Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2-甲硫基乙基)胺基衍生物的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2?甲硫基乙基)胺基衍生物的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2?甲硫基乙基)胺基衍生物的組合物、制備方法及其在制備抗菌藥物上的用途。本發(fā)明公開了一種Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2?甲硫基乙基)胺基衍生物的組合物及其制備方法。藥理學(xué)實驗表明，本發(fā)明的組合物具有抗菌作用，具有開發(fā)抗菌藥物的價值。
【專利說明】
Sa I v i sk i none A的苯并咪唑基和二(2-甲硫基乙基)胺基衍生 物的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 致病菌的擴(kuò)散及其耐藥性的增強(qiáng)嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命，抗菌藥物已作為 常規(guī)用藥廣泛用于艾滋病、器官移植以及慢性消耗性疾病(如癌癥、糖尿病、尿毒癥等)的治 療，雖然目前臨床上使用的抗菌藥劑(如酮康唑、阿米卡星、慶大霉素、活力康唑、伊曲康唑、 特比萘芬、二性霉素、氟康唑等)對皮膚及淺表部位感染的療效較好，但這些抗菌藥物的蓄 積毒性較強(qiáng)，常常引起肝腎損傷、消化道刺激、頭暈、過敏等，所以尋找作用機(jī)理獨特的新型 抗菌藥物成為當(dāng)今藥物研發(fā)的熱點之一。
[0003] 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭氏陰性螺旋狀細(xì)菌。研究顯 示，幽門螺桿菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指腸潰瘍的主要致病原因，并可能與胃癌和胃 粘膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤發(fā)病有關(guān)。最近，世界衛(wèi)生組織將Hp歸為I類致癌 物，它在胃癌發(fā)展中起主導(dǎo)作用。目前流行的治療Hp感染的方案是同時服用質(zhì)子栗抑制劑 (PPI)加兩種抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四環(huán)素、甲硝唑等選二種）的三聯(lián)療法。影響三聯(lián) 療法的最主要因素被認(rèn)為是Hp對抗菌劑的耐藥性;另一嚴(yán)重問題是質(zhì)子栗抑制劑會誘發(fā)消 化不良，大量抗菌劑則導(dǎo)致消化道內(nèi)菌群的嚴(yán)重毀滅。因此，尋找高效、安全的抗Hp活性一 類新藥物成為一個重要和迫切的任務(wù)。
[0004] 近年來全球結(jié)核病的發(fā)病呈增高趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計，目前全球受結(jié) 核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染的人口占世界人口的三分之一，其中 5~10%的感染者成為結(jié)核病患者。我國每年出現(xiàn)活動性肺結(jié)核病人130萬例，其中傳染性 肺結(jié)核約60萬例，其中傳染性肺結(jié)核約60萬例，是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。
[0005] 自抗結(jié)核藥物相繼問世，使結(jié)核病的治療起到劃時代的變化。然而由于結(jié)核病患 者的治療管理尚不十分規(guī)范，不規(guī)則化療，濫用抗結(jié)核藥物，使結(jié)核病耐藥情況日益嚴(yán)重， 且耐藥性的變化更趨向于多種藥物同時耐藥，這給結(jié)核病的防治工作造成極大困難。因此 尋找新的抗結(jié)核藥物，尤其是抗多藥耐藥性的抗結(jié)核藥物對保護(hù)人民身體健康，具有重要 意義。
[0006] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
[0007] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個2011年發(fā)表（Ayumi Ohsaki et al.， 20 11 ·Sa 1 viskinone A，a diterpene with a new skeleton from Salvia przewalskii .Tetrahedron Letters 52(2011)1375-1377)的化合物，我們對化合物I進(jìn)行 了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV 制備了組合物并對該組合物抗菌活性進(jìn)行了評價，其具有抗菌活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為65%和35%。
[0011] 本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
[0012] 藥效學(xué)實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗菌作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受 的鹽具有同樣的藥效。
[0013] 進(jìn)一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強(qiáng)的抗人體真菌活性，因此本發(fā) 明的組合物有望被用于制備新型抗人體真菌藥物。
[0014] 進(jìn)一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強(qiáng)的抗幽門螺旋桿菌活性，說明 對于與幽門螺旋桿菌密切相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來講，組合物是一 個極具開發(fā)潛力的化合物。它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。
