一種自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米藥物載體及制備工藝的制作方法
【專利摘要】一種自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米藥物載體及制備工藝，屬于生物材料領(lǐng)域。兩親性聚合物聚乳酸?嵌?聚維生素C丙烯酸酯(PLA?block?PAAA)與聚乳酸?嵌?聚乙二醇(PLA?block?PEG)通過共自組裝的方式制備得到的復(fù)合納米藥物載體。復(fù)合納米粒子可以保護(hù)維生素C抗氧化性，并使藥物遞送體系在保持納米載體功能性的基礎(chǔ)上，可以發(fā)揮聚合物納米粒子在遞送化藥的優(yōu)勢。
【專利說明】
-種自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米藥物載體及制備工藝
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體設(shè)及一種含聚維生素 C片斷的復(fù)合納米藥物遞送 體系及其制備工藝。 技術(shù)背景
[0002] 癌癥目前為止仍是世界上較難解決的問題。癌癥的治療需要精準(zhǔn)的篩查和選擇治 療方法，比如說放療、化療還是手術(shù)治療。盡管放療和手術(shù)治療可W短時(shí)間內(nèi)使腫瘤生長得 到抑制，但是他們需要許多復(fù)雜的日程安排。再者化療存在較低藥物利用率、高細(xì)胞毒副作 用和非特異性等的缺陷，嚴(yán)重限制了它們在癌癥治療上的應(yīng)用。因此，急需發(fā)展一個(gè)主動(dòng)或 被動(dòng)祀向癌細(xì)胞藥物載體系統(tǒng)。納米生物技術(shù)可W為目前化療的難題提供一個(gè)好的解決方 法，而且可W為癌癥治療的藥物和基因提供一個(gè)可控穩(wěn)定和祀向性的釋放。但是目前對于 納米藥物載體的研究主要側(cè)重于其智能性、祀向性，對納米載體本身具有抑制性的研究非 常少。同時(shí)有研究報(bào)道抗壞血酸具有抑制腫瘤的作用，包括去年11月《Science》上的一項(xiàng)研 究報(bào)告，也證明了維生素 C在小鼠體內(nèi)可W遏制腫瘤生長的功能。根據(jù)對藥理學(xué)抗壞血酸的 作用機(jī)制的理解可W將其用于疾病治療，例如將抗壞血酸作為癌癥治療的佐劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明利用共自組裝方法，制備一種生物相容性好，可降解的，有腫瘤抑制作用的 復(fù)合納米藥物載體。我們主要基于W上兩點(diǎn)，在保持納米載體功能性和保護(hù)維生素 C抗氧化 性的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成了含有維生素 C單元的聚合物納米粒子，使之不僅可W發(fā)揮聚合物納 米粒子在遞送化藥的優(yōu)勢，而且其本身還具有一定抑制腫瘤的作用，使傳統(tǒng)意義上的運(yùn)載 化療藥物的"車"自身也能發(fā)揮藥物的作用，充分發(fā)揮藥物制劑整體的效果，增強(qiáng)治療效果。
[0004] 本發(fā)明提出的一種自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米藥物遞載體，其特征在于， 兩親性聚合物聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)與聚乳酸-嵌-聚乙二醇 (PLA-block-PEG)通過共自組裝的方式制備得到的復(fù)合納米藥物載體。在祀向性遞送化療 藥物的基礎(chǔ)上，自身具有抗腫瘤作用，與化療藥物具有協(xié)同抑制腫瘤的作用。
[0005] 材料聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)的結(jié)構(gòu)式：
[0006]
[0007] 10《n《200，100，n和m為整數(shù)。
[000引材料聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG)的結(jié)構(gòu)式：
[0009]
[0010] 40《9《200，10《9《200,9和9為整數(shù)，3為能夠禪連巧光分子或者祀標(biāo)分子的功 能性官能團(tuán)，如班巧酷醋（NHS)、氨基（N出）、馬來酷亞胺順下締二酷亞胺(MAL)和生物素 (Biotin)等的基團(tuán)。
