一種載紫杉醇和/或載siRNA微泡，制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種載紫杉醇和/或載siRNA微泡，載紫杉醇微泡為PLGA包裹紫杉醇微泡；載siRNA微泡為PLGA包裹siRNA微泡；載紫杉醇和siRNA微泡為PLGA包裹紫杉醇微泡與PLGA包裹siRNA微泡混合物。載紫杉醇和siRNA微泡為PLGA包裹紫杉醇微泡與PLGA包裹siRNA微泡的混合物。其制備方法包括載紫杉醇微泡的制備及載siRNA微泡的制備。本發(fā)明將其應(yīng)用于制備抑制宮頸癌的藥物上。實驗表明超聲介導(dǎo)載紫杉醇及載siRNA微泡對宮頸癌Caski細胞分別有一定的抑制作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用，其協(xié)同抑制宮頸癌Caski細胞增殖的效果更好。
【專利說明】
一種載紫杉醇和/或載S i RNA微泡，制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供一種利用超聲介導(dǎo)載紫杉醇和/或載siRNA微泡聯(lián)合靶向抑制宮頸癌 的技術(shù)方案，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究署（International Agency forResearch on Cancer，IARC)統(tǒng)計，宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，全球?qū)m頸癌發(fā)病率在 女性惡性腫瘤中居第二位，占所有女性惡性腫瘤的13%。有調(diào)查統(tǒng)計，我國的宮頸癌發(fā)病率 為12.96/10萬，死亡率為4.32/10萬，呈明顯增長趨勢。目前，宮頸癌的傳統(tǒng)治療方式主要有 手術(shù)治療、放療、化療等，但這些治療方法均存在著相對的不足。
[0003] 近年來，有學(xué)者通過利用不同的超聲物理學(xué)參數(shù)，不同種類的藥物載體如微泡、微 膠粒和脂質(zhì)體等，以及不同的超聲生物學(xué)效應(yīng)(高熱、聲孔效應(yīng)等），來驗證利用超聲給藥是 一種新型的有前途的給藥方式。超聲介導(dǎo)超聲微泡作為一種安全有效地給藥途徑，可以大 力推廣。近年，有國外學(xué)者采用可降解生物高分子聚合材料，制備的顯影效果好、抗壓性強 的新型高分子材料超聲微泡，可使藥物釋放時間及降解時間延長，并減少藥物毒性及對組 織的損傷，顯示出這類新型微泡對腫瘤靶向釋藥能力及藥物治療作用的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明利用超聲介導(dǎo)載紫杉醇微泡及載siRNA微泡，進行藥物靶向釋放，用于治療 宮頸癌的實驗研究。通過自制高分子材料PLGA為外殼，包裹紫杉醇及針對HPV16E6、E7特異 性的siRNA，制備載藥、載siRNA微泡，在體外作用于宮頸癌細胞，初步評價超聲介導(dǎo)載紫杉 醇及載siRNA微泡聯(lián)合應(yīng)用對宮頸癌的協(xié)同抑制效果，為進一步臨床應(yīng)用研究提供實驗依 據(jù)。
[0005] 方法：（1)利用改良型雙乳劑揮發(fā)法和低溫真空干燥技術(shù)，自制出載紫杉醇和載 siRNA的PLGA超聲微泡。（2)實驗將宮頸癌Caski細胞分為四組:空白對照組、載紫杉醇微泡 組、載siRNA微泡組、聯(lián)合載紫杉醇及載siRNA微泡組。按照最佳參數(shù)給予相同頻率及時間強 度的超聲輻照，48小時后，進行WB檢測凋亡蛋白、FCM檢測細胞凋亡率及細胞周期的改變，評 價超聲介導(dǎo)載紫杉醇微泡聯(lián)合載siRNA微泡對宮頸癌細胞協(xié)同抑制作用的效果。具體如下：
[0006] -種載紫杉醇和/或載siRNA微泡，載紫杉醇微泡為PLGA包裹紫杉醇微泡;載siRNA 微泡為PLGA包裹s i RNA微泡；載紫杉醇和s i RNA微泡為PLGA包裹紫杉醇微泡與PLGA包裹 siRNA微泡混合物。所述的載紫杉醇和siRNA微泡為PLGA包裹紫杉醇微泡與PLGA包裹siRNA 微泡的混合物。
[0007] 載紫杉醇和/或載siRNA微泡的制備方法，包括如下步驟：
