一種雜帖類化合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雜帖類化合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用。具體涉及一種雜帖類化合物及其藥物組合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用。該應(yīng)用中的化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的雜帖類化合物，可以從干燥的蛇床子中提取、分離純化得到。本研究證實(shí)該化合物對(duì)破骨細(xì)胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在濃度依賴關(guān)系。應(yīng)用化合物(Ⅰ)治療以破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)為主的骨破壞性疾病有可能成為一種有前景的治療方法，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)成治療骨破壞性疾病的藥物。
【專利說(shuō)明】
一種雜帖類化合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從干燥的蛇床子中分離得到的一種雜帖類化 合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨骼通過(guò)破骨細(xì)胞(0C)的骨吸收和成骨細(xì)胞(0B)的骨形成來(lái)保持其動(dòng)態(tài)平衡，0C 是骨吸收的唯一細(xì)胞，它的增多或活性增強(qiáng)就會(huì)引起一些股破壞性疾病，例如骨質(zhì)疏松癥、 多發(fā)性骨髓瘤骨病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的骨破壞、腫瘤骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的骨破壞等。
[0003] 植物蛇床子為一年生草本植物，高30~80cm。莖直立，有分枝，表面有縱溝紋，疏生 細(xì)柔毛。葉互生，2~3回羽頭細(xì)裂，最終裂片線狀披針形，先端尖銳;基生葉有長(zhǎng)柄，柄基部 擴(kuò)大成鞘狀。復(fù)傘形花序頂生或腋生;總苞片8~10,線形;花白色，花柱基短圓錐形，花柱細(xì) 長(zhǎng)，反折。雙懸果寬橢圓形，果棱具翅?；ㄆ?~7月，果期6~8月。生于原野、田間、路旁、溪溝 邊等潮濕處。
[0004] 中藥蛇床子為傘形科(Umbelliferae)蛇床屬植物蛇床Cnidium monnieri (L.) Cuss.的干燥成熟果實(shí)。蛇床子性溫，味辛苦，有小毒。外用燥濕殺蟲(chóng)止癢，內(nèi)服溫腎壯陽(yáng)，祛 風(fēng)燥濕。用于治療陽(yáng)痿，宮冷，寒痹腰痛，外治滴蟲(chóng)性陰道炎，手、足癬感染等。國(guó)內(nèi)外關(guān)于蛇 床子藥理效應(yīng)的報(bào)道很多，涉及免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管、呼吸及生殖等系統(tǒng)，主要表現(xiàn) 為抗炎、抗過(guò)敏、中樞抑制、抗心律失常及抗腫瘤等作用。
[0005] 蛇床子主要含香豆素類化合物，此外還有色原酮類和苯并呋喃類化合物。蛇床子 揮發(fā)油中，相對(duì)含量較高的組分主要有倍半萜類，此外還有酯類和萜醇類化合物。大量研究 證明蛇床子的有效成分為香豆素類化合物，其中含量最高的兩種香豆素類化合物為蛇床子 素(Osthole，0st)、歐前古月素（Imperatorin，Imp) 〇
[0006] 因此Ost及Imp經(jīng)常作為評(píng)價(jià)不同來(lái)源地的蛇床子藥材的質(zhì)量及含蛇床子中成藥 的質(zhì)控指標(biāo)。由于〇st具有許多重要的藥理活性包括抗癌、抗增殖等活性，以及Imp具有抑制 癲癇發(fā)作、擴(kuò)張血管、抑制心肌肥大、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗微生物、影響藥物代謝酶活性等 多種藥理作用，而受到越來(lái)越多的關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的蛇床子中分離得到的一種雜帖類化合物及含 其的藥物組合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -種雜帖類化合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用，具有下述結(jié)構(gòu)式的化 合物(I)，
[0010] (I)
[0011] 上述應(yīng)用中，所述化合物（I)從干燥的蛇床子中分離得到，具體包含以下操作步 驟：（a)將干燥的蛇床子粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體 積，再用75 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏； (c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、65:1、30:1、15:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分 離，依次用體積比為25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d) 中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度 洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0012] 進(jìn)一步地，所述大孔樹(shù)脂為AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。
