一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法，具體的為，所述滴眼液其包括以下重量份組分：Lifitegrast 1?20份、硫酸類(lèi)肝素0.1?5份、玻璃酸鈉1?10份、生長(zhǎng)因子0.01?0.1份、膠原蛋白0.1?1份和水200?500份。一旦角膜受到損傷，本發(fā)明制備的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)生物功能，修復(fù)角膜細(xì)胞通信通道，達(dá)到調(diào)節(jié)修復(fù)角膜的生理功能。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞外基質(zhì)（糾化日。日11111日1'111日付;[義(3,6〔1)是由動(dòng)物細(xì)胞合成并分泌到胞外、分 布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。運(yùn)些物質(zhì)構(gòu)成復(fù) 雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng)。細(xì)胞外基質(zhì)是動(dòng) 物組織的一部分，不屬于任何細(xì)胞。它決定結(jié)締組織的特性，為細(xì)胞的生存及活動(dòng)提供適宜 的場(chǎng)所，并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形狀、代謝、功能、遷移、增殖和分化。胞外基質(zhì)不 僅靜態(tài)的發(fā)揮支持、連接、保水、保護(hù)等物理作用，而且動(dòng)態(tài)的對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生全方位影響，例 如，為細(xì)胞提供支持和固定、提供組織間的分離方法、調(diào)節(jié)細(xì)胞間的溝通。此外細(xì)胞外間質(zhì) 還吸收了多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子和蛋白酶。當(dāng)生理?xiàng)l件變化時(shí)，激活蛋白酶而釋放運(yùn)些細(xì)胞因 子，而無(wú)需從頭合成運(yùn)些因子，從而迅速激活細(xì)胞功能。
[0003] 硫酸類(lèi)肝素廣泛存在于細(xì)胞膜、胞外基質(zhì)和某些細(xì)胞器中，它們能夠與各種細(xì)胞 因子相結(jié)合，調(diào)節(jié)它們?cè)诎饣|(zhì)中的產(chǎn)生和維持過(guò)程，控制它們的分布和壽命，如與趨化 因子IL-8相互作用將促進(jìn)其活性;硫酸肝素蛋白多糖對(duì)典型的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)是 一種有效的輔因子是目前公認(rèn)的結(jié)論。肝素在1985年被發(fā)現(xiàn)其可W增強(qiáng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子1的生物學(xué)活性。并在1991年首次證明它可直接提升成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合力和 活性。此外，硫酸類(lèi)肝素還可W和胞外基質(zhì)中的多種蛋白質(zhì)相結(jié)合，控制它們的分布、轉(zhuǎn)移 和信息傳遞，誘導(dǎo)修復(fù)細(xì)胞外基質(zhì)通道。
[0004] 細(xì)胞生長(zhǎng)因子是指具有促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂作用的細(xì)胞因子。細(xì)胞生長(zhǎng)因子通常W 一定含量維持角膜組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。當(dāng)角膜組織受損后，其分泌量發(fā)生變化，從而引起對(duì)角 膜層細(xì)胞增殖、分化、移行的促進(jìn)或抑制作用。國(guó)內(nèi)有報(bào)道認(rèn)為當(dāng)角膜損傷后局部生長(zhǎng)因子 不能滿(mǎn)足修復(fù)需要時(shí)給予適宜濃度的生長(zhǎng)因子滴眼能通過(guò)刺激角膜上皮細(xì)胞及基質(zhì)成纖 維細(xì)胞的增生，移動(dòng)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)與膠原纖維增生使損傷加快修復(fù)。
[0005] 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)是目前已知的最大的生 長(zhǎng)因子家族之一，對(duì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的代謝和膠原蛋白的形成發(fā)揮著重要功能，能維持祖 細(xì)胞并介導(dǎo)祖細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、存活和形態(tài)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子通過(guò)與特異的、高親和 的細(xì)胞膜受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和其他功能，W此重新激活細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)通路介導(dǎo)代謝 功能、組織修復(fù)和再生。能促進(jìn)與皮膚損傷有關(guān)細(xì)胞的迅速生長(zhǎng)繁殖，并調(diào)節(jié)細(xì)胞間基質(zhì)的 合成、分泌及分解;促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的再生、修復(fù)，主要用來(lái)治療角膜炎和各種角膜損傷。
