wú)水乙腈 (IOmL)溶液。由鋁箱(避光)覆蓋的反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將制備的固體過(guò)濾，用乙 腈洗滌且將濾液在減壓下濃縮。將殘?jiān)芙庥谒?IOmL)中，并且在醚(25mL)中提取有機(jī)物。 將醚提取物用亞硫酸氫鈉（5%，IOmL)，隨后為鹽水（IOmL)進(jìn)行洗滌。將有機(jī)層在無(wú)水硫酸 鈉上干燥，過(guò)濾，濃縮且在高干燥真空下進(jìn)行干燥。得率2.72g( 58%); 1H-NMRSlJ(CUeH), 4.95(m，lH)，5.95(s，2H)〇
[0272] 步驟2。化合物5的烷基化:在攪拌下，向二核苷酸I (60mg，0.098mmol)的水(HPLC， 400mL)溶液中，加入碘甲基異丙基碳酸酯（80mg，0.0166mmo 1，3.33當(dāng)量）的丙酮（ImL)溶液。 加入另外的丙酮（ImL)，以獲得澄清溶液，以避免烷基化試劑的油性小球的任何分離。將以 鋁箱覆蓋的反應(yīng)混合物攪拌3小時(shí)，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)條件下濃縮，并且以后在高真空中濃縮，以 獲得作為白色固體的反應(yīng)混合物。這通過(guò)二氧化硅柱色譜法進(jìn)行純化，最初使用氯仿且緩 慢地使用含有2%至最終8%甲醇的氯仿。將含有主要組分的級(jí)分合并，濃縮且在高真空下 干燥過(guò)夜。所需純產(chǎn)物3以幾乎定量得率(68mg)分離; 31P-NMR(MeOH-Ck) δ27.7，28.6。
[0273] 實(shí)施例3:38 40、38 44和38 18作為從》2/1?16-1配體的發(fā)現(xiàn)和活性
[0274] 用于N0D2活化的SMNH化合物的評(píng)估通過(guò)一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)測(cè)定法進(jìn)行。在一級(jí)測(cè) 定法中，SMNH化合物就HLE Α549細(xì)胞中的IRF3表達(dá)誘導(dǎo)進(jìn)行測(cè)試，所述HLE Α549細(xì)胞已知 內(nèi)源表達(dá)N0D2。如圖1-2中所示，二核苷酸類似物SB 40、SB 43、SB 44和SB 1Β，而不是相關(guān) 類似物例如二核苷酸SB 50、SB 110和SB 60,誘導(dǎo)IRF3活化。SB 44,兩種異構(gòu)體Rp和Sp的混 合物，是SB 40的前體藥物。SB IB-SB 44的Rp異構(gòu)體，在圖1-2中顯示為SB 44-1。
[0275] IRF3螢光素酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與僅DMSO(UT)或SMNH化合物(μ M ) -起溫育。在12小時(shí) 溫育后，根據(jù)制造商的方案，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)測(cè) 量螢光素酶活性。通過(guò)測(cè)量海腎螢光素酶的表達(dá)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量螢 光素酶單位(即，誘導(dǎo)倍數(shù))（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。結(jié)果在圖1中描述。
[0276] HEK 293細(xì)胞用N0D2、pcDNA和IRF3螢光素酶進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞隨后與ssRNA(0.5mg/ ml)或SMNH化合物（ΙμΜ) -起溫育。在12小時(shí)溫育后，如先前描述的測(cè)量螢光素酶活性。螢 光素酶測(cè)定法結(jié)果呈現(xiàn)為來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土S.D.(在這些測(cè)定法中采用的詳細(xì) 材料和方法，參見(jiàn):參考文獻(xiàn)(28)。結(jié)果在圖2中描述。
[0277] 圖3顯示了通過(guò)SB 44的RIG-I活化。HEK 293細(xì)胞用RIGI、pcDNA和IRF3-螢光素酶 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞隨后與SB 44(100或500nM) -起溫育。在8小時(shí)或16小時(shí)溫育后，如先前描述 的測(cè)量螢光素酶活性。螢光素酶測(cè)定法結(jié)果呈現(xiàn)為來(lái)自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值± S. D.。
[0278] 圖4證實(shí)了經(jīng)由RIGI和Nod2活化，通過(guò)SB 44的NF-kB活性的誘導(dǎo)。HEK 293細(xì)胞用 RIGI、pcDNA、Nod2和NF-kB-螢光素酶進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞隨后與SB 44(10μΜ) -起溫育。在12小 時(shí)溫育后，如先前描述的測(cè)量螢光素酶活性。螢光素酶測(cè)定法結(jié)果呈現(xiàn)為來(lái)自三次獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)的平均值土 S.D.。
[0279] 圖5顯示了在SB 44處理的人肺上皮細(xì)胞(HLEC)中，活化的IRF3(磷酸化的IRF3或 磷酸-IRF3)的檢測(cè)。人肺上皮A549細(xì)胞與DMSO或SB 44(500nM) -起溫育。在所示處理后時(shí) 間點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞裂解產(chǎn)物實(shí)施蛋白質(zhì)印跡，所述蛋白質(zhì)印跡使用對(duì)于磷酸化的11^3(磷酸_ IRF3)特異性的抗體(細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)）。
[0280] 圖6顯示了在SB 44處理的人肺上皮細(xì)胞(HLEC)中，活化的IRF3(磷酸化的IRF3或 磷酸-IRF3)的檢測(cè)。人肺上皮A549細(xì)胞與DMSO或SB 44(500nM) -起溫育。在所示處理后時(shí) 間點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞裂解產(chǎn)物實(shí)施蛋白質(zhì)印跡，所述蛋白質(zhì)印跡使用對(duì)于磷酸化的11^3(磷酸_ IRF3)特異性的抗體(細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)）。
