狹山野豌豆中總黃酮的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及狹山野豌豆中總黃酮的制備方法。采用的技術方案是：取狹山野豌豆藥材粉末，以40?95％的乙醇水溶液為溶劑，液料比為1:10?20，70?90℃下提取，得提取液。選取填充有弱極性?中等極性大孔吸附樹脂的吸附柱，上樣總黃酮濃度為0.21?3.18mg/mL，調(diào)節(jié)pH為1?8，上樣于吸附柱，上樣體積為4?6倍樹脂柱床體積，調(diào)節(jié)吸附流速為2?6mL/min進行動態(tài)吸附，以30?95％的乙醇水溶液，2?6mL/min流速進行洗脫，收集洗脫液。本發(fā)明總黃酮大孔吸附樹脂制備方法，總黃酮的收率高，解吸條件比較溫和、使用周期長、再生簡便、提取率高、成本低，適于工業(yè)化生產(chǎn)的推廣和應用。
【專利說明】
狹山野魂豆中總黃酬的制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于中藥提取領域，具體地設及一種狹山野魏豆中藥有效部位的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 狹山野魏豆（V.amoena Fisch.var.angusta Freyn.)為豆科化eguminosae)野魏 豆屬(Vicia L.)植物，主要分布在我國東北、華北、西北等地，其地上部分作為中藥透骨草 入藥。2015年版《中國藥典》一部中收載的中成藥"坎離砂"、"養(yǎng)血榮筋丸"、"疏痛安涂膜劑" 處方中均有透骨草，且四部附錄(成方制劑中本版藥典未收載的藥材和飲片）中收錄了狹山 野魏豆V.amoena Fisch.var.angusta Rr巧η.作為透骨草使用。
[000引狹山野魏豆"味甘、性平"，"能補、能和、能緩"，屬于補肝腎型桂風濕藥，其桂風濕 作用是通過調(diào)節(jié)免疫，進而補益肝腎，達到桂風濕的目的。狹山野魏豆中黃酬類物質(zhì)是其免 疫調(diào)節(jié)的活性部位之一，總黃酬通過調(diào)節(jié)免疫，發(fā)揮補益肝腎、桂風濕的功效?，F(xiàn)有技術中， 總黃酬的提取方法主要有抑梯度萃取法、乙酸乙醋萃取法、堿提酸沉法，提取率低。所W，優(yōu) 化狹山野魏豆中總黃酬富集工藝，建立質(zhì)量控制方法，可W為狹山野魏豆運一東北豐富植 物資源的開發(fā)與利用提供科學依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是建立狹山野魏豆總黃酬的制備方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案是:狹山野魏豆中總黃酬的制備方法，包括提取步驟，方法 如下：取狹山野魏豆藥材粉末，W40-95%的乙醇水溶液為溶劑，液料比為1:10-20,提取溫 度為70-90°C，提取1-3次，每次提取時間為1-1.5小時，得提取液。
[0006] 優(yōu)選的，所述的提取步驟為：取狹山野魏豆藥材粉末，W70%的乙醇水溶液為溶 劑，液料比為1:20，提取溫度為90°C，提取2次，每次提取時間為1小時，得提取液。
[0007] 上述的狹山野魏豆中總黃酬的制備方法，包括純化步驟，方法如下:將提取液旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)得濃縮液，將濃縮液加水至濃度為0.21-3.18mg/mL，得上樣液，調(diào)節(jié)上樣液的抑為1-8; 選取填充有大孔吸附樹脂的吸附柱，上樣液上樣于吸附柱，上樣體積為4-6倍樹脂柱床體 積，調(diào)節(jié)吸附流速為2-6mL/min進行動態(tài)吸附，W30-95%的乙醇水溶液作為洗脫劑，W2- 6mL/min流速進行洗脫，W 5-12倍樹脂柱床體積洗脫液洗脫，收集洗脫液。
