一種基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物及其制備方法。由具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡裝載藥物得到；藥物為蛋白質(zhì)藥物、多肽藥物或者小分子藥物；具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡由聚合物自組裝后交聯(lián)得到；聚合物的分子鏈包括依次連接的親水鏈段、疏水鏈段以及PEI分子；疏水鏈段包括聚碳酸酯鏈段和/或聚酯鏈段。PEI通過(guò)靜電相互作用復(fù)合和裝載藥物；膜為可逆交聯(lián)的生物可降解且生物相容性好的聚酯/聚碳酸酯，側(cè)鏈的二硫戊環(huán)類似人體天然抗氧化劑硫辛酸，外殼為以PEG為背景、可靶向癌細(xì)胞，其有望成為集簡(jiǎn)易、穩(wěn)定、多功能等優(yōu)點(diǎn)于一身的納米藥物系統(tǒng)。
【專利說(shuō)明】
一種基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物及其 制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物載體技術(shù)，具體涉及一種基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫 瘤納米藥物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是威脅人類健康的主要?dú)⑹?，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。蛋白質(zhì) 和多肽藥物在抗癌方面具有高效、特異性強(qiáng)、毒副作用小、不受耐藥性的影響等優(yōu)點(diǎn)。但是， 誘導(dǎo)凋亡的很多蛋白質(zhì)藥物需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能發(fā)揮作用，而蛋白質(zhì)尺寸大進(jìn)入細(xì)胞能力 差，同時(shí)易被體液中的蛋白酶降解，大大影響了其發(fā)揮抗癌作用。另外，一些水溶性小分子 抗癌藥物尤其是在生理環(huán)境下帶負(fù)電荷的藥物如培美曲塞二鈉、甲氨蝶呤二鈉由于細(xì)胞本 身的負(fù)電荷難以高效進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致藥物的生物利用率低下，抗癌效果不高。由雙親性聚合 物自組裝形成的聚合物囊泡具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，其性能可調(diào)度大，能同時(shí)裝載親水性藥物和 疏水性藥物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是藥物控制釋放領(lǐng)域有應(yīng)用潛力?？墒牵F(xiàn)有囊泡技術(shù)對(duì) 帶負(fù)電的小分子抗癌藥以及高效低毒的蛋白藥物的裝載效率較低，或是蛋白質(zhì)和多肽在晚 期內(nèi)涵體/溶酶體中存留過(guò)久導(dǎo)致(部分)變性；同時(shí)還存在囊泡體內(nèi)循環(huán)不穩(wěn)定、腫瘤細(xì)胞 攝取低、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度低等問(wèn)題，導(dǎo)致納米藥物的藥效不高，還存在毒副作用，這些都極 大地限制了囊泡作為這類藥物的載體的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是公開一種基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物及 其制備方法。
[0004] 為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物，由具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆 交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡裝載藥物得到;所述藥物為蛋白質(zhì)和多肽藥物或者小分子抗癌 藥物;所述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡由聚合物自組裝后交聯(lián)得 到;所述聚合物的分子鏈包括依次連接的親水鏈段、疏水鏈段以及聚乙烯亞胺分子;所述疏 水鏈段包括聚碳酸酯鏈段和/或聚酯鏈段;所述親水鏈段的分子量為3000-8000Da;疏水鏈 段的分子量為未水鏈段分子量的2.3-8.4倍;PEI分子的分子量為未水鏈段分子量的10%-50% 〇
[0005] 優(yōu)選的，本發(fā)明的聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下： 其中，辦選自以下基團(tuán)中的一種：

r2選自以下基團(tuán)中的一種：
?.......;> PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
本發(fā)明的聚乙烯亞胺(PEI)為支化和線性兩種，得到聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為以下結(jié)構(gòu) 式中的一種：
所述聚合物中，PEG的分子量為3000-8000Da; PTMC或PLA的總分子量為PEG分子量的2-6 倍；PDTC的總分子量為PTMC或PLA總分子量的15%-40%;PEI分子的分子量為TOG分子量的 10%-50%〇
[0006] 本發(fā)明的聚合物中，限定PEI的結(jié)構(gòu)與分子量，作為載體時(shí)毒性小，結(jié)合PEG鏈段與 疏水鏈段，可以形成良好的藥物包載效果，即使當(dāng)藥物含量高達(dá)30 ri.%，該囊泡仍可以完 全、緊實(shí)包裹藥物；同時(shí)本發(fā)明的聚合物避免了現(xiàn)有PEI通過(guò)物理纏繞的方式結(jié)合藥物帶來(lái) 的不穩(wěn)定、帶正電易與細(xì)胞結(jié)合而迀移力差、釋放效率差的缺陷；通過(guò)靜電作用力結(jié)合藥 物，再被交聯(lián)的囊泡膜和外界分隔，避免在輸送過(guò)程被細(xì)胞黏附而造成損失和毒副作用，能 夠高效迀移至病灶處，并在體內(nèi)高濃度鹽和還原劑GSH的作用下，快速釋放藥物，解決疾病 問(wèn)題。
[0007] 本發(fā)明設(shè)計(jì)的具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)、還原敏感可逆交聯(lián)、細(xì)胞內(nèi)可解交聯(lián)的生物可 降解聚合物囊泡，其囊泡膜的外表面由具有不粘附性的聚乙二醇(PEG)組成，囊泡膜的內(nèi)表 面由較低分子量的PEI(300-4000Da)組成，用于高效裝載蛋白質(zhì)包括顆粒酶B、細(xì)胞色素 C或 者凋亡素、多肽和生理環(huán)境帶負(fù)電荷的小分子藥物如培美曲塞二鈉、甲氨蝶呤二鈉等;交聯(lián) 的囊泡膜可保護(hù)藥物不被降解、不泄漏，并可在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)，囊泡的納米尺寸以及表面的腫 瘤特異性靶向分子使得囊泡可定向輸送藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞；由于PEI的高質(zhì)子海綿效應(yīng)而 更蛋白質(zhì)易于逃離內(nèi)涵體預(yù)防了蛋白質(zhì)變性，在細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境下，囊泡解交聯(lián)，藥物被 釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮其作用。
[0008] 本發(fā)明中，聚合物囊泡為具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的還原敏感可逆交聯(lián)、細(xì)胞內(nèi)可解交 聯(lián)的生物可降解聚合物囊泡;所述聚合物為PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI， 即聚合物由PEG親水鏈段、疏水鏈段以及PEI分子組成，其中疏水鏈段的結(jié)構(gòu)為： a.-?