[0006] 玻璃酸鋼又名透明質(zhì)酸鋼(Sodium Hyalu;ronate,HA-化)是唯一不發(fā)生硫酸化的 氨基聚糖。透明質(zhì)酸作為機(jī)體結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)成分之一，具有良好的生物相容性、無(wú)抗 原性、可吸收降解等特性，是一種理想的天然生物材料。玻璃酸鋼廣泛存在于人體內(nèi)，在眼 玻璃體、房水、皮膚、關(guān)節(jié)滑液、廝帶等處均有分布。玻璃酸鋼高度親水，可形成水膜覆蓋于 眼表面上，與蛋白類(lèi)分子結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)活性促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的連接和伸展， 從而促進(jìn)結(jié)膜創(chuàng)傷、角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)，高濃度的玻璃酸鋼效果更顯著。另外玻璃酸鋼對(duì) 眼具有保濕和潤(rùn)滑作用。
[0007]角膜是一種無(wú)血管的透明組織，由上皮層、基質(zhì)層和內(nèi)皮層組成。角膜損傷的誘因 有化學(xué)、機(jī)械、激光等，其病理機(jī)制除了直接損傷作用外，免疫系統(tǒng)的參與也起著非常重要 的作用，免疫炎性細(xì)胞和免疫分子相互作用，形成復(fù)雜的免疫炎癥網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)角膜損傷的病 理變化。近年來(lái)由于角膜外傷的增多，加之廣譜抗生素、皮質(zhì)類(lèi)固醇在臨床上的廣泛應(yīng)用及 角膜接觸鏡的使用增多，導(dǎo)致角膜炎的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，目前常見(jiàn)的治療方法為 使用抗生素類(lèi)滴眼液，包括氯霉素滴眼液、紅霉素滴眼液及W左氧氣沙星為代表的第4代哇 諾酬類(lèi)滴眼，但是濫用抗生素滴眼液的后果非常嚴(yán)重，首先使病原菌耐藥性增加，臨床療效 降低，造成疾病久治不愈，其次是抗生素本身及其輔助成分一定程度上會(huì)影響眼睛的正常 生理環(huán)境，干擾角膜上皮的正常代謝，甚至加重原有的病情，不能長(zhǎng)期使用。因此需要開(kāi)發(fā) 一種生物安全性高、效果明顯、使用方便的滴眼液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明主要提供了一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法，一旦角膜受到損傷， 能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)生物功能，修復(fù)角膜細(xì)胞通信通道，達(dá)到調(diào)節(jié)修復(fù)角膜的生理功能。 [0009]其技術(shù)方案如下：一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分： Lifitegrast 1-20份、硫酸類(lèi)肝素0.1-5份、玻璃酸鋼1-10份、生長(zhǎng)因子0.01-0.1份、膠原蛋 白0.1-1份和水200-500份。
[0010] -種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lifitegrast 5-10份、硫酸類(lèi) 肝素1-3份、玻璃酸鋼4-7份、生長(zhǎng)因子0.5-0.07份、膠原蛋白0.4-0.6份和水300-400份。
[0011] 優(yōu)選的，所述滴眼液的抑為5.5-7.5，采用憐酸鹽緩沖液和/或棚酸緩沖液調(diào)節(jié)，采 用憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)時(shí)，憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液W任意比例混溶。
[0012] 優(yōu)選的，所述滴眼液的滲透壓為280-350m0sm/L，采用氯化鋼和/或氯化鐘調(diào)節(jié)，氯 化鋼的質(zhì)量濃度為0.3-0.8%，氯化鐘的質(zhì)量濃度為0.1-0.3%，采用氯化鋼和氯化鐘調(diào)節(jié) 時(shí)，氯化鋼和氯化鐘W任意比例混溶。
[0013] 優(yōu)選的，硫酸類(lèi)肝素提取自天然成分或采用細(xì)菌發(fā)酵法制得，硫酸類(lèi)肝素的濃度 為0.5-50mg/ml。
[0014] 優(yōu)選的，生長(zhǎng)因子濃度為lOOO-lOOOOIU/ml，生長(zhǎng)因子選自表皮生長(zhǎng)因子、成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子中的一種或幾種。
