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      一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹金納米顆粒的制備方法

      文檔序號:10633789閱讀:1460來源:國知局
      一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹金納米顆粒的制備方法
      【專利摘要】本發(fā)明涉及一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺?透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹金納米顆粒的制備方法:PLA?PEG?COOH溶液逐滴加入到LAP溶液中,攪拌,活化,然后滴加到PEI溶液中,得到LAP?PLA?PEG?PEI,然后加入氯金酸和NaBH4,反應(yīng)得LAP?PLA?PEG?PEI?(Au0)50;將活化的HA溶液滴加到LAP?PLA?PEG?PEI?(Au0)50水溶液中,攪拌,反應(yīng),然后加入DOX,攪拌反應(yīng)即得。本發(fā)明成本低,方法簡單,條件溫和,易于操作,具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的納米材料負(fù)載DOX作為納米藥物緩釋體系具有良好的藥物緩釋效果,對CD44受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有顯著的靶向性和明顯的抑制效果。
      【專利說明】
      -種負(fù)載阿霉素的聚乙稀亞胺-透明質(zhì)酸修飾的裡皂石包裹 金納米顆粒的制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001] 本發(fā)明屬于載藥納米材料的制備領(lǐng)域,特別設(shè)及一種負(fù)載阿霉素的聚乙締亞胺- 透明質(zhì)酸修飾的裡皂石包裹金納米顆粒的制備方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 癌癥被認(rèn)為是21世紀(jì)人類面臨的重大難題之一。在使用化學(xué)藥物治療腫瘤的過程 中,抗癌藥物存在水溶性差、在病灶部位保留時(shí)間短W及不能特異性識別腫瘤細(xì)胞等問題 對人體產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒副作用,而且無法有效實(shí)現(xiàn)藥物對腫瘤的殺傷效果。因此,發(fā)展一種具 有腫瘤祀向作用的載體材料實(shí)現(xiàn)藥物的負(fù)載、可控釋放與祀向治療是目前納米醫(yī)學(xué)的研究 執(zhí)占。 "、、'、、、〇
      [0003] 粘±類納米顆粒,如裡皂石化aponite,LAP),不僅具有良好的生物相容性,還能夠 高效負(fù)載藥物并實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放,在藥物輸送領(lǐng)域展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(Wu,Y.L.;Guo, R. . ;aii,X.Y. ;et al.J.Mater.Chem.B2014,2,7410-7418.)。盡管運(yùn)些文獻(xiàn)報(bào)道的納米粒 子體系能夠有效地應(yīng)用于癌癥的治療,但都是一種納米粒子只能適用于癌癥治療,沒有設(shè) 及癌癥的診斷功能。因此,制備一種新型、高效、多功能的納米醫(yī)學(xué)平臺適用成像和化學(xué)治 療的診療一體化中的應(yīng)用。
      [0004] 支化聚乙締亞胺(PEI)是一種分子量較大的支鏈狀PEI,內(nèi)部有疏水的空腔,具有 支化的Ξ維結(jié)構(gòu),表面具有大量帶正電荷的氨基,為其進(jìn)一步化學(xué)修飾提供了條件。PEI與 其它高分子聚合物相比,它具有良好的熱穩(wěn)定性,在空氣中低于30(TC并不分解。特別是近 年來發(fā)展的高分子修飾納米材料的興起,更是賦予其獨(dú)特理化性質(zhì),拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。在納 米顆粒合成和修飾方面,PEI不僅可W作為穩(wěn)定劑防止納米顆粒的聚集,還可W作為還原劑 制備納米顆粒,而且PEI豐富的氨基數(shù)量就使得其包覆的納米顆粒均可進(jìn)一步功能化(Shi, X.Y. ;Zhou,B. . ;Zheng,L. ;et al .ACS Appl .Mater. Inte;rfaces2014,6,17190-9.)。因此, PEI是介導(dǎo)合成和修飾多種納米顆粒優(yōu)良的載體。聚乙二醇(PEG)是一種具有良好生物相容 性的鏈狀聚合物,將其修飾到PEI表面能夠提高材料的水溶性和生物相容性,同時(shí)能延長藥 物緩釋周期W及增加 Au的加載量。透明質(zhì)酸(HA),是一種具有良好水溶性的高分子聚合物, 是脊椎動(dòng)物組織和體液的主要成分。此外,HA可W作為一種生物祀向分子,能與腫瘤細(xì)胞表 面過度表達(dá)的CD44受體分子特異性結(jié)合。通過HA與腫瘤細(xì)胞表面CD44受體分子的特異性結(jié) 合可實(shí)現(xiàn)藥物緩釋體系對腫瘤細(xì)胞的特異性識別與主動(dòng)富集,實(shí)現(xiàn)腫瘤的特異性的祀向治 療。
