禽類活病毒用凍干保護劑、制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種禽類活病毒用凍干保護劑、制備方法及應(yīng)用，屬于獸藥技術(shù)領(lǐng)域。每1000mL凍干保護劑由以下組分組成：蔗糖40～100g，精氨酸0.5～2g，甘露醇0.5～1g，余量為0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液。本發(fā)明中禽類活病毒用凍干保護劑不含有明膠、人血白蛋白、右旋糖酐等大分子過敏原性成分，配方簡單，安全性高，效果好。與禽類活病毒培養(yǎng)物混合均勻后凍干，于2～8℃下保存24個月后外觀、真空度、水分含量、病毒滴度均無明顯變化，能極大地提高獸用生物制品企業(yè)毒種的質(zhì)量。并且，該凍干保護劑的制備工藝簡單、操作簡便，適于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用，生產(chǎn)成本較低。
【專利說明】
禽類活病毒用凍干保護劑、制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種禽類活病毒用凍干保護劑，同時還設(shè)及該凍干保護劑的制備方法 及應(yīng)用，屬于獸藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽類活病毒培養(yǎng)物(毒種)是獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)制造獸用生物制品的基礎(chǔ)，毒 種質(zhì)量的優(yōu)劣直接關(guān)系到制品的質(zhì)量，合格的毒種是生產(chǎn)高質(zhì)量制品的前提和重要保證。 獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)通過建立完善的毒種種子批管理制度，實現(xiàn)毒種種子組成的均一 性、同一性和穩(wěn)定性，W此來滿足相當長時間內(nèi)的生產(chǎn)需要。
[0003] 基礎(chǔ)種子由原始種子經(jīng)適當方式傳代擴增而來，增殖到一定數(shù)量后，將相同代次 的所有培養(yǎng)物均勻混合成一批，定量分裝，保存于超低溫冰箱中或經(jīng)冷凍干燥后置適宜條 件下保存。通常情況下，應(yīng)對基礎(chǔ)種子批進行病毒含量測定及安全或毒力測試，同時進行免 疫抑制、毒力返強及免疫原性試驗等。種子批應(yīng)達到足夠的規(guī)模，并含有足量的活病毒，因 此毒種必須保存于超低溫冰箱中或經(jīng)冷凍干燥后置適宜條件下保存。但是超低溫冰箱的能 耗較高，且保存毒種的穩(wěn)定性差，保存期短。
[0004] 冷凍干燥是目前用于微生物、蛋白質(zhì)等生物制品保存的最常用、最有效的方法。凍 干保護劑和冷凍干燥技術(shù)是保證活病毒培養(yǎng)物質(zhì)量的關(guān)鍵。凍干保護劑包括有機高分子物 質(zhì)、抗氧化劑等組分，其中有機高分子物質(zhì)能夠保證病毒活力及抗原穩(wěn)定性，遇熱不會焦糖 化且耐干燥，能夠與冷凍的低分子物質(zhì)形成凍干活病毒耐熱性結(jié)構(gòu)，而抗氧化劑具有高度 抗氧化作用，能最大限度地消耗介質(zhì)中的氧，減少病毒與氧的接觸，降低病毒的代謝活力及 能量消耗，防止其在冷凍干燥及膽存過程中死亡。在冷凍干燥過程中，冷凍和干燥不可避免 地會造成部分微生物細胞的損傷及死亡，或者引起蛋白質(zhì)變性。公布號CN102657870A的發(fā) 明專利公開了一種疫苗用凍干保護劑，包含W下組分(g/L):右旋糖酢(40)10~60,薦糖10 ~60,乳糖10~50,甘露醇5~30,甘氨酸5~20,精氨酸1~10,谷氨酸鋼1~10,尿素1~10， 199綜合培養(yǎng)基1~50,該凍干保護劑不含有明膠及人血蛋白成分，疫苗內(nèi)毒素含量低，對人 體的刺激性和危害性小，但配方復(fù)雜，且不適于禽類活病毒的凍干保存。
[0005] 因此，為提高冷凍干燥后毒種的存活率、生物活性W及長時間保存的穩(wěn)定性，研制 一種配方簡單、安全性高、效果好的禽類活病毒培養(yǎng)物用凍干保護劑勢在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種配方簡單、安全性高、效果好的禽類活病毒用凍干保護 劑。