[0281] 進(jìn)一步的測(cè)試結(jié)果在圖7-9中描述。
[0282] 結(jié)論和討論:基于上述結(jié)果，化合物SB 40、SB 44和SB IB就與BCG疫苗組合的佐劑 樣活性進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)連同BCG-起使用時(shí)，也發(fā)現(xiàn)活化N0D2/RIG-I的二核苷酸化合物SB 40、 SB 44和SB IB增強(qiáng)體外抗原呈遞，增加 M Φ中的MHC-II且引起小鼠的抗TB T細(xì)胞功能中的 急劇增加。如先前所述，SB 44是兩種異構(gòu)體(Rp和Sp)的混合物，其中SB IB是構(gòu)成約55-60 %混合物的Rp異構(gòu)體。
[0283] 實(shí)施例4:N0D2和RIG-I的最佳配體的設(shè)計(jì)
[0284] 為了發(fā)現(xiàn)N0D2和RIG-I的最佳配體，二核苷酸結(jié)構(gòu)SB 40和SB 44用作初始先導(dǎo)化 合物，用于合成如下文作為舉例說(shuō)明性例子顯示的涉及堿基和糖修飾兩者的另外化合物。 與亞磷酰胺和H-膦酸酯化學(xué)結(jié)合的固相和液相合成策略兩者用于其合成。許多構(gòu)件塊是商 購(gòu)可得的將是內(nèi)部合成的。
[0285] 與SB 40和SB 44相關(guān)的化合物的代表性例子顯示于下文：
[0287] 實(shí)施例5:使用巨噬細(xì)胞和小鼠研究與BCG疫苗一起的作為佐劑的NLR配體
[0288] 關(guān)于SB IB的佐劑開(kāi)發(fā)的原理:佐劑已知增強(qiáng)M Φ中的細(xì)胞因子分泌，但其對(duì)M Φ 和DC呈遞抗原以活化T細(xì)胞的能力的作用是未知的。同樣地，T細(xì)胞功能是否可以進(jìn)行調(diào)節(jié) 用于長(zhǎng)期功效也是不明確的。BCG是全世界今天用于預(yù)防肺結(jié)核的最廣泛使用的疫苗。它使 兒童免于肺結(jié)核，但針對(duì)成人TB具有有限功效，可能是由于缺乏長(zhǎng)期功效。在這部分中，當(dāng) 由BCG疫苗感染時(shí)，我們證實(shí)SB IA和SB IB增強(qiáng)M Φ功能，并且它們作為初次疫苗給予小鼠 時(shí)加強(qiáng)BCG的活性，并且作為加強(qiáng)疫苗具有使免于肺結(jié)核的再感染的潛力。
[0289] C57B1/6小鼠骨髓衍生的巨噬細(xì)胞（M Φ )用IOyg/孔的SMNH化合物1-4和LPS陽(yáng)性 對(duì)照（lyg/mL)處理4小時(shí)，隨后用牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)卡介苗(BCG)細(xì)菌感 染4小時(shí)。覆蓋對(duì)于抗原85B表位特異性的BB7T細(xì)胞，并且使用夾心ELISA就IL-2測(cè)試在18小 時(shí)后收集的上清液(P值，t檢驗(yàn)）。
[0290] 圖10(a-d)顯示:a)最活性的SB化合物的初始篩選，評(píng)估SB I (N0D2激動(dòng)劑）以及SB 3和SB 44(與SB 1相關(guān)的二核苷酸)連同LPS，已知的TLR4激動(dòng)劑。a)SB 1和2增強(qiáng)抗原呈遞； b)SB 1A(SB 44)和SB 1B(SB 1B，SB 44的Rp異構(gòu)體)與SB 2和LPS相比較。SB 44的Rp異構(gòu)體 (SB 1B)保留完全活性;〇)ΜΦ用各5μΜ的信號(hào)傳導(dǎo)分子抑制劑(AP-1、CREB和MAPK(p38、 ERK1/2和JNK)處理2小時(shí)，隨后用SB化合物活化2小時(shí)且用BCG感染2小時(shí)。將M Φ固定且使 用流式細(xì)胞術(shù)分析表面MHC-II。SB IA增強(qiáng)MHC-II的表面表達(dá)，其通過(guò)阻斷MAPK或AP-I/ CREB進(jìn)行抑制（與含BCG的SB IA組合相比較，>0.51og 10轉(zhuǎn)變hSB IB具有相似活性(未示 出）；d) MPK或API /CREB的抑制劑單獨(dú)對(duì)MHC-II沒(méi)有作用。
[0291] 實(shí)施例6:N0D2-RIG-I活化SB IA和IB化合物增強(qiáng)BCG疫苗針對(duì)實(shí)驗(yàn)性氣溶膠誘導(dǎo) 的肺結(jié)核的功效
[0292] 在小鼠中的疫苗實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):C57B1/6小鼠用單獨(dú)的BCG或者與SB 1A、SB IB和MDP混 合的BCG進(jìn)行疫苗接種;這隨后為4周后通過(guò)用結(jié)核分枝桿菌的氣溶膠攻擊。小鼠在4周后處 死用于評(píng)估保護(hù)(Mtb的CFU計(jì)數(shù)降低）。使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量脾或肺的T細(xì)胞的表型和功能。 圖 11(a)
[0293] 圖11(b)顯示了SB IA和SB IB是比BCG或MDP+BCG更佳的降低肺的Mtb計(jì)數(shù)的有力 佐劑(通過(guò)雙因子ANOVA的p值）。條上方的數(shù)目指示IoglO細(xì)菌負(fù)荷(MDP相對(duì)于SB 1A/SB IB +BCG;p〈0.02) IA和SB IB在降低脾的Mtb計(jì)數(shù)中也比BCG疫苗更佳。與BCG疫苗相比較， SB IB增強(qiáng)多功能T細(xì)胞的數(shù)目，但SB IA和SB IB兩者均誘導(dǎo)可比較水平的四聚體特異性 CD8T 細(xì)胞（圖 ll(c-d))。
[0294] SB IA誘導(dǎo)比BCG疫苗更佳的記憶前體T細(xì)胞(MPEC)(圖lie)。下文舉例說(shuō)明的直方 圖顯示在脾中表達(dá)記憶標(biāo)記的T細(xì)胞群體的流式細(xì)胞術(shù)分析。
[0295] C57B1/6小鼠骨髓衍生的原代巨噬細(xì)胞用單獨(dú)的SB IA或SB 1B、單獨(dú)的MDP或所示 組合處理4小時(shí)。BCG用于感染4小時(shí)，并且使用ELISA就成熟IL10滴定18小時(shí)后收集的上清 液。巨噬細(xì)胞首先由用于半胱天冬酶阻斷的ZVAD-fmk(2小時(shí))進(jìn)行處理，隨后為用SBlA和SB 1B(4小時(shí)）的活化以及BCG感染(4小時(shí)）。18小時(shí)后測(cè)量細(xì)胞因子。結(jié)果呈現(xiàn)于圖12中，顯示 通過(guò)巨噬細(xì)胞中的半胱天冬酶依賴性機(jī)制，N0D2活化化合物SB IA和SB IB僅與MDP或完整 BCG桿菌組合而誘導(dǎo)IL-Ιβ。