[0013] 進(jìn)一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為80%。
[0014] -種藥物組合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用，所述藥物組合物含有治 療有效量的所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0015] 本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì) 人和動(dòng)物無(wú)毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過(guò)口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無(wú)菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0019] 本發(fā)明的應(yīng)用能夠治療以破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)為主的骨破壞性疾病，實(shí)驗(yàn)表明化合 物（I)對(duì)破骨細(xì)胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在濃度依賴關(guān)系。應(yīng)用化合物（I)治療 以破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)為主的骨破壞性疾病有可能成為一種有前景的治療方法，可以用來(lái)開(kāi) 發(fā)成治療骨破壞性疾病的藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0021] 圖2為化合物（I)理論E⑶值與實(shí)驗(yàn)E⑶值比較。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0023]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0024] 試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0025]制備方法：（a)將干燥的蛇床子(8kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取(25LX3次），合 并提取液，濃縮至無(wú)醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽和的正 丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(351g)和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹(shù)脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用 75%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75%乙醇洗脫液，減壓濃縮得75%乙醇洗脫物浸膏（133g); (c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1(8個(gè)柱體積）、65:1 (8個(gè)柱體積）、30:1 (6個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱體積)和1:1 (5個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4(31g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為 25:1(8個(gè)柱體積）、15:1(10個(gè)柱體積)和5:1(6個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3 個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2(17g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度 為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合 物（I)(31mg)。
[0026] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z 359.1112，結(jié)合核磁特征可得分子式為 CuftioO?，不飽和度為8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ppm，DMS〇-d6，600MHz): H-2 (6 · 43，s)，H-5 (3.26，d，J=15.1)，H-5(2.65，d，J=15.1)，H-8(2.37，m)，H-8(2.25，m)，H-9(1.91，dd，J = 12.7,7.3)，H-9(1.35，m)，H-ll(3.81，s)，H-15(1.21，s)，H-16(1.29，s)a-OH(12.87，s)，4-OH(8 · 75，s)，6-OH(4 · 73，s)，3-0CH3(3 · 85，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)(ppm，DMS〇-d6，125MHz): 158.5(C3-C)，99.0(CH，2-C)，154.2(C，3-C)，138.7(C，4-C)，30.9(CH2,5-C)，89.8(C，6-C)，202.7(C，7-C)，24.6(CH2,8-C)，31.4(CH2,9-C)，64.3(C，10-C)，73.9(CH，11-C)，199.3 (C，12-C)，114.2(C，13-C)，122.6(C，14-C)，21.3(CH3，15-C)，16.7(CH 3，16-C)，56.1(CH3,3-〇CH3);碳原子標(biāo)記參見(jiàn)圖1。