胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑制備治療肺動(dòng)脈高壓藥物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽?1受體激動(dòng)劑治療肺動(dòng)脈高壓的新用途。本發(fā)明用多種實(shí)驗(yàn)證實(shí)該類藥物能夠有效地降低細(xì)胞糖酵解水平，抑制肺血管細(xì)胞的異常增生，顯著減輕肺血管重構(gòu)，從而降低肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓力,治療肺動(dòng)脈高壓。
【專利說明】膜高血糖素樣化-1受體激動(dòng)劑制備治療肺動(dòng)脈高壓藥物的 應(yīng)用
[0001 ] 本申請針對申請?zhí)枮?01510428001.0申請日為2015年7月20日的中國專利申請?zhí)?出優(yōu)先權(quán)請求。
技術(shù)領(lǐng)域：
[0002] 本發(fā)明設(shè)及膜高血糖素樣膚-1受體激動(dòng)劑的新用途，特別設(shè)及其在制備肺動(dòng)脈高 壓治療藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0003] 膜高血糖素樣膚-UW下亦簡稱化P-1)是小腸 k細(xì)胞在腸腔內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的刺激下 所分泌產(chǎn)生的內(nèi)源性激素。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中的報(bào)道中，GLP-1主要是對糖代謝的作用，包括刺激膜島素釋放，阻止 膜高血糖素分泌，減慢胃排空，W及增加飽腹感等，運(yùn)些效應(yīng)的產(chǎn)生是通過化P-1受體實(shí)現(xiàn) 的?；疨-1受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，分布于膜島、腎臟、腦、屯、臟、胃腸道和肺血管等組織或 器官。內(nèi)源性化P-1作用時(shí)間有限，迅速被DDP-4酶降解。因此，人工合成的能夠抵抗DDP-4降 解的化P-1類似物先后被研發(fā)出來，作為化P-1受體激動(dòng)劑用于2型糖尿病的治療，如：艾塞 那膚、利拉魯膚和利西拉來等。此外，利拉魯膚近期還被美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn) 用于肥胖癥治療。
[0005] 肺動(dòng)脈高壓指由各種原因引起的肺血管床結(jié)構(gòu)和/或功能的改變，導(dǎo)致W肺血管 阻力進(jìn)行性升高為特點(diǎn)的臨床綜合征。在肺動(dòng)脈高壓的形成和發(fā)展機(jī)制中，致死性、難治性 的進(jìn)行性肺血管重構(gòu)具有極為重要的作用。肺血管重構(gòu)W平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞功能 障礙為主要特征，可W導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管閉塞，引起肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓力明顯增高，進(jìn)而 可誘發(fā)右屯、室功能不全。
[0006] 肺動(dòng)脈高壓預(yù)后較差，平均存活時(shí)間僅為2.8年，其早期診斷和治療仍然是目前面 臨的臨床難題。肺動(dòng)脈高壓藥物治療十分困難，目前臨床用藥，其治療機(jī)制主要是通過擴(kuò)張 肺血管來降低肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓力，如:巧通道阻滯劑、前列環(huán)素、憐酸二醋酶-5抑制 劑等，上述藥物僅緩解壓力，但對于抑制細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)沒有明確的作用。
[0007] 盡管已知利拉魯膚等GLP-1受體激動(dòng)劑對糖代謝的調(diào)節(jié)作用可通過激活A(yù)MPK通路 實(shí)現(xiàn)，而AMPK作為機(jī)體調(diào)節(jié)代謝的核屯、分子被激活可促進(jìn)分解代謝，下調(diào)合成代謝，恢復(fù)能 量代謝平衡，同時(shí)可降低HIF-la表達(dá)，抑制糖酵解水平的異常升高。但目前并未見到化P-1 受體激動(dòng)劑用于肺高壓治療的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的最終目的是提供一種肺動(dòng)脈高壓治療藥物，直接目的是發(fā)現(xiàn)化P-1受體 激動(dòng)劑的新的功能一-用于肺動(dòng)脈高壓的治療，特別是在有效抑制異常的細(xì)胞增生，減輕 肺血管重構(gòu)方面的作用。