      [0005] 查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)或?qū)@?,合成?fù)載阿霉素(D0X)的聚乙締亞胺一透明質(zhì)酸修 飾的裡皂石包裹金納米顆粒用于腫瘤祀向治療與CT成像的研究尚未見報(bào)道。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種負(fù)載阿霉素的聚乙締亞胺-透明質(zhì)酸修飾 的裡皂石包裹金納米顆粒的制備方法,本發(fā)明成本低,方法簡單,條件溫和,易于操作,具有 良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的LAP-PLA-PEG-PEI-(AuD)5〇-HA負(fù)載DOX作為納米藥物緩釋體系具 有良好的藥物緩釋效果,對CD44受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有顯著的祀向性和明顯的抑制效 果。
      [0007]本發(fā)明的一種負(fù)載阿霉素的聚乙締亞胺-透明質(zhì)酸修飾的裡皂石包裹金納米顆粒 的制備方
      [000引法,包括:
      [0009] (1)將聚乳酸一聚乙二醇PLA-PEG-C00田容于溶劑中,然后逐滴加入裡皂石LAP的水 溶液,常溫?cái)埌璺磻?yīng)1-化,透析,得到LAP-PLA-PEG-C00H;
      [0010] (2)將LAP-PLA-PEG-C00H的水溶液中加入抓C進(jìn)行活化2-地,然后加入到聚乙締亞 胺PEI水溶液,攬拌2-3d,透析,得到LAP-PLA-PEG-PEI;
      [0011] (3)氯金酸HAu(n4 · 4出0溶于水中得到氯金酸水溶液,然后將LAP-PLA-PEG-PEI的 水溶液加入氯金酸水溶液,攬拌15-30min,然后加入棚氨化鋼溶液,攬拌反應(yīng)l-4h,透析,得 到 LAP-PLA-PEG-PEI-(Au°)己0;
      [0012] (4)將透明質(zhì)酸HA溶于水中,加入抓C進(jìn)行活化2-地后,加入到LAP-PLA-PEG-PEI- (Ai^sq水溶液中,攬拌反應(yīng)2-3d,離屯、,得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5()-HA;
      [OOU] (5)將LAP-PLA-PEG-PEI-(AuD)日日-HA的水溶液加入阿霉素水溶液,攬拌12-24h,離 屯、,洗涂,分散,即得負(fù)載阿霉素的聚乙締亞胺-透明質(zhì)酸修飾的裡皂石包裹金納米顆粒 LAP-PLA-PEG-PEI-(Au。)日 0-HA/DOX。
      [0014] 所述步驟(1)中PLA-PEG-C00H(購買于濟(jì)南巧罷生物工程有限公司),其中陽G的分 子量為3000-5000,PLA的分子量為3000。
      [001引所述步驟(1)中溶劑為體積比為1:1的丙酬和水的混合溶液。
      [0016] 步驟(1)中LAP與PLA-PEG的質(zhì)量比為1:2-4。
      [0017] 步驟(1)中LAP與PLA-PEG的質(zhì)量比為1:3。
      [001引所述步驟(1)中透析具體為:采用的膜為纖維素透析膜,截留分子量MWC0為8000- 14000,在憐酸鹽緩沖溶液PBS中透析2天。
      [0019] 步驟(2)中抓C與LAP-化A-陽G的摩爾比為10-12:1,LAP-PLA-PEG-C00H與陽I的摩 爾比是15-20:1。
      [0020] 步驟(2)中EDC與LAP-PLA-PEG的摩爾比為10:1,LAP-PLA-PEG-C00H與陽I的摩爾比 是 20:1。
      [0021] 所述步驟(2)中透析具體為:采用的膜為纖維素透析膜,截留分子量MWC0為50000, 在憐酸鹽緩沖溶液PBS中透析2天。
      [0022] 步驟(3)中HAuCU · 4化0和LAP-化A-PEG-PEI 的摩爾比為50-60:l,NaBH4與 HAuCl4 · 4出0的摩爾比為2-5:1;棚氨化鋼溶液的溶劑為冰水。
      [0023] HAuCU · 4出0和LAP-PLA-PEG-PEI的摩爾比為50:1。
      [0024] 步驟(4)中邸C與HA的摩爾比為10-12:1,LAP與HA的質(zhì)量比是3-4:1。
      [00巧]步驟(4)中邸(:與齡的摩爾比為10:1,1^\口與齡的質(zhì)量比是3.5:1。
      [00%] 步驟(5)中LAP與D0X的質(zhì)量比2-4:1。
      [0027] 步驟(5)中LAP與D0X的質(zhì)量比3:1。
      [0028] 所述步驟(5)中攬拌速度為100-150r/min;離屯、的速率為8000-10000r/min,離屯、 的時(shí)間為5min。
      [0029] 本發(fā)明中使用PEG可W增加該材料的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間,并增加后續(xù)包裹納米金的量, 達(dá)到更加靈敏的CT造影效果。
      [0030] 本發(fā)明中氯金酸溶液加入后,攬拌20-40min,使氯金酸分子與聚乙締亞胺修飾的 裡皂石混合,利用氯金酸分子與聚乙締亞胺一透明質(zhì)酸修飾的裡皂石表面氨基的親和力使 得其進(jìn)入其內(nèi)部空腔,再W強(qiáng)還原劑NaBH4快速還原,得到聚乙締亞胺一透明質(zhì)酸修飾的裡 皂石包裹的金納米顆粒,很好地防止了金納米顆粒的聚集。HAuCU · 4此0:化BH4:LAP-PLA- 陽G-PEI摩爾比為50:250:1 (化肌4與HAu(n4 · 4此0的摩爾比>3:1),既保證納米金的膠體穩(wěn) 定性,又有效提高納米金的含量。在加入棚氨化鋼之時(shí),應(yīng)將化肌4溶液迅速滴加到4此14^與 裡皂石絡(luò)合物溶液中,快速還原得到產(chǎn)物L(fēng)AP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇。