[0015] 優(yōu)選的，生長(zhǎng)因子濃度為2000-6000IU/ml，生長(zhǎng)因子采用表皮生長(zhǎng)因子:成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)因子:堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:胎盤(pán)生長(zhǎng)因子按照1:2.5:1.6:3的重量比配置而 成。
[0016] Lifitegrast的化學(xué)名為N-[ [2-(6-苯并巧喃甲酯基）-5,7-二氯-1，2,3,4，-四氨 異哇嘟-6-基]甲酯基]-3-甲橫酷基-L-苯基丙氨酸，分子式：C2姐24C12N207S，CAS號(hào)： 1025967-78-5，結(jié)構(gòu)式如下式（I)所示：
[0017]
[001引 Lifitegrast屬于淋己細(xì)胞功能相關(guān)抗原-ULFA-1)括抗劑。LFA-1是存在于白細(xì) 胞表面的一種蛋白。在干眼癥中，ICAM-1在角膜和結(jié)膜組織中過(guò)量表達(dá)。LFA-l^CAM-l相互 作用促進(jìn)免疫突觸的形成，導(dǎo)致T細(xì)胞激活并遷移至目標(biāo)組織。Lifitegrast作用于LFA-1， 括抗LFA-1與ICAM-1的相互作用，從而避免T細(xì)胞的產(chǎn)生、遷移，從而達(dá)到治療干眼的效果。
[0019] 優(yōu)選的，玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā)酵法制得，玻璃酸鋼分子量為40-150wDa。
[0020] -種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液的制備方法，包括W下步驟：
[0021] (1)先稱(chēng)取配方量的氯化鋼和/或氯化鐘，加入40-60%體積的注射用水中，攬拌使 完全溶解，用0.2μπι的濾膜過(guò)濾除菌，收集濾液；
[0022] (2)稱(chēng)取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，適宜溫度下攬拌，直至玻璃酸鋼完全溶 解；
[0023] (3)稱(chēng)取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0024] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類(lèi)肝素和生長(zhǎng)因子，加 憐酸鹽緩沖液和/或棚酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下灌裝即可。
[00巧]優(yōu)選的，步驟(2)中攬拌時(shí)間為3-化，轉(zhuǎn)速100-20化pm，溫度15-30 Γ。
[0026] 采用上述仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液及其制備方法，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] 本發(fā)明中的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其組分是眼膜細(xì)胞外基質(zhì)固有成分，一旦角膜 受到損傷，能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)生物功能，修復(fù)角膜細(xì)胞通信通道，達(dá)到調(diào)節(jié)修復(fù)角膜的 生理功能。目前做的Lifitegrast、硫酸類(lèi)肝素、生長(zhǎng)因子、膠原蛋白及玻璃酸鋼量效關(guān)系研 究中，結(jié)果顯示，五種藥物聯(lián)合治療頑固性角膜上皮損傷、各種原因的角膜上皮病變、角膜 炎可起到高效用藥效果。
[0028] 本發(fā)明的滴眼液模擬角膜細(xì)胞外基質(zhì)組成，不僅能各自發(fā)揮療效，由于協(xié)同作用， 能使藥物長(zhǎng)時(shí)間停留于眼角膜損傷表面，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，大大增強(qiáng)對(duì)眼角膜的修復(fù)、保 護(hù)作用，提高療效，安全性高，制備方法簡(jiǎn)單，不含防腐劑，能長(zhǎng)期使用，大大滿(mǎn)足目前臨床 對(duì)此類(lèi)滴眼液的需求。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1中早期角膜上皮愈合與晚期角膜愈合率比較示意圖；
[0030] 圖2為藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1中上皮破損率比較示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] -、具體實(shí)施例
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 1.滴眼液配方
[0034] 一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lifitegrast 8份、0.5mg/ml 的硫酸類(lèi)肝素2份、150wDa的玻璃酸鋼6份、10000 lU/ml的生長(zhǎng)因子0.06份、膠原蛋白0.5份 和注射用水300份。