[0007] 同時，本發(fā)明還提供一種上述凍干保護劑的制備方法及應(yīng)用。
[000引為了實現(xiàn)W上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0009]禽類活病毒用凍干保護劑，每lOOOmL由W下組分組成：薦糖40~lOOg，精氨酸0.5 ~2g，甘露醇0.5~Ig，余量為O.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液。
[0010] 優(yōu)選的，禽類活病毒用凍干保護劑，每lOOOmL由w下組分組成：薦糖lOOg，精氨酸 0.5g，甘露醇Ig，余量為0.0 lmol/L憐酸鹽緩沖溶液。
[0011] 所述O.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液的組成為：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2冊〇4 1.44邑， K出P040.24g，pH7.2~7.6。也可采用市售商品。
[0012] 禽類活病毒用凍干保護劑的制備方法，包括W下步驟:按照用量準確取薦糖、精氨 酸和甘露醇，與0.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液混勻后定容，滅菌，即可?；旌蠒r可適當加熱，W 促進組分溶解。
[0013] 禽類活病毒用凍干保護劑的應(yīng)用，具體為:將禽類活病毒培養(yǎng)物、凍干保護劑混勻 后凍干，即可。
[0014] 所述禽類活病毒培養(yǎng)物與凍干保護劑的體積比為1:1。
[0015] 所述凍干的操作為:預(yù)凍后于-50~-70°C、真空條件下凍干，即可。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] 本發(fā)明中禽類活病毒用凍干保護劑由薦糖、甘露醇、精氨酸和0.Olmol/L憐酸鹽緩 沖溶液組成，配方簡單，安全性高，效果好。其中，0.0 lmol/L憐酸鹽緩沖溶液更接近于活體 生物的體液，可通過此ρ〇4\ηρ〇42?'司的轉(zhuǎn)變實現(xiàn)r轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮緩沖作用，并維持滲透壓 平衡，盡量保證與禽類活病毒培養(yǎng)物原始生境的相似性，而蒸饋水不具有鹽平衡作用，會破 壞生物蛋白結(jié)構(gòu)并影響其活性，同時生理鹽水不具有P的周節(jié)作用，不能保證活性物質(zhì)在最 適條件下參與生物反應(yīng);薦糖對阻止蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)改變，W及凍干、膽存過程中蛋白質(zhì)多 膚鏈的延伸和聚集發(fā)揮重要作用；而甘露醇屬于多徑基化合物，其徑基能夠替代蛋白質(zhì)表 面水分子的徑基，與病毒蛋白質(zhì)表面的氨鍵形成一層假定的水化膜，保護氨鍵的連接位點 不直接暴露在周圍環(huán)境中，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因凍干、膽存而變性； 在凍干過程中，0.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液結(jié)晶會引起pH值變化而使蛋白質(zhì)變性，精氨酸能 夠抑制憐酸鹽緩沖溶液結(jié)晶所致pH值改變，從而阻止蛋白質(zhì)變性。
[0018] 本發(fā)明中禽類活病毒用凍干保護劑不含有明膠、人血白蛋白、右旋糖酢等大分子 過敏原性成分，制備工藝簡單、操作簡便，適于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用，生產(chǎn)成本較低。與禽 類活病毒培養(yǎng)物混合均勻后凍干，于2~8°C下保存24個月后外觀、真空度、水分含量、病毒 滴度均無明顯變化，安全、穩(wěn)定、有效，能極大地提高獸用生物制品企業(yè)毒種的質(zhì)量。