      [0031] 本發(fā)明中透明質(zhì)酸化A)是一種具有良好水溶性的高分子聚合物,是脊椎動(dòng)物組織 和體液的主要成分。此外,HA可W作為一種生物祀向分子,能與腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的 CD44受體特異性結(jié)合。通過HA與腫瘤細(xì)胞表面CD44受體的特異性結(jié)合可實(shí)現(xiàn)藥物緩釋體系 對腫瘤細(xì)胞的特異性識別與主動(dòng)富集,實(shí)現(xiàn)腫瘤的特異性的祀向治療。
      [0032] 裡皂石化aponite,LAP)屬于粘±類納米顆粒,具有良好的生物相容性,并且被證 實(shí)可W高效負(fù)載藥物,是一種具有廣泛應(yīng)用前景的藥物載體。LAP經(jīng)過修飾可W得到聚乙締 亞胺一透明質(zhì)酸修飾的裡皂石納米顆粒LAP-PLA-PEG-PEI,它繼承了 LAP作為藥物載體的全 部優(yōu)良性質(zhì),并且便于負(fù)載及穩(wěn)定金納米顆粒和進(jìn)一步修飾,得到LAP-化A-PEG-PEI- (ΑιΛ 50。然而,LAP-PLA-PEG-PEI本身沒有對腫瘤的主動(dòng)祀向效果,因此,將祀向分子連接到 LAP-PLA-PEG-PEI表面,得到具有主動(dòng)祀向效果的多功能裡皂石納米顆粒用于藥物和金納 米顆粒負(fù)載,是改善抗腫瘤藥物載體LAP-PLA-PEG-PEI的有效途徑。本發(fā)明將ΗΑ連接到1^\口- PLA-PEG-PEI - ( AuD ) 50 表面,得到的 LAP-PLA-PEG-PEI - ( AuD ) 50-ΗΑ 不僅可 W 通過透明質(zhì)酸的 祀向作用被腫瘤細(xì)胞主動(dòng)攝取,同時(shí)將材料的表面電荷轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)電荷,降低材料毒性,提高 材料穩(wěn)定性,改善藥物釋放特性。本發(fā)明的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇載體用于抗腫瘤藥物 負(fù)載和檢測,可作為理想的祀向納米載體,實(shí)現(xiàn)藥物和診斷分子探針的負(fù)載與祀向輸送。 [00削本發(fā)明使用UV-Vis(紫外可見光譜)、TEM(透射電子顯微鏡)、TGA(熱重分析)、Ze化 表面電勢測量、FTIR(傅里葉變換紅外光譜儀)測試等方法表征本發(fā)明制備的聚乙締亞胺一 透明質(zhì)酸修飾的裡皂石納米顆粒,同時(shí)用CCK8試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)分析和激光共聚焦顯微 鏡來檢驗(yàn)載藥的裡皂石納米顆粒對腫瘤細(xì)胞表面CD44受體的特異性結(jié)合的毒性與祀向性, 具體測試結(jié)果如下:
      [0034] (1)表面電勢和水合粒徑測量
      [0035] 修飾前后粒子的粒徑W及表面電勢均通過動(dòng)態(tài)光散射進(jìn)行測定,結(jié)果如表1所示。 經(jīng)聚乳酸-聚乙二醇修飾后,裡皂石的表面電勢從-33.7mV變到-15.6mV,測試結(jié)果表明,裡 皂石表面已經(jīng)成功修飾了 LAP-PLA-PEG。在表面進(jìn)一步修飾了 PEI之后,所得到的LAP-PLA- PEG-PEI表面電勢變成34.9 ± 0.802mV。在修飾了祀向分子HA之后,表面電勢進(jìn)一步降低到- 18.5 ±0.208mV。因此,通過修飾前后的電勢變化也可W證明成功地合成了LAP-化A-PEG- PEI-(Ai^5〇-HA納米材料。表面修飾后裡皂石的較小且具有較好的分散性,因此,仍是一種 良好的載體材料。
      [0036] 表1LAP、LAP-PLA-PEG、LAP-PLA-PEG-PEI、LM-PEG-FA 的水合直徑和表面電勢
      [0037] L0038」(2)熱重分化
      [0039] 在附圖1所示的熱重測試結(jié)果中,分析圖中從200°C到800°C重量損失可知,與LAP 相比,LAP-PLA-PEG-C00H和LAP-PLA-PEG-PEI在升溫過程中分別損失了總質(zhì)量的7 2.8 %和 78.6 %。運(yùn)一結(jié)果證明PLA-PEG和陽I均已成功修飾在LAP表面。
      [0040] (3)紫外-可見光譜測試
      [0041] 在附圖2所示的紫外-可見光譜測試結(jié)果中,本發(fā)明中制備得到的功能化裡皂石的 表面等離子體共振(SPR)峰位于523nm,參見說明書附圖3。運(yùn)表明本發(fā)明中制備得到了金納 米顆粒。運(yùn)一結(jié)果也證實(shí)FA已被成功修飾到裡皂石表面。在負(fù)載D0X之后,材料在480皿附近 均顯示出一個(gè)明顯的吸收峰。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,運(yùn)個(gè)吸收峰為D0X的紫外特征吸收峰。因此,表 面修飾的裡皂石納米顆粒仍然能夠負(fù)載抗腫瘤藥物D0X。通過紫外定量分析,在投料比為 LAP-PLA-PEG-PE I - (Au。)50-HA: D0X = 3:1 的條件下,LAP-PLA-PEG-PE I - (Au。)50-HA 的載藥效 率為91%.