[0296] 具有BCG疫苗的N0D2活化SB 1A/1B組合在小鼠中誘導(dǎo)針對(duì)肺結(jié)核的再攻擊的保 護(hù)，提示長(zhǎng)期保護(hù)。BCG疫苗是唯一批準(zhǔn)用于預(yù)防TB的疫苗，盡管它在小鼠中針對(duì)氣溶膠誘 導(dǎo)的TB是弱保護(hù)的，并且誘導(dǎo)弱中央記憶(29)。這被認(rèn)為是由于BCG不能誘導(dǎo)MPEC。發(fā)現(xiàn)SB 化合物誘導(dǎo)升高的MPEC(參見(jiàn)圖11(e))。然而，產(chǎn)生中央記憶的MPEC在小鼠中以低數(shù)目存 在，并且其功能僅能通過(guò)其強(qiáng)回憶擴(kuò)增成效應(yīng)CD8T細(xì)胞進(jìn)行確定。
[0297] 因此，開(kāi)發(fā)了新模型，以驗(yàn)證SB IA和SB IB誘導(dǎo)的MPEC可以通過(guò)在小鼠中再生為 強(qiáng)效應(yīng)T細(xì)胞致使長(zhǎng)期保護(hù)。該模型顯示于圖14中，其中在初次疫苗接種和攻擊后，Mtb以及 疫苗通過(guò)藥物療法清除，允許MPEC靜止。隨后，小鼠用劇毒Mtb再攻擊，用于評(píng)估保護(hù)。
[0298] 使C57B1/6小鼠接種疫苗且攻擊，并且使用異煙肼和利福平3周來(lái)清除疫苗和Mtb 生物體，隨后為休息和用氣溶膠劑量的劇毒Mtb的再攻擊。四周后，通過(guò)來(lái)自3只分開(kāi)小鼠/ 組的肺和脾的CFU計(jì)數(shù)以及T細(xì)胞分析來(lái)評(píng)估保護(hù)。最重要的是，在初次和二次再攻擊后，具 有BCG的SB IB(SB 1B)組合均比BCG兩倍好地保護(hù)(通過(guò)雙因子ANOVA的p值;5只小鼠/組/時(shí) 間點(diǎn)）。
[0299] 圖15(a_b)顯示了具有BCG疫苗的SB IA或SB IB組合保留產(chǎn)生針對(duì)用肺結(jié)核的再 攻擊的更佳回憶應(yīng)答的能力。
[0300] 在再攻擊(第16周）后，使用流式細(xì)胞術(shù)就CD8T細(xì)胞分析圖11中所示的小鼠的肺。 直方圖例子顯示對(duì)于CD8T細(xì)胞的四聚體染色。四聚體+IFN γ染劑用于測(cè)量功能T細(xì)胞，并且 四聚體+CD44染劑用于測(cè)量針對(duì)肺中的肺結(jié)核的記憶CD8T細(xì)胞。（圖16a-b)
[0301] 數(shù)據(jù)顯示接種疫苗的小鼠的肺含有可比較數(shù)目的⑶62L+⑶44+中央記憶T細(xì)胞和 表達(dá)穿孔素+顆粒酶的功能CD8T細(xì)胞。（圖16c-d)然而，肺含有升高水平的四聚體+IFNy ⑶8T細(xì)胞，其也表達(dá)記憶標(biāo)記⑶62L和⑶44。這提示SB IA和SB IB加強(qiáng)抗原特異性記憶T細(xì) 胞的量級(jí)，其對(duì)于肺結(jié)核的長(zhǎng)期遏制是關(guān)鍵的。
[0302]總之，對(duì)于小鼠的這些分開(kāi)的研究已經(jīng)顯示具有BCG疫苗的SMNH組合增強(qiáng)針對(duì)用 肺結(jié)核的初次攻擊和二次攻擊兩者的保護(hù)。
[0303]實(shí)施例7: SB 44的臨床前研究
[0304]許多臨床前研究已使用SB 44和SB 40進(jìn)行，并且這些研究舉例說(shuō)明關(guān)于先導(dǎo)化合 物佐劑候選物SB IB的結(jié)果。
[0305]如通過(guò)使用BCG的研究舉例說(shuō)明的，SB 44和SB 40的作用機(jī)制涉及在"外源"核酸 的存在下，RIG-I和N0D2的誘導(dǎo)和活化。大多數(shù)外源核酸在其結(jié)構(gòu)中具有標(biāo)志模式(PAMP，病 原體相關(guān)分子模式），其構(gòu)成這些核酸被RIG-I和N0D2選擇性識(shí)別為"外源"的基礎(chǔ)。為了舉 例說(shuō)明在作用機(jī)制中的這種獨(dú)特選擇性，進(jìn)行幾個(gè)體外研究且概括于下文：1).通過(guò)對(duì)于28 種細(xì)胞因子進(jìn)行多路測(cè)定法，SB 40和SB 44就其在外周血單核細(xì)胞(PBMC)中誘導(dǎo)細(xì)胞因子 的能力進(jìn)行評(píng)估：1卩^〇、1卩10、正1丫、11^-13、11^-113、11^-11^、11^-2、11^-3、11^-4、11^-5、11^- 6、IL-7、IL-lO、IL-12p4O、IL-12p7O、IL-13、IL-17A、TNFa、TNF0、G-CSF、GM-CSFIL-8、MCP-1、Eotaxin、MI F -Ia、MI F -1β和RANTES?；衔镏钡?0μM在人PBMC培養(yǎng)物中不引起細(xì)胞 因子誘導(dǎo)。
[0306] 2).為了評(píng)估在細(xì)菌核酸的存在下，SB 40和SB 44是否可以加強(qiáng)細(xì)胞中的IFN產(chǎn) 生，PBMC用單獨(dú)的BCG以及使用具有以25μΜ的SB 44或SB 40的BCG進(jìn)行測(cè)量。BCG用作細(xì)菌 核酸的來(lái)源。PBMC與單獨(dú)或在BCG存在下的化合物一起溫育24小時(shí)，并且收獲上清液。使用 ELISA測(cè)定IFN水平。在BCG存在下，化合物引起IFN產(chǎn)生中的適度加強(qiáng)。（根據(jù)相同實(shí)驗(yàn)，BCG 不誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子例如IL_1、6、8、10和TNF-a)。
[0307] 3).使用ISG56螢光素酶報(bào)道分子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以測(cè)定外源RIG-I和N0D2表達(dá)是否可 以在受體缺陷細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)。為此，聚I-聚C用作陽(yáng)性對(duì)照。由于RIG-I和N0D2的活化，SB 40和SB 44在這些細(xì)胞中的添加引起ISG-56表達(dá)超過(guò)由聚I-聚C誘導(dǎo)的那種的適度2倍增 強(qiáng)。
[0308] 結(jié)果證實(shí)通過(guò)SB 40和SB 44的IFN誘導(dǎo)(通過(guò)N0D2/RIG-I信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)介導(dǎo)）可以 在外源核酸的存在下發(fā)生。因此對(duì)于這些化合物引起免疫途徑的非特異性刺激存在更少的 潛力，所述免疫途徑的非特異性刺激產(chǎn)生"細(xì)胞因子風(fēng)暴"和相關(guān)全身毒性。這些作用機(jī)制 觀察與SB 44對(duì)BCG的佐劑活性一致，且同樣應(yīng)適用于ITS ISOMERS。