當(dāng)R2)
?，為PTMC鏈段；當(dāng)R2:
時(shí)，為PLA鏈段，即疏水 鏈段由 P (TM(J-c〇-L)l(J)坱有八 LA-co-DTC)組成。
[0009] 優(yōu)選方案為:PEG分子量為4000-7500Da; PTMC或PLA總分子量為PEG分子量的2.5-5 倍;PDTC總分子量為PTMC或PLA總分子量的18%-38%;PEI的分子量為PEG單元分子量的15%- 40% 〇
[0010] 上述三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI，其中中間嵌段 的TMC或者LA與DTC呈無(wú)規(guī)排列;PEI分子量小于PEG分子量，在自組裝、交聯(lián)后得到具有不對(duì) 稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)的聚合物囊泡，囊泡膜的內(nèi)殼為PEI用于復(fù)合藥物如蛋白質(zhì)、多肽和小分子 藥物，并能通過(guò)質(zhì)子海綿效應(yīng)逃逸內(nèi)涵體;囊泡膜為可逆交聯(lián)的生物可降解且生物相容性 好的PTMC或者PLA，側(cè)鏈的二硫戊環(huán)類似人體天然的抗氧化劑硫辛酸，可提供還原敏感的可 逆交聯(lián)，不但支持生物藥物在血液中的長(zhǎng)循環(huán)，還可保證在細(xì)胞內(nèi)快速解交聯(lián)，釋放藥物到 靶細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)。
[0011] 本發(fā)明還公開了上述基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物的制備 方法，包括以下步驟： (1) 將PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的端羥基用羥基活化劑比如氯甲酸對(duì)硝基 苯酯（NPC)活化，再與PEI反應(yīng)制得PEG-P (TMC-DTC) -PEI或者PEG-P (LA-DTC) -PEI; (2) 在PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI的PEG端偶聯(lián)腫瘤特異性靶向分 子，得到靶向 PEG-P (TMC-DTC) -PEI或者靶向 PEG-P (LA-DTC) -PEI; (3) 以PEG-P(TMC-DTC)-PEI與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法制備抗腫瘤藥物；或者以 PEG-P(LA-DTC)-PEI與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法制備具有抗腫瘤藥物；或者以PEG-P (TMC-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法制備抗腫瘤藥 物;或者以PEG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PEG-P(LA-DTC)-PEI與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法制 備抗腫瘤藥物;或者以PEG-P (TMC-DTC) -PEI、靶向PEG-P (TMC-DTC)與藥物為原料，通過(guò)溶 劑置換法制備抗腫瘤藥物；或者以PEG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC)與藥物為原 料，通過(guò)溶劑置換法制備抗腫瘤藥物。
[0012] 優(yōu)選以 PEG-P (TMC-DTC) -PE I 和靶向 PEG-P (TMC-DTC )、藥物為原料，或者以 PEG-P (LA-DTC) -PEI和靶向PEG-P (LA-DTC)、藥物為原料，共混自組裝、裝載藥物、交聯(lián)得到腫瘤主 動(dòng)靶向具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的藥物囊泡，外殼為以PEG為背景、靶向分子對(duì)癌細(xì)胞可高特異性 結(jié)合，增加載體的靶向性。靶向分子可以為多肽CC9、cNGQ、cRGD、葉酸FA或半乳糖Gal。比如 通過(guò)PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI和偶聯(lián)了腫瘤主動(dòng)靶向分子的二嵌段聚 合物如cNGQ-PEG-P(TMC-DTC)混合，共自組裝、裝載藥物、交聯(lián)后得到腫瘤主動(dòng)靶向、具有不 對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物;所述cNGQ-PEG-P(TMC-DTC)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0013] 上述制備方法，具體包括以下步驟： 步驟（1)為將PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)、羥基活化劑氯甲酸對(duì)硝基苯酯NPC 溶于干燥的溶劑中反應(yīng)，然后沉淀、過(guò)濾、真空干燥得到活化的PEG-P (TMC-DTC) -NPC或者 PEG-P (LA-DTC) -NPC;將 PEG-P (TMC-DTC) -NPC 或者 PEG-P (LA-DTC) -NPC 溶液滴加到 PE I 溶液 中反應(yīng)后，透析、沉淀、抽濾、真空干燥得到PEG-P (TMC-DTC)-PEI或者PEG-P (LA-DTC)-PEI; 步驟(2 )為將得到聚合物溶于帶有靶向分子的有機(jī)溶劑如DMS0或DMF中；步驟(3 )為將原料 溶液加入非離子緩沖溶液中如HEPES，室溫放置少許后在相同緩沖溶液中透析，室溫孵育交 聯(lián)，得到基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物。本發(fā)明可以在加或不加還原 劑如二硫代蘇糖醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)下室溫交聯(lián)得到具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián) 生物可降解聚合物囊泡，從而得到基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物。
[0014] 比如： 將PEG-P(TMC-DTC)的末端羥基用羥基活化劑氯甲酸對(duì)硝基苯酯NPC活化，再與PEI的端 基伯胺反應(yīng)制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI，具體為，PEG-P(TMC-DTC)和NPC溶于干燥的二氯甲烷 (DCM)中冰水浴下反應(yīng)12-24小時(shí)，然后在冰乙醚中沉淀、過(guò)濾、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-NPC;然后將 PEG-P(TMC-DTC)-NPC 溶于干燥 DCM，滴加到 PEI 的 DCM 中 30-40°C 下反應(yīng) 12-24小時(shí)后，在DCM和甲醇(體積比為1:1)的介質(zhì)中透析24-48小時(shí)，接著沉淀、抽濾、真空干燥 得到產(chǎn)物PEG-P(TMC-DTC)-PEI; 以PEG-P (TMC-DTC) -PE I和靶向PEG-P (TMC-DTC )、細(xì)胞色素 C (CC )為原料，通過(guò)溶劑置換 法制備抗腫瘤藥物;具體為把PEG-P (TMC-DTC) -PEI和靶向PEG-P (TMC-DTC)的DMD0溶液混合 CC的緩沖液后加入HEPES緩沖液中，室溫下放置過(guò)夜、透析、加或不加還原劑如二硫代蘇糖 醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)孵育4 h，得到抗腫瘤藥物。
[0015] 本發(fā)明還公開了具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡作為蛋白 質(zhì)藥物、多肽藥物和生理環(huán)境帶負(fù)電的小分子藥物載體的應(yīng)用;所述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的 可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡由聚合物自組裝后交聯(lián)得到;所述聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如 下：
其中，辦選自以下基團(tuán)中的一種：
r2選自以下基團(tuán)中的
一種： PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
所述聚合物中，PEG的分子量為3000-8000Da; PTMC或PLA的總分子量為PEG分子量的2-6 倍；PDTC的總分子量為PTMC或PLA總分子量的15%-40%;PEI分子的分子量為TOG分子量的 10%-50%〇
[0016]本發(fā)明進(jìn)一步公開了具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡在制 備蛋白質(zhì)抗腫瘤藥物、多肽抗腫瘤藥物或者小分子抗腫瘤藥物中的應(yīng)用;所述具有不對(duì)稱 膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡由聚合物自組裝后交聯(lián)得到;所述聚合物的化學(xué) 結(jié)構(gòu)式如下：