[0035] 所述滴眼液的抑為7.5，采用棚酸緩沖液調(diào)節(jié)。
[0036] 所述滴眼液的滲透壓為300m0sm/L，采用氯化鋼和氯化鐘調(diào)節(jié)，氯化鋼的質(zhì)量濃度 為0.5%，氯化鐘的質(zhì)量濃度為0.1%。
[0037] 硫酸類(lèi)肝素提取自天然成分或采用細(xì)菌發(fā)酵法制得;玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā) 酵法制得。
[0038] 生長(zhǎng)因子采用表皮生長(zhǎng)因子:成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:胎 盤(pán)生長(zhǎng)因子按照1:2.5:1.6:3的重量比配置而成。
[0039] 2.滴眼液制備方法
[0040] (1)先稱(chēng)取配方量的氯化鋼和氯化鐘，加入40%體積的注射用水中，攬拌使完全溶 解，用0.2WI1的濾膜過(guò)濾除菌，收集濾液；
[0041 ] (2)稱(chēng)取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，20°C下攬拌4h，轉(zhuǎn)速20化pm，直至玻璃酸 鋼完全溶解；
[0042] (3)稱(chēng)取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0043] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類(lèi)肝素和生長(zhǎng)因子，加 棚酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下灌裝即可。
[0044] 實(shí)施例2
[0045] 1.滴眼液配方
[0046] 一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lifitegrast 5份、30mg/ml的 硫酸類(lèi)肝素0.1份、40w化的玻璃酸鋼4份、4000IU/ml的生長(zhǎng)因子0.1份、膠原蛋白0.1份和注 射用水200份。
[0047] 所述滴眼液的抑為5.5,采用憐酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)。
[004引所述滴眼液的滲透壓為350m0sm/L，采用氯化鋼調(diào)節(jié)，氯化鋼的質(zhì)量濃度為0.3%。
[0049] 硫酸類(lèi)肝素提取自天然成分或采用細(xì)菌發(fā)酵法制得;玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā) 酵法制得。
[0050] 生長(zhǎng)因子采用表皮生長(zhǎng)因子:成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:堿性成纖維按照1:3:1的重量 比配置而成。
[0051] 2.滴眼液制備方法
[0052] (1)先稱(chēng)取配方量的氯化鋼，加入60%體積的注射用水中，攬拌使完全溶解，用0.2 μπι的濾膜過(guò)濾除菌，收集濾液；
[0053] (2)稱(chēng)取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，30°C下攬拌化，轉(zhuǎn)速10化pm，直至玻璃酸 鋼完全溶解；
[0054] (3)稱(chēng)取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0055] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類(lèi)肝素和生長(zhǎng)因子，加 憐酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下灌裝即可。
[0056] 實(shí)施例3 [0化7] 1.滴眼液配方
[0化引一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lif itegrast 10份、30mg/ml 的硫酸類(lèi)肝素3份、lOOwDa的玻璃酸鋼1份、5000IU/ml的生長(zhǎng)因子0.01份、膠原蛋白1份和注 射用水500份。
[0059] 所述滴眼液的抑為6,采用憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)。
[0060] 所述滴眼液的滲透壓為280m0sm/L，采用氯化鐘調(diào)節(jié)，氯化鐘的質(zhì)量濃度為0.1%。 [0061 ]硫酸類(lèi)肝素提取自天然成分或采用細(xì)菌發(fā)酵法制得;玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā) 酵法制得。
[0062]生長(zhǎng)因子采用表皮生長(zhǎng)因子:堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:胎盤(pán)生長(zhǎng)因子按照1:4:3 的重量比配置而成。
[00創(chuàng) 2.滴眼液制備方法
[0064] (1)先稱(chēng)取配方量的氯化鐘，加入60%體積的注射用水中，攬拌使完全溶解，用0.2 μπι的濾膜過(guò)濾除菌，收集濾液；