[0008] (1)載紫杉醇微泡，取紫杉醇溶于聚乙二醇400作為內(nèi)水相(W〇,聚乳酸羥基乙酸 共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷作為油水相(0)，配置質(zhì)量濃度為0.2-0.3g/ml的聚乳酸羥基乙 酸共聚物二氯甲烷溶液;混合內(nèi)水相1和油水相0得到初乳(W/0)，配制質(zhì)量濃度為3-8%聚 乙烯水溶液作外水相(W2)，將外水相加入到初乳中，均質(zhì)機以lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速持續(xù)震蕩攪 拌3-8min乳化形成復(fù)乳(W/0/W)，磁力攪拌機攪拌，離心，洗滌，真空冷凍干燥，滅菌，收集滅 菌微泡粉末，即為載紫杉醇微泡。
[0009] (2)載siRNA微泡，將實驗所需的燒杯、離心管、玻璃棒以及滅菌后的物品放置于質(zhì) 量濃度為〇. 1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶;將DEPC水重懸siRNA，得 到已溶解的siRNA溶液；稱量聚乳酸羥基乙酸（PLGA)溶于二氯甲烷中，配置濃度為0.2-0.3g/ml的聚乳酸羥基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液;將已溶解的siRNA溶液加入到混合好的二 氯甲烷聚乳酸羥基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，均質(zhì)機以lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速持續(xù)震蕩攪拌 30-40s，形成乳白色油包水乳液，配制質(zhì)量濃度為3-8 %的聚乙烯PVA水溶液，為外水相;將 外水相加入到上述siRNA與PLGA乳白色油包水乳液，形成復(fù)乳，均質(zhì)機以lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速持 續(xù)震蕩攪拌3-8min，磁力攪拌機攪拌，離心，洗滌，真空冷凍干燥，滅菌，收集滅菌微泡粉末， 得到載siRNA微泡；
[0010] (3)載紫杉醇和SiRNA微泡，經(jīng)步驟（1)中的載紫杉醇微泡與步驟(2)中的載SiRNA 微泡混合得到。
[0011] 本發(fā)明將所述的載紫杉醇和/或載siRNA微泡在制備抑制宮頸癌的藥物上的應(yīng)用。 該應(yīng)用是超聲介導(dǎo)載紫杉醇和/或載siRNA微泡對宮頸癌Caski細胞的抑制。具體方法為:配 制濃度為2ug/ml的載紫杉醇微泡溶液，濃度為10ug/ml的載siRNA微泡溶液，及2ug/ml的載 紫杉醇微泡溶液與濃度為l〇ug/ml的載siRNA微泡溶液的混合液，將實驗分為四組:空白對 照組，載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組，載紫杉醇微泡及載siRNA微泡組，四組不同處理溶 液加入宮頸癌Caski細胞中，用頻率為1.5W/cm 2的超聲基因轉(zhuǎn)染儀輻照35s，將處理后的四 組24孔板放置C02細胞培養(yǎng)箱中，48h小時后，完成超聲介導(dǎo)載紫杉醇和/或載siRNA微泡對 宮頸癌Caski細胞。
[0012] 結(jié)果：（1)通過改良型雙乳劑揮發(fā)法和真空冷凍干燥技術(shù)，制備出載紫杉醇和載 siRNA的PLGA超聲微泡，形態(tài)規(guī)則呈球形，粒徑分布均勻，包封率達到89.58%，載藥率達到 11.86%，達到進一步實驗的要求。（2)與空白對照組相比，載紫杉醇微泡組宮頸癌Caski細 胞增殖受到一定程度抑制，載siRNA微泡組宮頸癌Caski細胞增殖有一定抑制，聯(lián)合載紫杉 醇及載siRNA微泡組宮頸癌Caski細胞增殖的抑制作用更加明顯；載紫杉醇組及載siRNA組 的Ba X、CaspaSe3促凋亡蛋白的表達均上調(diào)，聯(lián)合組的上調(diào)幅度更大(p〈0.05)，載紫杉醇組 及載siRNA組的Bcl2抑凋亡蛋白下調(diào)，聯(lián)合組的下調(diào)幅度更大(p〈0.05);流式細胞儀檢測空 白對照組、載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組、聯(lián)合組的細胞凋亡率分別為：（8.39 土 0·24)%、（21·56±2·20)%、（11·00±0·14)%、（27·9±0·76)%，與空白對照組相比，載紫 杉醇組與載siRNA組的凋亡率均增高，聯(lián)合組的凋亡率最高(ρ〈0.05);流式細胞儀檢測細胞 周期的變化顯示，載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組，聯(lián)合組阻滯在G2/M期細胞數(shù)目增加，其 中聯(lián)合組的阻滯在G2/M期細胞數(shù)目明顯高于其余三組(p〈0.05)。