[0009 ]發(fā)明人基于W下認(rèn)識(shí)和分析，設(shè)計(jì)了本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0010] 肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖與糖代謝異常有著密切的關(guān)系。對于肺動(dòng)脈高壓患 者，由于缺氧誘導(dǎo)因子HIF-la的表達(dá)和活化異常增強(qiáng)，會(huì)引起一系列與糖代謝有關(guān)的酶，如 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、己糖激酶、乳酸脫氨酶A、丙酬酸脫氨酶激酶和丙酬酸脫氨酶等的改變，從而 導(dǎo)致肺血管細(xì)胞的葡萄糖代謝方式從正常的線粒體有氧氧化向異常的糖酵解轉(zhuǎn)化，糖酵解 不斷增強(qiáng)，糖酵解的中間代謝產(chǎn)物可為細(xì)胞增殖合成DNA等提供大量底物，而且，細(xì)胞氧耗 與能量合成平衡被打破，能量代謝效率下降，線粒體功能障礙，從而破壞了肺血管平滑肌細(xì) 胞的增殖與調(diào)亡之間的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致或促進(jìn)肺血管重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的形成。
[0011] 本發(fā)明人認(rèn)為，如果能應(yīng)用化P-1受體激動(dòng)劑，通過其對細(xì)胞糖代謝的調(diào)節(jié)作用， 抑制細(xì)胞糖酵解，促進(jìn)線粒體功能，恢復(fù)細(xì)胞代謝效率，就有可能控制或逆轉(zhuǎn)肺血管平滑肌 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖，從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，達(dá)到治療肺動(dòng)脈高壓的目的。
[0012] 因此，推測運(yùn)類藥物有可能用于肺動(dòng)脈高壓的治療。
[0013] 本發(fā)明用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等多方實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了上述設(shè)想，首次證實(shí) GLP-1受體激動(dòng)劑可W作為肺動(dòng)脈高壓治療藥物，特別是能夠有效地抑制異常的細(xì)胞增生， 減輕肺血管重構(gòu)。
[0014] 所述實(shí)驗(yàn)如下：
[001引動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
[0016] 經(jīng)典大鼠肺高壓模型證明，與不用藥的對照組相比，GLP-1受體激動(dòng)劑治療組可明 顯降低肺高壓動(dòng)物模型的肺動(dòng)脈壓力，并明顯降低肺血管阻力和右屯、肥厚程度；
[0017] 體外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0018] 大鼠肺組織切片染色表明，與不用藥的對照組相比，GLP-1受體激動(dòng)劑治療組可明 顯減輕肺血管肌化程度和炎性細(xì)胞浸潤程度，提示肺高壓典型病理表現(xiàn)肺血管重構(gòu)減輕； 大鼠肺組織碳酸酢酶免疫組化染色，治療組大鼠肺組織碳酸酢酶水平較不用藥對照組相比 顯著下降，提示組織缺氧程度減輕；
[0019] 大鼠肺組織蛋白印記檢測顯示，治療組較不用藥對照組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白1 (Glut-1)表達(dá)下降，pAMPK/AMPK比例明顯升高;且表皮生長因子刺激人肺血管平滑肌細(xì)胞 模擬重構(gòu)肺血管細(xì)胞模型證明，GLP-1受體激動(dòng)劑可顯著抑制人肺血管平滑肌細(xì)胞增生、降 低細(xì)胞葡萄糖攝取W及糖酵解終產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生，提示化P-1受體激動(dòng)劑可有效干預(yù)細(xì)胞 代謝，抑制糖酵解。
[0020] 上述各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證實(shí):GLP-1受體激動(dòng)劑能夠通過對細(xì)胞糖代謝方式進(jìn)行調(diào)節(jié)。其 藥理機(jī)制是:有效地降低細(xì)胞糖酵解水平，抑制肺血管細(xì)胞的異常增生，顯著減輕肺血管重 構(gòu)，從而降低肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓力，能夠達(dá)到治療肺動(dòng)脈高壓的目的。
[0021] 而現(xiàn)有技術(shù)中治療肺動(dòng)脈高壓的藥物主要是通過擴(kuò)張肺血管來降低肺血管阻力 和肺動(dòng)脈壓力，對于抑制細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)沒有明確的作用。而本發(fā)明的藥物從根本上 解決了問題。
[0022] 本發(fā)明所述的化P-1受體激動(dòng)劑包括但不限于艾塞那膚（exenatide)、利拉魯膚 (liraglutide)和利西拉來（lixisenatide)，阿必魯膚（albiglutide)，杜拉魯膚 (dulaglutide)。
[0023] 通過本發(fā)明給予的啟示，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W預(yù)見：能夠?qū)?xì)胞糖代謝進(jìn)行調(diào)節(jié) 的GLP-1受體激動(dòng)劑，都可W達(dá)到本發(fā)明的目的。
【附圖說明】