[000引優(yōu)選的，所述的純化步驟為:將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮液，將濃縮液加水至濃度為 0.39mg/mL，得上樣液，調(diào)節(jié)上樣液的抑為5-6;選取填充有大孔吸附樹脂的吸附柱，上樣液 上樣于吸附柱，上樣體積為5倍樹脂柱床體積，調(diào)節(jié)吸附流速為2mL/min進行動態(tài)吸附，W 70 %的乙醇水溶液作為洗脫劑，W3mL/min流速進行洗脫，W10倍樹脂柱床體積洗脫液洗 脫，收集洗脫液。
[0009]上述的狹山野魏豆中總黃酬的制備方法，所述的大孔吸附樹脂是HPD-826型大孔 吸附樹脂。
[0010] 本發(fā)明的原理是:本發(fā)明首次對狹山野魏豆中總黃酬的制備方法進行了優(yōu)化，采 用大孔吸附樹脂富集總黃酬，采用正交設計考察了藥材提取溶劑、料液比、提取時間、提取 次數(shù)，建立了最佳的提取工藝;考察了樹脂類型、上樣濃度、pH值、上樣體積、吸附流速、洗脫 劑、洗脫流速、洗脫體積，建立最佳的純化工藝。
[0011] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明，總黃酬大孔吸附樹脂制備方法和其他方法相比，總 黃酬的收率高于pH梯度萃取法、乙酸乙醋萃取法、堿提酸沉法；大孔樹脂具有物理穩(wěn)定性 高、不受無機物存在的影響、吸附選擇性好、解吸條件比較溫和、使用周期長、再生簡便、提 取率高、成本低等特點，適于狹山野魏豆總黃酬的制備，也適合工業(yè)化生產(chǎn)的推廣和應用。
【具體實施方式】
[0012]實施例1狹山野魏豆總黃酬的制備方法
[OOU] 1)提取:取狹山野魏豆藥材粉末10g，70%的乙醇水溶液200mL(液料比為1:20)，提 取溫度為90°C，提取2次，每次提取時間為1小時，得提取液；
[0014] 2)純化：選取填充有冊D-826型大孔吸附樹脂的吸附柱（Φ1.5cmX20cm，10g)，將 步驟1)獲得的提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，得濃縮液，濃縮液加水調(diào)節(jié)濃度為〇.39mg/mL，用 HC1調(diào)節(jié)樣品水溶液pH為5.5，上樣體積為5倍樹脂柱床體積，調(diào)節(jié)流速為2mL/min進行動態(tài) 吸附，洗脫劑為70 %乙醇水溶液，W3mL/min流速進行洗脫，洗脫體積為10倍樹脂床體積，收 集洗脫液。
[0015] 3) W金絲桃巧、異搬皮巧、山奈巧、搬皮巧及山奈酪-3-0-α-Ι^-阿拉伯糖作為檢測 物，測定洗脫液中總黃酬的含量，得總黃酬34.Olmg。
[0016] 實施例2提取步驟的優(yōu)化 [0017]( - )提取溶劑的影響
[0018] 精密稱取狹山野魏豆藥材粉末（4號篩）5g，共7份，置250ml錐形瓶中，分別加入 40 %、50%、60%、70%、80%、95 %乙醇水溶液75ml (料液比為1:15)，90°C，加熱1小時，提取 2次，提取液合并，蒸干，甲醇溶解，定容至50ml。測定提取液中總黃酬的含量，結果如表1。
[0019] 表1提取試劑考察結果
[0020]
[0021] (二)提取條件的影響
[0022] 提取溶劑濃度為70%乙醇水溶液。W提取溫度、料液比、提取時間、提取次數(shù)4個因 素進行正交試驗設計，因素水平見表2，L9(34)正交設計試驗方案及結果分析見表2、表3和表 4。
[0023] 表2正交試驗設計因素水平表
[0024]
[0029] 影響狹山野魏豆總黃酬提取效率的因素依次為:液料比(B)、提取次數(shù)(D)、提取溫 度(A)、提取時間（C)。綜合考慮節(jié)省能源、節(jié)約時間等因素，確定最佳提取工藝，即采用70% 乙醇水溶液，提取溫度為90°C，液料比為1:20,提取次數(shù)為2次，提取時間為每次化。
[0030] 實施例3純化步驟的優(yōu)化
[0031 ]( - )大孔吸附樹脂對狹山野魏豆總黃酬的影響