自制PLGA超聲微泡，其形 態(tài)、粒徑分布、包封率、載藥率達到實驗要求。體外實驗表明，超聲介導(dǎo)載紫杉醇及載siRNA 微泡對宮頸癌Caski細胞分別有一定的抑制作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用，其協(xié)同抑制宮頸癌Caski 細胞增殖的效果更好。本實驗研究結(jié)果為臨床上探索宮頸癌治療提供了一種新的思路。
【附圖說明】
[0013] 圖1為PLGA載紫杉醇微泡的掃描電鏡圖。
[0014] 圖2為PLGA載siRNA微泡的掃描電鏡圖。
[0015] 圖3為流式細胞儀檢測空白對照組、載紫杉醇微泡組、載s iRNA微泡組及載紫
[0016] 杉醇微泡聯(lián)合載SiRNA微泡組的細胞凋亡率（與空白對照組相比，*p〈0.05，**p〈 0.01)。其中，N為空白對照，P為載紫杉醇微泡組，S為載siRNA微泡組，PS為載SiRNA微泡組及 載紫杉醇微泡聯(lián)合載siRNA微泡組。
[0017] 圖4為流式細胞儀檢測空白對照組、載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組及載紫杉醇 微泡聯(lián)合載siRNA微泡組的細胞凋亡率。其中，N為空白對照，P為載紫杉醇微泡組，S為載 s iRNA微泡組，PS為載s iRNA微泡組及載紫杉醇微泡聯(lián)合載s iRNA微泡組。
[0018] 圖5為流式細胞儀分析空白對照組、載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組及載紫杉醇 微泡聯(lián)合載siRNA微泡組對細胞周期的影響。其中，N為空白對照，P為載紫杉醇微泡組，S為 載s iRNA微泡組，PS為載s iRNA微泡組及載紫杉醇微泡聯(lián)合載s iRNA微泡組。
[0019] 圖6為如8七6111131〇1:1:;[1^檢測1^1、0&8口&863、13(312的蛋白表達水平（噸〈0.05，林卩〈 0.01)。其中，N為空白對照，P為載紫杉醇微泡組，S為載SiRNA微泡組，P+S為載SiRNA微泡組 及載紫杉醇微泡聯(lián)合載siRNA微泡組。
[0020] 圖7為紫杉醇微泡、siRNA微泡及紫杉醇微泡聯(lián)合載siRNA微泡對Bax、CaspaSe3、 Be 12的蛋白表達水平的影響。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1
[0022]實驗瘤株人宮頸癌Caski細胞：由三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤微循環(huán)與免疫治療實驗室 保存。
[0023] 主要儀器及試劑儀器：數(shù)顯高速均質(zhì)機（上海）、冷凍干燥儀（PLPHA2-4LSC，德 國）、掃描電鏡(JSM-7500F、日本）、UGT1025超聲基因轉(zhuǎn)染治療儀(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué) 研究所研制）、幾_1177型激光粒度分布測試儀(成都精新粉體測試設(shè)備公司）。試劑:紫杉醇 原料(成都曼斯特）、siRNA合成(江蘇吉瑪基因股份有限公司）
[0024] PLGA載紫杉醇微泡制備稱取40mg紫杉醇溶于lml聚乙二醇400作為內(nèi)水相(I)， 取適量聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)溶于10ml二氯甲烷作為油水相(0)，配置質(zhì)量濃度為 0.2g/ml的聚乳酸羥基乙酸共聚物二氯甲烷溶液;混合1和0得到初乳(W/0)，配制質(zhì)量濃度 為3-8 %聚乙烯溶液作外水相(W2) 10ml，加入初乳中，均質(zhì)機乳化形成復(fù)乳(W/0/W)，磁力攪 拌機攪拌，離心，洗滌，真空冷凍干燥，滅菌，收集滅菌微泡粉末，即為載紫杉醇微泡。
