一種ebv lmp1蛋白的功能抑制劑及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明對(duì)天然小分子化合物EGCG與EB病毒致瘤蛋白LMP1的相互作用進(jìn)行了一系列研究，確定EBV LMP1可作為天然小分子化合物EGCG的分子靶標(biāo)，即，天然小分子化合物EGCG可作為EBV LMP1蛋白的功能抑制劑，為EGCG介導(dǎo)的腫瘤化學(xué)預(yù)防和治療效應(yīng)提供新的證據(jù)。
【專利說明】
一種EBV LMP1蛋白的功能抑制劑及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種EBV LMP1蛋白的功能抑制劑及應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)也稱為人類皰疹病毒4型，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤直接相關(guān)的病毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界超過90 %的人群感染過該病毒。國(guó)際癌癥研究署 (IARC)2008年發(fā)布的世界癌癥報(bào)告指出，EB病毒引發(fā)了全球癌癥的1%，占所有感染性癌癥的5.6 %。根據(jù)I ARC對(duì)致癌因子的分類標(biāo)準(zhǔn)，EB病毒被列在第一組致癌因子中。EB病毒與多種特定的人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，包括鼻咽癌、霍奇金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和胃癌等。美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)已將EBV列為減少全球癌癥負(fù)擔(dān)的重要因子。
[0003]在宿主細(xì)胞內(nèi)，EB病毒的感染方式可分為兩種形式:①潛伏感染，病毒基因組以環(huán)狀分子形式游離于細(xì)胞DNA細(xì)胞染色體之外，僅有少量的病毒基因表達(dá)，其基因組伴隨每個(gè)細(xì)胞周期復(fù)制一次，不釋放病毒。②裂解復(fù)制感染，也稱作生產(chǎn)性感染，病毒基因組以線型分子形式插入宿主細(xì)胞染色體DNA中，進(jìn)行完整的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和病毒裝配，并釋放病毒顆粒，導(dǎo)致細(xì)胞裂解。在EB病毒陽性腫瘤中，該病毒主要以潛伏狀態(tài)存在。
[0004]EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白。LMP1由386個(gè)氨基酸組成，包括 3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:①24個(gè)氨基酸殘基組成的胞漿氨基末端(N末端)；②6個(gè)疏水性跨膜區(qū) (25?186位氨基酸)；③200個(gè)氨基酸殘基組成的胞漿羧基末端(C末端)，其包含3個(gè)重要的C 末端激活結(jié)構(gòu)域(C terminal activating reg1ns，CTARs):CTARl、CTAR2和CTAR3。研究表明，LMP1通過其C末端CTARs募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor associated factors，TRAFs)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(TNFR associated dead domain protein，TRADDs)并組成性活化這些蛋白，介導(dǎo)LMP1胞衆(zhòng)信號(hào)通路的活化。LMP1通過激活陬-仙、從1(3/5141'、]\^?1(8(￡?duì)睢ⅲ?8和見1〇、？131(/^肚等信號(hào)通路， 影響上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體、抗凋亡基因bcl-2和survivin以及與細(xì)胞周期相關(guān)的基因 cyclinDl、⑶K4和P53等，控制細(xì)胞的增殖和凋亡，使上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，從而誘發(fā)腫瘤的形成。此外，LMP1促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移因子E-cadherin、ICAMl、MMP9以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)， 在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。由于LMP1在EBV陽性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移多階段具有重要功能，已被確定為鼻咽癌存活的標(biāo)志物。因此，EBV LMP1已成為EBV陽性腫瘤的治療靶點(diǎn)。
[0005]表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigall〇CateChingallate，EGCG)，又稱為表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯，是一種從綠茶中提取的多酚類化合物。EGCG的化學(xué)式是C22H18〇n，分子量為458.4,是一種具有抗氧化、抗腫瘤和抗病毒等多種生物活性的小分子化合物。研究表明，EGCG可調(diào)節(jié)酶活性及信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和周期阻滯，并通過抑制腫瘤新生血管的生成，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的功能，從而在多階段發(fā)揮抗腫瘤功能，在腫瘤化學(xué)預(yù)防以及治療中發(fā)揮重要作用。