[0015] 進(jìn)一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強(qiáng)的抑制大腸桿菌、熒光假單孢 菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌的作用，所以組合物可作為具有抗細(xì)菌作用的化 合物，并有望在制備抗細(xì)菌藥物中得到應(yīng)用。
[0016]進(jìn)一步的，根據(jù)初步試驗的結(jié)果，本發(fā)明用固體培養(yǎng)基稀釋法測定了組合物對卡 介苗、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株和耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR MTB)三種結(jié)核菌的最小抑 菌濃度，實驗結(jié)果證實組合物具有很強(qiáng)的抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié) 核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物。
[0017]以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1化合物Salviskinone A的制備
[0019] 化合物Salviskinone A(I)的制備方法參照Ayumi Ohsaki等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Ayumi Ohsaki et al.,2011.Salviskinone A,a diterpene with a new skeleton from Salvia przewalskii .Tetrahedron Letters 52(2011)1375-1377)的方法。
[0020]
[0021] 實施例2 Salviskinone A的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0022] 將化合物I (312mg，1 · OOmmo 1)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙烷(3.76(^，20.00111111〇1)和61^的50%氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏 度攪拌12Κ12?!之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然 后對有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌4次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除 溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100:1.5，v/v)， 收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(327mg，78% )。
[0023] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)S6.63(s，lH)，6.37(s，lH)，5.81(s，lH)，4.51(s，2H)， 3.84(s，1H)，3.79(s，2H)，2.15(s，1H)，2.04(s，1H)，1.91(s，1H)，1.65(s，1H)，1.39(s，3H)， 1.08(s,6H),0.99(s,6H).
[0024] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)5l88.07(s),183.70(s),154.38(s),147.57(s),140.21 (s),136.40(s),134.71(s),131.25(s),128.40(s),118.83(s),72.12(s),45.49(s),37.54 (s),33.58(s),31.78(s),26.17(s),25.12(s),24.66(s),23.51(s),23.17(s),22.65(s).
[0025] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for C22H28Br03:419.1222；found 419.1220.
[0026] II
[0027] 實施例3 Salviskinone A的0-(苯并咪唑基）乙基衍生物（III)的合成 [0028] 將化合物II(209mg，0.5mmo 1)溶于20mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg， 2 · 5mmol)，鵬化鉀(84mg，0 · 5mmol)和苯并咪唑（1180mg，lOmmol)，混合物加熱回流5h。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮 即得到化合物ΠI的棕色固體(215mg，43 % )。
[0029] 咕匪R(500MHz，DMS0-d6)S8.15(s，1H)，7.54((1, J = 25.0Hz，2H)，7· 15(s，lH)， 7.06(s，lH)，6.33(d，J = 84.1Hz，lH)，6.26(s，lH)，5.66(s，lH)，4.38(d，J=15.8Hz，4H)， 3.57(s，1H)，1.96(s，1H)，1.90(s，1H)，1.77(s，1H)，1.51(s，1H)，1.20(s，3H)，0.99(s，6H)， 0.81(s,6H).
[0030] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)Sl87.90(s),183.51(s),154.17(s),147.37(s),146.27 (s),139.98(s),139.63(s),136.22(s),134.51(s),133.48(s),131.05(s),128.18(s), 123.93(s),123.35(s),118.56(d,J=9.6Hz),110.85(s),68.55(s),45.29(s),44.74(s), 37.34(s),33.36(s),25.96(s),24.94(s),24.46(s),23.32(s),22.96(s),22.42(s).