      [00創(chuàng) (4)TEM測試結(jié)果
      [0043] ??Μ測試結(jié)果顯示了金納米顆粒的尺寸及尺寸分布,參見說明書附圖3。金納米顆 粒平均直徑約4.6nm,尺寸分布較窄,具有良好的單分散性。
      [0044] (5)體外釋放結(jié)果
      [0045] 附圖4為LAP-PLA-PEG-(AuD)5〇-陽I-HA/D0X的體外累積釋放曲線。在48小時(shí)中,D0X 在抑=5.0的弱酸性環(huán)境中從LAP-PLA-PEG-陽I - ( ΑιΛ 50-HA/DOX中累計(jì)釋放了 35±1.22%, 比在抑=7.4的中性環(huán)境中累計(jì)釋放量(12.7±0.939%)高。運(yùn)說明基于裡皂石的載藥體系 均具有抑響應(yīng)性,即在與腫瘤組織類似的弱酸性環(huán)境中的釋放速度快,累積釋放率高,而在 正常組織的中性環(huán)境中釋放速度慢,累積釋放率低。
      [0046] (6)穩(wěn)定性測試結(jié)果
      [0047] 穩(wěn)定性測試結(jié)果表明:發(fā)明中制備得到的功能化裡皂石包裹的金納米顆粒在不同 溫度,不同抑中具有良好的穩(wěn)定性,無沉淀產(chǎn)生,參見說明書附圖5。運(yùn)表明本發(fā)明中制備的 材料穩(wěn)定性好。
      [004 引(7)CCK8 實(shí)驗(yàn)
      [0049] CCKSii試結(jié)果表明:本發(fā)明中制備得到的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX解化 癌細(xì)胞24h后,在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)了癌細(xì)胞的調(diào)亡,且較純D0X而言,對癌細(xì)胞的療效更 好,起到藥物治療作用,且不含藥載體材料不存在藥物毒性,參見說明書附圖6。
      [0050] (8)細(xì)胞吞隧實(shí)驗(yàn)
      [0051 ] 為了證實(shí)LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX的祀向作用,選擇CD44受體表達(dá)的人 源宮頸癌細(xì)胞化La細(xì)胞作為模型,采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞吞隧材料后產(chǎn)生的巧光效果。
      [0052] 利用流式細(xì)胞儀對化La細(xì)胞吞隧藥物后產(chǎn)生的巧光效果進(jìn)行了檢測。附圖7為DOX 濃度為2.5、5、7.5、10和15yg/mL,藥物和細(xì)胞共培養(yǎng)4小時(shí)之后細(xì)胞由于吞隧藥物產(chǎn)生巧光 的結(jié)果??蒞看出,經(jīng)過4小時(shí)共培養(yǎng),HeLa細(xì)胞對于LAP-PLA-PEG-PEI-(ΑιΛ5Q-HA/D0X的吞 隧效果顯示出強(qiáng)烈的增強(qiáng),其平均巧光值與阻斷組材料平均巧光值高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明本發(fā) 明報(bào)道的LAP-化A-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX可W通過ΗΑ的祀向作用有效提高腫瘤細(xì)胞對 D0X的吞隧,從而增強(qiáng)D0X的抗腫瘤活性。
      [0053] (9)細(xì)胞內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)
      [0054] 為了更直觀的觀察藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布,采用激光掃描共聚焦顯微鏡考察了細(xì)胞 與藥物共培養(yǎng)4小時(shí)之后細(xì)胞內(nèi)巧光分布情況。附圖8為D0X濃度lOppm條件下化La細(xì)胞內(nèi)巧 光分布結(jié)果??蒞看出本發(fā)明報(bào)道的LAP-PLA-PEG-PEI - ( ΑιΛ 50-HA/DOX可W通過HA的祀向 作用提高腫瘤細(xì)胞對D0X的吞隧作用。
      [0055] (10)體外X-射線衰減性能
      [0056] 體外X-射線衰減性能測試結(jié)果表明,負(fù)載阿霉素(D0X)的聚乙締亞胺-透明質(zhì)酸 修飾的裡皂石包裹金納米顆粒表現(xiàn)出優(yōu)異的X-射線衰減系數(shù)。參見附圖9。
      [0057] (11)體外材料祀向HeLa細(xì)胞的CT成像
      [0化引 口'掃描結(jié)果表明相同金濃度下1^\口斗1^\斗66斗61-^11*^)50-齡/00乂復(fù)合納米顆粒與 化La細(xì)胞共培養(yǎng)后處理的細(xì)胞懸浮液的CT信號比阻斷材料強(qiáng),證明負(fù)載阿霉素(D0X)的聚 乙締亞胺一透明質(zhì)酸修飾的裡皂石包裹金納米顆粒對化La細(xì)胞具有特異性祀向作用。參見 附圖10。
      [0059] (12)體內(nèi)腫瘤生長抑制研究
      [0060] 體內(nèi)腫瘤生長測量表明,與生理鹽水組相比,注射DOX,LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇- HA/D0X+HA blocking,和LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX的實(shí)驗(yàn)組中裸鼠腫瘤生長明顯 受到抑制,而且祀向組的抑制效果優(yōu)于阻斷組,證明負(fù)載阿霉素(D0X)的聚乙締亞胺-透明 質(zhì)酸修飾的裡皂石包裹金納米顆粒對化La細(xì)胞具有特異性祀向作用。參見附圖11。
      [0061] (13)免疫組化分析