[0025] PLGA載siRNA微泡制備將實驗所需的燒杯、離心管、玻璃棒滅菌后放置于0.1 %焦 碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶;將lml的DEPC水重懸10D的siRNA，得到已 溶解的siRNA溶液;稱量聚乳酸羥基乙酸(PLGA)溶于6ml二氯甲烷中，配置濃度為0.2g/ml的 聚乳酸羥基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液;將已溶解的s iRNA溶液lml加入到上述混合好的二氯 甲烷聚乳酸羥基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，超聲均質(zhì)機以lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速持續(xù)震蕩攪 拌30-40s，形成乳白色油包水乳液;配制質(zhì)量濃度為3-8 %PVA溶液10ml，為外水相;將外水 相加入到上述siRNA與PLGA混合液中，形成復(fù)乳，超聲均質(zhì)機以lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速持續(xù)震蕩攪 拌3-8min，磁力攪拌機攪拌，離心，洗滌，真空冷凍干燥，滅菌，收集滅菌微泡粉末。
[0026]微泡相關(guān)物理特性的檢測描電鏡觀察微泡形態(tài)，粒徑分布儀檢測微泡粒徑大小 和分布，紫外分光光度計分析紫杉醇濃度，計算：載藥量=(微泡中紫杉醇質(zhì)量/微泡總質(zhì) 量)X100 %、包封率=(微泡中紫杉醇質(zhì)量/投入紫杉醇總質(zhì)量)X100 %。
[0027] 實驗分組及處理觀察24孔板內(nèi)鋪的細胞，待細胞貼壁良好，長到70%左右時，進 行分組處理。根據(jù)前期實驗摸索及參考國內(nèi)外文獻，提前配制濃度為2ug/ml的載紫杉醇微 泡溶液，濃度為l〇ug/ml的載siRNA微泡溶液，及2ug/ml的載紫杉醇微泡溶液與濃度為10ug/ ml的載s iRNA微泡溶液的混合液。將實驗分為四組:空白對照組，載紫杉醇微泡組、載s iRNA 微泡組，載紫杉醇微泡組聯(lián)合載siRNA微泡組，四組不同處理溶液加入細胞中，用頻率為 1.5W/cm2的超聲基因轉(zhuǎn)染儀輻照35s。將處理后的四組24孔板放置⑶ 2細胞培養(yǎng)箱中，48h小 時后，通過Western Blot及流式細胞儀等檢測相關(guān)參數(shù)。
[0028] Western Blot檢測Caspase3、Bax、Bcl_2蛋白的表達提取細胞總蛋白，BCA方法進 行蛋白定量，加入同體積蛋白上樣緩沖液，沸水浴5min。取總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳， 轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉lh，加入兔抗人Bax抗體（1:800)、兔抗人Caspase3抗體（1: 800)、兔抗人Bcl-2抗體（1:800)，4°C過夜，分別加入HRP標記的羊抗兔IgG(l :50000)，顯色 液顯色，以β-actin為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)拍照。蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度/內(nèi)參灰 度。
[0029]流式檢測細胞凋亡使用沒有EDTA的0.25 %胰酶對細胞進行消化，終止消化后，收 集細胞，1500rpm，5min離心，去上清，加 PBS重懸。以1500rpm，5min的條件，用PBS將細胞潤洗 2次。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測，流式細胞儀上機檢測。
[0030] 流式檢測細胞周期使用沒有m)TA的0.25 %胰酶對細胞進行消化，終止消化后，收 集細胞，1500rpm，5min離心，去上清，加 PBS重懸。以1 OOOrpm，5min的條件離心，去上清液，重 懸細胞，緩慢加入預(yù)冷的80 %無水乙醇，使無水乙醇的終濃度為70 %。4 °C固定4小時以上。 以lOOOrpm，5min的條件離心，預(yù)冷PBS潤洗2次。加入100ul的RNase (50ug/ml)，37°C水浴處 理30min。加入400ul PI(50ug/ml)，4°C避光染色30min，流式細胞儀上機檢測。