紅外光譜表明該化合物含有羥基基團(tuán)（3442CHT 1);此外該化合 物在373和294nm有紫外吸收，說(shuō)明含有多共輒結(jié)構(gòu)。13C NMR譜和HSQC譜顯示有17個(gè)碳信號(hào)， 分別為三個(gè)甲基(包括一個(gè)甲氧基），三個(gè)亞甲基，兩個(gè)次甲基(一個(gè)烯烴碳，一個(gè)含氧碳）以 及九個(gè)季碳(兩個(gè)羰基碳，兩個(gè)烯烴碳，兩個(gè)含氧季碳，三個(gè)烯烴含氧季碳）。另外，一個(gè)烯烴 質(zhì)子信號(hào) 5冊(cè).43(1!1，8，!1-2)，以及六個(gè)烯碳信號(hào)5(：158.5((：，1-〇,99.0(〇1，2-〇，154.2((：， 3-C)，138.7(C，4-C)，114.2(C，13-C)和 122.6(C，14-C)，表明該化合物含有一個(gè)五取代的苯 環(huán)結(jié)構(gòu)。HMBC譜中，羥基質(zhì)子0H12.87，s，l-〇H)與C-1，C-2，C-13以及SC199.3(s，12-C)的相 關(guān)性表明羰基碳(C-12)與苯環(huán)C-13位相連，該化合物在373和294nm的紫外吸收也驗(yàn)證了這 一結(jié)論。HMBC譜中，羥基質(zhì)子3!18.75(1!1，8,4-〇!〇與3(：138.7((：，4-〇，154.2((：，3-〇和122.6 (C，14-C);甲氧基質(zhì)子SH3.85(s，3-0CH 3)與C-3;以及H-2與C-3的相關(guān)性表明羥基和甲氧基 分別位于C-4和C-3位上。去除苯環(huán)和甲氧基的七個(gè)碳，剩余的10個(gè)碳原子形成了一個(gè)十元 環(huán)單萜結(jié)構(gòu)。此外，兩個(gè)含氧碳信號(hào)SC64.3(C，10-C)和73.9(CH，11-C)表明存在一個(gè)10,11-環(huán)氧基團(tuán)。HMBC譜中，!1-110!13.79,8)與(：-12和(：-1〇 ;!13-160!11.28,8)與(：-1〇和(：-16(3 C16.0)的相關(guān)性驗(yàn)證了上述推論。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類 型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過(guò)ECD試驗(yàn)確定，理論值與 實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0027]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0028] -、材料和儀器
[0029] SD雄性大鼠（4周齡)購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)，體重150g?；衔?(I)自制，HPLC歸一化純度大于98Ha，25(0H) 2D3購(gòu)于英國(guó)普利茅斯生物研究實(shí)驗(yàn)室。α-ΜΕΜ培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)GIBCOBRL。Soluble RANKL購(gòu)于英國(guó)Peprotec Science?？咕剖崴嵝?磷酸酶(TRAP)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。葡聚糖凝膠購(gòu)于上海如吉科技發(fā)展有限公司。標(biāo) 準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)于山東銀香偉業(yè)生物有限公司。注射用青霉素鈉購(gòu)于華北制藥有限公司。注 射用硫酸鏈霉素購(gòu)于深圳華藥南方制藥有限公司。丙酮、甲醛溶液購(gòu)于石家莊市有機(jī)化工 廠。異氟烷購(gòu)于魯南貝特制藥有限公司。二甲基亞砜購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。
[0030] BB5060/BB16二氧化碳培養(yǎng)箱（上海Heraeus公司），VD-650型桌上式細(xì)胞培養(yǎng)超凈 操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），BFX5-320型低速離心機(jī)（中國(guó)上海瀘南科學(xué)儀器聯(lián)營(yíng) 廠），XD-1019810倒置顯微鏡(江南公司），CX-21光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS)，微量加樣器(法 國(guó)GILSON)，2510型變頻振蕩儀(上海新波生物技術(shù)有限公司），GF-300型電子天(Japan A&D Company，limited)，725型超低溫冰箱(Forma Scientific · Inc)。未提到的材料和儀器均為 常規(guī)儀器。未提到的溶液配制均采用本領(lǐng)域常規(guī)溶液配制方法配制即可。
[0031] 藥液配制及葡聚糖凝膠柱的制備：
[0032] 1、α-ΜΕΜ培養(yǎng)液的制備：