[0031] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C29H33N2〇3:457.2491;found:457.2493〇
[0032]
[0033] 實施例4 Salviskinone A的0-(二輕乙胺基）乙基衍生物的合成
[0034] 將化合物II(209mg，0.5mmo 1)溶于30mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg， 5.0mmol)，碘化鉀（252mg，1.5mmol)和二乙醇胺（1051mg，lOmmol)，混合物加熱回流9h。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和 食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn) 物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100:0.5，v/v)，收集黃色集中洗脫帶 并揮去溶劑即得到Salviskinone A的0-(二輕乙胺基）乙基衍生物的淡黃色固體（159.5mg, 72%)。
[0035] 4 MMR(500MHz，DMS0-d6)S6.52(s，lH)，6.40(s，lH)，5.71(s，lH)，4.15(s，2H)， 3.70(s，1H)，3.37(s，4H)，3.00(s，2H)，2.50(s，4H)，2.07(s，1H)，1.96(s，1H)，1.83(s，1H)， 1.57(d ,J = 1.4Hz,3H),1.30(s,3H),0.99(s,6H),0.90(s,6H).
[0036] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)Sl88.01(s),183.52(s),154.08(s),147.15(s),140.11 (s),136.23(s),134.42(s),130.84(s),128.31(s),118.62(s),68.93(s),58.73(s),56.61 (s),53.94(s),45.20(s),37.13(s),33.49(s),25.96(s),24.84(s),24.26(s),23.43(s), 22.97(s),22.33(s).
[0037] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H38N〇5:444.2750;found:444.2746〇
[0038]
[0039] Salviskinone A的
0_(二羥乙胺基）乙基衍生物
[0040] 實施例5 Salviskinone A的0-(二氯乙胺基）乙基衍生物的合成
[0041 ] 將實施例4制備的Salviskinone A的0-(二羥乙胺基）乙基衍生物（0.222g， 0 · 5mmol)溶于6mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(0 · 238g，2mmol)，反應(yīng)物加熱回流lh。將反應(yīng)物 冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化 (石油醚/丙酮100:0.3，v/v)，得到Salviskinone A的0-(二氯乙胺基）乙基衍生物的淡黃色 固體（170.0mg，71%)。
[0042] 4 NMR(500MHz，Chloroform-dl)S6.51(s，lH)，6.22(s，lH)，5.72(s，lH)，4.16(s， 1H)，3.66(s，1H)，3.44(s，4H)，3.01(s，2H)，2.80(s，2H)，2.64(s，2H)，2.04(s，1H)，1.98(s， 1H)，1.85(s，1H)，1.59(s，1H)，1.28(s，3H)，0.97(s，6H)，0.93(s，6H).
[0043] 13C NMR(125MHz，DMS0-d6)Sl87.90(s),183.41(s),153.97(s),147.04(s),140.00 (s),136.12(s),134.31(s),130.73(s),128.20(s),118.51(s),68.82(s),55.57(s),53.94 (s),45.20(s),39.10(s),37.02(s),33.39(s),25.87(s),24.76(s),24.19(s),23.33(s), 22.88(s),22.25(s).
[0044] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C26H36Ci2N03:480.2072;found:480.2070〇
[0045]
[0046] Salviskinone A的0_(二氯乙胺基）乙基衍生物
[0047] 實施例6 Salviskinone A的0_(二(2-甲硫基乙基)胺基）乙基衍生物的合成 [0048] 將實施例5制備的Salviskinone A的0-(二氯乙胺基）乙基衍生物（0.240g， 0 · 5mmo 1)溶于15mL乙醇，室溫下加入甲硫醇鈉(0 · 2lg，3mmo 1)，反應(yīng)物加熱回流lh。減壓濃 縮除去溶劑，所得產(chǎn)物用硅膠柱層析進(jìn)行純化(石油醚/丙酮100:0.5，v/v)，得到黃色固體 物，即化合物 IV(0.169g，67%)。
[0049] 4 NMR(500MHz，Chloroform-dl)S6.48(s，lH)，6.41(s，lH)，5.65(s，lH)，4.12(s， 2H)，3.99(s，lH)，2.94(s，2H)，2.53(d，J=15.4Hz，8H)，1.99(s，lH)，1.94(s，6H)，1.90(s， 1H)，1.77(s，lH),1.51(s，lH)，1.23(s，3H)，0.92(s，6H)，0.83(s，6H).
[0050] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)5l87.81(s),183.42(s),154.08(s),147.28(s),139.90 (s),136.12(s),134.44(s),130.96(s),128.09(s),118.53(s),68.94(s),53.83(s),52.15 (s),45.21(s),37.24(s),33.29(s),31.87(s),25.85(s),24.86(s),24.38(s),23.21(s), 22.88(s),22.34(s),14.38(s).