[0024] 圖1大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和利拉魯膚治療組肺動(dòng)脈壓力測定結(jié) 果的比較，顯示利拉魯膚治療組的肺動(dòng)脈壓力明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[0025] 圖2大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和利拉魯膚治療組肺血管阻力測定結(jié) 果的比較，顯示利拉魯膚治療組的肺血管阻力明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[00%]圖3大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和利拉魯膚治療組右屯、肥厚指數(shù)測定 結(jié)果的比較，顯示利拉魯膚治療組右屯、肥厚程度明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[0027]圖4大鼠肺高壓模型組和利拉魯膚治療組分別進(jìn)行肺組織彈性纖維EVG染色，檢測 肺血管肌化程度。結(jié)果顯示:箭頭所指為重構(gòu)的彈性纖維層，利拉魯膚治療組肺血管肌化程 度較肺高壓模型組明顯減輕。
[00%]圖5大鼠肺高壓模型組和利拉魯膚治療組分別進(jìn)行肺組織CD68染色，檢測炎性細(xì) 胞浸潤程度。結(jié)果顯示：箭頭所指為CD68陽性的細(xì)胞，即浸潤在肺血管周圍的炎性細(xì)胞，利 拉魯膚治療組炎性細(xì)胞浸潤程度較肺高壓模型組明顯減輕。
[0029] 圖6 Glut-l、pAMPK/AMPK表達(dá)蛋白印記檢測，結(jié)果顯示:利拉魯膚治療組較肺高壓 組大鼠肺組織pAMPK/AMPK比例明顯升高，提示AMPK憐酸化程度增高，Glut-1表達(dá)顯著減少。
[0030] 圖7肺組織碳酸酢酶免疫組化染色，結(jié)果顯示:箭頭所指為碳酸酢酶免疫組化染色 陽性的肺血管組織，利拉魯膚治療組較肺高壓組大鼠肺組織碳酸酢酶水平顯著下降。
[0031] 圖8大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和艾塞那膚治療組肺動(dòng)脈壓力測定結(jié) 果的比較，顯示艾塞那膚治療組的肺動(dòng)脈壓力明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[0032] 圖9大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和艾塞那膚治療組肺血管阻力測定結(jié) 果的比較，顯示艾塞那膚治療組的肺血管阻力明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[0033] 圖10大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和艾塞那膚治療組右屯、肥厚指數(shù)測定 結(jié)果的比較，顯示艾塞那膚治療組右屯、肥厚程度明顯低于肺高壓模型未用藥組。
【具體實(shí)施方式】
[0034] W下實(shí)施例所用的藥物僅用于舉例說明本發(fā)明，并不限定本發(fā)明所稱的化P-1受 體激動(dòng)劑的范圍。
[0035] 實(shí)施例1 GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯膚對肺高壓動(dòng)物的治療作用
[0036] 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[0037] 通過建立肺高壓動(dòng)物模型，并利用化P-1受體激動(dòng)劑利拉魯膚進(jìn)行治療，通過對大 鼠肺動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)和右屯、肥厚指標(biāo)的檢測，觀察利拉魯膚的療效。
[0038] 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)方法
[0039] 選擇體重為220-230g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為Ξ組，分別為健康對照組、肺動(dòng)脈高 壓模型未用藥組和藥物治療組，每組6只。健康對照組僅皮下注射生理鹽水。未用藥組和藥 物治療組均皮下注射野百合堿(Sigma公司)誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓形成，野百合堿單次注射，注射 劑量為60mg/Kg。藥物治療組于野百合堿注射后7天開始，再連續(xù)14天每日腹腔注射利拉魯 膚(Novo Nordisk公司）治療，劑量為0.4mg/Kg。
[0040] 野百合堿單次注射后Ξ周，利用右屯、導(dǎo)管測量各組大鼠的右屯、和肺動(dòng)脈血流動(dòng)力 學(xué)指標(biāo)。大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酬/美托咪挫混合液2mL/Kg麻醉后，將預(yù)制導(dǎo)管連接壓力測量 儀，經(jīng)右頸外靜脈插管，經(jīng)上腔靜脈到達(dá)右房、右室、肺動(dòng)脈，分別記錄右屯、房、右屯、室、肺動(dòng) 脈壓力完畢后，將導(dǎo)管退入至右屯、室，固定。取左屯、導(dǎo)管經(jīng)頸動(dòng)脈插管，測量體循環(huán)動(dòng)脈壓， 進(jìn)入左屯、室，測量左屯、壓力，記錄完畢后撤出左屯、導(dǎo)管，再經(jīng)相同路徑插入溫度測量導(dǎo)管， 進(jìn)行熱稀釋法屯、輸出量測量。從右屯、導(dǎo)管注入固定體積冰鹽水Ξ次，記錄每次注入生理鹽 水的體積和溫度，并記錄左屯、室內(nèi)溫度變化。根據(jù)平均肺動(dòng)脈壓、屯、輸出量計(jì)算肺血管阻 力。