[0033] (Ι)α-ΜΕΜ粉一袋+超純水800ml，完全溶解；
[0034] (2)加碳酸氫鈉3.02g待完全溶解后加鹽酸測(cè)PH達(dá)7.2;
[0035] (3)再次加超純凈水至1000ml;
[0036] (4)加抗生素(青霉素及鏈霉素）；
[0037] (5)濾過(guò)滅菌(0 · 22微米微孔濾膜過(guò)濾）
[0038] (6)500ml滅菌瓶分裝，4°C儲(chǔ)藏備用。
[0039] 2、la，25(0H)2D3 儲(chǔ)存液的分裝
[0040] (1)取la，25(0H)2D3原液50微升（50微升一支），加入無(wú)水乙醇1150微升，使總量至 1200微升（即24倍稀釋）
[0041 ] (2)以100微升/只分裝于12支滅菌試管內(nèi)，-30 °C冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br>[0042] (3)應(yīng)用前再次稀釋1000倍，使最終濃度為IX 10_8M。
[0043] 3、Soluble RANKL儲(chǔ)存液分裝
[0044] (1)取1^疆17東干粉一支(10微克）；
[0045] (2)0.1M tris-HCl buffer 5〇微升溶解RANKL;
[0046] (3)以5微升/只分裝于10支滅菌冷凍管內(nèi)，_30°C冰箱內(nèi)儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?br>[0047] (4)使用前取出一支，先用含10%FBSa-MEM培養(yǎng)液495微升溶解（即稀釋100倍）；添 加前再次稀釋100倍，使終濃度為20ng/ml。
[0048] 4、0· 1M tris-HCl buffer的制備
[0049] (l)tris-HCl 12.llg(0.1M)；
[0050] (2)超純水800ml(添加溶解后，調(diào)節(jié)pH至8.2);
[0051 ] (3)加超純水至1000ml備用。
[0052] 5、化合物（I)儲(chǔ)存液的制備
[0053] (1)儲(chǔ)存液的濃度：lmg/ml及 100ug/ml。
[0054] (2)儲(chǔ)存液的配制：稱取化合物（I)lmg放于滅菌冷凍管內(nèi)，加入二甲基亞砜lml完 全溶解，配成lmg/ml的儲(chǔ)存液。從lmg/ml的儲(chǔ)存液中取出100微升放于另一支滅菌冷凍管 內(nèi)，加入二甲基亞砜900微升即配成100微克/毫升的儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存于4°C恒溫冰箱，使用時(shí)間 不超過(guò)兩周。lmg/ml的儲(chǔ)存液冷凍保存。
[0055] 6、TRAP固定液的制備
[0056]在染色之前，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制。首先取無(wú)菌20ml試管一支，按以下順序依次加入 試劑:丙酮6.5ml、枸橡酸2.5ml、甲醛0.8ml，充分混勾，計(jì)9.8ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0057] 7、TRAP染色液的制備
[0058]同樣是在染色之前配制，按產(chǎn)品說(shuō)明制備，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0059] 8、葡聚糖凝膠柱的制備
[0060] (1)消毒后50ml注射器一個(gè)，除去內(nèi)芯；
[0061] (2)注射筒與注射頭交接處置消毒后的脫脂棉球一個(gè)；
[0062] (3)固定架固定針筒，針頭處接關(guān)閉狀的三通；
[0063] (4)將滅菌的葡聚糖凝膠混勻，抽取30ml注入針筒內(nèi)，打開(kāi)三通，緩慢過(guò)濾沉淀，待 凝膠沉淀液面至15ml時(shí)為止;關(guān)閉三通，放入4°C恒溫冰箱過(guò)夜；
[0064] (5)實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)用含有15 %胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液50ml緩慢注入凝膠柱內(nèi)，打 開(kāi)三通，自然過(guò)濾洗滌凝膠柱后待用。
[0065]二、試驗(yàn)方法 [0066] 1、全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)
[0067] 1.1全骨髓細(xì)胞提取
[0068]實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前30分鐘將標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清放入37 °C水浴箱內(nèi)解凍;取50mL無(wú)菌離心管一 個(gè)，裝入40mL不含胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液，以備沖洗全骨髓細(xì)胞用。
[0069] (1)選4周齡SD雄性大鼠1只，75%乙醇消毒后，采用異氟烷吸入麻醉；（2)待麻醉起 效后，無(wú)菌條件下取大鼠兩側(cè)脛骨和股骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔；（3)用10mL注射器抽取 不含血清的a-MEM培養(yǎng)液，換用25號(hào)針頭后自骨髓腔內(nèi)沖出骨髓細(xì)胞至50mL無(wú)菌離心管內(nèi)； (4)將所提取的細(xì)胞懸液充分吹打，待沒(méi)有團(tuán)塊后，將盛有細(xì)胞的離心管與平衡管一起放入 離心機(jī)內(nèi)離心，調(diào)整轉(zhuǎn)速(2000轉(zhuǎn)/分），離心5分鐘;離心過(guò)程中配制含有15%胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液50mL(7.5mL胎牛血清加入42.5mLa-MEM培養(yǎng)液中）備用；（5)離心結(jié)束后棄去上清 液，加入含15 %胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液20mL，充分吹打混勻，形成細(xì)胞懸液，此液簡(jiǎn)稱為細(xì) 胞原液。