其中，辦選自以下基團(tuán)中的一種：
R2選自以下基團(tuán)中的一種：
PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
所述聚合物中，PEG的分于量為3000-8000Da; PTMC或PLA的總分于量為PEG分子量的2-6 倍；PDTC的總分子量為PTMC或PLA總分子量的15%-40%;PEI分子的分子量為TOG分子量的 10%-50%〇
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1.本發(fā)明公開的抗腫瘤納米藥物中具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物囊泡用于體內(nèi)傳 遞;首先合成了三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI，PEI分子量為PEG分子量的10%-50%，在 聚合物自組裝、交聯(lián)后得到具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)的聚合物囊泡，囊泡膜的內(nèi)殼為PEI用 于復(fù)合蛋白質(zhì)、多肽和生理環(huán)境帶負(fù)電荷的小分子藥物;囊泡膜為可逆交聯(lián)的生物可降解 且生物相容性好的PTMC，側(cè)鏈的二硫戊環(huán)類似人體天然抗氧化劑硫辛酸，可提供還原敏感 的可逆交聯(lián)，不但支持納米藥物在血液中長(zhǎng)循環(huán)，還可保證在細(xì)胞內(nèi)快速解交聯(lián)，釋放藥物 到靶細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)；外殼以PEG為背景同時(shí)具有靶向分子，對(duì)癌細(xì)胞可高特異性結(jié)合。
[0018] 2.本發(fā)明公開的抗腫瘤藥物通過(guò)對(duì)具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物囊泡來(lái)裝載 治療性蛋白質(zhì)、多肽和生理環(huán)境帶負(fù)電荷的小分子藥物，其體內(nèi)外抗腫瘤效果、體內(nèi)血液循 環(huán)及生物分布、治療荷原位肺癌小鼠的情況和毒副作用研究，表明該囊泡裝載藥物擁有多 種獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，包括制備的簡(jiǎn)易操控性、杰出的生物相容性、對(duì)藥物極好的控制釋放性(生理 條件泄漏量低/腫瘤細(xì)胞內(nèi)快速釋放）、超強(qiáng)的體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性、對(duì)癌細(xì)胞的優(yōu)越靶向性、顯 著的特異性基因沉默能、卓越的抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力；因此，本發(fā)明的囊泡體系有望 成為集便捷、穩(wěn)定、多功能等優(yōu)點(diǎn)于一身的納米系統(tǒng)平臺(tái)，用于高效、主動(dòng)靶向輸送蛋白質(zhì) 等藥物至腫瘤包括原位腫瘤。
[0019] 3.本發(fā)明公開的抗腫瘤藥物中具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的、還原敏感可逆交聯(lián)、細(xì)胞內(nèi) 可解交聯(lián)的生物可降解聚合物囊泡的囊泡膜的內(nèi)表面由低分子量的PEI(300-4000Da)組 成，用于高效裝載蛋白質(zhì)、多肽和生理環(huán)境帶負(fù)電荷的小分子藥物等，交聯(lián)的囊泡膜可保護(hù) 藥物不被降解，并可在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)，囊泡的納米尺寸以及腫瘤特異性靶向使得囊泡可輸送 藥物高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境下，囊泡解交聯(lián)，藥物解離釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)； 這里限定的低分子量PEI作為載體時(shí)毒性小，在結(jié)合PEG鏈段與疏水鏈段后卻可以形成良好 的藥物包載效果；同時(shí)本發(fā)明的聚合物避免了現(xiàn)有PEI通過(guò)靜電相互作用結(jié)合蛋白質(zhì)等形 成的復(fù)合物帶來(lái)的不穩(wěn)定、帶正電易與細(xì)胞結(jié)合而迀移力差、釋放效率差的缺陷。
[0020] 4.本發(fā)明公開的抗腫瘤藥物的具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的聚合物囊泡為交聯(lián)囊泡，PEI 配合親水鏈段以及疏水鏈段，從而具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)循環(huán)良好，能夠即使當(dāng)藥物含量 高達(dá)35 ri.%，該囊泡仍可以完全、緊實(shí)包裹藥物，證明本發(fā)明的抗腫瘤藥物穩(wěn)定性優(yōu)異，當(dāng) 它在10 mM GSH存在下孵育20 h后發(fā)現(xiàn)，由于交聯(lián)囊泡的解交聯(lián)及溶脹大部分藥物釋放出 來(lái);是一種良好的蛋白質(zhì)或者小分子藥物控釋載體，用于腫瘤治療。
【附圖說(shuō)明】
[0021]圖 1 是實(shí)施例一中PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEIl. 8k的核磁圖； 圖2為實(shí)施例五中PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k囊泡粒徑分布及TEM圖； 圖3是實(shí)施例七中裝載甲氨蝶呤鈉鹽的MTX-CPP33-RCCPS體外釋放圖； 圖4是實(shí)施例十二中靶向交聯(lián)囊泡CPP33-RCCPS對(duì)A549肺癌細(xì)胞的毒性圖； 圖5是實(shí)施例十三中靶向CPP-MTX-RCCPs對(duì)A549細(xì)胞的毒性圖； 圖6是實(shí)施例十四中靶向囊泡CC9-PEM-RCCPs對(duì)H460細(xì)胞的毒性圖； 圖7是實(shí)施例十五中靶向囊泡CPP-GrB-RCCPs對(duì)A549細(xì)胞的毒性圖； 圖8是實(shí)施例十七中靶向交聯(lián)囊泡CC9-RCCPs-Cy5在小鼠血液中循環(huán)圖； 圖9是實(shí)施例十八中靶向交聯(lián)囊泡CPP-MTX-RCCPs對(duì)荷皮下A549肺癌小鼠生物分布圖； 圖10是實(shí)施例十九中靶向交聯(lián)囊泡CC9-PEM-RCCPs對(duì)荷皮下H460肺癌小鼠生物分布 圖； 圖11是實(shí)施例二十中載MTX· 2Na靶向交聯(lián)囊泡CPP-RCCPs在皮下荷A549肺癌小鼠的多 劑量治療圖； 圖12是實(shí)施例二^^一中載PEM靶向交聯(lián)囊泡CC9-RCCPs在荷皮下H460肺癌小鼠的多劑 量治療圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述： 實(shí)施例一 PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k嵌段共聚物的合成 PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k的合成分為兩步，首先是開環(huán)聚合制備PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)二嵌段共聚物，具體操作如下，在氮?dú)馐痔紫鋬?nèi)，依次稱取MeO-PEG-OH =5.0 kg/mol，0.50 g，100 μπιο?)，TMC (2.0 g，19.2 mmol)和DTC (0.50 g， 2.60 mmol)并溶解在二氯甲烷(DCM，7.0 mL)中，快速加入開環(huán)聚合催化劑如雙(雙三甲基 硅基)胺鋅(29 mg，75 μπιο?)。密閉反應(yīng)器密封好放置40 °C油浴中磁力攪拌下反應(yīng)2天。冰 醋酸終止反應(yīng)后在冰乙醚中沉淀兩次、抽濾、常溫真空干燥后得到PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)〇
[0023] 接著，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)的末端羥基氯甲酸對(duì)硝基苯酯NPC活化，再與 支化PEI(bPEI)的伯胺反應(yīng)制得。具體的，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k) (0.4 g，羥基 0.013 mmol)和NPC(40 mg，0.07 mmol)溶于干燥的DCM中在0°C下反應(yīng)24小時(shí)，然后在冰乙 醚中沉淀、過(guò)濾、真空干燥得到PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-NPC。然后將產(chǎn)物溶于3 mL DCM后滴加到3 mL溶有bPEI (#n =1.8 kg/mol) (180 mg, 0.10 mmol)的DCM中，30°C下反 應(yīng)24小時(shí)后，在DCM和甲醇(體積比為1:1)中透析(MW⑶7000) 48小時(shí)，接著在冰乙醚中沉 淀兩次、抽濾并室溫真空干燥得到產(chǎn)物PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k。產(chǎn)率： 91.6%。咕匪R (400 MHz, DTC13):PEG: δ 3.38， 3.65; TMC: δ 4.24， 2.05; DTC: δ 4.32，3.02，PEI: δ 2.56-2.98:? NMR表征顯示除了PEG及P(DTC-TMC)峰外，還有PEI的 特征峰在d 2 · 59-2 · 79，附圖 1為PEG5k-P(DTC4 · 4k-TMC19 · 8k)-bPEI 1 · 8k的核磁圖譜，其1Η NMR表征顯示除了PEG及P(DTC-TMC)峰外，還有PEI的特征峰在d 2.59-2.79，通過(guò)積分可知， 聚合物的分子量為5.0_(4.4-19.8)-1.8 kg/mol。