[0011] 聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)和聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA- block-PEG)兩者的摩爾比例為1:1~12:1。
[0012] -種含有自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米載體的藥物遞送體系的制備方法，其 具體步驟如下：
[0013] ①合成聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)和聚乳酸-嵌-聚乙二醇 (PLA-block-PEG)
[0014] 1)通過自由基聚合反應(yīng)得到聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA);
[0015] 用面化節(jié)保護(hù)維生素 C的活性締醇式徑基，制備得到維生素 C丙締酸醋單體 (化AA);金屬催化劑催化丙交醋開環(huán)聚合得到聚乳酸均聚物(PLA-Br)，PLA-化再和化AA通 過自由基聚合得到聚乳酸-嵌-芐基保護(hù)聚維生素 C丙締酸醋(PLA-block-PBnAA)，然后再通 過催化加氨得到聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)。
[0016] 2) W雙徑基端的PEG作為原料，一端功能化，另一端引發(fā)聚合，得到聚乳酸-嵌-聚 乙二醇（PLA-block-PEG)。
[0017] W雙徑基端的PEG作為原料，對聚乙二醇一端徑基進(jìn)行對甲苯橫酷的保護(hù)，再進(jìn)行 疊氮化，然后再修飾上可禪連巧光分子和祀標(biāo)分子的功能化官能團(tuán)；一端保留徑基引發(fā)丙 交醋的開環(huán)聚合，得到聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG)。
[0018] ②制備復(fù)合納米藥物遞載體的藥物遞送體系：
[0019] 避光條件下，將聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙締酸醋(PLA-block-PAAA)、聚乳酸-嵌-聚 乙二醇(PLA-block-PEG)和化療藥物溶于有機(jī)溶劑中，其中優(yōu)選化療藥物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度 為10%~100%，整個(gè)聚合物材料的濃度為l.Omg/mL，采用共自組裝方法得到復(fù)合納米藥物 遞送材料。
[0020] 所用的自由基聚合法為RAFT、ATRP或NMRP法。
[0021 ] 所用的雙徑基端的PEG分子量為2000-5000。
[0022] 所用的PEG-端用來禪連巧光分子或者祀標(biāo)分子的功能性官能團(tuán)（R)為班巧酷醋 (NHS)、馬來酷亞胺順下締二酷亞胺(MAL)、氨基(NH2)和生物素(Biotin)等。
[0023] 所用的有機(jī)溶劑為Ξ氯甲燒、二甲基亞諷、四氨巧喃。
[0024] 所用的復(fù)合納米遞送體系的制備方法中的自組裝方法為乳化溶劑蒸發(fā)法、透析法 或微相分離法。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)勢在于形成的復(fù)合納米粒子可W保護(hù)維生素討亢氧化性，并使藥物遞 送體系在保持納米載體功能性的基礎(chǔ)上，可W發(fā)揮聚合物納米粒子在遞送化藥的優(yōu)勢，而 且其本身還具有一定抑制腫瘤的作用，使傳統(tǒng)意義上的運(yùn)載化療藥物的"車"自身也能發(fā)揮 藥物的作用，充分發(fā)揮藥物制劑協(xié)同抑制腫瘤的效果，增強(qiáng)療效。
【附圖說明】
[0026] 圖1含本發(fā)明的復(fù)合納米載體的藥物遞送體系示意圖；
[0027] 圖2復(fù)合納米粒子對NIH 3T3細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0028] 圖3不同腫瘤細(xì)胞系對復(fù)合納米粒子和抗壞血酸的敏感性測試效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于W下實(shí)施例。
[0030] 實(shí)施例1