[0070] 1.2細(xì)胞數(shù)的計(jì)算(原液濃度及稀釋倍數(shù)）
[0071] (1)取以上提取的細(xì)胞懸液25yL放入試管內(nèi)，然后加入5%醋酸475yL，即形成20倍 稀釋的細(xì)胞懸液;將試管放在振蕩器上，振蕩20秒鐘，目的是去除紅細(xì)胞；（2)計(jì)算細(xì)胞數(shù)： 取振蕩后細(xì)胞懸液滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)盤(pán)，勿超過(guò)邊緣，蓋玻片覆蓋，倒置顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞數(shù)， 計(jì)數(shù)盤(pán)4個(gè)大格內(nèi)所有細(xì)胞均計(jì)入。本實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞數(shù)為537個(gè)，根據(jù)公式(細(xì)胞數(shù)/4) X20 \104〇6 118/11^推算細(xì)胞原液的濃度，本實(shí)驗(yàn)計(jì)算如下（537/4)\20\ 104 = 26.85 \ 106cellS/mL即本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞原液濃度為26.85\106(^11 8/11^，而我們需要的目的濃度是2\ 106cellS/mL，所以細(xì)胞原液需要稀釋。（3)稀釋倍數(shù)計(jì)算如下:稀釋倍數(shù)=原液濃度/目的 濃度;本實(shí)驗(yàn)稀釋倍數(shù)=26.85 X 106cells/mL/2 X 106cells/mL= 13.425，即原液需要稀釋 13.425倍才能達(dá)到需要的目的濃度。本實(shí)驗(yàn)需要2\10%118/1^的細(xì)胞懸液4〇1!^，簡(jiǎn)稱為 目的量。（4)達(dá)到目的濃度所需原液的量，計(jì)算如下:達(dá)到目的濃度所需原液的量=目的量/ 稀釋倍數(shù)。本實(shí)驗(yàn)計(jì)算如下：達(dá)到目的濃度所需原液的量= 40mL/13.425￥2.98mL。即取 26 · 85 X 106cells/mL的細(xì)胞原液2 · 98mL放入滅菌的50mL離心管內(nèi)，然后加入37 · 02mL(40-2.98)含15%胎牛血清的€1-|^培養(yǎng)液即可配成2\106〇6118/1^的細(xì)胞懸液4〇1^，然后加入 la，25 (OH)2D3儲(chǔ)存液40yL，操作過(guò)程應(yīng)避光，即la，25(OH)2D 3終濃度為1 X 10-8M;再加入4yL soluble RANKL儲(chǔ)存液，即soluble RANKL終濃度為20ng/mL;加液過(guò)程在超凈工作臺(tái)上操 作，至此，所需2 X 106cel ls/mL的細(xì)胞懸液目的量配置完成。
[0072] 1.3培養(yǎng)細(xì)胞、加藥
[0073] (1)細(xì)胞接種：取4行6列24孔培養(yǎng)板一塊，每孔加入2X106cell S/mL的細(xì)胞懸液 O.SmLaxiOkellshU)加入化合物（I):取100yg/mL化合物（I)分裝液一支于培養(yǎng)板的第 2列分別加入2.5yL，每加一孔均需換一個(gè)吸頭;第3列每孔加入5yL;第4列每孔加入10yL。加 完第4孔后，將此液放入4 °C恒溫冰箱保存，取lmg/mL化合物(I)儲(chǔ)存液一支。第5列每孔加入 lmg/mL化合物（I)儲(chǔ)存液2.5yL;第6列每孔加入5yL。加完后剩余藥液放入4°C恒溫冰箱保 存。第一列不加藥物，作為對(duì)照組。至此在24孔培養(yǎng)板中化合物（I)每行都有6個(gè)濃度，分別 為0、0.5、1、2、5、10yg/mL，每個(gè)濃度每列4孔(η = 4)，第一列為對(duì)照組。（3)培養(yǎng)細(xì)胞:加完藥 后，將培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱內(nèi)，在37°C、5 %C02及飽和濕度條件下，培養(yǎng)7天。培養(yǎng)至第4天時(shí) 換培養(yǎng)液一次，按上述方法配制含有15%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液40m(16mL胎牛血清加入 34mLa-MEM培養(yǎng)液中），內(nèi)含10yL青霉素8yL鏈霉素(80萬(wàn)u青霉素，100萬(wàn)鏈霉素分別用2mL滅 菌蒸餾水溶解），加入4yL soluble RANKL儲(chǔ)存液，然后取1<1，25(0!〇2〇3儲(chǔ)存液4(^加入。從 培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)板后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每孔吸出舊培養(yǎng)液300此，加入 新培養(yǎng)液400yL，每吸出一列更換一次吸頭，每加一孔更換一次吸頭。換液完成后，將培養(yǎng)板 繼續(xù)放入C0 2培養(yǎng)箱內(nèi)，在37°C、5 %C02及飽和濕度條件下，再培養(yǎng)3天。