      [0062] 免疫組化分析表明,經(jīng)過D0X處理后的裸鼠臟器,盡管肝,脾,腎沒有顯示出明顯的 損傷,但是屯、和肺部分出現(xiàn)明顯的大面積壞死(完全粉色不含藍(lán)色區(qū)域)。運(yùn)個(gè)結(jié)果可W證 明D0X在目前的注射劑量與注射頻率下,對屯、和肺造成損傷。然而在LAP-化A-PEG-PEI- (Au〇)5〇-HA/DOX+HA blocking和LAP-PLA-PEG-PEI-(Au〇)5〇-HA/DOX處理的裸鼠屯、和肺中并 沒有發(fā)現(xiàn)大面積壞死區(qū)域,證明本章所研究的LAP-PLA-PEG-PEI - ( AuD ) 50-HA/DOX在相同的 注射劑量與注射頻率下,對屯、和肺的損傷比純D0X明顯減小。參見附圖12。
      [0063] 綜合W上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W認(rèn)為,本發(fā)明的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX可W明 顯提高腫瘤細(xì)胞對D0X的攝取,減少D0X對正常組織細(xì)胞的毒副作用,改善了D0X的抗癌效 果,具有良好的應(yīng)用前景。
      [0064] 本發(fā)明藥物載體負(fù)載D0X得到的LAP-PLA-PEG-(Ai^日日-陽I-HA/D0X納米藥物緩釋 體系具有良好的藥物緩釋效果,對CD44受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有顯著的祀向性和明顯的抑 制效果,用于癌細(xì)胞的祀向治療。本發(fā)明的制備過程簡單,實(shí)驗(yàn)條件為常溫常壓,易于操作。 所制備的材料有望用于體內(nèi)腫瘤CT診斷,具有良好的診斷應(yīng)用前景。制備得到的負(fù)載阿霉 素化0X)的聚乙締亞胺一透明質(zhì)酸修飾的裡皂石包裹金納米顆粒具有良好的祀向及藥物療 效,為新型納米藥物的開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。
      [0065] 有益效果
      [0066] (1)本發(fā)明的PEI-FI-(PEG-HA)負(fù)載D0X得到的載藥納米顆粒具有良好的水溶性和 生物相容性,較好的藥物緩釋效果與抑響應(yīng)性釋放特性,對高CD44受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具 有祀向性和明顯的抑制效果,可用于癌細(xì)胞的祀向治療;
      [0067] (2)本發(fā)明制備方法簡單,反應(yīng)條件溫和,成本低廉,易于操作,具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的 前景。
      【附圖說明】
      [0068] 圖 1 為LAP,LAP-PLA-PEG-C00H 和LAP-PLA-PEG-PEI 的熱重分析圖譜;
      [0069] 圖 2為LAP-化 A-陽G-陽 I - (Au〇) 50-HA 和LAP-PLA-PEG-PEI - (Au〇) 50-HA/DOX的紫外吸 收光譜圖;
      [0070] 圖3為相關(guān)材料的TEM照片,其中(a)為LAP,(b)為LAP-化A-PEG-PEI-(Au〇)日0-HA/ D0X(插圖為金納米顆粒的晶格),(c)為(b)的粒徑分布圖,(d)為(b)的能譜圖;
      [0071] 圖4為在不同抑條件下D0X從LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX中釋放的累積釋放 曲線;
      [0072] 圖5為本發(fā)明制備的LAP-PLA-PEG-PEI- ( ΑιΛ 50-HA/DOX在(a)不同溫度和(b)不同 抑的UV-Vis譜圖;
      [0073] 圖6為用CCK8法測試得到的HeLa細(xì)胞經(jīng)過LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA、free D0X 和 LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX 處理 2地后的細(xì)胞活力;
      [0074] 圖 7 為流式細(xì)胞術(shù)測試得到經(jīng) LAP-PLA-PEG-PEI-(AuD)5〇-HA/DOX 和 LAP-PLA-PEG- 陽I-(Ai^5〇-HA/DOX+HA blocking處理地后,HeLa對D0X的吞隧情況(縱坐標(biāo)為細(xì)胞內(nèi)吞D0X 后的平均巧光強(qiáng)度,與吞隧量成正比,*p<0.05,**p<0.005,***p<0.001);
      [0075] 圖 8 為HeLa細(xì)胞經(jīng)生理鹽水 NS(a)、LAP-化 A-PEG-PEI-(Au〇)日 o-HA/DOX+HA 61〇〇1^叫(6)和1^\口斗1^\斗66斗61-^1/^)5〇-齡/00乂((3)處理地后細(xì)胞內(nèi)巧光分布,其中材料 中D0X濃度均為lOyg/mL,細(xì)胞核用DAPI染成藍(lán)色;其中標(biāo)尺均為20皿;
      [0076] 圖9為本發(fā)明制備的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX的X-射線衰減系數(shù)比較; (a)為CT成像圖片,(b)為測得的X-射線衰減強(qiáng)度結(jié)果;
      [0077] 圖10為本發(fā)明制備的LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5〇-HA/DOX與阻斷材料的細(xì)胞CT成像 效果和CT值的比較;(a)為CT成像圖片,(b)為測得的X-射線衰減強(qiáng)度結(jié)果;
      [0078] 圖11化La移植瘤體積變化圖,對實(shí)驗(yàn)組裸鼠在第0,7和14天進(jìn)行瘤內(nèi)注射,注射 劑量為4mg DOX/kg,相對腫瘤體積根據(jù)初始腫瘤大小歸一化,(n = 5);
      [00巧]圖 12經(jīng)過NS(a)、D0X(b)、LAP-化A-陽G-PEI-(Au°)50-HA/DOX+HA blocking(c)和 LAP-PLA-陽G-陽I-(Ai^5〇-HA/DOX(d)不同治療的裸鼠的屯、肝脾肺腎五大主要臟器的H&E染 色組織切片照片,照片由相差顯微鏡拍攝,圖中比例尺為100WI1;