[0065] (2)稱(chēng)取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，15 °C下攬拌化，轉(zhuǎn)速15化pm，直至玻璃酸 鋼完全溶解；
[0066] (3)稱(chēng)取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0067] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類(lèi)肝素和生長(zhǎng)因子，加 憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下灌裝即可。
[006引實(shí)施例4
[0069] 1.滴眼液配方
[0070] 一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其包括W下重量份組分:Lifitegrast 20份、50mg/ml 的硫酸類(lèi)肝素0.1份、40w化的玻璃酸鋼10份、lOOOOIU/ml的生長(zhǎng)因子0.07份、膠原蛋白0.6 份和注射用水200份。
[0071] 所述滴眼液的抑為7.0,采用憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)。
[0072] 所述滴眼液的滲透壓為300m0sm/L，采用氯化鋼和氯化鐘調(diào)節(jié)，氯化鋼的質(zhì)量濃度 為0.8%，氯化鐘的質(zhì)量濃度為0.2%。
[0073] 硫酸類(lèi)肝素提取自天然成分或采用細(xì)菌發(fā)酵法制得;玻璃酸鋼采用雞冠提取或發(fā) 酵法制得。
[0074] 生長(zhǎng)因子采用表皮生長(zhǎng)因子:成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:胎 盤(pán)生長(zhǎng)因子按照1:2.5:1.6:3的重量比配置而成。
[00對(duì) 2.滴眼液制備方法
[0076] (1)先稱(chēng)取配方量的氯化鋼和氯化鐘，加入40%體積的注射用水中，攬拌使完全溶 解，用0.2WI1的濾膜過(guò)濾除菌，收集濾液；
[0077] (2)稱(chēng)取配方量的玻璃酸鋼加入濾液中，25°C下攬拌地，轉(zhuǎn)速l(K)rpm，直至玻璃酸 鋼完全溶解；
[0078] (3)稱(chēng)取配方量的Lifitegrast至剩余的注射用水中，攬拌并溶解；
[0079] (4)將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類(lèi)肝素和生長(zhǎng)因子，加 憐酸鹽緩沖液和棚酸緩沖液調(diào)節(jié)pH，用0.2WI1的濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下灌裝即可。
[0080] 對(duì)比例1
[0081 ]制備100ml滴眼液:將透明質(zhì)酸鋼Ig完全溶解于40ml注射用水中，備用；另取50ml 注射用水，加入5g甘露醇、ο. 9g氯化鋼，完全溶解后加入l(K)yg人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子， 再加入事先準(zhǔn)備好的透明質(zhì)酸鋼溶液，混合均勻后，加注射用水定容至所需體積并同時(shí)加 入氨氧化鋼溶液使抑為7.0，用0.2-0.5皿的微孔濾膜過(guò)濾除菌，濾液分裝至滴眼液塑料瓶 中，即制成滴眼液成品。
[0082] 二、動(dòng)物耐受試驗(yàn)
[0083] 目的:考察本發(fā)明的滴眼液對(duì)兔眼的刺激性。
[0084] 樣品：實(shí)驗(yàn)組:實(shí)施例1制備的滴眼液樣品；對(duì)照組:0.9%生理鹽水。
[0085] 動(dòng)物:健康家兔5只。
[0086] 操作：將每只動(dòng)物眼睫毛剪去，每只動(dòng)物左側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)均滴實(shí)驗(yàn)組的滴眼液 (0.1ml/眼），右側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)滴對(duì)照組的0.9%生理鹽水。每次給藥時(shí)壓迫鼻淚管，并使眼 被動(dòng)閉合5-lOs。每日5次，連續(xù)給藥4周于試驗(yàn)開(kāi)始后每周觀察并記錄至試驗(yàn)結(jié)束。
[0087] 結(jié)果:測(cè)定記錄各組動(dòng)物滴眼藥后lOmin內(nèi)的巧眼次數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理t檢驗(yàn)。結(jié)果 見(jiàn)表1。
[0088] 表1兔巧眼次數(shù)測(cè)定結(jié)果(n = 5)
[0089]
[0090] 表中結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組滴眼液組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P〉0.05)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn) 組滴眼液對(duì)兔眼無(wú)刺激性。
[0091] Ξ、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1
[0092] 目的:考察滴眼液對(duì)堿燒傷兔眼修復(fù)作用