[0031] 1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，依次向10毫升反應(yīng)瓶中加入化合物引發(fā)劑PLA-Br(1.12mmol)， 偶氮二異下臘(〇.〇14mmol)，維生素 C單體(2.16mmol)和甲苯（ImL)，反應(yīng)體系置于60°C油浴 中攬拌14h后。反應(yīng)體系用Ξ氯甲燒溶解，濃縮后在無水甲醇中沉淀重復(fù)3次，得到聚合物 PLAi2〇-block-PAAA3〇 ；
[0032] 2)W雙徑基端的PEG4000作為原料，一端NHS化，另一端引發(fā)丙交醋開環(huán)聚合，直形 的Schlenk瓶除水除氧后加入重結(jié)晶處理過的L型丙交醋（g.Ommol)、引發(fā)劑H0-PEG- Maleimide(0.085mmol)、催化劑辛酸亞錫（1.05mmol)和甲苯2.0血。將整個(gè)反應(yīng)體系置于85 °(：油浴中開始反應(yīng)，反應(yīng)4h后停止，用液氮快速終止反應(yīng)。反應(yīng)體系用Ξ氯甲燒溶解，在無 水甲醇中沉淀離屯、3次，真空干燥化，得到白色粉末狀聚合物PLA2〇〇-block-PEG8〇。
[0033] ②制備復(fù)合納米遞送體系：
[0034] 避光條件下，將奧沙利銷（10% )、聚合物PLAi2〇-block-PAAA3〇( 1.6祉mol)和聚合物 PLA2Q()-block-PEG8()(0.14皿〇1)溶于4血四氨巧喃。完全溶解后緩慢滴加4mL去離子水。連續(xù) 攬拌約化后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除有機(jī)溶劑，得到載奧沙利銷的復(fù)合納米粒子的溶液。
[0035] 實(shí)施例2
[0036] ①合成聚合物 PLA-block-PAAA 和 PLA-block-PEG
[0037] 1)在圓底Schlenk瓶中加入引發(fā)劑PLA-化(0.085mmol)、維生素 C單體(2.16mmol)、 配體PMDETA(0.1 Immol)、漠化銅（0.0043mmol)和無水甲苯2. OmL，室溫下密封攬拌溶解過 夜。冷凍循環(huán)Ξ次，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入漠化亞銅(〇.〇85mmol)，繼續(xù)進(jìn)行冷凍循環(huán)3次。75°C 油浴中反應(yīng)40h，用液氮快速終止反應(yīng)。反應(yīng)體系用Ξ氯甲燒溶解，用中性氧化侶的柱子除 銅，濃縮后在無水甲醇中沉淀重復(fù)3次，得到聚合物PLAso-block-PAAAio;
[0038] 2) W雙徑基端的PEG2000作為原料，一端氨基化，另一端引發(fā)乙二醇聚合，直形的 Schlenk瓶除水除氧后加入乙二醇（10.5mmol)、引發(fā)劑冊-PEG-Maleimide(0.0525mmol)和 甲苯3 .OmL。將整個(gè)反應(yīng)體系置于90°C油浴中開始反應(yīng)，反應(yīng)化后停止，用液氮快速終止反 應(yīng)。反應(yīng)體系用Ξ氯甲燒溶解，在無水甲醇中沉淀離屯、3次，真空干燥化，得到白色粉末狀聚 合物 PLA3〇〇-block-PEG4〇。
[0039] ②制備復(fù)合納米遞送體系：
[0040] 避光條件下，將阿霉素（50 % )、聚合物化AsQ-block-PAAAiQ(0.9如mol)和聚合物 PLA3Q()-block-PEG4() (0.14皿〇1)溶于4血Ξ氯甲燒。完全溶解后緩慢滴加4mL去離子水。連續(xù) 攬拌約化后，將納米體系轉(zhuǎn)移到截留分子量(MWC0)為3500的滲析袋中，置于0.15M的抑7.4 的憐酸鹽緩沖液中進(jìn)行滲析，得到載阿霉素的復(fù)合納米粒子的溶液。
[0041 ] 實(shí)施例3
[0042] ①合成聚合物 PLA-b 10 ck-PAAA 和 PLA-b 10 ck-PEG
[0043] 1)在圓底Sch 1 enk瓶中加入引發(fā)劑PLA-Br (0.11 Ommo 1)、維生素 C單體（1.86mmo 1)、 鏈轉(zhuǎn)移試劑4-氯基戊酸二硫代苯甲酸(0. lOmmol)和二氧六環(huán)3.OmL,室溫下密封攬拌至溶 液澄清。冷凍循環(huán)Ξ次。60°C油浴中反應(yīng)2地，用液氮快速終止反應(yīng)。反應(yīng)體系用Ξ氯甲燒溶 解，在無水甲醇中沉淀重復(fù)3次，得到聚合物PLAiso-block-PAAAso;