[0309]實(shí)施例8:在來(lái)自人肝的S9級(jí)分中的SB 44的代謝
[0310] SB 44(10μΜ)與混合物一起溫育，所述混合物含有S9級(jí)分（由人合并）（lmg/ml)、 0卩!1(1.31111)、1]〇?6厶(511^)、在111111父？83緩沖液中的阿拉霉素（1(^8/1111)、3-(5'-腺苷）-L-甲硫氨酸碘化物（0 . ImM)、腺苷3 磷酸5 磷酸硫酸鋰鹽水合物（0 . ImM)和乙酰CoA (ImM)。代謝產(chǎn)物樣品通過(guò)HPLC和LC/MS分析進(jìn)行評(píng)估。
[0311]前體藥物Rp，Sp-SB 44對(duì)肝微粒體暴露高達(dá)八小時(shí)導(dǎo)致其立體特異性轉(zhuǎn)換為二核 苷酸Rp，Sp-SB 40。微粒體溫育的LC/MS評(píng)估揭示代謝的一種或多種主要產(chǎn)物是Rp，Sp-二核 苷酸SB 40。如通過(guò)MS分析測(cè)定的，還檢測(cè)到少量脫硫產(chǎn)物(〈5%)。還可見(jiàn)少數(shù)次要代謝產(chǎn) 物(〈10% )。然而，這些代謝產(chǎn)物的身份基于分子離子無(wú)法充分確定。在所有情況下，在微粒 體代謝中，前體藥物SB 44的心和5[)異構(gòu)體均經(jīng)歷立體特異性轉(zhuǎn)換為活性SB 40,僅觀察到具 有少量脫硫產(chǎn)物[對(duì)應(yīng)于SB 40]。在SB 44的個(gè)別RdPSp異構(gòu)體分別轉(zhuǎn)換為SB 40的心和5[)異 構(gòu)體中，不存在顯著速率差異。
[0312]類似于血清介導(dǎo)的SB 44至SB 40轉(zhuǎn)換，在微粒體的情況下，肝酯酶看起來(lái)是涉及 SB 44至SB 40水解轉(zhuǎn)換的主要代謝酶。在使用血清的早期RP，SP-SB 44生物可逆性研究中， 個(gè)別異構(gòu)體以幾乎相等的速率立體特異性轉(zhuǎn)換為Rp-SB 44,Sp-SB 40。在肝和血漿中SB 44 至SB 40的溫和生物轉(zhuǎn)換也與遍在的酯酶的廣泛底物特異性一致。
[0313] 實(shí)施例9: SB 44通過(guò)S9級(jí)分的體外代謝
[0314] 類似于純化的人肝微粒體研究，前體藥物SB 44暴露于人肝S9級(jí)分導(dǎo)致SB 4位體 特異性轉(zhuǎn)換為二核苷酸SB 40。通過(guò)LC/MS的溫育評(píng)估揭示除了主要產(chǎn)物SB 40之外，還形成 對(duì)應(yīng)于SB 40的少量脫硫產(chǎn)物(〈5% )。還觀察到少數(shù)次要產(chǎn)物。關(guān)于S9級(jí)分的代謝產(chǎn)物模式 類似于用純化的肝微粒體觀察到的那種。因此，不存在SB 44或最初形成的活性代謝產(chǎn)物SB 40的任何II期綴合反應(yīng)的明顯證據(jù)。
[0315] 實(shí)施例10: SB 44的體外臨床前毒物學(xué)研究
[0316] 對(duì)SB 44實(shí)施針對(duì)細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)對(duì)象組的細(xì)胞毒性評(píng)估，所述細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)對(duì)象組包 括Madin-Darby牛腎（MDBK)、Vero和HFF(人包皮成纖維細(xì)胞），以測(cè)定其CC 5q Atandard Microculture Tetrazolium Assay(MTT)測(cè)定法在96孔板中執(zhí)行，使用MDBK、Vero和HFF細(xì)胞系 (得自美國(guó)典型培養(yǎng)物中心）。對(duì)照包括核苷類似物3TC、AZT和ddC，以及不含藥物的培養(yǎng)基。SDS 用作陽(yáng)性細(xì)胞毒性對(duì)照。所有前體藥物均以100、300和ΙΟΟΟμΜ的濃度一式三份地進(jìn)行測(cè)試。在 細(xì)胞與測(cè)試物質(zhì)溫育24小時(shí)后，進(jìn)行MTT測(cè)定法。
[0317] SB 40的CC5Q為>1000μΜ。
[0318]實(shí)施例11 :SB 44的細(xì)菌突變測(cè)試(篩選形式）
[0319] 該研究的目的是使用篩選(非GLP)形式的細(xì)菌突變測(cè)試，評(píng)估測(cè)試物品的基因毒 性。
[0320] 研究設(shè)計(jì):測(cè)試僅在一個(gè)場(chǎng)合下執(zhí)行。標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株亞集(列表菌株）用于評(píng)估測(cè) 試物品的具遺傳毒性潛力。
[0321] 測(cè)試物品在二甲亞砜(DMSO)中進(jìn)行配制，并且以5000yg/板(該測(cè)定法的標(biāo)準(zhǔn)限制 劑量)的最大濃度連同大約半對(duì)數(shù)稀釋進(jìn)行測(cè)試，使用預(yù)溫育形式的細(xì)菌突變測(cè)試。在無(wú)菌 性檢查板上的菌落的不存在證實(shí)微生物污染的不存在。關(guān)于媒介物對(duì)照的平均逆轉(zhuǎn)株菌落 計(jì)數(shù)接近于實(shí)驗(yàn)室歷史對(duì)照數(shù)據(jù)，或在實(shí)驗(yàn)室歷史對(duì)照數(shù)據(jù)內(nèi)。適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照化合物 (+/-S9混合物)誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)株菌落數(shù)目中的增加是使用適當(dāng)細(xì)菌菌株的同時(shí)媒介物對(duì)照水 平的至少兩倍(對(duì)于菌株TA 100為1.5X)，證實(shí)測(cè)試相同的靈敏度和S9混合物的活性。在暴 露于SB 44后，未獲得非逆轉(zhuǎn)株細(xì)菌的本底菌苔的明顯變薄，指示測(cè)試物品在測(cè)試的水平上 對(duì)細(xì)菌是無(wú)毒的。未觀察到沉淀。
[0322] 在S9混合物的不存在或存在下，在暴露于測(cè)試物品后，在任何菌株中未獲得逆轉(zhuǎn) 株菌落計(jì)數(shù)中的大量增加。因此得出結(jié)論SB 44在這種體外誘變測(cè)定法中未顯示任何具遺 傳毒性活性的證據(jù)。
[0323] 實(shí)施例12:體位心血管安全性測(cè)定法(hERG測(cè)試）。
[0324] 該研究的目的是檢查SB 40和SB 44對(duì)hERG(人ether-a-go-go相關(guān)基因）鉀通道電 流(IKr，快速激活延遲整流心臟鉀電流的替代物)的體外作用。