[0051] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C28H42N03S2:504.2606;found:504.2603〇
[0052]
[0053] 實施例7組合物抗人體真菌活性
[0054] 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的65mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的35mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到lOOmg組合物， 使用時用水溶解這l〇〇mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0055]抗人體真菌活性實驗是采用濃度稀釋的方法，每次測定重復(fù)三次，測試的病原菌 有紅色毛癬菌、羊毛狀小孢子菌和斷發(fā)癬菌，菌液濃度為1〇5個/mL。藥物的起始濃度為 50.00yg/mL(5%二甲基亞砜DMS0)，梯度稀釋至0.10yg/mL，等量體積的菌液和測試樣品混 合培養(yǎng)在96孔板中（形成的最終濃度有：25·00、12·50、6·25、3·13、1·56、0·78、0·39、0·20、 0.10和0.05yg/mL)，人體真菌培養(yǎng)溫度分別為28°C，培養(yǎng)時間24h后觀察，若發(fā)現(xiàn)沒有菌落 形成的處理孔中最低的那個濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。該實驗陽性對照為酮康 唑，組合物抗人體真菌結(jié)果見表1。
[0056]表1組合物抗人體真菌MIC值(yg/mL)
[0057]
[0058] 結(jié)論:組合物具有很強(qiáng)的抗人體真菌活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備 新型抗人體真菌藥物?；衔颕II和化合物IV無抗人體真菌活性，因此不能用于制備新型抗 人體真菌藥物。
[0059] 實施例8組合物抗幽門螺桿菌活性
[0060] 1)供試菌株
[0061 ] 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43504購于美國菌種保存 中心(American Type Culture Collectior^ATCC)。]^株Hp臨床菌株采自南京市鼓樓醫(yī)院 胃鏡室接受胃鏡檢查的患者;在連續(xù)胃鏡檢查中對消化性潰瘍、十二指腸球炎或疣狀胃炎 的患者，先經(jīng)快速尿素酶實驗確定為Hp陽性者，再取胃竇黏膜1-2塊，切碎后接種于含8%馬 血清、三甲氧節(jié)氨啼啶（1：1'；[11161:111'(^;[11，110 3)1.258凡、多粘菌素(。0150115^;[11)1325001]凡、萬古 霉素 (vancomycin) 10mg/L的Columbia選擇性瓊脂培養(yǎng)基中，于37°C在微氧環(huán)境下（5%〇2， 10%〇)2和85%他)培養(yǎng)72小時。收集細(xì)菌，經(jīng)涂片革蘭氏染色，氧化酶、觸酶和尿素酶鑒定為 陽性后，傳代純培養(yǎng)，所得菌株作為實驗菌株。
[0062] 2)菌株培養(yǎng)
[0063] 我們采用微需氧袋(購自上海醫(yī)科大學(xué))進(jìn)行HP的菌株培養(yǎng)，它可通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn) 生Hp所需要的微需氧環(huán)境。
[0064] 3)生物活性測定
[0065] 采用紙片法(Microbiological paper method)測定藥物對幽門螺桿菌的抑制作 用，用瓊脂稀釋法來測定供試樣品的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC) 〇
[0066] I ·紙片法實驗
[0067] (A)準(zhǔn)備培養(yǎng)基將配制好的Columbia培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至50-60°C， 加8 %馬血清或綿羊血，混勾傾注于已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿7-10ml，培養(yǎng)基厚度為1.5mm (無菌操作）。
[0068] (B)轉(zhuǎn)接實驗菌(涂菌）用微量取樣器取稀釋好的108CFU/ml(10D 66Q = 108CFU/ml) Hp的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在適宜的培養(yǎng)皿表面。倒置于37°C烘干箱中15min后取出，目 的使瓊脂表面干燥，備用。
[0069] (C)貼樣品紙片用微量取樣器取6μ1待測樣品（質(zhì)量濃度2mg/ml)注入已經(jīng)滅菌的 圓濾紙片上。用無菌鑷子鑷取含樣品的紙片和對照空白紙片，按無菌操作分別紙片緊貼于 含菌瓊脂表面，每隔一定距離貼一張紙片。每種菌做3皿，所得結(jié)果求其平均值。
[0070] (D)培養(yǎng)將各平皿置于微需氧袋中，封口，打開氣體發(fā)生器，再置于37°C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)72h。
[0071] (E)測抑菌圈直徑取出平板后，分別測量各紙片周圍抑菌圈直徑的大小。參照對 照組的結(jié)果，可得出待測樣品敏感實驗的結(jié)果。重復(fù)三次。
[0072] II.瓊脂稀釋法測定MIC
[0073] (A)藥物平板的制備首先將測試的藥物用二甲基亞砜(DMS0)溶液配制成0.5mg/ ml 的母液，再用無菌水稀釋，最終配成 100 · 0，80 · 0，60 · 0，45 · 0，40 · 0，35 · 0，30 · 0，25 · 0， 20.0，15.0，10.0，5.0和2.5μg/ml的濃度系列，DMS0在介質(zhì)中的濃度小于1 %。將lml配制好 的測試藥物溶液與保溫于50°C的8ml哥倫比亞培養(yǎng)基，另加 lml保溫于50°C的馬血清充分混 勻，澆制入培養(yǎng)皿中冷卻即成(培養(yǎng)皿中藥物的終濃度為10.0,8.0,6.0,4.5,4.0,3.5,3.0， 2.5,2.0，1.5，1.0,0.5和0.25μg/ml，如果有抑菌作用，則MIC值即這些值當(dāng)中的一個）。 [0074] (B)轉(zhuǎn)接實驗菌（涂菌）用微量取樣器吸取稀釋好的lX10 8CFU/ml Hp的菌懸液 0.1ml均勻地涂抹在培養(yǎng)皿表面，倒置于37°C烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥， 備用。