[0074] 2、破骨前驅(qū)細(xì)胞(P0C)培養(yǎng)
[0075] 2.1全骨髓細(xì)胞的提取:如同以上所述方法，制備全骨髓細(xì)胞懸液1.5mL。
[0076] 2.2非附著骨髓細(xì)胞的提取
[0077] (1)把用培養(yǎng)液沖洗過(guò)的凝膠柱，固定在固定架上；（2)緩慢向凝膠柱內(nèi)注入全骨 髓細(xì)胞1.5mL，打開(kāi)三通，緩慢過(guò)濾；待1.5mL全骨髓細(xì)胞滲入凝膠柱內(nèi)后，再緩慢注入含 15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培養(yǎng)液1 OmL。（ 3)收集含有非附著骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)液共計(jì)12-15mL，此 液稱為非附著骨髓細(xì)胞原液。
[0078] 2.3細(xì)胞數(shù)的計(jì)算(原液濃度及稀釋倍數(shù))及達(dá)到目的濃度所需原液的量
[0079] 如同以上所述方法，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，稀釋倍數(shù)，達(dá)到目的濃度所需原液的量。本實(shí)驗(yàn) 計(jì)算細(xì)胞數(shù)為337個(gè)，推算細(xì)胞原液的濃度為16.85\10 6(^118/1111;稀釋倍數(shù)為8.425，即細(xì) 胞原液需稀釋8.425倍才能達(dá)到需要的目的濃(2\10 6(^118/!111);達(dá)到目的濃度所需原液 的量4〇1111/8.425￥4.751111，即取4.751111細(xì)胞原液放入滅菌的5〇1111離心管內(nèi)，然后加入 35.251111(40-4.75)含15%胎牛血清的€[-]冊(cè)]\1培養(yǎng)液即可配成2\10 6〇6118/1111的目的細(xì)胞懸 液40ml，然后加入la，25(0H)2D3儲(chǔ)存液40ul，操作過(guò)程應(yīng)避光，即la，25(0H) 2D3終濃度為IX 10-8M;加入soluble RANKL儲(chǔ)存液4ul，即soluble RANKL終濃度為20ng/ml;加液過(guò)程均在超 凈工作臺(tái)上操作，至此，未附著骨髓細(xì)胞懸液目的量配置完成。
[0080] 2.4培養(yǎng)細(xì)胞及加藥如同前述。
[00811 3、倒置顯微鏡下觀察
[0082] 3.1倒置顯微鏡的調(diào)節(jié)
[0083] (1)將顯微鏡合軸；
[0084] (2)將視野光圈開(kāi)大至與聚光器光闌邊緣一致；
[0085] (3)將與物鏡放大倍數(shù)一致的相板放入聚光器中；
[0086] (4)把調(diào)中目鏡換到目鏡筒中，旋動(dòng)調(diào)中目鏡上的調(diào)焦環(huán)至相板相環(huán)的圖像清晰；
[0087] (5)調(diào)節(jié)聚光器上的相環(huán)調(diào)中旋鈕，使兩個(gè)圓環(huán)圖像重疊成同心圓狀態(tài)；
[0088] (6)用普通目鏡換下調(diào)中目鏡。
[0089] 3.2 TRAP染色
[0090] (1)培養(yǎng)7天后，將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，棄去培養(yǎng)液；（2)加入固定液0.4mL/孔， 固定1分鐘；（3)棄去固定液，蒸餾水沖洗四次；（4)加入染色液3-4滴/孔，用錫紙包裹培養(yǎng) 板；（5)在37°C、5 % C02及飽和濕度條件下孵育30分鐘后，取出培養(yǎng)板，棄去染色液，蒸餾水 沖洗四次，自然干燥。
[0091] 3.3觀察
[0092] 培養(yǎng)7天后將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，棄去培養(yǎng)液之前，在倒置顯微鏡下觀察不同 藥物濃度下細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及形態(tài)，決定是否染色。染色后帶染色液倒置顯微鏡下觀察染 色效果。
[0093] 4、光鏡觀察
[0094]帶染色液倒置顯微鏡下觀察后，棄去染色液，蒸餾水洗4次，自然干燥，普通光鏡下 觀察計(jì)算破骨細(xì)胞數(shù)。
[0095] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0096] 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)處理采用mean土SD表示，對(duì)不同藥物濃 度相同處理時(shí)間，各組與對(duì)照組之間比較，化合物（I)對(duì)破骨細(xì)胞形成及分化的影響，得出 的數(shù)據(jù)資料分析采用方差分析，從而得出藥效和藥物濃度的變化關(guān)系。
[0097]三、結(jié)果及結(jié)論
[0098] 在全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系中，0.5、1、2yg/mL組與對(duì)照組比較，TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞(3核 以上)數(shù)僅為對(duì)照組的49.04%、28.85 %、5.77 %，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，加藥組對(duì)破骨細(xì)胞的形成 有抑制作用，當(dāng)藥物濃度為lyg/mL時(shí)與對(duì)照組相比，對(duì)破骨細(xì)胞形成有顯著抑制作用（P< 〇.〇1)。見(jiàn)表1。