[0325] 在該研究中，hERG通道在缺乏內(nèi)源IKr的人胚腎(HEK293)細(xì)胞系中表達(dá)。HEK293細(xì) 胞用hERG cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，并且評(píng)估在室溫下使用QPatchHT⑩（自動(dòng)化平行膜片鉗系統(tǒng)） 來(lái)完成。每種測(cè)試物品以1〇、50、100和200μΜ進(jìn)行評(píng)估，其中每種濃度在三種細(xì)胞中進(jìn)行測(cè) 試(η = 3)。暴露于每種測(cè)試物品濃度的持續(xù)時(shí)間為3分鐘。
[0326] 因?yàn)橥ㄟ^(guò)測(cè)試的最高濃度的hERG電流抑制小于50%，所以無(wú)法測(cè)定兩種測(cè)試物品 的IC5q值。陽(yáng)性對(duì)照E-4031證實(shí)測(cè)試系統(tǒng)對(duì)hERG抑制的靈敏度。
[0327] 總之，SB 40和SB 44在hERG測(cè)定法中未顯示出任何活性，并且IC5q為>200μΜ。
[0328] 實(shí)施例13: SB 44的體內(nèi)臨床前毒物學(xué)研究
[0329] SB 44是兩種非對(duì)映體(Rp，Sp)的混合物，其中SB IB是Rp異構(gòu)體，在混合物中存在 至55-60%的程度。許多臨床前研究通過(guò)使用經(jīng)由經(jīng)口管飼法施用的SB 44進(jìn)行，并且研究 結(jié)果是當(dāng)SB IB單獨(dú)使用時(shí)的可能結(jié)果的舉例說(shuō)明。研究已奠定了SB IB的臨床前研究的堅(jiān) 實(shí)基礎(chǔ)，因?yàn)榉治龊蜕锓治龇椒?、毒物學(xué)研究的制劑、毒物學(xué)方案等可以轉(zhuǎn)移至SB 1B。
[0330] 實(shí)施例14:SB 44在Sprague-Dawley大鼠中的劑量范圍發(fā)現(xiàn)研究
[0331 ] 該研究的目的是在SB 44對(duì)成年雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠連續(xù)7天的每日 經(jīng)口管飼法后，測(cè)定潛在的毒性效應(yīng)，鑒定潛在的毒性靶器官，且測(cè)定最大耐受劑量(MTD) 和對(duì)于檢查的終點(diǎn)未觀察到不利效應(yīng)的水平(NOAEL)。來(lái)自該研究的信息用于設(shè)計(jì)后續(xù)毒 性研究且測(cè)定提議的人劑量的適合性。該研究由A期和B期組成。A期是劑量范圍發(fā)現(xiàn)研究。 在該研究中包括兩只大鼠（1只雄性和1只雌性）。動(dòng)物通過(guò)經(jīng)口管飼法(Po)給予以1000 mg/ kg的SB 44的單一劑量，且觀察3天。兩只動(dòng)物均具有預(yù)期的體重增加，且在研究自始至終看 起來(lái)是正常的，直至其預(yù)定處死時(shí)。未執(zhí)行尸檢。
[0332] 在B期中，大鼠（3/性別/組)給予以50、250和1000mg/kg/天的SB 44的每日經(jīng)口劑 量連續(xù)7天。對(duì)照組(3/性別）也給予以相等體積的媒介物的每日經(jīng)口劑量共7天，所述媒介 物是50%PEG 400加上50%HPMCT(無(wú)菌水中的0.1%羥丙基甲基纖維素和0.2%Tween 80)。 動(dòng)物在第8天時(shí)處死。評(píng)估下述參數(shù):死亡率/發(fā)病率、臨床觀察、體重、臨床病理學(xué)(血液學(xué) 和血清化學(xué)）、器官重量，以及在尸檢時(shí)，肝組織的肉眼觀察和顯微鏡組織病理學(xué)。
[0333] 在B期中的所有動(dòng)物均存活直至其預(yù)定尸檢時(shí)。在劑量施用后不同天時(shí)，在處理組 中的所有動(dòng)物中注意到劑量依賴性"鏟土 (shoveling)"模式，除了在低劑量組中的雄性之 外。因?yàn)椴淮嬖谂c神經(jīng)系統(tǒng)功能或其他毒物學(xué)參數(shù)相關(guān)的其他不利體征，所以該觀察最可 能指示大鼠將測(cè)試物品的味道和/或質(zhì)地察覺(jué)為令其不快的。對(duì)于體重、臨床病理學(xué)、器官 重量、以及肉眼和顯微鏡評(píng)估，未發(fā)現(xiàn)其他藥物相關(guān)效應(yīng)?？傊琒B 44每日經(jīng)口管飼法施用 于雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠連續(xù)7天，未產(chǎn)生明顯的生物學(xué)或毒物學(xué)顯著的不利效 應(yīng)。當(dāng)SB 44通過(guò)每日經(jīng)口施用給予連續(xù)7天時(shí)，NOAEL視為至少1000mg/kg/天。
[0334] 實(shí)施例15:SB 44在大鼠中的14天毒性研究，伴隨兩周恢復(fù)期和骨髓微核評(píng)估
[0335] 該研究的目的是測(cè)定在每日經(jīng)口劑量施用14天后，SB 44的潛在毒性效應(yīng)，并且如 通過(guò)微核評(píng)估測(cè)定的，評(píng)估SB 44的具遺傳毒性。雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠每天以 50、200和500mg/kg/天的劑量施用SB 44,共連續(xù)14天。衛(wèi)星組類似地處理用于毒代動(dòng)力學(xué) (TK)評(píng)估的目的，并且血漿就SB 40(SB 44的活性代謝產(chǎn)物）的水平進(jìn)行分析。執(zhí)行微核評(píng) 估以測(cè)定SB 44的潛在基因毒性。對(duì)于主要研究組中的大鼠在第15天時(shí)，并且對(duì)于恢復(fù)組中 的大鼠在第28天時(shí)，執(zhí)行尸檢。
[0336] 所有大鼠均存活至研究結(jié)束。如通過(guò)臨床觀察、臨床病理學(xué)、體重、尿參數(shù)、尸檢和 器官重量測(cè)定的，SB 44不引起明顯毒性。然而，組織的顯微鏡評(píng)估揭示在胸腺中與測(cè)試物 品相關(guān)的變化。在以200和500mg/kg/天的雄性和雌性兩者中，均觀察到胸腺吞噬性巨噬細(xì) 胞中的極輕度至輕度增加，指示增加的胸腺淋巴細(xì)胞破壞。這種胸腺變化存在于主要和恢 復(fù)組兩者中，但與胸腺萎縮或增加的胸腺退化的任何組織病理學(xué)證據(jù)無(wú)關(guān)。在其他器官中 不存在增加的淋巴細(xì)胞破壞的證據(jù)。該觀察可以是GI應(yīng)激相關(guān)的，并且因此視為具有有限 的毒物學(xué)意義。在該研究的微核測(cè)定法部分中，未發(fā)現(xiàn)SB 44在大鼠骨髓紅細(xì)胞中誘導(dǎo)微 核。
[0337] 實(shí)施例16:毒代動(dòng)力學(xué)分析