[0031] 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用S±s表示，各組之間 的比較使用單因素方差分析，P〈〇.05為差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0032]自制高分子PLGA超聲微泡的形態(tài)觀察
[0033]制備出的PLGA載紫杉醇微泡及載siRNA微泡經(jīng)冷凍干燥后外觀為白色粉末狀，在 掃描電鏡下分別觀察載紫杉醇微泡，見圖1，與載siRNA微泡，見圖2。掃描電鏡下可見微泡形 態(tài)呈規(guī)則的圓球形，表面光滑，微泡的大小分布均一。
[0034]通過粒徑分布儀的數(shù)據(jù)計算出載紫杉醇微泡的粒徑大小約1.91 ±0.96um，載 siRNA微泡的粒徑大小約1.98±0.99um。通過紫外分光光度計的檢測，計算得出PLGA超聲微 泡的包封率為89.58 %，載藥率為11.86 %。
[0035]流式細胞術(shù)分析聯(lián)合微泡對細胞凋亡的影響
[0036] 通過流式細胞儀，用熒光標記試劑Annexin V-FITC/PI檢測實驗各組的凋亡率:空 白對照組的細胞凋亡率為（8.39 ± 0.24) %，載紫杉醇微泡組的細胞凋亡率為（21.56 土 2.20)%，載siRNA組微泡組的細胞凋亡率為（11.00 ±0.14) %，聯(lián)合組的細胞凋亡率為 (27.9 ±0.76) %，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)軟件分析，與空白對照組相比，載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡 組與聯(lián)合組的凋亡率均有統(tǒng)計學(xué)意義，（P〈〇.01)，其中，聯(lián)合組凋亡率最高，分別是單純載 紫杉醇微泡組及單純載siRNA微泡的1.3倍、2.5倍，見圖3、圖4。圖3為流式細胞儀檢測空白 對照組、載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組及載紫杉醇微泡聯(lián)合載siRNA微泡組的細胞凋亡 率(與空白對照組相比，*P〈0.05，#p〈0.01)。
[0037] 圖4為流式細胞儀檢測空白對照組、載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組及載紫杉醇 微泡聯(lián)合載s iRNA微泡組的細胞凋亡率。
[0038] 流式細胞術(shù)分析聯(lián)合微泡對細胞周期的影響
[0039]結(jié)果顯示，圖5為流式細胞儀分析空白對照組、載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組及 載紫杉醇微泡聯(lián)合載s iRNA微泡組對細胞周期的影響。結(jié)果表明載紫杉醇微泡組、載s iRNA 微泡組，聯(lián)合組阻滯在G2/M期的細胞數(shù)目增加，其中聯(lián)合組阻滯在G2/M期細胞數(shù)目明顯高 于其余三組。
[0040] Western Blotting檢測Bax、Caspase3、Bcl2三種凋亡蛋白的表達 [0041 ] 結(jié)果顯示，圖6為Western Blotting檢測1^1、〇38口&863、13(312的蛋白表達水平（*卩〈 0.05，**p〈0.01)。圖7為紫杉醇微泡、siRNA微泡及紫杉醇微泡聯(lián)合載siRNA微泡對Bax、 Caspa Se3、Be 12的蛋白表達水平的影響。載紫杉醇微泡組、載s iRNA微泡組，聯(lián)合微泡組，三 組的Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表達均上調(diào)，但聯(lián)合組的Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表達 更加明顯(P〈〇.01)。載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組，聯(lián)合組Bcl2抑凋亡蛋白的表達均下 調(diào)，但聯(lián)合組的Bcl2抑凋亡蛋白的下調(diào)更加明顯(p〈0.01)。
【主權(quán)項】