[0075] (C)確定MIC將待測培養(yǎng)皿在微需氧袋(含:85%N2，10%C02和5%0 2)中，保溫37°C 培養(yǎng)72小時，觀察Hp生長情況，與空白組相對照，以完全沒有菌生長的樣品最低濃度為最低 抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC)值。陽性對照為氨節(jié)西林 (Ampicillin)〇
[0076] 實驗結(jié)果
[0077] 體外實驗表明，組合物具有很強(qiáng)的抗幽門螺旋桿菌活性，紙片法顯示其抑菌圈直 徑為32mm(ATCC43504)。用瓊脂稀釋法顯示它能完全抑制5個隨機(jī)的臨床菌株和1個標(biāo)準(zhǔn)菌 株(ATCC43504)的生長，最小抑菌濃度(MIC)均為2. Oμg/ml。用氨芐西林作陽性對照，其對6 株測試菌完全抑制的最小濃度(MIC)為1. Oμg/ml?；衔颕II和化合物IV無抗幽門螺旋桿菌 活性。
[0078] 結(jié)論:組合物具有較強(qiáng)的抑制幽門螺旋桿菌活性，說明對于與幽門螺旋桿菌密切 相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來講，組合物是一個極具開發(fā)潛力的藥物。它 可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備?；衔颕II和化合物IV無抗幽門螺旋桿 菌活性，不可以用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。
[0079]實施例9組合物抗細(xì)菌活性
[0080]抗菌活性實驗是采用濃度稀釋的方法，每次測定重復(fù)三次，測試病原菌有大腸桿 菌、熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌，菌液濃度為1 〇5個/mL。藥物起始 濃度為50.00yg/mL(5%二甲基亞砜DMSO)，梯度稀釋至0.10yg/mL，等量體積的菌液和測試 樣品混合培養(yǎng)在96孔板中（形成的最終濃度有:25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、 0.20、0.10和0.05yg/mL)，細(xì)菌培養(yǎng)溫度分別為37°C，培養(yǎng)時間24h后觀察，若發(fā)現(xiàn)沒有菌落 形成的處理孔中最低的那個濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。組合物抗菌結(jié)果見表2。 [0081 ] 表2組合物抗細(xì)菌MIC值(yg/mL)
[0082]
[0083] 結(jié)論:組合物具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型 抗細(xì)菌藥物?；衔颕II和化合物IV無抗細(xì)菌活性，不能被用于制備新型抗細(xì)菌藥物。
[0084] 實施例10組合物抗結(jié)核菌活性
[0085] (1)固體培養(yǎng)基稀釋法測定組合物抗卡介苗(BCG)絕對濃度
[0086] 從斜面上刮取卡介苗培養(yǎng)物，加入到3ml Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少 量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液。
[0087] 將藥物用DMS0配成高濃度的原液，用含5 %的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需 濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng) 121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C )，混勻，制成含藥物，濃度分別為6. Oug/ml， 4.0ug/ml，3 ·0ug/ml，2·0ug/ml，1 · 5ug/ml，1 .Oug/ml，0· 75ug/ml，0 · 5ug/ml等濃度的斜面培 養(yǎng)基。
[0088] 將濃度為lmg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含各個藥 物系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37°C培養(yǎng)4~8周，觀察實驗結(jié)果，結(jié)果 如表3所示。
[0089] 本實施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基和Middlebrook7Hll瓊脂培養(yǎng)基為本 領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)時的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可。
[0090] (2)固體培養(yǎng)基稀釋法測定組合物抗結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV株絕對濃度 [0091] 從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株培養(yǎng)物，加入到3ml Middlebrook7H9 肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)?比池管(MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的H37Rv株菌懸液。