[0093] 樣品：實(shí)驗(yàn)組:按照本實(shí)施例1制備的滴眼液樣品；對(duì)照組:對(duì)比例1制備的滴眼液 樣品；
[0094] 動(dòng)物:新西蘭兔。
[009引操作:取新西蘭兔，眼表采用3.5 %利多卡因麻醉，將直徑8mm的濾紙?jiān)?.5N的 NaO田容液中浸濕，置角膜正中1分鐘后取下，立即用無(wú)菌生理鹽水沖洗。
[0096] 取造模成功的兔6只，傷后6小時(shí)即刻右眼滴實(shí)驗(yàn)組的滴眼液樣品，左眼滴對(duì)照的 樣品，5次/日，共2周。
[0097] 評(píng)價(jià)：角膜上皮愈合率及破損率計(jì)算:相機(jī)配近攝接圈，固定焦距，于傷后化、2化、 24h、3化、4化在角膜巧光著色區(qū)拍攝，沖洗后繪出巧光著色區(qū)，SPSS軟件測(cè)出各時(shí)點(diǎn)面積 值，經(jīng)線性回歸計(jì)算上皮愈合率(mm2A)。于傷后3-15天每天觀察角膜2次，凡巧光著色為陽(yáng) 性，上皮破損率=(治療眼或?qū)φ昭坳?yáng)性數(shù)/治療眼或?qū)φ昭劭倲?shù)）X 100%。
[009引結(jié)果；
[0099] (1)早期角膜上皮愈合與晚期角膜愈合觀察
[0100] 早期(傷后6小時(shí)）角膜愈合十分緩慢，傷后6~48小時(shí)，角膜愈合趨于一條直線，見(jiàn) 附圖1。實(shí)驗(yàn)組角膜平均愈合率1.42 ± 0.027iWVh，對(duì)照組角膜平均愈合率0.89 ± 0.047mm2/ 11，前者明顯較后者快(口<0.01)。
[0101] (2)上皮破損率
[0102] 結(jié)果見(jiàn)附圖2。實(shí)驗(yàn)組上皮破損率明顯低于對(duì)照組，于燒傷后第6天角膜上皮痊愈， 對(duì)照組于第10天角膜上皮痊愈。
[0103] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，實(shí)施例1滴眼液治療堿燒傷角膜上皮效果明顯優(yōu)于對(duì)比例1滴眼 液，對(duì)臨床應(yīng)用有指導(dǎo)意義。
[0104] 四、藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)2
[0105] 目的:考察制劑對(duì)兔腺病毒性角膜炎治療作用。
[0106] 樣品：實(shí)驗(yàn)組:按照本實(shí)施例2制備的滴眼液樣品、對(duì)照組1:阿昔洛韋滴眼液(修正 藥業(yè)）；對(duì)照組2:對(duì)比例1制備的滴眼液樣品；
[0107] 動(dòng)物:新西蘭兔24只（雌雄各半）。
[0108] 操作:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢查雙眼均無(wú)異常后，雙眼用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行表面 麻醉，后將小鼠置于裂隙燈顯微鏡下，用4.5號(hào)無(wú)菌針頭交叉劃傷右眼角膜上皮層多次，呈 1mm大小"井"形劃痕，然后給結(jié)膜囊內(nèi)滴入50μ1含有15TCID/0.1ml的腺病毒3型病毒液，連 續(xù)感染3d。腺病毒感染5d后出現(xiàn)病毒性角膜炎典型病變（角膜出現(xiàn)點(diǎn)狀、地圖狀、樹(shù)枝狀病 灶，虹膜充血，畏光流淚癥狀）。
[0109] 造模成功后，隨機(jī)分為治療組(實(shí)施例2制備的復(fù)合滴眼液）、對(duì)照組1(阿昔洛韋滴 眼液）、對(duì)照組2(對(duì)比例1制備的滴眼液）。出現(xiàn)典型病變Id后，開(kāi)始結(jié)膜囊給藥，2滴/次，4 次/天，連續(xù)給藥lOd。于用藥后第3、6、10天，W2%巧光素鋼染色，裂隙燈下觀察角膜病變范 圍。10天后處死各組白兔，取其角膜，常規(guī)處理后，肥染色，光鏡觀察。
[0110] 評(píng)價(jià):角膜病變程度判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)化ilienhaus等上皮表面缺損面積W0至4計(jì)分， 結(jié)果見(jiàn)表2所示。
[0111] 表2角膜上皮病變程度分級(jí)
[0112]
[0113] 結(jié)果；
[0114] (1)于用藥后第3、6、10天觀察各組兔眼角膜情況，^393313.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析，計(jì)量數(shù)據(jù)WX±s表示，組間差異采用多因方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3所示。與陰性對(duì)照組比 較，治療組於〇. 02，陽(yáng)性對(duì)照組於0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0115] 表3兔腺病毒性角膜炎病變?cè)u(píng)分(g± S)
[0116]
[0117]由結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明的滴眼液治療兔腺病毒性角膜炎效果比對(duì)照組1、對(duì)照組2的 藥物明顯，說(shuō)明Lifitegrast、類(lèi)硫酸肝素、FGF、膠原蛋白和玻璃酸鋼聯(lián)合使用能大大提高 對(duì)角膜炎的治療效果。
[011引 （2)角膜病理觀察