[0032]考察的樹脂型號為 HPD-750、HPD-600、HPD-826、HPD-5000、ADS-17、ADS-7、AB-8、 0101心-5、01-130。精密稱取10種經(jīng)過預處理的大孔樹脂各1肖(干燥無水），置于50血錐形瓶 中，分別加入50mL生藥濃度為0.17g/mL溶液(5種黃酬巧濃度Co為0.6404mg/mL)，時時振搖 (12化/min),振搖2小時，濾過，取續(xù)濾液，測定5個黃酬巧含量，得濃度Cl。取上述濾過得到 的10種大孔樹脂，分別置于50mL錐形瓶中，分別加入50mL70%乙醇水溶液，時時振搖（120r/ min)，振搖2小時，濾過，取續(xù)濾液，測定5個黃酬巧含量，得濃度C2，計算，結果見表5。
[0033] 表5 10種大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附試驗結果
[0034]
[0035] (二)上樣濃度對狹山野魏豆總黃酬的影響
[0036] 稱取5份經(jīng)過預處理的冊D-826型大孔樹脂各lOg(干燥）濕法裝于各層析柱（Φ 1.5cmX 20cm)中，取0.2g/mL生藥濃度的樣品20mL，共5份，分別經(jīng)過稀釋或濃縮至不同濃 度，超聲溶解，使樣品充分溶解。取樣品分別上柱，控制流速為2mL/min，收集流出液，濾過， W 5個黃酬巧含量為指標進行檢測。結果見表6。
[0037] 表6上樣濃度對總黃酬影響試驗結果 [00；3 引
[0040] (Ξ)ρΗ對狹山野魏豆總黃酬的影響
[0041 ]分別量取樣品溶液(總黃酬濃度為0.385 60mg/mL)100mL，共5份，其中4份用ImoL/ L肥1溶液或ImoL/L化0田容液調(diào)節(jié)PH范圍1~2、3~4、5~6、7~8。將上述5份溶液依次加入 HPD-826型大孔樹脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，控制流速為2血/min,收集流出液，濾過，W 5個黃酬巧含量為指標進行檢測。結果見表7。當上樣液體抑5~即寸，HPD-826型大孔樹脂對 狹山野魏豆總黃酬的吸附率達到95.67%，pH范圍為1~2和3~4時，吸附率均達到了90% W 上，然而抑值偏低，在工業(yè)化生產(chǎn)中會腐蝕金屬機器及色譜柱，故將上樣液體抑范圍定為5 ~6。
[0042]表7 pH對總黃酬影響試驗結果
[0043]
[0044] (四）吸附流速對狹山野魏豆總黃酬的影響
[0045] 分別量取PH 5~6樣品水溶液(總黃酬濃度為0.38971mg/mL)100mL，依次加入5根 HPD-826型大孔樹脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，分別調(diào)節(jié)流速為2、3、4、5和6血/min進行動 態(tài)吸附，收集流出液，濾過，W5個黃酬巧含量為指標進行檢測。結果見表8。
[0046] 表8吸附流速對總黃酬影響試驗結果
[0047]
[004引（五)上樣體積對狹山野魏豆總黃酬的影響
[00例將抑5~6樣品水溶液(總黃酬濃度為0.377 89mg/mL)，加入預處理好的HPD-826 型大孔樹脂柱（Φ 1.5cmX20cm，lOg)中，調(diào)節(jié)流速為2mL/min進行動態(tài)吸附，按樹脂床體積 倍數(shù)上樣，收集流出液，濾過，W 5個黃酬巧含量為指標進行檢測。結果見表9。
[0050]表9上樣體積對總黃酬影響試驗結果
[0化1 ]
[0052] (六)洗脫劑對狹山野魏豆總黃酬的影響
[0053] 分別量取抑5~6樣品水溶液(總黃酬濃度為0.377 89mg/血）100血，分別加入4根 預處理好的HPD-826型大孔樹脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，調(diào)節(jié)流速為2mL/min進行動態(tài) 吸附，收集流出液，濾過，定容。先用水洗脫至近無色，再分別用30 %、50 %、70 %和95 %乙醇 水溶液洗脫至近無色，洗脫液濾過，定容。W 5個黃酬巧含量為指標進行檢測。結果見表1 ο。 [0054]表10洗脫劑對總黃酬影響試驗結果
[0化5]
[0056](屯)洗脫速度對狹山野魏豆總黃酬的影響