      [0080] 圖13為本發(fā)明制備原理示意圖。
      【具體實(shí)施方式】
      [0081] 下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,運(yùn)些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人 員可W對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
      [0082] 實(shí)施例1
      [0083] (1)在50mL PLA-PEG-C00H的丙酬與水的混合溶液(6mg/mL)中,緩慢滴加入lOmL LAP的水溶液(lOmg/mL),攬拌反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后,將得到的溶液全部轉(zhuǎn)移到截留分析 量大小為8000-14000的透析袋中。將透析袋放入裝有化去離子水的燒杯中透析,透析持續(xù) 2-4天,每天換水3-4次。透析結(jié)束后,將透析袋內(nèi)產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到lOOmL玻璃瓶內(nèi)4°C保存,即得 到聚乙二醇修飾的LAP-PLA-PEG-C00H。
      [0084] (2)取上述30mL LAP-化A-PEG-C00H的水溶液(3mg/mL),加入2mL EDC的水溶液 (8.42mg/mU,攬拌反應(yīng)3小時(shí)。然后逐滴滴加到10.98mL陽I的水的溶液(Img/mU,快速攬 拌反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后,將得到的溶液全部轉(zhuǎn)移到截留分析量大小為50000的透析袋中。將 透析袋放入裝有化去離子水的燒杯中透析,透析持續(xù)2-4天,每天換水3-4次。透析結(jié)束后, 將透析袋內(nèi)產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到1 OOmL玻璃瓶內(nèi)4 °C保存,即得到聚乙二醇修飾的LAP-PLA-PEG-PEI。
      [0085] (3)取上述30血LAP-PLA-PEG-PEI的水溶液(2mg/血),邊攬拌邊逐滴滴加11祉L氯 金酸溶液(30mg/血),攬拌30min后,加入1.624mg的化肌4溶液化2〇: C曲細(xì)(體積比)=2:1), 溶液瞬間變成深紅色,在室溫下攬拌反應(yīng)祉,得到LAP-PLA-PEG-PEI- ( ΑιΛ 50。取2mL的透明 質(zhì)酸水溶液(3. Img/mL),然后逐滴加入24化L EDC的水溶液(8.42mg/ml),攬拌反應(yīng)3小時(shí) 后,逐滴加入到上述LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5g溶液中,快速攬拌反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后,將溶 液分別轉(zhuǎn)移到15mL離屯、管中,在轉(zhuǎn)速為SOOOrpm條件下離屯、(5min),得到的沉淀用去離子水 洗涂3次后溶于lOmL的水中,加入7.23mL濃度為Img/mL的D0X水溶液,在避光的條件下磁力 攬拌反應(yīng)24小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后,將溶液分別轉(zhuǎn)移到15mL離屯、管中,在轉(zhuǎn)速為SOOOrpm條件下 離屯、(5min),得到的沉淀用去離子水洗涂3次,即可得到載藥納米顆粒LAP-^A-PEG-PEI- (Au°)5〇-HA/DOX。
      [00化]實(shí)施例2
      [0087] W紫外可見吸收光譜圖對材料的穩(wěn)定性進(jìn)行分析,取0.5mg/mL實(shí)施例1制備的功 能化的樹狀大分子材料,溶劑為蒸饋水,置于4°C,37°C,50°C的溫度條件下和抑=5,6,7,8 的條件下,測其紫外可見吸收光譜。
      [0088] 實(shí)施例3
      [0089] 取實(shí)施例1所得產(chǎn)品W蒸饋水為溶劑,配制金濃度為0.04M的母液。之后梯度稀釋 出0.02、0.01、0.005、0.0025和0.005M的樣品。同時(shí),W臨床用艦海醇為對照材料,W蒸饋水 稀釋出相應(yīng)艦濃度的樣品。之后,對運(yùn)兩組材料進(jìn)行CT成像測試。
      [0090] 實(shí)施例4
      [0091] 取培養(yǎng)好的化La細(xì)胞種于6孔板中,按照200萬細(xì)胞/孔的密度接種,每孔體積2mL。 培養(yǎng)過夜后,加入上述兩種各稀釋梯度的樣品,與細(xì)胞共培養(yǎng)地。每個(gè)梯度用培養(yǎng)液稀釋10 倍,即每孔終濃度分別為10、20、40、80、150μΜ。WPBS緩沖液作為空白對照,在實(shí)驗(yàn)對比組中 加入化L ΗΑ溶液(WA] =500μΜ)。膜酶消化離屯、后收集細(xì)胞,并將細(xì)胞均勻的分散在20化 LPBS緩沖液中。之后,對運(yùn)兩組材料進(jìn)行CT成像測試。
      [0092] 實(shí)施例5
      [0093] 將實(shí)施例1制備的1^\?斗1^\斗66斗61-^11〇)5()-齡/0(放分別用抑=7.0和抑=5.4的 緩沖液溶解成濃度為Img/mL的溶液,取ImL放入透析袋中固定,置于含有9mL不同抑的緩沖 液的容器中,放在37°C搖床中振蕩。在0.5,1,2,4,6,8,10,12,24,36,48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)取樣。每 次取透析袋外液體ImL,測量其480nm處吸光度值,再向透析袋外加入對應(yīng)的緩沖溶液ImL。 用此方法得到體外不同抑條件下D0X從LAP-PLA-PEG-PEI - ( ΑιΛ 50-HA/DOX中釋放的釋放曲 線。