[0119] 對(duì)照組1和對(duì)照組2可見(jiàn)角膜修復(fù)，但細(xì)胞層次和細(xì)胞間連接的病理?yè)p害仍存在， 實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)上皮修復(fù)完整，新生的鱗狀上皮排列整齊，未見(jiàn)脫落或水泡?？梢?jiàn)Lifitegrast、 類(lèi)硫酸肝素、FGF、膠原蛋白和玻璃酸鋼聯(lián)合使用能有效抑制角膜病毒向周?chē)徑?xì)胞擴(kuò) 散，縮小病灶范圍，有利于上皮細(xì)胞的遷移和增殖來(lái)修復(fù)傷口，又防止病菌的感染。
[0120] 對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可根據(jù)W上描述的技術(shù)方案W及構(gòu)思，做出其它各種 相應(yīng)的改變W及形變，而所有的運(yùn)些改變W及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其包括以下重量份組分:Lifitegrast 1-20份、硫酸類(lèi)肝 素0.1-5份、玻璃酸鈉1-10份、生長(zhǎng)因子0.01-0.1份、膠原蛋白0.1-1份和注射用水200-500 份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其包括以下重量份組分:Lifitegrast 5-10份、硫酸類(lèi)肝素1-3份、玻璃酸鈉4-7份、生長(zhǎng)因子0.05-0.07份、膠原蛋白0.4-0.6份和 注射用水300-400份。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于：所述滴眼液的pH為5.5-7.5，采用磷酸鹽緩沖液和/或硼酸緩沖液調(diào)節(jié)，采用磷酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液調(diào)節(jié)時(shí)，磷 酸鹽緩沖液和硼酸緩沖液以任意比例混溶。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于：所述滴眼液的滲透壓為 280-350m0sm/L，采用氯化鈉和/或氯化鉀調(diào)節(jié)，氯化鈉的質(zhì)量濃度為0.3-0.8%，氯化鉀的 質(zhì)量濃度為〇. 1-0.3%，采用氯化鈉和氯化鉀調(diào)節(jié)時(shí)，氯化鈉和氯化鉀以任意比例混溶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于:硫酸類(lèi)肝素提取自天然成 分或采用細(xì)菌發(fā)酵法制得，硫酸類(lèi)肝素的濃度為0.5-50mg/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于：生長(zhǎng)因子濃度為1000-10000IU/ml，生長(zhǎng)因子選自表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子中的一種或幾種。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于：生長(zhǎng)因子濃度為2000-6000IU/ml，生長(zhǎng)因子采用表皮生長(zhǎng)因子:成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子:堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子： 胎盤(pán)生長(zhǎng)因子按照1:2.5:1.6:3的重量比配置而成。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液，其特征在于:玻璃酸鈉采用雞冠提取或 發(fā)酵法制得，玻璃酸鈉分子量為40-150w Da。9. 一種如權(quán)利要求4所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液的制備方法，其特征在于:包括以下步 驟： (1) 先稱(chēng)取配方量的氯化鈉和/或氯化鉀，加入40-60%體積的注射用水中，攪拌使完全 溶解，用0.2μπι的濾膜過(guò)濾除菌，收集濾液； (2) 稱(chēng)取配方量的玻璃酸鈉加入濾液中，適宜溫度下攪拌，直至玻璃酸鈉完全溶解； (3) 稱(chēng)取配方量的Lif i tegrast至剩余的注射用水中，攪拌并溶解； (4) 將步驟(2)與步驟(3)中的溶液混合，加入配方量的硫酸類(lèi)肝素和生長(zhǎng)因子，加磷酸 鹽緩沖液和/或硼酸緩沖液調(diào)節(jié)PH，用0.2μπι的濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下灌裝即可。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的仿細(xì)胞外基質(zhì)滴眼液的制備方法，其特征在于:步驟(2)中攪 拌時(shí)間為3_6h，轉(zhuǎn)速100-200rpm，溫度15-30 °C。
【文檔編號(hào)】A61P27/02GK105999235SQ201610566636
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月19日
【發(fā)明人】周曉惠, 張軍東, 陳晚華, 廉云飛, 吳劍英
【申請(qǐng)人】上海建華精細(xì)生物制品有限公司