[0044] 2) W雙徑基端的PEG5000作為原料，一端生物素化，另一端引發(fā)乙二醇聚合，直形 的Schlenk瓶除水除氧后加入乙二醇（10.5mmol)、引發(fā)劑冊-PEG-Maleimide(0.0525mmol) 和甲苯3.OmL。將整個(gè)反應(yīng)體系置于100°C油浴中開始反應(yīng)，反應(yīng)4h后停止，用液氮快速終止 反應(yīng)。反應(yīng)體系用Ξ氯甲燒溶解，在無水甲醇中沉淀離屯、3次，真空干燥化，得到白色粉末狀 聚合物 PLA2 日日-block-PEGi2〇。
[0045] ②制備復(fù)合納米遞送體系：
[0046] 避光條件下，將多西他賽（100%)、聚合物PLAi8〇-block-PAAA8〇(0.14皿〇1)和聚合 物PLA2日日-block-PEGi2〇(0.14μηιο1)溶于4mL二甲基亞諷。完全溶解后緩慢滴加4mL去離子水。 用MCW0為1000的超濾離屯、管離屯、除有機(jī)試劑，得到載多西他賽的復(fù)合納米粒子的溶液。
[0047] 數(shù)據(jù)集：
[0048] 1)復(fù)合納米粒子具有良好的生物相容性
[0049] 測試條件：聚合物膠束濃度:〇. 1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.5mg/mL 測試細(xì) 胞:小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH 3T3);測試時(shí)間：24，48，7化;試劑盒:MTS試劑盒;現(xiàn)聯(lián)儀器： 酶標(biāo)儀，490nm。
[0050] 2)復(fù)合納米粒子自身具有一定的腫瘤抑制作用
[0051] 測試條件：聚合物膠束濃度：800、400、200、100、50、25、12.5、6.75、3.38、1.56、 0.84、0.42μg/mレ測試細(xì)胞：腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6)、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7)、人肺癌細(xì)胞 化1299)、人肺癌細(xì)胞(95C)、人卵巢腺癌細(xì)胞(Sk-ov-3)、人宮頸癌細(xì)胞化ela)、人口腔癌細(xì) 胞(ACC)、人肝癌細(xì)胞化址-7)、人肝癌細(xì)胞化epG2);測試時(shí)間：4化;試劑盒:MTS試劑盒；ii 試儀器:酶標(biāo)儀，490nm。
[0052] Table 1 Molecular Qiaracteristics of PLA-block-PEG
[0化6] 表1:
[0化7] 表示W(wǎng)馬來酷化端基陽G為大分子引發(fā)劑；
[0化引b DPrati。表示嵌段聚合物PLA-block-PEG的疏水片段重復(fù)單元數(shù)；
[0059] 皆義均分子量是由核磁氨譜計(jì)算得到的；
[0060] d數(shù)均分子量和Mw/Mn即PDI是由GPC得到的；
[0061] 表2:
[0062] 3mi表示W(wǎng)乳酸均聚物PLA-化為大分子引發(fā)劑；
[0063] 6 DPrati。表示嵌段聚合物化A-block-PBnAA的疏水片段與親水片段的重復(fù)單元數(shù) 之比，如120/30表示疏水片段重復(fù)單元為120,親水片段重復(fù)單元為30的嵌段聚合物；
[0064] 等義均分子量是由核磁氨譜計(jì)算得到的；
[0065] d數(shù)均分子量和Mw/Mn即PDI是由GPC得到的；
[0066] e DPrati康示氨化后通過氨化率計(jì)算得到的最終的兩親性聚合物PLA-block-PAAA 的疏水與親水片段重復(fù)單元數(shù)之比。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米藥物遞載體，其特征在于，兩親性聚合物聚 乳酸-嵌-聚維生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA)與聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG) 通過共自組裝的方式得到的復(fù)合納米藥物載體； 材料聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA)的結(jié)構(gòu)式：10彡η彡200，5彡m彡100，n和m為整數(shù)； 材料聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG)的結(jié)構(gòu)式：40<p<200，10<q<200，p和q為整數(shù)，R為能夠耦連熒光分子或者靶標(biāo)分子的功能性 官能團(tuán)。