[0338] 僅報(bào)告在經(jīng)口施用后的最大血漿濃度(Cmax)和直到最后取樣時(shí)間點(diǎn)的血漿濃度時(shí) 間曲線下面積(AUCi ast)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)樣品具有在或接近LLOQ的SB 40血漿濃度，使得所有TK 參數(shù)的測(cè)定成問(wèn)題。在第1和14天兩者時(shí)，對(duì)于雄性和雌性大鼠中的Cma^PAUClast不存在非 線性劑量關(guān)系。在第14天時(shí)，對(duì)于雄性和雌性兩者，在最高劑量(500mg/kg)時(shí)測(cè)量最高的全 身暴露，并且對(duì)于施用的每個(gè)劑量，關(guān)于SB 40的第14天Cmax和AUClast高于第1天時(shí)的那些。 在SB 44每天施用共14天后的這種SB 40累積可以通過(guò)與緩慢回釋到血漿內(nèi)組合的對(duì)肝的 顯著分布引起。雌性一般具有比雄性更大的全身暴露，其中最大差異是在500mg/kg劑量組 中在第14天時(shí)約兩倍。在胸腺中的顯微鏡下發(fā)現(xiàn)和不存在來(lái)自SB 44的這些效應(yīng)的恢復(fù)證 據(jù)的基礎(chǔ)上，該研究中的未觀察到效應(yīng)的水平(NOEL)測(cè)定為50mg/kg/天。
[0339] 實(shí)施例17:SB 44在食蟹猴中的劑量范圍發(fā)現(xiàn)研究
[0340]該研究的目的是在SB 44對(duì)食蟹猴連續(xù)4天的每日經(jīng)口管飼法后，測(cè)定最大耐受劑 量(MTD)和對(duì)于檢查的終點(diǎn)未觀察到不利效應(yīng)的水平(NOAEL)。來(lái)自該研究的信息用于設(shè)計(jì) 后續(xù)劑量范圍毒性研究，且測(cè)定所提議人劑量的適合性。
[0341] SB 44以500mg/kg/天經(jīng)口施用于食蟹猴連續(xù)4天。該劑量是臨床上充分耐受的，并 且伴隨約2倍的ALT升高和約6倍的AST升高，這在處理停止后約一周回到基線。所有血液學(xué) 參數(shù)看起來(lái)均為正常的，并且不存在其他明顯毒性的證據(jù)。
[0342] 結(jié)論:如上所述，SB 44是兩種異構(gòu)體(Rp，Sp)的混合物，其中SB IB是Rp異構(gòu)體，以 大于55%存在。在小鼠中的短期初次和長(zhǎng)期Mtb攻擊實(shí)驗(yàn)中，SB IB看起來(lái)作為佐劑比SB 44 更有效。另外，關(guān)于SB 44的第二種異構(gòu)體(Sp-異構(gòu)體)作為佐劑的功效知之甚少。許多臨床 前研究通過(guò)使用SB 44進(jìn)行。研究結(jié)果是由SB 44代表的二核苷酸組合物的極佳安全性的舉 例說(shuō)明。因此，預(yù)料關(guān)于皮下施用的SB IB的極佳安全性概況。
[0343] 實(shí)施例18:在用BCG和化合物處理的PBMC中的干擾素的誘導(dǎo)
[0344] 對(duì)于該測(cè)定法，PBMC以1百萬(wàn)細(xì)胞/ml鋪平板在24孔板中。一組板用BCG、BCG+化合 物進(jìn)行處理，并且溫育24小時(shí)。將細(xì)胞裂解且收獲上清液。使用ELISA測(cè)定法與標(biāo)準(zhǔn)試劑盒， 評(píng)價(jià)細(xì)胞因子和I型干擾素的產(chǎn)生。根據(jù)相同實(shí)驗(yàn)，BCG的確誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子(IL-l、IL-6、 IL-8、IL-10和TNF)。與單獨(dú)的BCG相比較，用BCG和化合物處理的細(xì)胞誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生增加。 結(jié)果在圖17中提供。
[0345] 根據(jù)相同實(shí)驗(yàn)，BCG的確誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子（幾-1、11^-6、幾-8、11^-10和了冊(cè)）。與單 獨(dú)的BCG相比較，用BCG和化合物處理的細(xì)胞誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生增加。
[0346] 總之，本發(fā)明中請(qǐng)求保護(hù)的化合物充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)微生物傳感器的激活物，并且引起 免疫應(yīng)答的活化。當(dāng)與疫苗結(jié)合使用時(shí)，該化合物充當(dāng)佐劑且加強(qiáng)由疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
[0347] 實(shí)施例19.體外細(xì)胞毒性研究
[0348] 使用預(yù)測(cè)肝、腎、骨髓和線粒體毒性的細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)對(duì)象組（內(nèi)部的），一種或多種先 導(dǎo)化合物的體外細(xì)胞毒性研究。
[0349] 化合物1和3具有極佳的安全性概況，在許多細(xì)胞系中具有CC5Q>1000微摩爾。標(biāo)準(zhǔn) MTT測(cè)定法在96孔板中執(zhí)行，使用與96孔板閱讀器(ThermoMax,Molecular devices)結(jié)合的 Promega CellTiter96 Non-radioactive Cell Proliferation Assay Kit，以及MDBK、 Vero和HFF細(xì)胞系(得自ATCC)。采用幾種對(duì)照，包括核苷類似物3TC、AZT和ddC，以及不含藥 物的培養(yǎng)基。SDS用作陽(yáng)性細(xì)胞毒性對(duì)照?；衔镆?00、300和ΙΟΟΟμ M的濃度一式三份地進(jìn) 行測(cè)試。在細(xì)胞與測(cè)試物質(zhì)溫育24小時(shí)后，進(jìn)行MTT測(cè)定法。所有測(cè)試的化合物均顯示CC50> 1000微摩爾，指示化合物的高安全性指數(shù)。
[0350] 引用的參考文獻(xiàn)
[0351] l.(a)WH0 REP0RT:Global prevalence of hepatitis A,B,C.Weekly Epidemiological RecordjVol 77,6,2002；(b)Delwaide,J.,Gerard,C.Evidence-based medicine treatment of chronic hepatitis C. Liege study Group on Viral hepatitis.Revue medicale de Liege 55,337,2000.