[0041] 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測量完畢后，撤出導(dǎo)管，解剖大鼠，取材。仔細(xì)分離左右屯、室并稱 重，并計(jì)算右屯、肥厚指數(shù)，右屯、肥厚指數(shù)=右屯、質(zhì)量/左屯、和室間隔質(zhì)量之和。
[0042] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0043] 1)健康對照組大鼠平均肺動(dòng)脈壓力為18.78 ± 3.60mmHg，未用藥組和藥物治療組 的平均肺動(dòng)脈壓分別為44.90 ± 11.57mmHg和30.86 ± 4.85mmHg，未用藥組壓力較健康對照 組明顯升高，而藥物治療組明顯低于未用藥組，兩組間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇.001，圖 1)；
[0044] 2)健康對照組大鼠肺血管阻力為0.19±0.09mmHg/mL/min，未用藥組和藥物治療 組的肺血管阻力分別為0.40 ±0.02mmHg/mL/min和0.31 ±0.03mmHg/mL/min，未用藥組阻力 較健康對照組明顯升高，藥物治療組明顯低于未用藥組，兩組間同樣有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.05,圖2)。
[0045] 3)健康對照組、未用藥組和藥物治療組的體循環(huán)動(dòng)脈壓分別為113. 56 ± 26.38111111化、103.24±3.93111111化和109.16±9.15111恤旨，屯、輸出量分別為94.47±19.5311117 min、89.85 ±4.48mL/min和91.54 ± 10.77mL/min，Ξ組間均無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均為P〉 0.05)。
[0046] 4)此外，健康對照組、未用藥組和藥物治療組的右屯、肥厚指數(shù)分別為0.26±0.01、 0.44 ± 0.10和0.34 ± 0.04，未用藥組右屯、明顯肥厚，而藥物治療組右屯、肥厚程度明顯低于 未用藥組，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇.01，圖3)。
[0047] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[004引對比未用藥的肺高壓模型組，利拉魯膚能夠明顯降低平均肺動(dòng)脈壓和肺血管阻 力，而體循環(huán)動(dòng)脈壓、屯、輸出量未受到影響。且能夠明顯減輕右屯、肥厚程度。
[0049]表1各實(shí)驗(yàn)組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和右屯、肥厚指標(biāo)的比較
[(Κ)加 ]
[0052]實(shí)施例2 GLP-1受體激動(dòng)劑艾塞那膚對肺高壓動(dòng)物的治療作用 [0化3] 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[0054] 通過建立肺高壓動(dòng)物模型，并利用化P-1受體激動(dòng)劑艾塞那膚進(jìn)行治療，通過對大 鼠肺動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)和右屯、肥厚指標(biāo)的檢測，觀察艾塞那膚的療效。
[0055] 2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)方法
[0056] 選擇體重為220-230g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為Ξ組，分別為健康對照組、肺動(dòng)脈高 壓模型未用藥組和藥物治療組，每組6只。健康對照組僅皮下注射生理鹽水。未用藥組和藥 物治療組均皮下注射野百合堿(Sigma公司)誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓形成，野百合堿單次注射，注射 劑量為60mg/Kg。藥物治療組于野百合堿注射后7天開始，再連續(xù)14天每日腹腔注射艾塞那 膚(As traZeneca公司）治療，劑量為1 Oyg/Kg。
[0057] 野百合堿單次注射后Ξ周，利用右屯、導(dǎo)管測量各組大鼠的右屯、和肺動(dòng)脈血流動(dòng)力 學(xué)指標(biāo)。大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酬/美托咪挫混合液2mL/Kg麻醉后，將預(yù)制導(dǎo)管連接壓力測量 儀，經(jīng)右頸外靜脈插管，經(jīng)上腔靜脈到達(dá)右房、右室、肺動(dòng)脈，分別記錄右屯、房、右屯、室、肺動(dòng) 脈壓力完畢后，將導(dǎo)管退入至右屯、室，固定。取左屯、導(dǎo)管經(jīng)頸動(dòng)脈插管，測量體循環(huán)動(dòng)脈壓， 進(jìn)入左屯、室，測量左屯、壓力，記錄完畢后撤出左屯、導(dǎo)管，再經(jīng)相同路徑插入溫度測量導(dǎo)管， 進(jìn)行熱稀釋法屯、輸出量測量。從右屯、導(dǎo)管注入固定體積冰鹽水Ξ次，記錄每次注入生理鹽 水的體積和溫度，并記錄左屯、室內(nèi)溫度變化。根據(jù)平均肺動(dòng)脈壓、屯、輸出量計(jì)算肺血管阻 力。