      [0094] 實(shí)施例6
      [00巧]配制D0X濃度分別為 12.5、25.0、50.0、75.0、100 . Oyg/mL的純D0X、LAP-PLA-PEG- PEI-(Ai^5q-HA 和 LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5q-HA/D0X 的無菌生理鹽水(NS)溶液(材料加入培 養(yǎng)液中,其濃度要稀釋10倍),紫外照射過夜殺菌。收集對數(shù)生長期化La細(xì)胞,按照1.0 X 104cel 1 s/孔接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,置于5 % C〇2,37 °C條件下培養(yǎng)24小時(shí)。棄掉培養(yǎng)液 后,每孔更換180化培養(yǎng)液,并加20化含不同D0X濃度的LAP-PLA-PEG-PEI - ( ΑιΛ 50-HA/DOX、 純D0X或LAP-PLA-PEG-陽Ι-(ΑιΛ5〇-ΗΑ的NS溶液或純NS(對照組),每組設(shè)5個(gè)平行樣。將細(xì)胞 培養(yǎng)板繼續(xù)放置在5 % C〇2,37 °C條件下培養(yǎng)24小時(shí)。然后按20化/孔加入CCK8溶液,避光條 件下37Γ恒溫靜止培養(yǎng)3小時(shí),然后用酶標(biāo)儀測量在45化m處紫外吸收值,并根據(jù)此值計(jì)算 細(xì)胞的存活率。
      [0096] 實(shí)施例7
      [0097] 配制D0X濃度分別為25、50、75、80.0、100.0、150 . Oyg/mL的LAP-化A-PEG-PEI- (AuD ) 5G-HA/D0X無菌NS溶液,及500μΜ的高濃度HA溶液。紫外照射過夜殺菌,收集對數(shù)期HeLa 細(xì)胞,按照2.0 X 105celIs/孔接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,置于5%C〇2,37°C條件下培養(yǎng)24小 時(shí)。棄掉培養(yǎng)液后,每孔更換90化L培養(yǎng)液,并添加10化L含不同D0X濃度的LAP-化A-PEG- PEI-(Ai^5q-HA/D0X或純D0X的NS溶液或NS(對照組),在實(shí)驗(yàn)對比組中加入扣L HA溶液 ([HA] = 500μΜ)。繼續(xù)置于5 % C〇2,37 °C條件下培養(yǎng)4小時(shí)。倒去培養(yǎng)液,用PBS洗涂3次,加入 100化膜酶消化約3分鐘后,立即加入ImL左右PBS吹打并收集細(xì)胞,轉(zhuǎn)移到lOmL離屯、管中 10(K)rpm離屯、5分鐘,繼續(xù)用ImL PBS重懸。W巧光分辨率作為參數(shù),將濾網(wǎng)過濾重懸的細(xì)胞 液作為樣品加入到流式細(xì)胞儀中進(jìn)行檢測,得到細(xì)胞對藥物的吞隧結(jié)果。
      [009引實(shí)施例8
      [0099] 將大小合適的處理過的圓形蓋玻片W每孔1片的密度放入12孔板中,每孔加入 1 . OmL培養(yǎng)液浸泡過夜。棄掉浸泡培養(yǎng)液后,收集對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞,按照4.0 X 104cells/孔接種在圓形載玻片上,置于5%C02,37°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)。棄掉培養(yǎng)液后,每 孔更換900化培養(yǎng)液,并添加100化含LAP-PLA-PEG-陽I-( ΑιΛ 5Q-HA/D0X的NS溶液或NS (對照 組),在實(shí)驗(yàn)對比組中加入扣LHA( WA] = 500μΜ)溶液。繼續(xù)置于5 % C〇2,37 °C條件下培養(yǎng)4小 時(shí)。棄掉培養(yǎng)液,用無菌PBS洗1-2遍,每孔加2.5%戊二醒的?85溶液80化,靜置于4°(:條件下 固定30分鐘。棄掉戊二醒溶液,用無菌PBS洗1-2遍,加 DAPI (lug/ml),覆蓋細(xì)胞即可,靜置于 37°C染色15分鐘。將DAPI液吸出,用無菌PBS洗3遍,在載玻片上滴加一滴巧光封閉劑,將蓋 玻片從12孔板中勾出,將有細(xì)胞的一面壓到載玻片上,用激光掃描共焦顯微鏡觀察細(xì)胞形 態(tài)及細(xì)胞內(nèi)巧光分布。
      [0100] 實(shí)施例9
      [0101] 取實(shí)施例1所得產(chǎn)品W蒸饋水為溶劑,配制金濃度為20mM的母液。之后梯度稀釋出 20、10、5、2.5和ImM的樣品,然后用CT成像儀測定復(fù)合納米顆粒的X射線衰減特性,并測量各 個(gè)圖片的CT信號值。掃描參數(shù)為:X射線管電壓ΙΟΟΚν,Χ射線管電流80mA,層厚0.625mm。
      [0102] 實(shí)施例10
      [0103] 取實(shí)施例1所得產(chǎn)品WPBS緩沖液為溶劑,用無菌PBS緩沖液配制成1500μΜ的母液。 之后梯度稀釋為1〇〇、200、400、80化1的樣品溶液。另^同樣方案并且添加透明質(zhì)酸阻斷分 子作為對照材料。取培養(yǎng)好的化La細(xì)胞種于6孔板中,按照200萬細(xì)胞/孔的密度接種,每孔 體積2mL。培養(yǎng)過夜后,加入上述兩種各稀釋梯度的樣品,與細(xì)胞共培養(yǎng)地。每個(gè)梯度用培養(yǎng) 液稀釋10倍,即每孔終濃度分別為10、20、40、80、150nM。WNS緩沖液作為空白對照。膜酶消 化離屯、后收集細(xì)胞,并將細(xì)胞均勻的分散在20化LNS緩沖液中。之后,對運(yùn)兩組材料進(jìn)行CT 成像測試。
      [0104] 實(shí)施例11