[0024] 實(shí)施例二合成共聚物 Mal-PEG6k-P(DTC3.2k-TMC15.4k)-bPEI1.8k 其合成與實(shí)施例一類似，也是分為兩步，只是將其中的第一步中的引發(fā)劑Me〇-PEG-〇H 換為馬來(lái)酰亞胺官能化的Mal-PEG6k-OH，開環(huán)聚合TMC和DTC得到Mal-PEG6k- P(DTC3.2k-TMC15.4k)，然后其末端羥基用NPC活化，再與bPEI1.8k的伯胺反應(yīng)制得。具體操作與實(shí)施例 一類似。產(chǎn)率：90.29^? M1R (400 MHz, DTC13):PEG: δ 3.38，3.65; TMC: δ 4.24， 2.05; DTC: δ 4.32，3.02,ΡΕΙ: δ 2.56-2.98,以及Mai的特征峰。聚合物數(shù)均分子量通過(guò) 特征峰面積積分比值計(jì)算為6.0-(3.2-15.4)-1.8 kg/mol。
[0025] 實(shí)施例三合成聚合物 Azide-PEG6.5k-P(DTC4.0k-LA15.3)-lPEI0.7k 其合成與實(shí)施例一類似，也是分為兩步，只是將第一步的MeO-PEG-OH換為疊氮官能化 的Azide-PEG6 · 5k-OH，開環(huán)聚合LA和DTC得到Azide-PEG6 · 5k-P(DTC4 · 0k-LA15 · 3)，然后其 末端羥基用NPC活化，再與線性PEI(1PEI0.7k)的伯胺反應(yīng)制得。產(chǎn)率:90.2%。1H NMR (400 MHz, DTC13):PEG: δ 3.38，3.65; TMC: δ 4.24，2.05; DTC: δ 4.32，3.02,以及PEI的 特征峰。聚合物數(shù)均分子量通過(guò)特征峰面積積分比值計(jì)算為6.5-(4.0-15.3)-0.7 kg/mol。
[0026] 實(shí)施例四合成靶向二嵌段共聚物〇??^^66.51^-?(01^3.01^〇-了]\05.01〇 CPP-PEG6.5k-P(DTC3. Ok-co -TMC15. Ok)的合成與實(shí)施例一類似，也是分為兩步，將第 一步中的引發(fā)劑Me〇-PEG-〇H換為丙烯酸酯官能化的AA-PEG-OH，開環(huán)聚合TMC和DTC得到八八-PEG6 · 5k-P(DTC3 · Ok-co -TMC15 · Ok);其次，具有自由巰基的多肽CPP33-SH與AA-PEG6 · 5k-P (DTC3. Ok-co -TMC15. Ok)通過(guò)邁克爾反應(yīng)而鍵合。簡(jiǎn)要的說(shuō)44^^66.51^-?(01^3.01^〇-TMC15.0k) (0.017 mmol)與CPP33-SH (0.033 mmol)相繼溶解在5 mL DMF中，加少許 AIBN反應(yīng)2天后，蒸餾水中透析兩天（MWC0 3500)，冷凍干燥得產(chǎn)物CPP-PEG6.5k-P (DTC3 · 0k-co -TMC15 · 0k)。產(chǎn)率:85 · 29LBCA蛋白試劑盒(Thermo scientific)測(cè)得CPP33的 接枝率為91.7%。通過(guò)調(diào)整原料比例可以得到不同分子量的聚合物，見表1。
[0027] 表1各個(gè)聚合物制備條件和產(chǎn)物的核磁表征結(jié)果
實(shí)施例五制備交聯(lián)聚合物囊泡PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI 1.8k 溶劑置換法制備。室溫下向950μL的HEPES(5mM，pH6.8)緩沖液中加入50μL濃度為5 mg/ml的PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k的DMS0溶液，室溫靜置lh，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)混 合液，使之分散均勻后，加入相當(dāng)于DTC摩爾量10%-30%的DTT溶液(最終0.1 mM)后在37°C搖 床中震蕩12h充分交聯(lián)。然后透析(MWCO: 3500)12h除去有機(jī)溶劑和游離蛋白，期間換5次 介質(zhì)，由此得到可逆核交聯(lián)的囊泡，簡(jiǎn)稱為RCCPs。圖2為得到的囊泡粒徑分布圖及TEM圖。在 制備該囊泡時(shí)也可以不加入DTT，在制備過(guò)程中囊泡內(nèi)部可以自交聯(lián)，形成穩(wěn)定的交聯(lián)囊 泡，避免交聯(lián)劑的干擾。
[0028] 實(shí)施例六靶向聚合物的合成和靶向聚合物囊泡的制備 靶向聚合物的合成有多種方式。炔功能化的Alkynyl-PEG5k-OH引發(fā)DTC與LA開環(huán)聚合、 端羥基活化、與線性1PEI 1.2k反應(yīng)得到末端為活性炔基的聚合物Alkynyl-PEG5k-P (DTC5.8k-LA23k)-lPEI 1.2k;最后，與疊氮功能化的靶向分子，如多肽CNGQ-N3或半乳糖 Gal-N3,通過(guò)疊氮-炔基的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)得到靶向聚合物Gal-PEGSk-POTCS.Sk-IJ^SlO-iPEIUk。 隨后靶向囊泡的制備方法即 是：首先混合 Gal-TOG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-1PEI1.2k和PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-lPEI 1.2k的DMS0溶液，打入HEPES溶液中，同實(shí)施例 五的方法制備得到囊泡，稱為Ga 1 -RCCPs。
[0029] 疊氮功能化的Azide-PEG3k-OH引發(fā)DTC與TMC開環(huán)聚合、端羥基活化、與支化 bPEI0.6k反應(yīng)得到末端為活性疊氮基的聚合物Azide-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0.6k， 最后與炔基功能化的靶向分子如alk-CC9或是cRGD-alk，通過(guò)疊氮-炔基的點(diǎn)擊化學(xué)得到靶 向聚合物CC9-PEG3k-P (DTC4k-TMC 12k) -bPE 10.6k。隨后靶向囊泡的制備方法即是：把CC9-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0·6k和PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)_ bPEIO·6k的DMS0溶液混 合，打入HEPES溶液中，同實(shí)施例五的方法制備得到囊泡，稱為CC9-RCCPs。
[0030]當(dāng)疊氮或炔基功能化的聚合物為無(wú)末端PEI的二嵌段聚合物的情況，即Alkynyl-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)和 Azide-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)，其鍵合 cNGQ 等多肽的方式和 制備靶向囊泡(和無(wú)靶向的三嵌段聚合物混合)的方式與上述例子類似。
[0031] 馬來(lái)酰亞胺Mai功能化的Mal-PEG6k-OH或者丙烯酸酯功能化的AA-PEG6.5k-OH引 發(fā)DTC與TMC開環(huán)聚合、端羥基活化、與支化bl .8k PEI反應(yīng)得到聚合物Mal-PEG6k-P (DTC4 · 8k-TMC19 · 2k)-bPEI 1 · 8k或AA-PEG6 · 5k-P(DTC4 · 6k-TMC18 · 6k)-bPEI 1 · 8k。然后，他 們和相應(yīng)的無(wú)活性端的聚合物PEG5k-P (DTC4.6k-TMC 18.6k) -bPE 11.8k混合溶于DMSO中后， 打入HEPES溶液中，同實(shí)施例五制備得到交聯(lián)囊泡。最后，在囊泡溶液中加入含有自由巰基 的靶向分子如多肽cNGQ-SH或葉酸FA-SH或CPP33-SH，通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)和表面有活性 Mai或AA的囊泡鍵合，得到靶向聚合物囊泡CPP33-RCCPs、FA-RCCP等。
[0032]馬來(lái)酰亞胺Mai功能化的和丙烯酸酯功能化的嵌段聚合物為無(wú)末端PEI的二嵌段 聚合物的情況，即Mal-PEG6k-P(DTC3 · 2k-TMC15 · 4k)和AA-PEG5k-P(DTC4 · 5k-TMC19 · 3k)，其 和含有PEI的三嵌段聚合物混合制備囊泡、鍵合cNGQ等多肽的方式和制備靶向囊泡的方式 與上述例子類似。