[005引血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測量完畢后，撤出導(dǎo)管，解剖大鼠，取材。仔細(xì)分離左右屯、室并稱 重，并計(jì)算右屯、肥厚指數(shù)，右屯、肥厚指數(shù)=右屯、質(zhì)量/左屯、和室間隔質(zhì)量之和。
[0化9] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0060] 1)健康對照組大鼠平均肺動(dòng)脈壓力為14.83 ± 3.27mmHg，未用藥組和藥物治療組 的平均肺動(dòng)脈壓分別為36.37 ± 5.61mmHg和30.11 ± 2.17mmHg，未用藥組壓力較健康對照組 明顯升高，而藥物治療組明顯低于未用藥組，兩組間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇.01，圖8); [0061 ] 2)健康對照組大鼠肺血管阻力為0.16 ± 0.03mmHg/mL/min，未用藥組和藥物治療 組的肺血管阻力分別為ο. 39 ±0.05mmHg/mL/min和ο. 31 ±0.0 lmmHg/mL/min，未用藥組阻力 較健康對照組明顯升高，藥物治療組明顯低于未用藥組，兩組間同樣有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P<0.001，圖9)。
[0062] 3)健康對照組、未用藥組和藥物治療組的體循環(huán)動(dòng)脈壓分別為102.33 ± 9.02111111化、98.31±10.76111111化和98.60±9.91111111化，屯、輸出量分別為95.20±4.5611117111111、 92.20 ± 7.49mL/min和96.08 ±8.12mL/min，Ξ組間均無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P〉0.05)。
[0063] 4)此外，健康對照組、未用藥組和藥物治療組的右屯、肥厚指數(shù)分別為0.27±0.03、 0.43 ± 0.07和0.33 ± 0.04，未用藥組右屯、明顯肥厚，而藥物治療組右屯、肥厚程度明顯低于 未用藥組，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<〇.01，圖10)。
[0064] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0065] 對比未用藥的肺高壓模型組，艾塞那膚能夠明顯降低平均肺動(dòng)脈壓和肺血管阻 力，而體循環(huán)動(dòng)脈壓、屯、輸出量未受到影響。且能夠明顯減輕右屯、肥厚程度。
[0066] 表2各實(shí)驗(yàn)組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和右屯、肥厚指標(biāo)的比較
[0067]
[006引實(shí)施例3 GLP-1受體激動(dòng)劑對肺血管重構(gòu)的影響
[0069] 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[0070] 體外組織檢測評價(jià)利拉魯膚治療對肺血管重構(gòu)的影響。
[0071] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0072] 上述各組大鼠處死后，取出新鮮肺組織浸泡在10%福爾馬林溶液中過夜，然后換 70%乙醇保存，石蠟包埋切片，進(jìn)行彈性纖維EVG染色測量肺血管肌化程度和CD68染色測量 炎性細(xì)胞浸潤程度。
[0073] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0074] 肺高壓模型未用藥組和藥物治療組的肺血管肌化程度分別為66.96±6.28%和 49.78±4.83%，利拉魯膚治療后肺血管肌化程度明顯減低，兩組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.001，圖4);未用藥組和藥物治療組的CD68陽性細(xì)胞數(shù)分別為20.01 ±2.51個(gè)/mm哺9.28 ±5.93個(gè)/mm2,利拉魯膚治療后，炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,圖 5)。
[00巧]4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0076] 對比肺高壓模型組，利拉魯膚治療后肺血管肌化和炎性細(xì)胞浸潤等肺血管重構(gòu)病 理變化明顯減輕。
[0077] 實(shí)施例4 GLP-1受體激動(dòng)劑對細(xì)胞增生的影響 [007引1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[0079] 通過進(jìn)行體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(BrdU染色)評價(jià)利拉魯膚對肺血管平滑肌細(xì)胞增生 的影響。
[0080] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0081 ]平底透明96孔板培養(yǎng)人肺血管平滑肌細(xì)胞(第Ξ至五代）（L0NZA公司），細(xì)胞密度 約5000個(gè)/mL，每孔體積10化1，普通10%牛血清培養(yǎng)液，37攝氏度、5%C02培養(yǎng)過夜。第二 日，移除陳舊培養(yǎng)液，換成0.05 %牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，使其生長速率均一化。