[0092] 將藥物分別用DMS0配成高濃度的原液，用含5 %的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至 所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基 已經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.0ug/ ml，4·Oug/ml，3 ·Oug/ml，2 ·Oug/ml，1 · 5ug/ml，1 ·Oug/ml，0· 75ug/ml，0· 5ug/ml等濃度的斜 面培養(yǎng)基。
[0093]將濃度為lmg/ml的H37Rv株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含藥物系列濃 度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37°C培養(yǎng)4~8周，觀察實驗結(jié)果，結(jié)果如表3所 不。
[0094] (3)固體培養(yǎng)基稀釋法測定藥物抗結(jié)核分支桿菌臨床分離耐ISRE MTB株絕對濃度
[0095]從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株(耐異煙肼、鏈霉素、利福平、 乙胺丁醇結(jié)核分枝桿菌臨床分離柱)培養(yǎng)物，加入到3ml Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加 入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?(MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的菌懸液。
[0096] 將藥物分別用DMS0配成高濃度的原液，用含5%的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至 所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基 已經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.0ug/ ml，4·Oug/ml，3 ·Oug/ml，2 ·Oug/ml，1 · 5ug/ml，1 ·Oug/ml，0 · 75ug/ml，0 · 5ug/ml等濃度的斜 面培養(yǎng)基。
[0097] 將濃度為lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù) 環(huán)，分別接種于含各個藥物系列濃度的培養(yǎng)基和空白對照培養(yǎng)基斜面上，置于37°C培養(yǎng)4~ 8周，觀察實驗結(jié)果，結(jié)果如表3所示。
[0098] 表3固體培養(yǎng)基稀釋法測定組合物抗結(jié)核菌絕對濃度結(jié)果
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103]
[0104] 結(jié)論:組合物具有很強(qiáng)的抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié)核菌感 染疾病的先導(dǎo)化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物?；衔颕II和化合物IV無抗結(jié)核菌和 抗耐藥性結(jié)核菌活性，不能作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也不能用于制備治療 結(jié)核病藥物。
[0105] 實施例11本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0106] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0107] 實施例12本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0108] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為65%和35%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為：將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為65 %和35 %充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述菌為細(xì)菌。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述菌為真菌。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述菌為幽門螺桿菌。7. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述菌為結(jié)核菌。8. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為：所述真菌為紅色毛癬 菌、羊毛狀小孢子菌或者斷發(fā)癬菌。9. 如權(quán)利要求4所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述細(xì)菌為大腸桿菌、 熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌或者新生隱球菌。10. 如權(quán)利要求7所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述結(jié)核菌為卡介苗、 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株和耐多藥結(jié)核分枝桿菌。
【文檔編號】A61P31/10GK105998001SQ201610256269
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】王卓婷
【申請人】南京賦海澳賽醫(yī)藥科技有限公司