[0099] 在破骨前驅(qū)細(xì)胞培養(yǎng)系中，0.5、1、2、5yg/mL組與對(duì)照組相比，TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞 (單核或2核)數(shù)僅為對(duì)照組的85 · 11 %、65 · 79%、37 · 83 %、2 · 21 %，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，加藥組對(duì) 破骨前驅(qū)細(xì)胞的形成有抑制作用，當(dāng)藥物濃度為2yg/mL時(shí)與對(duì)照組相比，對(duì)破骨前驅(qū)細(xì)胞 形成有顯著抑制作用(P<〇.01)。見(jiàn)表2。
[0100] 結(jié)論，本研究結(jié)果表明化合物（I)對(duì)破骨細(xì)胞的分化及增殖具有抑制作用，且存在 濃度依賴關(guān)系。應(yīng)用化合物（I)治療以破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)為主的骨破壞性疾病有可能成為 一種有前景的治療方法。
[0101] 表1全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)系中TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞(3核以上)數(shù)
[0102]
[0103 ]表2破骨前驅(qū)細(xì)胞培養(yǎng)系中TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞(單核或2核)數(shù)
[0104] L0105J 實(shí)施例3
[0106] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I )，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0107] 實(shí)施例4
[0108] 口服液制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服 液。
[0109] 實(shí)施例5
[0110] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0111] 實(shí)施例6
[0112] 注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0113] 實(shí)施例7
[0114] 無(wú)菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無(wú)機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無(wú)菌注射用水 中，攪拌使溶，用無(wú)菌抽濾漏斗過(guò)濾，再無(wú)菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無(wú)菌熔封 得粉針劑。
[0115] 上述實(shí)施例的作用在于說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雜帖類化合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于，具有下述 結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，(I)2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述化合物（I)從干燥的蛇床子中分離得到，具 體包含以下操作步驟：（a)將干燥的蛇床子粉碎，用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液， 濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹(shù)脂除雜，先用 10 %乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用75 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得 75%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為 90 :1、65:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；（(1)步驟((3)中組分4 用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3 個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70% 的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述大孔樹(shù)脂為AB-8型大孔吸附樹(shù)脂。4. 根據(jù)2權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度 為 80 %。5. -種藥物組合物在制備治療骨破壞性疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于：其中含有治 療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61K31/336GK105997980SQ201610392034
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日
【發(fā)明人】武曉丹
【申請(qǐng)人】武曉丹