[0082] 24小時(shí)后，用含10%牛血清無生長因子的培養(yǎng)液配制濃度為50ng/ml的表皮生長 因子(PDGF)溶液、PDGF (50ng/ml) +利拉魯膚(20μΜ)溶液和 PDGF (50ng/ml) +利拉魯膚(50μΜ) 溶液分別作為培養(yǎng)液，將人肺血管平滑肌細(xì)胞分成對照組、PDGF組和利拉魯膚治療組(PDGF +利拉魯膚），每組η = 6，37攝氏度、5 % C〇2培養(yǎng)。48小時(shí)后向各組加入化加繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí) 至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)72小時(shí)。移除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞固定液固定細(xì)胞30分鐘后，移除固定液加入抗體 室溫解育1小時(shí)，洗一次，加入二抗室溫解育30分鐘后洗兩次，加入10化1反應(yīng)底物，暗室室 溫解育30分鐘后加入反應(yīng)終止溶液10化1，使用多功能微孔板檢測儀(Promega公司），450皿 吸收峰讀數(shù)。
[0083] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0084] PDGF組細(xì)胞增生速率為對照組細(xì)胞1.5倍，而20μΜ和50μΜ利拉魯膚治療組細(xì)胞增 生速率僅分別是對照組細(xì)胞1.27倍和1.26倍，利拉魯膚治療組較PDGF組細(xì)胞增生速率顯著 下降，其差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.05)。
[0085] 另外，為了研究利拉魯膚治療在正常條件下對健康細(xì)胞增生有無影響，在相同細(xì) 胞條件下，無 PDGF刺激，進(jìn)行細(xì)胞增生化加染色，20ιχΜ和SOiiM利拉魯膚治療72小時(shí)，和對照 組細(xì)胞相比，細(xì)胞增生速率差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〉〇.05)。
[00化]4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0087] 利拉魯膚能夠顯著降低PDGF誘導(dǎo)的肺血管平滑肌細(xì)胞增生，而對正常條件下的健 康細(xì)胞無明顯的影響。
[0088] 實(shí)施例5 GLP-1受體激動(dòng)劑對體外細(xì)胞葡萄糖攝取的作用
[0089] 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[0090] 通過巧光標(biāo)記2-N-[7-硝基苯-2-乙二酸-3,4-二徑氨基]-2-脫氧葡萄糖(2-NBDG) 攝取實(shí)驗(yàn)測定GLP-1受體激動(dòng)劑對肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響
[0091] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0092] 平底黑色96孔板培養(yǎng)人肺血管平滑肌細(xì)胞(第Ξ至五代KL0NZA公司），細(xì)胞密度 約5000個(gè)/mL，每孔10化1，普通10 %牛血清培養(yǎng)液，37攝氏度，5 % C〇2培養(yǎng)過夜。移除陳舊培 養(yǎng)液，用含10 %牛血清無生長因子的培養(yǎng)液配置PDGF(5化g/ml)和PDGF(5化g/ml)+利拉魯 膚(50μΜ)溶液分別作為培養(yǎng)液，
[0093] 將細(xì)胞分成對照組、表皮生長因子(PDGF)組及治療組(PDGF+利拉魯膚），每組η = 6,37攝氏度、5%C02培養(yǎng)。72小時(shí)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)前3小時(shí)，向各組加入100μl2-NBDG(Cayman 化emical公司），最終濃度l(K)μg/ml，解育3小時(shí)后離屯、96孔板(400xg，室溫5分鐘），小屯、吸 去上清，憐酸鹽緩沖液洗Ξ次后，加入100μΙ分析緩沖液，使用多功能微孔板檢測儀 (Promega公司），激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm，巧光讀數(shù)獲取巧光強(qiáng)度。用細(xì)胞質(zhì)量校正 結(jié)果。
[0094] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[00M]對照組、PDGF組、利拉魯膚治療組人肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取水平校正巧光 強(qiáng)度分別為 3225.86 ± 787.93、6190.32 ± 980.76 和 3868.20 ± 14：34.26。72 小時(shí) PDGF 刺激誘 導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取增加，而利拉魯膚顯著減少了人肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖 攝取(P<〇.〇5)