[0033]實(shí)施例七裝載甲氨蝶呤鈉鹽的交聯(lián)囊泡MTX-CPP33-RCCPS及體外釋放 室溫向950 μL含不同濃度甲氨蝶呤鈉鹽(MTX·2Na)的HEPES緩沖溶液(5mM，pH5.5)中 加入50 yL的PEG5·0k-P(DTC3·Ok-co -TMC15·0k)-PEI 1 ·8k和CPP-PEG6·5k-P(DTC3·Ok-co -TMC15.0k)(質(zhì)量比4:1)的DMSO溶液（10 mg/mL)，室溫靜置2 h，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)混合液，使之逐漸 均勻分散后，氮?dú)庀?，加入相?dāng)于DTC摩爾量10%-30%的DTT溶液(最終0.1 mM)，37°C搖床中 震蕩（200 rpm)12 h，使之充分交聯(lián)。然后轉(zhuǎn)入透析袋(MW⑶：3500)透析24h除去有機(jī)溶劑 和游離的藥物，透析介質(zhì)為HEPES緩沖溶液(5 mM，pH 5.5)，期間至少換5次介質(zhì)。載不同比 例的MTX'2Na(10%-30wt%)的交聯(lián)囊泡的粒徑在60-120 nm，粒徑分布0.12-0.19。紫外光譜 儀測(cè)定MTX'2Na的包裹效率為60%-85%。得到的載藥可逆核交聯(lián)囊泡稱為MTX-CPP33-RCCPS， 表示載的藥物為MTX· 2Na，靶向分子為CPP33，其他命名以此類推。
[0034] 研究不同聚合物囊泡裝載MTX的情況:PEG5k-P(DTC4.4k- TMC19.8k) -bPE11.8k和 Mal-PEG6k-P(DTC4 · 8k-TMC19 · 2)-bPEI 1 · 8k 包載不同量 MTX· 2Na( 10-30wt%)后形成囊泡，并 和cRGD-SH反應(yīng)得到載藥靶向交聯(lián)囊泡MTX-cRGD-RCCPs，粒徑80-120nm，粒徑分布0.08-0.17，藥物包裹效率為70%-85% ;由聚合物I3EG7k-P(DTC4k-LA18)-lPEI3.5k包載不同量 MTX· 2Na( 10%-30wt%)后形成囊泡的粒徑90-150nm，粒徑分布0.12-0.19，MTX· 2Na的包裹效率 為70%-85%。
[0035] MTX'2Na的體外釋放實(shí)驗(yàn)在37 °C恒溫?fù)u床中震蕩（200 rpm)進(jìn)行，每組各有三個(gè) 平行樣。第一組，載MTX'2Na的交聯(lián)囊泡在加入10 mM GSH模擬細(xì)胞內(nèi)還原環(huán)境HEPES (10 mM，pH 7.4)中；第二組，載MTX'2Na的交聯(lián)囊泡在HEPES (10 mM，pH 7.4)中；載藥交聯(lián)囊 泡的濃度為100 mg/L，取0.5 mL放入透析袋(麗C0: 12,000)中，每個(gè)試管中加入相應(yīng)的透 析溶劑25 mL，預(yù)定時(shí)間間隔取5.0 mL透析袋外介質(zhì)用HPLC測(cè)定溶液中藥物濃度，同時(shí)向試 管中補(bǔ)加5.0 mL相應(yīng)介質(zhì)。圖3為MX2Na累積釋放量與時(shí)間的關(guān)系，可看出，加入模擬細(xì) 胞內(nèi)GSH后，藥釋明顯快于沒(méi)加 GSH的樣本，說(shuō)明載藥交聯(lián)囊泡在10 mM的GSH的存在下能有 效釋放藥物。
[0036] 實(shí)施例八載PEM'Na的靶向交聯(lián)囊泡PEM-CC9_RCCPs及體外釋放 室溫下向950 yL含不同濃度培美曲塞鈉鹽(PEM'Na)的HEPES緩沖溶液（5 mM，pH 5.5) 中加入50 yL的PEG5·0k-P(DTC3·Ok-co -TMC15·0k)-PEI 1 ·8k和CC9-PEG6·5k-P(DTC3·Ok-C〇-TMC15.0k)(質(zhì)量9:1)的DMSO溶液（10mg/mL)，室溫靜置2 h，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)混合液，使之逐 漸分散均勻后，氮?dú)庀?，加入相?dāng)于DTC摩爾量的10%-30%的DTT溶液(最終0.1 mM)，同實(shí)施 例七的制備方法制備PEM-CC9-RCCPs。載不同比例的PEM· Na (10%-30wt%)的交聯(lián)囊泡的粒徑 在55-120 nm，粒徑分布0.12-0.18。紫外光譜儀測(cè)定PEM'Na的包裹效率為的 體外釋放實(shí)驗(yàn)同實(shí)施例七。PEM'Na累積釋放量與時(shí)間的關(guān)系可看出，加入模擬細(xì)胞內(nèi)GSH 后，藥釋明顯快于沒(méi)加 GSH的樣本，說(shuō)明載藥交聯(lián)囊泡在10 mM的GSH的存在下能有效釋放藥 物。
[0037] 研究多種不同聚合物囊泡的裝載PEM'Na的情況。實(shí)施例六中的由PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0 · 6k和CC9-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0 · 6k包載不同PEM.Na( 10%-30wt%)，后交聯(lián)得到載藥靶向交聯(lián)囊泡TOM-CC9-RCCPs，粒徑50-100nm，粒徑分布0.14_ 0.18，MTX· 2Na 的包裹效率為 55%-75%。
[0038]實(shí)施例九載細(xì)胞色素 C的交聯(lián)靶向囊泡CC-cRGD-RCCPs及體外釋放 按質(zhì)量比4:1把PEG5k-P(DTC4 · 4k-TMC19 · 8k)-bPEI 1 · 8k 和cRGD-PEG6k-P(DTC4·8k-TMC19.2k)-bPEI 1.8k混合溶于DMS0( lOmg/mL)，加入950 yL含不同濃度蛋白質(zhì)FITC-CC的 HEPES(5 mM，pH 6.8)緩沖溶液中，同實(shí)施例七制備？11'00>〇1^〇-1?0^8。載不同比例0： (l%-5wt%)的交聯(lián)囊泡粒徑在90-120 nm，粒徑分布0.13-0.19。熒光光譜儀測(cè)定FITC-CC的 包裹效率為95%-100%。
[0039] 按照上述類似的方法，實(shí)施例六中由Gal-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-lPEI1.2k和 PEG5k-P(DTC5 · 8k-LA23k)-lPEI 1 · 2制備的Gal-RCCPs在包載不同量凋亡蛋白（apoptin)(1-5wt%)得到載藥靶向交聯(lián)囊泡的粒徑90-130nm，粒徑分布0.14-0.17，蛋白質(zhì)包裹效率接近 100%。由 PEG8k-P (DTC8k-LA30) -bPE 11 · 2k 和 Ga 1 -PEG8k-P (DTC8k-LA30) -bPE 11 · 2k 包載不同 量Caspase3( l-5wt%)得到的載藥囊泡粒徑110-150nm，粒徑分布0.14-0.17，包裹效率接近 lOOQ/hPEGdk-PmTCS · 7k-LA18 · 8k)-PEI2 · Ok 和 cNGQ-PEG5k-P(DTC5 · 7k-LA18 · 8k)包載不同 量胰島素（l_5wt%)，得到載藥交聯(lián)囊泡粒徑100-120nm，粒徑分布0.15-0.18，包裹效率接近 100%〇
[0040] FITC-CC的體外釋放實(shí)驗(yàn)同實(shí)施例七，只是透析袋MWC0為300kDa，使用熒光儀測(cè)定 溶液中藥物濃度。結(jié)果表明，加入10 mM DTT后，F(xiàn)ITC-CC累積釋放量釋放明顯要快于沒(méi)加 DTT的樣本，說(shuō)明載藥交聯(lián)囊泡在10 mM的DTT的存在下，能有效釋放藥物。
[0041 ] 實(shí)施例十裝載顆粒酶B(GrB)的交聯(lián)靶向囊泡GrB-CPP-RCCPs的制備 PEG5·0k-P(DTC3·Ok-co -TMC15·0k)-PEI1·8k和CPP-PEG6·5k-P(DTC3·Ok-co -TMC15.0k)按質(zhì)量比4:1混合于DMS0溶液中，同實(shí)施例八制備載GrB交聯(lián)靶向囊泡GrB-CPP-RCCPs。載不同比例GrB(l%-5 wt%)的交聯(lián)囊泡粒徑在90-120 nm，粒徑分布在0.12-0.17,囊 泡包裹效率接近100%。更換聚合物以及藥物，可得到不同的載藥聚合物囊泡的載藥量、包封 率，結(jié)果見表2。
[0042]表2載藥聚合物囊泡的載藥量、包封率
實(shí)施例十一 MTT法測(cè)試聚合物囊泡的細(xì)胞毒性 MTT法使用人肺癌細(xì)胞(H460)，以5 X 103個(gè)/mL將細(xì)胞種于96孔板，每孔100 yL，24小時(shí) 后培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁70%左右。然后，實(shí)驗(yàn)組各孔中分別加入含有不同濃度(0.1-0.5 mg/mL) 的CC9-RCCPS和RCCPs囊泡樣品（實(shí)施例五、實(shí)施例六），另設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照孔和培養(yǎng)基空白 孔(復(fù)4孔）。培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入MTT(5.0 mg/mL)10 yL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后每孔加入150 yL DMSO溶解生成的結(jié)晶子，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)吸光度值(A)，以培養(yǎng)基空白孔調(diào)零，計(jì) 算細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，當(dāng)交聯(lián)囊泡的濃度從〇. 1增到〇. 5 mg/mL時(shí)，H460的存活率仍高于 90%，說(shuō)明本發(fā)明的交聯(lián)囊泡具有良好的生物相容性。其他聚合物囊泡的細(xì)胞毒性的測(cè)定于 此類似，毒性均很小，具有良好的生物相容性。