1. 一種載紫杉醇和/或載siRNA微泡，其特征在于，載紫杉醇微泡為PLGA包裹紫杉醇微 泡;載s i RNA微泡為PLGA包裹s i RNA微泡;載紫杉醇和s i RNA微泡為PLGA包裹紫杉醇微泡與 PLGA包裹s iRNA微泡混合物。2. 權(quán)利要求1所述的載紫杉醇和/或載siRNA微泡，其特征在于，載紫杉醇和siRNA微泡 為PLGA包裹紫杉醇微泡與PLGA包裹siRNA微泡的混合物。3. 權(quán)利要求1所述的載紫杉醇和/或載siRNA微泡的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 載紫杉醇微泡，取紫杉醇溶于聚乙二醇400作為內(nèi)水相(WD，聚乳酸羥基乙酸共聚物 (PLGA)溶于二氯甲烷作為油水相(0)，配置質(zhì)量濃度為0.2-0.3g/ml的聚乳酸羥基乙酸共聚 物二氯甲烷溶液;混合內(nèi)水相1和油水相0得到初乳(W/0)，配制質(zhì)量濃度為3-8%聚乙烯水 溶液作外水相(W 2)，將外水相加入到初乳中，均質(zhì)機以lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速持續(xù)震蕩攪拌3-8min乳化形成復(fù)乳(W/0/W)，磁力攪拌機攪拌，離心，洗滌，真空冷凍干燥，滅菌，收集滅菌微 泡粉末，即為載紫杉醇微泡。 (2) 載siRNA微泡，將實驗所需的燒杯、離心管、玻璃棒以及滅菌后的物品放置于質(zhì)量濃 度為〇. 1 %焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶;將DEPC水重懸siRNA，得到已 溶解的siRNA溶液;稱量聚乳酸羥基乙酸(PLGA)溶于二氯甲烷中，配置濃度為0.2-0.3g/ml 的聚乳酸羥基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液;將已溶解的siRNA溶液加入到混合好的二氯甲烷 聚乳酸羥基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，均質(zhì)機以lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速持續(xù)震蕩攪拌30-40s， 形成乳白色油包水乳液，配制質(zhì)量濃度為3-8 %的聚乙烯PVA水溶液，為外水相;將外水相加 入到上述siRNA與PLGA乳白色油包水乳液，形成復(fù)乳，均質(zhì)機以lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速持續(xù)震蕩攪 拌3-8min，磁力攪拌機攪拌，離心，洗滌，真空冷凍干燥，滅菌，收集滅菌微泡粉末，得到載 siRNA微泡； (3) 載紫杉醇和siRNA微泡，經(jīng)步驟（1)中的載紫杉醇微泡與步驟(2)中的載siRNA微泡 混合得到。4. 權(quán)利要求1-3任一項所述的載紫杉醇和/或載siRNA微泡在制備抑制宮頸癌的藥物上 的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用是超聲介導(dǎo)載紫杉醇和/或載siRNA微泡 對宮頸癌Caski細胞的抑制。6. 權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，超聲介導(dǎo)載紫杉醇和/或載siRNA微泡對宮頸癌 Caski細胞的方法為:配制濃度為2ug/ml的載紫杉醇微泡溶液，濃度為10ug/ml的載siRNA微 泡溶液，及2ug/ml的載紫杉醇微泡溶液與濃度為10ug/ml的載siRNA微泡溶液的混合液，將 實驗分為四組:空白對照組，載紫杉醇微泡組、載siRNA微泡組，載紫杉醇微泡及載siRNA微 泡組，四組不同處理溶液加入宮頸癌Caski細胞中，用頻率為1.5W/cm 2的超聲基因轉(zhuǎn)染儀輻 照35s，將處理后的四組24孔板放置C02細胞培養(yǎng)箱中，48h小時后，完成超聲介導(dǎo)載紫杉醇 和/或載siRNA微泡對宮頸癌Caski細胞。
【文檔編號】A61K31/337GK105997938SQ201610560044
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月15日
【發(fā)明人】趙云, 蘇子涵, 劉朝奇, 于嬌嬌, 胡兵
【申請人】三峽大學(xué)