[0096] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0097] 人肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取經(jīng)治療后顯著減低，表示利拉魯膚可調(diào)節(jié)細(xì)胞葡 萄糖代謝，進(jìn)而有可能抑制肺血管增生、改善肺血管重構(gòu)。
[0098] 實(shí)施例6GLP-1受體激動(dòng)劑對細(xì)胞糖酵解水平的作用
[0099] 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>[0100] 通過測量細(xì)胞外環(huán)境乳酸水平，檢測對細(xì)胞糖酵解水平的影響。
[0101] 說明：乳酸為細(xì)胞糖酵解過程終產(chǎn)物，并被釋放至細(xì)胞外環(huán)境，被分泌至細(xì)胞外環(huán) 境的乳酸水平與細(xì)胞糖酵解水平呈正相關(guān)，因此，采用對利拉魯膚治療后的人肺血管平滑 肌細(xì)胞外環(huán)境乳酸水平的檢測，可W研究利拉魯膚對細(xì)胞糖酵解過程W及肺血管重構(gòu)的影 響。
[0102] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0103] 平底透明96孔板培養(yǎng)人肺血管平滑肌細(xì)胞(第Ξ至五代）（L0NZA公司），細(xì)胞密度 約5000個(gè)/mL，每孔10化1，普通10%牛血清培養(yǎng)液，37攝氏度、5%C02培養(yǎng)過夜。移除陳舊培 養(yǎng)液，用含10%牛血清無生長因子的培養(yǎng)液配置PDGF(50ng/ml)，PDGF(50ng/ml)+利拉魯膚 (50μΜ)溶液分別作為培養(yǎng)液，細(xì)胞分成對照組、表皮生長因子(PDGF)組及治療組(PDGF+利 拉魯膚），每組η = 6，37攝氏度、5 % C〇2培養(yǎng)72小時(shí)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)離屯、96孔板（100化pm，室溫5分 鐘），每孔分別取扣1上清測量各組細(xì)胞乳酸水平。依照廠家提供試劑及實(shí)驗(yàn)方法步驟，另取 一空96孔板，分別放入不同濃度梯度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品（Cayman化emical公司）及相對應(yīng)組 別每孔扣1細(xì)胞上清液，向所有各孔加入100μΙ反應(yīng)液后，將96孔板置于搖床室溫緩慢反應(yīng) 30分鐘。反應(yīng)30分鐘結(jié)束后，使用多功能微孔板檢測儀(Promega公司），49化m吸收峰讀數(shù)。 根據(jù)乳酸脫氨酶催化氧化乳酸反應(yīng)生成丙酬酸過程中形成NADH還原底物，利用乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣 品，測量吸收峰490nm強(qiáng)度計(jì)算相應(yīng)乳酸水平。
[0104] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0105] 經(jīng)利拉魯膚治療后的人肺血管平滑肌細(xì)胞外環(huán)境的乳酸水平為2.47±0.32mM，較 PDGF刺激增生的人肺血管平滑肌細(xì)胞外乳酸水平(3.12±0.54mM)顯著降低(P<0.05)。
[0106] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0107] 利拉魯膚降低人肺血管平滑肌細(xì)胞糖酵解水平，表示利拉魯膚可調(diào)節(jié)肺血管的糖 代謝失衡，促進(jìn)葡萄糖代謝效率，進(jìn)而改善肺血管重構(gòu)。
[010引實(shí)施例7 GLP-1受體激動(dòng)劑分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測
[0109] 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头椒?br>[0110] 為驗(yàn)證上述利拉魯膚對肺動(dòng)脈高壓的療效，W及對細(xì)胞增生W及葡萄糖代謝的影 響是否與AMPK通路激活并影響下游缺氧誘導(dǎo)因子及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體有關(guān)，分別應(yīng)用蛋白質(zhì)印 記和免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)檢測AMP時(shí)溝酸化水平、缺氧誘導(dǎo)因子直接相關(guān)的細(xì)胞缺氧標(biāo)記 物碳酸酢酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白1(W下亦簡稱Glut-1)。
[0111] (1 )Glut-l、pAMPK/AMPK 表達(dá)蛋白印記檢測