[0352] 2.(a)SorrelI,M.F.,Belongia,E.A.,Costa,J.,Gareen, I.F.,Grem,J.L., Inadomi,J.M.,Kern1E.R.,McHugh,J. A.,Peterson,G.M.,Rein,M.F., Strader,D.B., Trotter,H.T.National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis B. Ann.Int.Med. 150,204,2009.
[0353] (b)Wild，C.P.，Hall，A.J.Primary prevention of hepatocellular carcinoma in developing countries.Mutation Res.462,381,2000.Liang,T.J.,RehermannjB., Seeff，L.B.,Hoofnagle，J.H.Pathogenesis，natural history,treatment，and prevention of hepatitis C.Ann.Intern.Med.132,296,2000.
[0354] 3.AkirajS.,UematsujS.,Takeuchi,0.Pathogen recognition and Innate immunity.Cell，24,783-801，2006.
[0355] 4·Katze，M·G·，He，Y·，Gale，M·Viruses and interf eron: A fight for supremacy.Nature Reviews,2,675, Sept 2002.
[0356] 5.TakedajK. ,AkirajS.Toll-like receptors in innate immunity. International Immunology，17,1-14,2005.
[0357] 6·Saito，T.，Hirai，R.，Loo，Y_M.，0wen，D.,Johnson，C.L.，Sinha，S.C，Akira，S.， Fujita，T·，Gale，M.Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain in RIG-I and LGP2.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,10,No.2,582-587, 2007.
[0358] 7.MeylanjE.,CurranjJ.,Hofmann jK.,MoradpourjD.,BinderjM., Bartenschlager，R·，Tschopp，J·Cardif is an acceptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus.Nature，437,1167-1172， 2005.
[0359] 8.Hiscott，J.，Lin，R.，Nakhaei，P.，Paz，S.MasterCARD:A priceless link to innate immunity. TRENDS in Molecular Medicine，12，53-56，2006·
[0360] 9.Cui,S.,EisenacherjK.,KirchhoferjA.,Brozka jK.,LammensjA.,LammensjK., Fujita jT.,ConzelmannjK-K.,KrugjA.,Hopfner,K-P.The C-terminal regulatory domain is the RNA 5'-triphosphate sensor of RIG-I.Molecular Cell,29,169-179, 2008.
[0361 ] 10.Yoneyama,M.,KikuchijM.,Natsukawa,T. ,Shinobu,N.,Imaizumi,T., MiyagishijM. ,TairajK. ,AkirajS.,Fujita,T. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses.Nat. Immunol.5,730-737,2004.
[0362] 12.HornungjV.,EllegastjJ.,Kim jS.,BrzozkajK.,JungjA.,KatojH.,Poeck jH., AkirajS.,ConzelmannjK-K.,Schlee jM.,EndresjS.,and Hartmann,G.5J-triphosphate RNA is the ligand for RIG-I.Science，314,994-997,2006.
[0363] 13·Pichlmair，A.，Schulz，0·，Tan，C.P·,Naslund，T·I·，Liljestrom，P·，Weber， F.,Reis e Sousa,C.RIG-I mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates.Science，314,997-1001，2006.
[0364] I4.MyongjS.,CuijS.,Cornish jP-V.,KirchhoferjA.,GackjM-U.,JungjJ-U., Hopfner jK-P.,HajT-Cytosolic viral sensor RIG-I is a5'-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA.Science,323,1070,2009.
[0365] 15.GackjM.U.,Kirchhofer A.,ShinjY-Cj Inn K.S.,Liang CjCui S.,Myong S., Ha T.,HopfnerjK-P.,JungjJ-U-Roles of RIG-I N-terminal tandem CARD and splice variant in TRIM25_mediated antiviral signal transduction.Proc Natl Acad Sci U S A.105(43):16743-8,2008.
[0366] 15.(a)Sabbah,A.,ChangjT-H.,Harnack jR.,FrohlichjV.,TominagajK.,Dube, P·H·，Xiang，Y·，Bose，S·Activation of innate immune antiviral responses by NOD2. Nat. Immunol.10,1073,2009.(b)Franchi,L., Warner,N.,VianijK. , Nunez , G. Function of N0D-1ike receptors in microbial recognition and host defense. Immunol.Rev.227，106，2009.
[0367] 16.(a)Iyer,R.P.,PandeyjR.,Kuchimanchi,S.RNA interference:An exciting new approach for target vaI idation，gene expression analysis and therapeutics.Drugs of the Future，2003，28，51-59·(b)For reviews on antisense approach see:(i)Mirabelli，C.T.，Crooke，S.T.Antisense Oligonucleotides in the context of modern molecular drug discovery and development.ImAntisense Research and Applications ,S.T.Crooke and B.Lebleu(Eds.,)CRC PressjNew York 1993,7-35.(ii)Szymkowski,D.E.Developing antisense oligonucleotides from the laboratory to clinical trials.Drug.Disc.Today,1996,1,415-28
[0368] 17. Iyer，R.P.，Jin，Y.，Ro land A.，Morrey，J.D·，Mounir，S.，Korba， B.E.Phosphorothioate Di-and Tri-nucIeotides as a novel class of anti-HBV agents.Antimicrob.Agents Chemother.48(6):2199_2205,2004.
[0369] 18.Iyer，R.P·，RoIand A.，Jin，Y.，Mounir，S.，Korba，B.E.，Julander，J.， Morrey,J.D.Anti-hepatitis B virus activity of 0RI-9020, a novel phosphorothioate dinucleotide，in a transgenic mouse model.Antimicrob Agents Chemother.48(6):2318-20,2004.