【具體實施方式】
[0019] 下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0020] 實施例1
[0021] 禽類活病毒用凍干保護劑，每lOOOmL由W下組分組成:薦糖40g，精氨酸2g，甘露醇 〇.5g，余量為0.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液。0.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液的組成為:NaCl 8邑， KC1 0.2g，Na抽P〇4 1.44g，K出P〇4 0.24g，pH 7.4。
[0022] 上述凍干保護劑的制備步驟為：按照用量準確稱取薦糖40g、精氨酸2g和甘露醇 0.5g，將薦糖、精氨酸、甘露醇依次加入800mL 0.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液中，加熱攬拌溶解 后定容至lOOOmL，于121°C高壓滅菌30min，存于4°C備用。
[0023] 上述凍干保護劑的應(yīng)用，具體為:無菌條件下，將禽流感-HP株活病毒培養(yǎng)物（10日 齡雞胚制備）與等量（體積比1:1)凍干保護劑混合均勻，定量分裝于lOmL無菌西林瓶中 (2mL/瓶）；半壓塞后無菌保存于-60°C超低溫冰箱中，使樣品快速凍結(jié)，再在無菌條件下快 速置于已于-60°C預(yù)冷30mi η的真空冷凍干燥機中，-60°C下冷凍干燥1她;冷凍干燥完畢，壓 塞加蓋，貼簽保存于4°C冰箱中備用。
[0024] 實施例2
[0025] 禽類活病毒用凍干保護劑，每lOOOmL由W下組分組成:薦糖60g，精氨酸1.5g，甘露 醇〇.6g，余量為O.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液。O.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液的組成同實施例1。
[0026] 上述凍干保護劑的制備及應(yīng)用同實施例1。
[0027] 實施例3
[00%]禽類活病毒用凍干保護劑，每lOOOmL由W下組分組成:薦糖80g，精氨酸Ig，甘露醇 〇.8g，余量為O.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液。O.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液的組成同實施例1。
[0029] 上述凍干保護劑的制備及應(yīng)用同實施例1。
[0030] 實施例4
[0031] 禽類活病毒用凍干保護劑，每lOOOmL由W下組分組成：薦糖lOOg，精氨酸0.5g，甘 露醇Ig，余量為O.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液。O.Olmol/L憐酸鹽緩沖溶液的組成同實施例1。
[0032] 上述凍干保護劑的制備及應(yīng)用同實施例1。
[0033] 實施例5
[0034] 禽類活病毒用凍干保護劑的組成及制備同實施例4。
[0035] 上述凍干保護劑的應(yīng)用，具體為:無菌條件下，將鴨肝炎病毒-SD株活病毒培養(yǎng)物 (4日齡維鴨制備)與等量(體積比1:1)凍干保護劑混合均勻，定量分裝于lOmL無菌西林瓶中 (2mL/瓶）；半壓塞后無菌保存于-60°C超低溫冰箱中，使樣品快速凍結(jié)，再在無菌條件下快 速置于已于-60°C預(yù)冷30mi η的真空冷凍干燥機中，-60°C下冷凍干燥1她;冷凍干燥完畢，壓 塞加蓋，貼簽保存于4°C冰箱中備用。
[0036] 實施例6
[0037] 禽類活病毒用凍干保護劑的組成及制備同實施例4。
[0038] 上述凍干保護劑的應(yīng)用，具體為:無菌條件下，將小碟攝-WF株活病毒培養(yǎng)物（10日 齡碟胚制備）與等量（體積比1:1)凍干保護劑混合均勻，定量分裝于lOmL無菌西林瓶中 (2mL/瓶）；半壓塞后無菌保存于-60°C超低溫冰箱中，使樣品快速凍結(jié)，再在無菌條件下快 速置于已于-60°C預(yù)冷30mi η的真空冷凍干燥機中，-60°C下冷凍干燥1她;冷凍干燥完畢，壓 塞加蓋，貼簽保存于4°C冰箱中備用。