[0112] 新鮮肺組織取出后立即放入液氮保存，利用憐酸鹽裂解液(含lOOmM憐酸根，其中 憐酸氨二鐘:憐酸二氨鐘=3:1，ImM邸TA，ImM二硫蘇糖醇，蛋白酶抑制劑），電動(dòng)低溫勻漿， 12000xg，4攝氏度離屯、20分鐘后保留上清液，并進(jìn)行蛋白定量后，可根據(jù)蛋白印記基本實(shí)驗(yàn) 步驟進(jìn)行目的蛋白表達(dá)檢測。其中，一抗憐酸化AMPK及AMPK抗體(Cell Signalling公司）稀 釋濃度為1:1000,一抗葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白1抗體(Abeam公司）稀釋濃度為1:1000,一抗均于4 攝氏度解育過夜;二抗為辣根過氧化氨酶標(biāo)記抗兔抗體(sigma公司），稀釋濃度為1:2000， 室溫解育1小時(shí)?？贵w解育結(jié)束漂洗后，利用辣根過氧化氨酶化學(xué)發(fā)光法，采用高靈敏度化 學(xué)發(fā)光成像儀顯影(化emidoc，Bi〇-Rad公司），經(jīng)過Image J軟件分析圖像獲得數(shù)據(jù)。
[0113] (2)碳酸酢酶免疫組化染色(CA9)
[0114] 取出各組大鼠新鮮肺組織，浸泡在10%福爾馬林溶液中過夜，然后換70%乙醇保 存，石蠟包埋切片，根據(jù)免疫組織化學(xué)染色基本方法進(jìn)行碳酸酢酶肺組織切片染色。碳酸酢 酶一抗(Novus公司)稀釋濃度為1:100，4攝氏度解育過夜;二抗為辣根過氧化氨酶標(biāo)記抗兔 抗體（Sigma公司），稀釋濃度為1:200,室溫解育1小時(shí)?？贵w解育結(jié)束后，經(jīng)辣根過氧化氨 酶-二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精伊紅染色后，酒精二甲苯脫水固定后封片。
[0115] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論
[0116] 蛋白印記實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):利拉魯膚治療組較肺高壓組大鼠肺組織Glut-1表達(dá)有顯 著減少，pAMPK/AMPK比例明顯升高，提示AMPK憐酸化程度增高，AMPK通路被激活，且下游葡 萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)下降。
[0117] 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):碳酸酢酶在利拉魯膚治療組有顯著下降，提示利拉魯膚 治療后，AMPK通路下游缺氧誘導(dǎo)因子下調(diào)，組織缺氧程度減輕(圖6，圖7)。
[0118] W上實(shí)驗(yàn)結(jié)論表明，利拉魯膚能夠激活機(jī)體能量代謝核屯、通路AMPK，平衡肺血管 葡萄糖代謝，減輕細(xì)胞組織缺氧，從而改善肺高壓肺血管重構(gòu)病變，治療肺動(dòng)脈高壓。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑在制備治療肺動(dòng)脈高壓藥物中的應(yīng)用。2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述治療肺動(dòng)脈高壓，是減輕肺血管重構(gòu)。3. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述治療肺動(dòng)脈高壓，是抑制異常的細(xì)胞增生。4. 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述抑制異常的細(xì)胞增生是抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增生。5. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述治療肺動(dòng)脈高壓，是降低細(xì)胞糖酵解水平。6. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑，是具有對肺動(dòng)脈細(xì)胞糖 代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)功能的胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑。7. 權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑選自艾塞那肽 (exenatide)、利拉魯肽（liraglutide)、利西拉來（lixisenatide)，阿必魯肽 (albiglutide)，或杜拉魯肽（dulaglutide)。8. -種治療肺動(dòng)脈高壓的藥物，其特征是，其活性成分是胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng) 劑。9. 權(quán)利要求8所述的藥物，所述治療肺動(dòng)脈高壓，是抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增生并減輕 肺血管重構(gòu)。10. 權(quán)利要求8所述的藥物，所述胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑選自艾塞那肽 (exenatide)、利拉魯肽（liraglutide)、利西拉來（lixisenatide)，阿必魯肽 (albiglutide)，或杜拉魯肽（dulaglutide)。
【文檔編號(hào)】A61P9/12GK105999272SQ201610526144
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】汪蕾, 方緯
【申請人】汪蕾, 方緯