[0370] 19.For examples of nucleotide combinatorial synthesis and antiviral evaluation，see:(a)Jin，Y. ,Roland，A.，Zhou，W. ,Fauchon，M.，Lyaku，J·，Iyer， R.P.Bioorg.Med.Chem.Lett.10,1921-25,2000.(b)Jin，Y.，X.Chen，M.-E.Cote，A.Roland， B.Korba，S.Mounir，Iyer，R.P.Bioorg.Med.Chem.Lett.11，2057-2060,2001.
[0371 ] 20.Iyer,R.P. ,CoughlinjJ. ,Padmanabhan,S.Microwave-assisted functionalization of solid supports for rapid loading of nucleosides.Current Protocols Unit 3.13,(Beaucage et al Eds，）John Wiley and Sons，2006.
[0372] 2 I .Padmanabhan ,S. ,CoughlinjJ. ,IyerjR.P.Microwave-assisted functionalization of solid supports.Application in the rapid loading of nucleosides on controlled-pore-glass(CPG).Tet.Lett.46，343-347，2005.
[0373] 22.Iyer,R.P.,CoughlinjJ.,PadmanabhanjS-Rapid functionalization and loading of solid supports .Organic Preparations&Procedure International，37， 205-212,2005.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通過(guò)給鑒定為有此需要的受試者施用有效量的預(yù)防試劑，來(lái)治療微生物感染的 方法，其中所述預(yù)防試劑是短寡核巧酸化合物或其類似物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋 物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。2. -種改善受試者中針對(duì)疾病、狀況、感染或病毒的免疫系統(tǒng)應(yīng)答的方法，所述方法包 括給所述受試者施用有效量的疫苗佐劑，其中所述疫苗佐劑是短寡核巧酸化合物或其類似 物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述短寡核巧酸化合物或其類似物是式(I)的化合物： 其中：化和化各自獨(dú)立地是H、0H、O-烷基、烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、雜 環(huán)、0-芳基、0-雜芳基芳基或雜環(huán)； 化選自氨、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C(O)NH-燒 基和C(O)NH-芳基； Y和Z各自獨(dú)立地是0或S; Bi和B2各自獨(dú)立地是腺嚷嶺、鳥(niǎo)嚷嶺、胸腺喀晚、胞喀晚、尿喀晚或經(jīng)修飾的核巧； Hl= 1-6; R4獨(dú)立地是H、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C(O) NH-烷基和C(O)NH-芳基、單憐酸、二憐酸或=憐酸基。4. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述短寡核巧酸化合物或其類似物是式(II)的化合物： 其中X =不存在、0、NH、NR或S; Xi =不存在、O或NH; A =不存在、芳基或芳烷基； n = 0、l、2、3、4或 5; R=烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、雜環(huán)、O-烷基、O-雜芳基或醬體； 化和化各自獨(dú)立地是H、0H、0-烷基、烷基、取代烷基、環(huán)烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、雜 環(huán)、0-芳基、0-雜芳基芳基或雜環(huán)； 化選自氨、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C(O)NH-燒 基和C(O)NH-芳基； Y和Z各自獨(dú)立地是0或S; Bi和B2各自獨(dú)立地是腺嚷嶺、鳥(niǎo)嚷嶺、胸腺喀晚、胞喀晚、尿喀晚或經(jīng)修飾的核巧； m=l-6； R4獨(dú)立地是H、烷基、取代烷基、C(O)-烷基、C(O)O-烷基、C(O)-芳基、C(O)O-芳基、C(O) NH-烷基和C(O)NH-芳基、單憐酸、二憐酸或=憐酸基。5. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述短寡核巧酸化合物或其類似物是下述結(jié)構(gòu)的化合 物：或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。6. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述短寡核巧酸化合物或其類似物是下述結(jié)構(gòu)的化合 物：或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。7. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述方法包括施用疫苗。8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述疫苗是BCG疫苗。9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述預(yù)防試劑或疫苗佐劑是式（I)的化合物，或者其藥學(xué)可 接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。10. 權(quán)利要求8的方法，其中所述預(yù)防試劑或疫苗佐劑是式（II)的化合物，或者其藥學(xué) 可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。11. 權(quán)利要求8的方法，其中所述預(yù)防試劑或疫苗佐劑是下述結(jié)構(gòu)的化合物：或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。12. 權(quán)利要求8的方法，其中所冰預(yù)階試劑或疫巧化劑是下述結(jié)構(gòu)的化合物：或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。13. 權(quán)利要求2的方法，其中所述疫苗佐劑與用于治療或預(yù)防微生物感染的疫苗一起施 用。14. 權(quán)利要求7的方法，其中所述方法用于改善所述受試者中針對(duì)病毒的免疫系統(tǒng)應(yīng) 答。15. 權(quán)利要求7的方法，其中所述方法用于改善針對(duì)癌癥的免疫系統(tǒng)應(yīng)答。16. -種用于預(yù)防和治療受試者中的病毒感染的方法，所述方法包括給所述受試者施 用有效量的化合物，其中所述化合物是式（I)或（II)的化合物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外 消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述方法包括與所述化合物組合或順次施用疫苗或者一 種或多種另外試劑。18. 權(quán)利要求16的方法，其中所述化合物是或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。19. 一種用于預(yù)防和治療受試者中的細(xì)菌感染的方法，所述方法包括給所述受試者施 用有效量的化合物，其中所述化合物是式（I)或（II)的化合物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外 消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述方法包括與所述化合物組合或順次施用疫苗或者一 種或多種另外試劑。21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述化合物是或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。22. -種用于預(yù)防和治療受試者中的真菌感染的方法，所述方法包括給所述受試者施 用有效量的化合物，其中所述化合物是式（I)或（II)的化合物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、外 消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述方法包括與所述化合物組合或順次施用疫苗或者一 種或多種另外試劑。24. 權(quán)利要求22的方法，其中所述化合物是或者其藥學(xué)可接受的鹽、外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。25. -種用于預(yù)防和治療受試者中的寄生蟲(chóng)感染的方法，所述方法包括給所述受試者 施用有效量的化合物，其中所述化合物是式（I)或（II)的化合物，或者其藥學(xué)可接受的鹽、 外消旋物、對(duì)映體、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體或互變異構(gòu)體。26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述方法包括與所述化合物組合或順次施用疫苗或者一 種或多種另外試劑。27. 權(quán)利要求25的方法，其中所述化合物是或者其藥芋W預(yù)送的鹽、外巧兩物、對(duì)映體、非對(duì)映體J LM弁巧體或旦雙異構(gòu)體。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK105992587SQ201480009224
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2014年2月18日
【發(fā)明人】R·P·艾依爾
【申請(qǐng)人】春堤制藥公司