      [0105] 取老鼠的腫瘤體積達(dá)到100-300mm3的時(shí)候開始實(shí)驗(yàn)(大約在注射腫瘤細(xì)胞四周 后),并將實(shí)驗(yàn)開始的時(shí)間記為第0天。在第0天,將100化含有D0X,LAP-化A-PEG-PEI- (ΑιΛ 50-HA/DOX,或者LAP-PLA-PEG-陽I - ( ΑιΛ 50-HA/DOX的生理鹽水溶液化0X的最終濃度為 Img/mL)通過瘤內(nèi)注射到各組裸鼠體內(nèi)。同時(shí),未治療組的裸鼠注射1(Κ)化生理鹽水(安慰 劑),并W此作為空白對照。在第7天和第14天分別重復(fù)注射。實(shí)驗(yàn)過程中,每Ξ天用游標(biāo)卡 尺測量腫瘤大小,并記錄裸鼠體重。同時(shí),長期觀察W記錄每組裸鼠的存活時(shí)間。腫瘤體積, 相對腫瘤體積,W及相對體重可W用下面的公式(1)-(3)分別計(jì)算
      [0106] 腫瘤體積(V)=aXb2 (1)
      [0107] a和b分別代表腫瘤直徑的最大值和最小值
      [0108] 相對腫瘤體積= V/V〇 (2)
      [0109] Vo為腫瘤在開始治療時(shí)的體積大小
      [0110] 相對體重=M/Mo (3)
      [0111] Mo為裸鼠在開始治療時(shí)的體重
      [0112] 實(shí)施例12
      [0113] 為了確定材料的生物安全性,采用H&E染色法對裸鼠主要組織器官進(jìn)行免疫組化 分析。實(shí)驗(yàn)用裸鼠分為4組,分別經(jīng)過生理鹽水,D0X,LAP-PLA-PEG-PEI - ( ΑιΛ 50-HA/DOX+HA blocking和LAP-PLA-PEG-PEI-(Ai^5q-HA/D0X處理,其處理方法同例11所述。在第21天,殺 死實(shí)驗(yàn)鼠并將主要臟器(屯、,肝,脾,肺,腎和腫瘤)取出,浸泡在10%中性福爾馬林溶液中保 存。將獲取的臟器包埋于石蠟中,切割為厚度約化m的切片,并按照標(biāo)準(zhǔn)步驟,用蘇木精和伊 紅染色。用Leica DM IL L抓相差顯微鏡觀察裸鼠的主要組織器官切片,分析經(jīng)過不同治療 的裸鼠的器官壞死情況。
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1. 一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹金納米顆粒的制備方 法,包括: (1) 將聚乳酸一聚乙二醇PLA-PEG-⑶0H溶于溶劑中,然后逐滴加入鋰皂石LAP的水溶 液,常溫?cái)嚢璺磻?yīng)l_2h,透析,得到LAP-PLA-PEG-COOH; (2) 將LAP-PLA-PEG-⑶0H的水溶液中加入EDC進(jìn)行活化2-4h,然后加入到聚乙烯亞胺 PEI水溶液,攪拌2-3d,透析,得到LAP-PLA-PEG-PEI; (3) 氯金酸HAuCl4 · 4H20溶于水中得到氯金酸水溶液,然后將LAP-PLA-PEG-PEI的水溶 液加入氯金酸水溶液,攪拌15-30min,然后加入硼氫化鈉溶液,攪拌反應(yīng)l-4h,透析,得到 LAP-PLA-PEG-PEI-(Au°) 5〇; (4) 將透明質(zhì)酸HA溶于水中,加入EDC進(jìn)行活化2-4h后,加入到LAP-PLA-PEG-TOI-(Auq)5Q水溶液中,攪拌反應(yīng)2-3d,離心,得到LAP-PLA-PEG-PEI-(Au q)5Q-HA; (5) 將LAP-PLA-PEG-PEI - ( Auq ) 5Q-HA的水溶液加入阿霉素水溶液,攪拌12-24h,離心,洗 滌,分散,即得負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹金納米顆粒1^41^-PEG-PEI - (AuQ) 5Q-HA/DOX。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:所述步驟(1)中溶劑為體積比為1:1的丙酮和水的混 合溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:步驟(1)中LAP與PLA-PEG的質(zhì)量比為1:2-4。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:所述步驟(1)中透析具體為:采用的膜為纖維素透析 膜,截留分子量MWCO為8000-14000,在磷酸鹽緩沖溶液PBS中透析2天。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:步驟(2)中EDC與LAP-PLA-PEG的摩爾比為10-12 :1, LAP-PLA-PEG-COOH 與PE I 的摩爾比是 15-20:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:所述步驟(2)中透析具體為:采用的膜為纖維素透析 膜,截留分子量MWC0為50000,在磷酸鹽緩沖溶液PBS中透析2天。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:步驟(3)中HAuCl4 · 4H20和LAP-PLA-PEG-PEI的摩爾比 為50-60:1,NaBH4與HAuCl4 · 4H20的摩爾比為2-5:1;硼氫化鈉溶液的溶劑為冰水。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:步驟⑷中EDC與HA的摩爾比為10-12:1,LAP與HA的質(zhì) 量比是3-4:1。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:步驟(5)中LAP與D0X的質(zhì)量比2-4:1。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種負(fù)載阿霉素的聚乙烯亞胺-透明質(zhì)酸修飾的鋰皂石包裹 金納米顆粒的制備方法,其特征在于:所述步驟(5)中攪拌速度為100-150r/min;離心的速 率為8000-10000r/min,離心的時(shí)間為5min。
      【文檔編號】A61K49/04GK105999283SQ201610292982
      【公開日】2016年10月12日
      【申請日】2016年5月5日
      【發(fā)明人】郭睿, 莊英, 史向陽
      【申請人】東華大學(xué)
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