[0039] 對比例1
[0040] 凍干保護劑，每升由W下用量的組分組成：右旋糖酢(40)50g，薦糖50g，乳糖20g， 甘露醇5g，甘氨酸5g，精氨酸1.85g，谷氨酸鋼9.2g，尿素4.6g，199綜合培養(yǎng)基2g，余量為注 射用水。
[0041] 上述凍干保護劑的制備步驟為:按照用量準確取各組分，混勻后定容；用1N鹽酸調(diào) 節(jié)pH值為7.4，除菌過濾后存于4°C備用。
[0042] 上述凍干保護劑的應(yīng)用，操作同實施例1。
[00創(chuàng)對比例2
[0044] 凍干保護劑及其制備同對比例1，應(yīng)用同實施例5。
[0045] 對比例3
[0046] 凍干保護劑，每升由W下用量的組分組成：人血清白蛋白lOg，薦糖40g，海藻糖 15g，右旋糖酢(70) 50g，谷氨酸鋼6g，尿素3g，精氨酸Ig，甘露醇lOg，余量為PBS緩沖液。
[0047] 上述凍干保護劑的制備步驟為：按照用量準確取各組分，混勻后定容，除菌過濾， 存于4°C備用。
[004引上述凍干保護劑的應(yīng)用，操作同實施例1。
[0049] 對比例4
[0050] 凍干保護劑及其制備同對比例3,應(yīng)用同實施例5。
[0化1 ] 試驗例
[0052]分別將實施例1~6及對比例1~4中凍干粉置于4°C條件下保存，并于保存的第6、 12、18、24個月對其外觀、真空度、剩余水分、病毒滴度進行觀察和檢測，方法參見《中國獸藥 典》(2010版)第Ξ部附錄部分。測試結(jié)果見下表1。
[OOM]表1實施例1~6及對比例1~帥凍干粉在4°C下保存的穩(wěn)定性試驗結(jié)果
[0化4]
[ο化5]
[0056]由表1可知，實施例1~4中凍干保護劑的組分用量雖發(fā)生變化，但凍干粉在4 °C下 保存24個月后其外觀、真空度、水分含量、病毒滴度均無明顯變化，滴度下降均小于0.5。尤 其是實施例4中凍干粉在4°C下保存30個月后外觀、真空度、水分含量、病毒滴度仍無明顯變 化。
[0057]與對比例1~4中凍干粉相比，實施例中凍干粉的保存效果與之相當，或稍好于對 比例。但由于實施例中凍干保護劑的組分較少，配方簡單，因此生產(chǎn)成本較低。
【主權(quán)項】
1. 禽類活病毒用凍干保護劑，其特征在于:每lOOOrnL由以下組分組成：蔗糖40~100g， 精氨酸〇. 5~2g，甘露醇0.5~lg，余量為0.0 lmol/L磷酸鹽緩沖溶液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干保護劑，其特征在于：每lOOOrnL由以下組分組成：蔗糖 l〇〇g，精氨酸〇. 5g，甘露醇lg，余量為0.0 lmol/L磷酸鹽緩沖溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的凍干保護劑，其特征在于:所述0.Olmol/L磷酸鹽緩沖溶液 的組成為：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HP〇4 1.44g，KH2P〇4 0.24g，pH 7.2~7.6。4. 如權(quán)利要求1~3中任一項所述凍干保護劑的制備方法，其特征在于:包括以下步驟： 按照用量準確取蔗糖、精氨酸和甘露醇，與0.0 lmol/L磷酸鹽緩沖溶液混勻后定容，滅菌，即 得。5. 如權(quán)利要求1~3中任一項所述凍干保護劑的應(yīng)用，其特征在于:將禽類活病毒培養(yǎng) 物、凍干保護劑混勻后凍干，即可。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述禽類活病毒培養(yǎng)物與凍干保護劑的體 積比為1: 1。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述凍干的操作為:預(yù)凍后于-50~-70 °C、真空條件下凍干，即可。
【文檔編號】A61K9/19GK105999281SQ201610594399
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月26日
【發(fā)明人】孫永珍, 吳紅云, 徐進, 李厚偉
【申請人】河南后羿生物工程股份有限公司