[0化7] 分別將抑5~6樣品水溶液(總黃酬濃度為0.361 29mg/血）100血，加入5根預處理 好的HPD-826型大孔樹脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，調(diào)節(jié)流速為2血/min進行動態(tài)吸附，收 集流出液，濾過。先用水洗脫至近無色，再70 %乙醇水溶液洗脫，分別W2、3、4、5、6血/min流 速進行洗脫，收集洗脫液，濾過，W 5個黃酬巧含量為指標進行檢測。結果見表11。
[0058]表11洗脫流速對總黃酬影響試驗結 [0化9]
[0060](八)洗脫體積對狹山野魏豆總黃酬的影響
[00川將pH 5~6樣品水溶液（總黃酬濃度為0.359 25mg/mL)100mL，加入預處理好的 HPD-826型大孔樹脂柱（Φ 1.5cmX 20cm，lOg)中，調(diào)節(jié)流速為2mL/min進行動態(tài)吸附，收集流 出液，濾過。先用水洗脫至近無色，再70%乙醇水溶液洗脫，W3mL/min流速進行洗脫，按樹 脂床體積倍數(shù)收集洗脫液，濾過，W 5個黃酬巧含量為指標進行檢測。結果見表12。
[0062] 表12洗脫體積考察試驗結果
[0063]
[0064]綜合考慮節(jié)省能源、節(jié)約時間等因素，確定最佳純化工藝，即，填料采用HPD-826型 大孔吸附樹脂，用HC1調(diào)節(jié)樣品水溶液抑為5-6，上樣體積為5倍樹脂柱床體積，調(diào)節(jié)流速為 211117111111進行動態(tài)吸附，洗脫劑為70%乙醇水溶液，^311117111111流速進行洗脫，^10倍樹脂柱 床體積洗脫液洗脫。
【主權項】
1. 狹山野豌豆中總黃酮的制備方法，其特征在于，包括提取步驟，方法如下：取狹山野 豌豆藥材粉末，以40-95%的乙醇水溶液為溶劑，液料比為1:10-20，提取溫度為70-90°C，提 取卜3次，每次提取時間為1_1.5小時，得提取液。2. 根據(jù)權利要求1所述的狹山野豌豆中總黃酮的制備方法，其特征在于:所述的提取步 驟為:取狹山野豌豆藥材粉末，以70%的乙醇水溶液為溶劑，液料比為1:20,提取溫度為90 °C，提取2次，每次提取時間為1小時，得提取液。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的狹山野豌豆中總黃酮的制備方法，其特征在于:包括純化 步驟，方法如下：將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮液，將濃縮液加水至濃度為0.21-3.18mg/mL，得 上樣液，調(diào)節(jié)上樣液的pH為1-8;選取填充有大孔吸附樹脂的吸附柱，上樣液上樣于吸附柱， 上樣體積為4-6倍樹脂柱床體積，調(diào)節(jié)吸附流速為2-6mL/min進行動態(tài)吸附，以30-95 %的乙 醇水溶液作為洗脫劑，以2_6mL/min流速進行洗脫，以5-12倍樹脂柱床體積洗脫液洗脫，收 集洗脫液。4. 根據(jù)權利要求3所述的狹山野豌豆中總黃酮的制備方法，其特征在于:所述的純化步 驟為:將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得濃縮液，將濃縮液加水至濃度為〇. 39mg/mL，得上樣液，調(diào)節(jié)上樣 液的pH為5-6;選取填充有大孔吸附樹脂的吸附柱，上樣液上樣于吸附柱，上樣體積為5倍樹 脂柱床體積，調(diào)節(jié)吸附流速為2mL/min進行動態(tài)吸附，以70 %的乙醇水溶液作為洗脫劑，以 3mL/min流速進行洗脫，以10倍樹脂柱床體積洗脫液洗脫，收集洗脫液。5. 根據(jù)權利要求3所述的狹山野豌豆中總黃酮的制備方法，其特征在于:所述的大孔吸 附樹脂是HPD-826型大孔吸附樹脂。
【文檔編號】A61P29/00GK105998154SQ201610427486
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】桑育黎, 郝延軍, 郭方巖, 陳長蘭, 陳立江, 劉玉峰, 徐亮, 孔玉梅, 王宇
【申請人】遼寧大學