[0043] 實(shí)施例十二MTT法測(cè)試聚合物囊泡的細(xì)胞毒性 MTT法使用人肺癌細(xì)胞(A549)，以5 X 103個(gè)/mL將細(xì)胞種于96孔板，每孔100 yL，24小時(shí) 后培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁70%左右。然后，實(shí)驗(yàn)組各孔中分別加入含有不同濃度(0.1-0.5 mg/mL) 的CPP33-RCCPs和RCCPs囊泡樣品（實(shí)施例五、實(shí)施例六）。培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入MTT(5.0 mg/mL) 10 yL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后每孔加入150 yL DMS0溶解生成的結(jié)晶子，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)吸光度值(A)，以培養(yǎng)基空白孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。由圖4結(jié)果顯示，當(dāng)交聯(lián)囊泡 的濃度從0.1增到0.5 mg/mL時(shí)，H460的存活率仍高于90%，說(shuō)明該交聯(lián)囊泡RCCPs和靶向的 CPP33-RCCPS均有良好的生物相容性。其他囊泡的細(xì)胞毒性的測(cè)定于此類似，毒性均很小， 具有良好的生物相容性。
[0044] 實(shí)施例十三MTT法測(cè)載藥聚合物囊泡對(duì)A549肺癌細(xì)胞的毒性 測(cè)試對(duì)象為實(shí)施例七M(jìn)TX-CPP33-RCCPS，用自由藥、無(wú)靶向和20%靶向的載藥囊泡做對(duì) 八549細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，]\^('2恥濃度范圍為0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、20和40以8/11^，無(wú) 靶向載藥交聯(lián)聚合物囊泡及游離fflX2Na組作為對(duì)照組。細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)施例^^一相同，共 同培養(yǎng)4小時(shí)后，吸出樣品換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育44 h后，而后的MTT加入、處理和測(cè)定吸 光度同實(shí)施例十一。由圖5結(jié)果可知，載MTX· 2Na的含20% CPP33靶向交聯(lián)聚合物囊泡對(duì)A549 細(xì)胞的半致死濃度(IC5Q)為2.8 yg/mL，無(wú)靶向囊泡的半致死濃度約為9.8 yg/mL，比自由藥 小20和5倍，說(shuō)明本發(fā)明的囊泡能很好的將藥物傳送到細(xì)胞內(nèi)，并有效的釋放，最終殺死癌 細(xì)胞，而靶向納米粒的效果要更好。
[0045] 實(shí)施例十四MTT法測(cè)載藥聚合物囊泡對(duì)H460肺癌細(xì)胞的毒性 測(cè)試對(duì)象為實(shí)施例八PEM-CC9-RCCPs，用自由藥、無(wú)靶向和10%靶向的載藥囊泡做對(duì) H460細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，PEM濃度范圍為0.001、0.01、0.1、0.5、l、5、10和20μg/mL，無(wú)靶向載 藥交聯(lián)聚合物囊泡及游離PEM組作為對(duì)照組。細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)施例十一相同，共同培養(yǎng)4小 時(shí)后，吸出樣品換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育44 h后，而后的MTT加入、處理和測(cè)定吸光度同實(shí) 施例十一。由圖6結(jié)果可知，載PEM的含20% CC9的靶向交聯(lián)囊泡對(duì)A549細(xì)胞的半致死濃度 (IC5Q)為3.6 yg/mL，無(wú)革巴向囊泡的半致死濃度為9.2yg/mL，自由藥為4.5yg/mL，說(shuō)明本發(fā)明 的靶向囊泡能很好的將藥物傳送到細(xì)胞內(nèi)，并有效的釋放，最終殺死癌細(xì)胞，而靶向納米粒 的效果要更好，結(jié)果見表3。
[0046] 實(shí)施例十五MTT法測(cè)載藥聚合物囊泡對(duì)A549肺癌細(xì)胞的毒性 測(cè)試對(duì)象為實(shí)施例十GrB-CPP-RCCPs，用自由藥、無(wú)靶向和20%靶向的載藥囊泡做對(duì) 八549細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，6池濃度范圍為0.0001、0.001、0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.2 4 g/mL，無(wú)靶向載藥交聯(lián)聚合物囊泡及游離GrB組作為對(duì)照組。細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)施例十一相 同，共同培養(yǎng)4小時(shí)后，吸出樣品換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育68 h后，而后的MTT加入、處理和 測(cè)定吸光度同實(shí)施例十一。由圖7結(jié)果可知，載GrB的含20% CPP靶向交聯(lián)聚合物囊泡對(duì)A549 細(xì)胞的半致死濃度(IC5Q)為0.32 yg/mL，遠(yuǎn)低于自由藥，比無(wú)靶向囊泡的半致死濃度小3倍， 說(shuō)明本發(fā)明的囊泡能很好的將藥物傳送到細(xì)胞內(nèi)，并有效的釋放，最終殺死癌細(xì)胞，而靶向 納米粒的效果要更好。
[0047]實(shí)施例十六靶向載藥囊泡的內(nèi)吞和細(xì)胞內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn) 靶向載藥囊泡的內(nèi)吞和細(xì)胞內(nèi)釋放實(shí)驗(yàn)以載FITC標(biāo)記的MTX的囊泡FITC-MTX-CPP-RCCPs為例、采用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)跟蹤測(cè)定。將400UL的A549細(xì)胞的1640培養(yǎng)基(含 10%牛血清、100IU/ml青霉素及l(fā)OOug/ml鏈霉素）懸浮液鋪于24孔培養(yǎng)板(每孔5X104個(gè)細(xì) 胞）中，37°C、5% 二氧化碳條件下培養(yǎng) 24h。將 100yL 的 FITC-MTX-RCCPs 和 FITC-MTX-CPP-RCCPs的roS溶液加入孔中（FITC終濃度為lSμg/ml)，繼續(xù)孵育4 h后，移去培養(yǎng)基，再補(bǔ)加 500UL培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育4 h，移去培養(yǎng)基并用roS洗三次、用4%的多聚甲醛溶液200UL固定 15min、PBS洗3次。最后用CLSM(TCS SP5)觀察拍照。結(jié)果表明FITC-MTX-CPP-RCCPs相對(duì)于無(wú) 靶向FITC-MTX-RCCPs可以通過(guò)介導(dǎo)作用更有效內(nèi)吞進(jìn)入A549細(xì)胞且FITC-MTX在細(xì)胞內(nèi)可 以快速釋放，引起有效細(xì)胞凋亡。
[0048] 同樣地，CLSM跟蹤靶向載藥囊泡CC9-RCCPs-Cy5在H460細(xì)胞的內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， CC9-RCCPs-Cy5相對(duì)于無(wú)靶向RCCPs-Cy5可以通過(guò)介導(dǎo)作用更有效內(nèi)吞進(jìn)入H460細(xì)胞。再 如，靶向載藥囊泡FITC-CC-Gal-RCCPs的肝癌細(xì)胞HepG2的內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-CC-Gal-RCCPs相對(duì)于無(wú)靶向FITC-CC-RCCPs可以通過(guò)介導(dǎo)作用更有效內(nèi)吞進(jìn)入HepG2細(xì)胞，且 FITC-CC在細(xì)胞內(nèi)可以快速釋放，引起有效細(xì)胞凋亡。