2. 按照權(quán)利要求1所述的一種自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米藥物遞載體，其特征 在于，R為琥珀酰酯(NHS)、氨基(NH2)、馬來酰亞胺順丁烯二酰亞胺(MAL)或生物素(Biotin) 的基團(tuán)。3. 按照權(quán)利要求1所述的一種自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米藥物遞載體，其特征 在于，聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙烯酸酯（PLA-block-PAAA)和聚乳酸-嵌-聚乙二醇（PLA-block-PEG)兩者的摩爾比例為1:1 ~12:1 。4. 一種含有權(quán)利要求1所述的自身具有抑制腫瘤作用的復(fù)合納米藥物遞載體的藥物遞 送體系的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： ① 合成聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙烯酸酯（PLA-block-PAAA)和聚乳酸-嵌-聚乙二醇 (PLA-block-PEG)； 1) 通過自由基聚合反應(yīng)得到聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA); 2) 以雙羥基端的PEG作為原料，一端功能化，另一端引發(fā)丙交酯的開環(huán)聚合，得到聚乳 酸-嵌-聚乙二醇（PLA-block-PEG); ② 制備包復(fù)合納米藥物遞載體的藥物遞送體系： 避光條件下，將聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA)、聚乳酸-嵌-聚乙二 醇(PLA-block-PEG)和化療藥物溶于有機(jī)溶劑中，采用共自組裝方法得到藥物遞送體系。5. 按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA)的制備：用鹵化芐保護(hù)維生素 C的活性烯醇式羥基，制備得到維生素 C丙烯酸酯單體 (BnAA);金屬催化劑催化丙交酯開環(huán)聚合得到聚乳酸均聚物(PLA-Br) ,PLA-Br再和BnAA通 過自由基聚合得到聚乳酸-嵌-芐基保護(hù)聚維生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PBnAA)，然后再通 過催化加氫得到聚乳酸-嵌-聚維生素 C丙烯酸酯(PLA-block-PAAA); 聚乳酸-嵌-聚乙二醇(PLA-block-PEG)的制備：以雙羥基端的PEG作為原料，對聚乙二 醇一端羥基進(jìn)行對甲苯磺酰的保護(hù)，再進(jìn)行疊氮化，然后再修飾上可耦連熒光分子和靶標(biāo) 分子的功能化官能團(tuán)；一端保留羥基引發(fā)丙交酯的開環(huán)聚合，得到聚乳酸-嵌-聚乙二醇 (PLA-block-PEG)〇6. 按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，制備包復(fù)合納米藥物遞載體的藥物遞送體系 時(shí)，化療藥物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度為10%~100% ;整個(gè)聚合物材料的濃度為I .Omg/mL。7. 按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，用的自由基聚合法為RAFT、ATRP或NMRP法。8. 按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所用的雙羥基端的PEG分子量為2000-5000。9. 按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所用的有機(jī)溶劑為三氯甲烷、二甲基亞砜或四 氫呋喃。10. 按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，復(fù)合納米遞送體系的制備方法中的自組裝方 法為乳化溶劑蒸發(fā)法、透析法或微相分離法。
【文檔編號】A61K47/48GK105999282SQ201610320069
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】楊晶, 宋玉鳳, 謝嫣琪, 李瑞瓊
【申請人】北京化工大學(xué)