研究揭示，EGCG對(duì)其分子靶標(biāo)的結(jié)合是EGCG抗腫瘤活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，高親和力的EGCG結(jié)合蛋白可能是EGCG的直接作用靶標(biāo)。目前，已經(jīng)鑒定了EGCG的多個(gè)分子祀標(biāo)，如脂後膜分子laminin和67-kDa laminin受體、 vimentin、胞漿蛋白ZAP-70、Fyn以及分子伴侶GRP-78等，這些分子靶標(biāo)多為細(xì)胞膜蛋白或其受體，與EGCG具有較高的親和力。研究證實(shí)，腫瘤病毒可以編碼相應(yīng)的致瘤蛋白，并通過與宿主細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白相互作用影響其正常的功能，以誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。因此，發(fā)現(xiàn)EGCG 的病毒編碼分子靶標(biāo)將對(duì)腫瘤化學(xué)預(yù)防和治療以及針對(duì)其分子靶標(biāo)開發(fā)新抗腫瘤藥物提供新的重要啟示。
[0006]EGCG是具有廣譜抗腫瘤活性的天然小分子化合物，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤、人結(jié)腸癌、胰腺癌以及人頭頸部腫瘤等均有抑制生長(zhǎng)的作用。在不同類型的腫瘤中，EGCG發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制不盡相同。此外，EGCG具有抗病毒活性，其抗病毒譜涵蓋多個(gè)病毒家族，包括EBV， HIV，HCV等多種重要的人類致瘤病毒。因此，對(duì)EBV引發(fā)的腫瘤，EGCG的抗病毒活性是發(fā)揮其抗腫瘤作用的重要方式。國(guó)際癌癥研究署(IARC)2008年發(fā)布的世界癌癥報(bào)告指出，EB病毒引發(fā)了全球癌癥的1%，占所有感染性癌癥的5.6%，說明不是所有的腫瘤均由病毒感染引發(fā)。對(duì)于致病機(jī)理與病毒感染無關(guān)的腫瘤而言，EGCG的抗腫瘤活性則需要通過其他途徑實(shí)現(xiàn)。EGCG的抗腫瘤機(jī)制包括:作為抗氧化劑，減少R0S產(chǎn)生抑制腫瘤的發(fā)展;結(jié)合并調(diào)節(jié)能夠影響細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖相關(guān)酶(如MAPKs、MMPs等)、受體(如EGFR、IGF-1R、HGFR等)和信號(hào)分子 (如Bcl2和Vimentin)的活性。目前，EGCG的臨床效果與抑制EBV裂解復(fù)制有關(guān)，其能夠抑制腫瘤患者外周血中的EBV抗體滴度和DNA拷貝數(shù)。但是，EGCG抑制EBV裂解復(fù)制機(jī)制的研究還較少。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]我們通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LMP1不僅能夠介導(dǎo)EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而且能夠促進(jìn)EBV的裂解復(fù)制。本發(fā)明對(duì)天然小分子化合物EGCG與EB病毒致瘤蛋白LMP1的相互作用進(jìn)行了一系列研究，確定EBV LMP1可作為天然小分子化合物EGCG的分子靶標(biāo)，S卩，天然小分子化合物EGCG可作為EBV LMP1蛋白的功能抑制劑，為EGCG介導(dǎo)的腫瘤化學(xué)預(yù)防和治療效應(yīng)提供新的證據(jù)。
[0008]為明確EGCG結(jié)合LMP1，本發(fā)明首先利用熒光光譜法分析了二者之間的相互作用性質(zhì)。觀察熒光光譜發(fā)現(xiàn)，隨著LMP1蛋白溶液中EGCG濃度的提高，LMP1的內(nèi)源熒光逐漸淬滅。 根據(jù)EGCG對(duì)LMP1內(nèi)源熒光的淬滅機(jī)理，測(cè)得兩者在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)均大于生物大分子熒光平均壽命，確定EGCG對(duì)LMP1的淬滅為靜態(tài)過程，從而排除了二者的相互作用為動(dòng)態(tài)碰撞。通過進(jìn)一步分析，判斷EGCG與LMP1的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約等于1。[00〇9] 本發(fā)明隨后利用pul 1-down親和層析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證EGCG與LMP1的結(jié)合作用。經(jīng)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，1.EGCG能夠捕獲細(xì)胞蛋白裂解液中的LMP1; 2.EGCG可結(jié)合純化的 LMP1蛋白。
[0010]為確定LMP1是EGCG的分子靶標(biāo)，本發(fā)明借助等溫滴定量熱(iso thermal titrat1n calorimetry，ITC)技術(shù)明確EGCG結(jié)合LMP1的熱力學(xué)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG 與LMP1的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.05，Kd值為0.36yM，確定LMP1為EGCG的高親和蛋白。[〇〇11]最后，本發(fā)明利用細(xì)胞增殖能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證EGCG靶向LMP1的抗腫瘤效應(yīng)。結(jié)果顯示，在EGCG生理濃度(lyM)作用下，LMP1陽性的鼻咽癌細(xì)胞系與陰性細(xì)胞系相比，增殖能力受到明顯的抑制。[0〇12]已發(fā)現(xiàn)的EGCG靶標(biāo)都是由人類細(xì)胞表達(dá)，大多數(shù)定位于細(xì)胞質(zhì)膜，例如EGFR、Fas、 Vimentin、IGF-1 受體、Laminin、67kDa Laminin receptor、Fibronectin、Fibrinogen和 Histindine-rich glycoprotein。