[0049] 實(shí)施例十七RCCPs_Cy5和CC9-RCCPs_Cy5交聯(lián)囊泡的血液循環(huán) 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心規(guī)定。實(shí)驗(yàn)選用體重為18~20克左右，4 ~6周齡的Balb/C裸鼠。首先用Cy5-NHS和PEG5 · 0k-P(DTC3 · 0k-co -TMC15 · 0k)-PEIl · 8k通過(guò) 酰胺化反應(yīng)制備Cy5標(biāo)記的聚合物PEG5·0k-P(DTC3·Ok-co -TMC15·0k)-PEI 1 ·8k-Cy5( 1 個(gè) Cy5/分子鏈）。囊泡CC9-RCCPs-Cy5由PEG5 · 0k-P(DTC3 · Ok-co -TMC15 · 0k)-PEI 1 · 8k-Cy5、 PEG5.0k- P(DTC 3.0k-co -TMC15.0k)-PEI1.8k和CC9-PEG6·5k-P(DTC3·0k-co-T M C15.0 k)按1: 3 :1混合而成，形成的聚合物囊泡粒徑為10 0納米，粒徑分布為0.14。將 RCCPs-Cy5交聯(lián)囊泡、和CC9-RCCPs-Cy5靶向交聯(lián)囊泡通過(guò)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（Cy5濃度為 4 41〇，在0、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24小時(shí)定點(diǎn)取血約10以1^，通過(guò)差量法準(zhǔn)確計(jì)算血液 重量，再加100 yL濃度為1%的曲拉通和500 yL二甲亞砜萃取(其中含有20 mM的DTT);然后 離心(20000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘)后，取上層清液，通過(guò)熒光光譜儀測(cè)得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)Cy5的量。由 圖8可知，靶向交聯(lián)聚合物囊泡、非靶向交聯(lián)聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)的消除半衰期分別為 7.46、7.5小時(shí)，所以本發(fā)明的交聯(lián)聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定，有較長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間。
[0050] 按照上述方法，由PEG8·0k-P(DTC9·0k-LA32·0k)-PEI3·2k-Cy5和Gal-PEG8·5k-P(DTC9.2k-LA32.0k)形成的囊泡有較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，靶向交聯(lián)聚合物囊泡、非靶向交聯(lián)聚 合物囊泡在小鼠體內(nèi)的消除半衰期分別為8.16和8.5小時(shí)；*PEG4.0k-P(DTC2.4k-TMC8·0k)-PEI0·6k-Cy5和CC9-PEG5·0k-P(DTC2·6k-TMC8·2k)形成的囊泡有相對(duì)長(zhǎng)的循 環(huán)時(shí)間，靶向交聯(lián)聚合物囊泡、非靶向交聯(lián)聚合物囊泡在小鼠體內(nèi)的消除半衰期分別為 6.16和6.5小時(shí)。
[0051 ] 實(shí)施例十八MTX-CPP33-RCCPS和MTX-RCCPs載藥交聯(lián)聚合物囊泡在荷A549肺癌小 鼠的體內(nèi)生物分布 動(dòng)物同實(shí)施例十七。在皮下注射1 x 1〇7個(gè)A549人肺癌細(xì)胞，3~4周后腫瘤為100~200 mm3時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。靶向交聯(lián)囊泡ΜΤΧ· 2Na-CPP-RCCPs 由PEG5 · Ok-P (DTC3 · Ok-TMCl 5 · Ok)-bPEIl·8k和CPP-PEG6·5k-P(DTC3·0k-TMC15·0k)制備。將MTX-CPP33-RCCPs、非靶向MTX-RCCPs和自由MTX'2Na尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（MTX'2Na:15 mg equiv./kg)，8小時(shí)后處死老 鼠，將腫瘤及心，肝，脾，肺和腎組織取出，清洗稱重后加入500 yL 1%的曲拉通通過(guò)勻漿機(jī) 磨碎，再加入900 yL二甲亞砜萃?。ㄆ渲泻?0 mM的DTT)。離心（20000轉(zhuǎn)/分鐘，20分鐘） 后，取上層清液，通過(guò)HPLC測(cè)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)MTX· 2Na的量。圖9可知MTX-CPP33-RCCPs、MTX-RCCPs和MTX· 2Na注射8小時(shí)在腫瘤積累的MTX· 2Na量分別為5.4、1.6和0.7 ID%/g，MTX-CPP33-RCCPs 是 MTX-RCCPs和 MTX· 2Na的 3 · 4和 7 · 7倍，說(shuō)明MTX-CPP33-RCCPs 通過(guò)主動(dòng)靶向在 腫瘤積累較多。
[0052] 實(shí)施例十九PEM-CC9-RCCPs和PEM-RCCPs載藥交聯(lián)聚合物囊泡在荷H460肺癌小鼠 的體內(nèi)生物分布 動(dòng)物同實(shí)施例十七。在皮下注射1 X 1〇7個(gè)H460人肺癌細(xì)胞，3~4周后腫瘤為100~200 mm3 時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。由 PEG5 · 0k-P(DTC3 · 0k-TMC15 · 0k)-bPEI 1 · 8k 和 CC9-PEG6 · 5k-P(DTC3 · Ok-TMC15.0k)制備載PHM的靶向交聯(lián)囊泡PEM-CC9-RCCPs。將PEM-CC9-RCCPs、非靶向交聯(lián)聚合物 囊泡PEM-RCCPs和自由PEM通過(guò)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（PEM:12.5 mg equiv./kg)，8小時(shí)后 處死老鼠，將腫瘤及心，肝，脾，肺和腎組織取出，清洗稱重后加入500 yL 1%的曲拉通通過(guò) 勻漿機(jī)磨碎，再加入900 yL二甲亞砜萃取(其中含有20 mM的DTT)。離心（20000轉(zhuǎn)/分鐘，20 分鐘）后，取上層清液，通過(guò)高效液相色譜測(cè)得每個(gè)時(shí)間點(diǎn)PEM的量。圖10結(jié)果可知，PEM-CC 9-RCCPs、PEM-RCCPs和PEM注射8小時(shí)在腫瘤積累的PEM量分別為6.8、2.1和0.8 ID%/g， PEM-CC9-RCCPs是PEM-RCCPs和PEM的3.2和8.5倍，說(shuō)明PEM-CC9-RCCPs通過(guò)主動(dòng)靶向在腫瘤 積累較多，結(jié)果見表3。
[0053]實(shí)施例二十靶向交聯(lián)囊泡MTX-CPP33-RCCPS在荷A549皮下肺癌的小鼠中的抑瘤 效果、體重變化和存活率 實(shí)驗(yàn)選用體重為18~20克左右，4~6周齡的Balb/C裸鼠，在皮下注射1 X 107個(gè)A549人肺 癌細(xì)胞，大約3~4周后，腫瘤大小為100~200 mm3時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。接著，如實(shí)施例十七的方式將 藥MTX-CPP33-RCCPs、MTX-RCCPs、Trexal 1以及PBS在0、4、8和12天通過(guò)尾靜脈注射小鼠體內(nèi) (MTX·2Na: 15 mg/kg)。在0~18天，每?jī)商旆Q量小鼠的體重，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，腫瘤體 積計(jì)算方法為:V=(L X WX H)/2，（其中L、W和Η分別為腫瘤的長(zhǎng)度、寬度、厚度）。持續(xù)觀察小 鼠的生存到70天。由圖11可知，其中Α為腫瘤生長(zhǎng)曲線，Β為小鼠治療后腫瘤圖片，C為體重變 化，D為生存曲線，MTX-CPP33-RCCPS組治療18天內(nèi)，腫瘤得到明顯抑制，而MTX-RCCPs組腫瘤 有一定的增長(zhǎng)。兩組的小鼠體重幾乎沒(méi)有改變，說(shuō)明載藥交聯(lián)囊泡對(duì)小鼠沒(méi)有毒副作用。 MTX-CPP33-RCCPS治療組在70天后全部存活，Trexal 1組在48天時(shí)全死亡，PBS組在40天時(shí)也 全部死亡。因此，本發(fā)明的靶向交聯(lián)囊泡載藥后可有效抑制腫瘤的增長(zhǎng)，對(duì)小鼠沒(méi)有毒副作 用，還可以延長(zhǎng)荷瘤老鼠的生存時(shí)間。
[0054]實(shí)施例二^^一載藥靶向交聯(lián)囊泡PEM-CC9-RCCPs在荷H460皮下肺癌的小鼠中的 抑瘤效果、體重變化和存活率 實(shí)驗(yàn)選用體重為18~20克左右，4~6周齡的Balb/C裸鼠，在皮下注射1 X 107個(gè)H460人肺 癌細(xì)胞，大約3~4周后，腫瘤大小為100~200 mm3時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。接著，藥劑PEM-CC9-RCCPs、PEM- RCCPs、A1 imta以及PBS在Ο、4、8和12天通過(guò)尾靜脈注射小鼠體內(nèi)（PEM: 12 · 5 mg/kg; A1 imta: 25 mg/kg)。在0~18天，每?jī)商旆Q量小鼠的體重，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算方法 為:V=(LXWXH)/2,（其中L為腫瘤的長(zhǎng)度，W為腫瘤的寬度，Η為腫瘤的厚度）。持續(xù)觀察小鼠 的生存到60天。由圖12中可知，其中Α為腫瘤生長(zhǎng)曲線，Β為小鼠治療后腫瘤圖片，C為體重變 化曲線，PEM-CC 9-RCCPs治療組20天時(shí)，腫瘤得到明顯抑制，而載藥PEM-RCCPs組腫瘤有一定 的增長(zhǎng)。相比之下，PEM-CPP-RCCPs和PEM-RCCPs組的小鼠體重幾乎沒(méi)有改變，說(shuō)明載藥交聯(lián) 囊泡對(duì)小鼠沒(méi)有毒副作用。PEM-CC 9-RCCPs治療組在60天后全部存活，PEM-RCCPs組在42天 時(shí)已全部死亡，Alimta組在38天時(shí)也全部死亡PBS組在30天時(shí)也全部死亡。因此，本發(fā)明的 靶向交聯(lián)囊泡載藥后可有效抑制腫瘤的增長(zhǎng)，對(duì)小鼠沒(méi)有毒副作用，還可以延長(zhǎng)荷瘤老鼠 的生存時(shí)間。