另外，還有少數(shù)的革E標(biāo)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，包括GRP-78、 ZAP-70和Fyn。本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)的EGCG新靶標(biāo)LMP1是致瘤病毒EBV編碼的潛伏膜蛋白，其6個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域錨定于宿主細(xì)胞質(zhì)膜，該靶標(biāo)是一個(gè)組成型活化的蛋白，持續(xù)性地活化相關(guān)的致瘤信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，天然小分子化合物EGCG是一種EBV LMP1蛋白的功能抑制劑，通過靶向LMP1對(duì)EBV陽性腫瘤的化學(xué)預(yù)防與治療具有較好的發(fā)展前景。【附圖說明】[〇〇13]圖la顯示了天然小分子化合物EGCG對(duì)EB病毒致瘤蛋白LMP1的熒光淬滅效應(yīng)，圖lb 和圖lc顯示了EGCG對(duì)LMP1熒光淬滅的Stern-Volmer曲線；圖lc顯示了EGCG對(duì)LMP1熒光淬滅的雙對(duì)數(shù)圖；[〇〇14]圖2a顯示了 EGCG與AGS-EBV(EB病毒陽性胃腺癌細(xì)胞系)和B95-8 (EB病毒陽性狨猴淋巴瘤細(xì)胞系)細(xì)胞裂解液中的LMP1的結(jié)合;圖2b顯示了EGCG與純化的LMP1蛋白的結(jié)合；
[0015]圖3顯示了EGCG與LMP1結(jié)合的熱力學(xué)特征及相關(guān)參數(shù)；[〇〇16]圖4a和4b分別顯示了 EGCG對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系CNE1-LMP1以及胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS-EBV增殖能力的抑制效應(yīng)?！揪唧w實(shí)施方式】[0〇17]本發(fā)明所用細(xì)胞系B95-8(ATCC;CRL 1612)來自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏所(AmericanType Culture Collect1n,ATCC);胃腺癌細(xì)胞系A(chǔ)GS-EBV來自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);CNE1和CNE1-LMP1由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所建系。[〇〇18]實(shí)施例1熒光光譜法檢測(cè)EGCG與LMP1的相互作用。
[0019]蛋白質(zhì)分子中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸而產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光。熒光猝滅劑與熒光物質(zhì)相互作用而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象稱為熒光猝滅作用。熒光猝滅作用因猝滅機(jī)制不同可分為動(dòng)態(tài)熒光猝滅和靜態(tài)熒光猝滅。以此原理為基礎(chǔ)的熒光光譜法是研究生物大分子與小分子、離子相互作用的重要手段。
[0020]實(shí)驗(yàn)方法如下:在25°C和37°C條件下，分別在比色杯加入一定摩爾濃度梯度(0? 75yM)的EGCG和純化的LMP1蛋白溶液(加入的EGCG體積不超過溶液總體積的1.5%，此時(shí)體積影響較小，可以忽略體積效應(yīng)，即純化的LMP1蛋白溶液濃度保持不變)，定容后混勻;設(shè)置熒光光譜儀激發(fā)波長(zhǎng)為以lx = 280nm，狹縫寬度5nm，在300?450nm范圍內(nèi)掃描LMP1的熒光光譜以及LMP1在EGCG作用下的熒光淬滅光譜，并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。[〇〇21]通過處理數(shù)據(jù)，疊加熒光光譜，獲得EGCG對(duì)LMP1的熒光淬滅光譜。結(jié)果如圖la。根據(jù)熒光光譜峰值和對(duì)應(yīng)的EGCG濃度，分別用Stern-Volmer方程和雙對(duì)數(shù)方程等處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(結(jié)果見圖lb和圖lc，證實(shí)了在實(shí)驗(yàn)濃度和溫度范圍內(nèi)，EGCG能夠與LMP1形成復(fù)合物，弓丨起靜態(tài)熒光猝滅；并得到了在25°C和37°C下結(jié)合反應(yīng)的相關(guān)參數(shù):25°C和37°C時(shí)LMP1對(duì) EGCG的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.8551和0.9283，約等于1;對(duì)于n?1，即當(dāng)熒光體與猝滅體之間形成不發(fā)焚光的1:1型復(fù)合物時(shí)，靜態(tài)猝滅滿足Lineweaver-Burk方程，求得結(jié)合常數(shù)Ka = 4.4X104(mol/L)_1〇
[0022]實(shí)施例2Pull-down親和層析實(shí)驗(yàn)確定EGCG結(jié)合LMP1蛋白。[〇〇23] 操作步驟如下:
[0024]將制備好的總蛋白(含LMPl)500yg(或者純化的LMP1蛋白單體)與50yl EGCG-Sepharose 4B(或者與50yl Sepharose 4B，作為陰性對(duì)照)置于反應(yīng)Buffer(50mmol/L Tris(pH 7.5)，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，lmmol/L DTT，0.01%Ninidet P-40， 0.02mmol/L Phenylmethylsulfonyl fluoride ,4Ag/mL bovine serum albumin ,IX protease inhibitor cocktail)中，于4°C輕輕振搖、孵育過夜。次日，珠子以Washing Buffer([50mmol/L Tris(pH 7.5)，5mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，lmmol/L DTT,0.01% NP40,0? 02mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride])洗5次以去除未結(jié)合的蛋白。加入適量的SDS上樣緩沖液，沸水浴5min，13000rpm離心5min，取上清上樣，在不連續(xù)SDS變性凝膠中分離，將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，然后膜與EB 病毒LMP1—抗4°C孵育12h，PBST洗滌;二抗室溫孵育2h，PBST洗滌，加入化學(xué)發(fā)光底物，于凝膠及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，拍照記錄圖像。結(jié)果見圖2a和圖2b。[〇〇25]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGCG直接結(jié)合EB病毒陽性細(xì)胞系總蛋白裂解液中的LMP1，也可結(jié)合體外表達(dá)純化的LMP1單體蛋白。
[0026]實(shí)施例3EGCG與LMP1結(jié)合的ITC曲線，以及由實(shí)測(cè)ITC曲線積分得到的結(jié)合反應(yīng)熱對(duì)EGCG與蛋白摩爾比的非線性擬合曲線。[〇〇27]等溫滴定量熱技術(shù)是一種原位、在線和無損傷地研究生物熱力學(xué)與生物動(dòng)力學(xué)的重要方法。它通過類似化學(xué)滴定的方法，記錄反應(yīng)熱流隨時(shí)間的變化，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好和原位在線不干擾研究反應(yīng)的特點(diǎn)，是目前最準(zhǔn)確、應(yīng)用最多的熱力學(xué)方法之一。常應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-小分子相互作用以及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)等。[〇〇28] 操作步驟如下:[〇〇29]在25°C時(shí)，EGCG與LMP1相互作用的熱力學(xué)性質(zhì)的測(cè)定在美國(guó)TA公司生產(chǎn)的等溫滴定微量熱儀Nano ITC上進(jìn)行。滴定實(shí)驗(yàn)中，將100yM EGCG溶液裝入50yl的滴定注射器，4.5y M LMP1純化蛋白溶液放入lml的樣品池，攪拌器以300r/min的速度攪拌，每間隔200s加入 2.5yl EGCG溶液到LMP1溶液中，共滴定20次。參比池中加入去離子水作為樣品池的熱平衡參照。另做一空白實(shí)驗(yàn)以扣除EGCG稀釋熱的影響，即在樣品池中加入緩沖液，用100yM EGCG 溶液滴定。LMP1的稀釋熱經(jīng)測(cè)定非常小，可略去。所有的溶液都在25°C條件下真空脫氣處理以減小信號(hào)噪音。積分每個(gè)峰面積并扣除稀釋熱后得到結(jié)合反應(yīng)熱，對(duì)EGCG與LMP1的摩爾比作圖得到反應(yīng)等溫線。以TA公司提供的Nano Analyze數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)等溫線中的獨(dú)立結(jié)合位點(diǎn)模型進(jìn)行非線性最小方差擬合，可計(jì)算出EGCG與LMP1相互作用的本征解離常數(shù)Kd、 本征摩爾結(jié)合焓A H、反應(yīng)熵變A S和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果見圖3。
[0030]結(jié)果顯示，EGCG與LMP1結(jié)合的Kd值為0.36yM，為高親和性結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.05〇[〇〇31]實(shí)施例4LMP1的表達(dá)增強(qiáng)EGCG對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力的抑制效應(yīng)。[〇〇32]取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用含EDTA的胰酶于37°C消化，制成細(xì)胞懸液，以每孔2 X 1〇4個(gè)細(xì)胞接種到24孔板中，接種體積為500yl; 37 °C、5 % C02培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁。在37 °C、 5%C02培養(yǎng)條件下，以DMS0(對(duì)照組)和EGCG的生理濃度(lyM)分別處理兩種細(xì)胞系，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)5天。處理完畢后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。結(jié)果見圖4a和4b。
[0033] 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，lyM的EGCG能夠明顯抑制CNE1-LMP1和AGS-EBV細(xì)胞的增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*代表P<〇.〇5，***代表P<0.001)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種EBV LMP1蛋白的功能抑制劑，其特征在于，所述功能抑制劑為天然小分子化合 物EGCG。2.天然小分子化合物EGCG在制備EBV LMP1蛋白功能抑制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105997987SQ201610328003
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月17日
【發(fā)明人】曹亞, 李弘德, 羅湘建
【申請(qǐng)人】中南大學(xué)