[0055] 因此，本發(fā)明的聚合物制備的藥物載體載藥后可有效抑制肺癌腫瘤增長(zhǎng)，對(duì)小鼠 沒(méi)有毒副作用，還可以延長(zhǎng)荷瘤老鼠的生存時(shí)間。
[0056] 表3載藥交聯(lián)囊泡對(duì)肺癌的體內(nèi)外抗腫瘤結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物，由具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可 逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡裝載藥物得到;所述藥物為蛋白質(zhì)藥物、多肽藥物或者小分 子抗癌藥物;所述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡由聚合物自組裝后 交聯(lián)得到;所述聚合物的分子鏈包括依次連接的親水鏈段、疏水鏈段以及聚乙烯亞胺分子； 所述疏水鏈段包括聚碳酸酯鏈段和/或聚酯鏈段;所述親水鏈段的分子量為3000-8000Da; 疏水鏈段的分子量為親水鏈段分子量的2.3-8.4倍;PEI的分子量為親水鏈段分子量的10%-50% 〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物，其特征在 于:所述聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：所述聚合物中，PEG的分子量為3000-8000Da;PTMC或PLA總分子量為I3EG分子量的2-6 倍;PDTC總分子量為PTMC或PLA總分子量的15%-40%; PEI的分子量為PEG分子量的10%-50%。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物，其特征在 于:PEG的分子量為4000-7500Da; PTMC或PLA的總分子量為PEG分子量的2.5-5倍;PDTC總分 子量為PTMC或PLA總分子量的18%-38%; PEI的分子量為PEG分子量的15%-40%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物，其特征在 于:所述蛋白質(zhì)藥物包括顆粒酶B (GrB)、細(xì)胞色素 C (CC)或者凋亡素(Apoptin);所述多肽 藥物包括卡非佐米、腫瘤凋亡肽;所述小分子抗癌藥物為生理環(huán)境帶負(fù)電荷的小分子抗癌 藥。5. 權(quán)利要求1-4所述任意一項(xiàng)基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物的制 備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)的端羥基通過(guò)羥基活化劑活化，再與PEI反 應(yīng)制得PEG-P (TMC-DTC) -PEI 或者PEG-P (LA-DTC) -PEI; (2) 在PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PeG-P(LA-DTC)-PEI的PEG端偶聯(lián)腫瘤特異性靶向分 子，得到靶向 PEG-P (TMC-DTC) -PEI或者靶向 PEG-P (LA-DTC) -PEI; (3) 以PEG-P(TMC-DTC)-PEI與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法制備基于交聯(lián)生物可降解 聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物;或者以PeG-P(LA-DTC)-PEI與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法 制備基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物;或者以Peg-P(TMC-DTC)-PEI、靶 向PEG-P(TMC-DTC)-PEI與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法制備基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊 泡的抗腫瘤納米藥物;或者以PeG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PeG-P(LA-DTC)-PEI與藥物為原料， 通過(guò)溶劑置換法制備基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物；或者以PEG-P (TMC-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC)與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法制備基于交聯(lián)生物 可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物;或者以PeG-P(LA-DTC)-PEI、靶向PEG-P(TMC-DTC) 與藥物為原料，通過(guò)溶劑置換法制備基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物的制備方 法，其特征在于，步驟（1)為將PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(LA-DTC)、羥基活化劑在干燥的溶 劑中反應(yīng)，然后沉淀、過(guò)濾、真空干燥得到端羥基活化的PEG-P (TMC-DTC)或者PEG-P (LA-DTC);將端羥基活化的PEG-P (TMC-DTC)或者PEG-P (LA-DTC)的溶液滴加到PEI溶液中反應(yīng)， 然后透析、沉淀、抽濾、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(LA-DTC)-PEI;步驟 (2)為將步驟（1)得到聚合物和溶于有機(jī)溶劑的靶向分子反應(yīng)得到靶向peg-p(tmc-dtc)-PEI或者靶向PEG-P(LA-DTC) -PEI;步驟(3 )為將原料溶液加入非離子緩沖溶液中，室溫放置 后透析、交聯(lián)，得到基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物的制備方 法，其特征在于：步驟（2)中，腫瘤特異性靶向分子為葉酸(FA)、半乳糖(Gal)或多肽CC9、 cNGQ、cRGD;步驟(3)中，非離子緩沖溶液為HEPES。8. 權(quán)利要求5所述基于交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的抗腫瘤納米藥物的制備方法，其 特征在于:所述藥物占原料的質(zhì)量比為1%-35%。9. 具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡作為蛋白質(zhì)藥物、多肽藥物或 者小分子藥物載體的應(yīng)用;所述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡由聚 合物自組裝后交聯(lián)得到;所述聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：其中，辦選自以下基團(tuán)中的一種：所述聚合物中，PEG的分子量為3000-8000Da; PTMC或PLA的總分子量為PEG分子量的2-6 倍；PDTC的總分子量為PTMC或PLA總分子量的15%-40%; PEI分子的分子量為I3EG分子量的 10%-50%〇10.具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡在制備抗腫瘤納米藥物中的 應(yīng)用;所述抗腫瘤納米藥物的活性成分為蛋白質(zhì)藥物、多肽藥物或者生理環(huán)境帶負(fù)電荷的 小分子抗癌藥;所述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡由聚合物自組裝 后交聯(lián)得到;所述聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：所述聚合物中，PEG的分子量為3000-8000Da; PTMC或PLA的總分子量為PEG分子量的2-6 倍；PDTC的總分子量為PTMC或PLA總分子量的15%-40%; PEI分子的分子量為I3EG分子量的 10%-50%〇
【文檔編號(hào)】A61K9/127GK105997880SQ201610559279
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】孟鳳華, 楊煒靜, 方媛, 鄒艷, 鐘志遠(yuǎn)
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)