新的抗adam17抗體及其用于治療癌癥的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種能夠結(jié)合ADAM17的新的抗體，以及編碼所述抗體的氨基酸和核酸序列。從一個方面，本發(fā)明涉及一種能夠結(jié)合ADAM17的具有抗腫瘤活性的新的抗體、或抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還包含所述抗體作為用于治療癌癥的藥物的用途。最后，本發(fā)明包含單獨含有所述抗體、或含有與其它抗癌癥化合物組合或綴合的所述抗體的組合物，以及其用于治療癌癥的用途。CNCM I-468620121018
【專利說明】
新的抗ADAM17抗體及其用于治療癌癥的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種能夠結(jié)合ADAM17的新的抗體，W及編碼所述抗體的氨基酸和核酸 序列。從一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種能夠結(jié)合ADAM17的具有抗腫瘤活性的新的抗體、或抗原 結(jié)合片段。本發(fā)明還包含所述抗體作為用于治療癌癥的藥物的用途。最后，本發(fā)明包含單獨 含有所述抗體、或含有與其它抗癌癥化合物組合或綴合的所述抗體的組合物，W及其用于 治療癌癥的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] ADAM17(含有解聚素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)17)也被稱為蛇毒樣蛋白酶、 TNF-a轉(zhuǎn)換酶（TNF-alpha conve;rtase)、TNF-a-轉(zhuǎn)換酶（TNF-alpha-conve;rtingenzyme， TACE)W及CD15化，ADAM17是膜結(jié)合金屬蛋白酶，負(fù)責(zé)許多病理上重要的底物的細(xì)胞外切割 (胞外域脫落(shedding))。起初ADAM17被鑒定為負(fù)責(zé)切割膜結(jié)合的pro-TNF-a、釋放可溶性 蛋白的酶（Black R.A.等人，1997(NaUire. 1997;385(6618) :729-33),Moss Μ丄.等人，1997 (NaUire. 1997; 385(6618): 733-6))，自此已經(jīng)描述了ADM17在胞外域脫落大量膜結(jié)合前體 蛋白（Black R.A.等人，1997(化 ture. 1997; 385(6618): 729-33)，Moss M.L.等人，1997 (化ture. 1997;385(6618): 733-6))。通過ADAM17所進行的胞外域脫落，從細(xì)胞膜釋放大量 可溶性細(xì)胞因子和生長因子，例如:雙調(diào)蛋白、肝素結(jié)合EGF樣生長因子化B-EGF)、轉(zhuǎn)化生長 因子a(TGF-a)、上皮調(diào)節(jié)蛋白、上皮細(xì)胞有絲分裂蛋白（邱igen)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（Arribas J.等人，（Curr 曲arm Des. 2009; 15(20): 2319-35 .)) eADAM17還調(diào)節(jié)大量受體的脫落，包 括：比-6Ra、比-lRII、Her4、c-Kit、Notch、Mer、TNF-αR巧PII(Arribas，2009)，其生理上的結(jié) 果可W是如對于IL-6Ra和gpl30所描述的（Chalaris A.等人，20lUEur J Cell Biol .2011:90(6-7) :484-94.))，通過受體脫落或可溶性配體誘捕、或受體反式激活所致的 信號沉默。ADAM17通過脫落大量的粘附分子和細(xì)胞外微環(huán)境的成分，例如:心選擇素、ICAM- UVCAM-1、粘連蛋白-4、CD44和膠原蛋白XVII，能夠主動參與細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞間接觸的重 建。對ADAM17 了解較少的活性包括細(xì)胞航蛋白和淀粉樣前體蛋白的胞外域脫落。
[0003] 為避免疑義，無任何說明時，表述ADAM17指序列是SEQ ID齡.29的人40施17。
[0004] 結(jié)構(gòu)上，ADAM17是由824個氨基酸組成的蛋白，其包含前蛋白原結(jié)構(gòu)域(aal-214)、 細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(aa 215-671)、跨膜結(jié)構(gòu)域(aa 672-692)和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(aa 693-824)。
[0005] 更具體地，細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含金屬蛋白酶(MP)結(jié)構(gòu)域，其序列是SEQ ID No.30(對 應(yīng)于ADAM17的aa 215-474)，解聚素(DI)結(jié)構(gòu)域，其序列是SEQ ID No.31(對應(yīng)于ADAM17的 aa 475-563)?及膜近端(MPD)結(jié)構(gòu)域，其序列是SEQID No.32(對應(yīng)于ADAM17的aa 564- 671)。
[0006] 已經(jīng)描述了 A D A Μ 1 7作為技術(shù)上困難的祀標(biāo)用于產(chǎn)生括抗抗體 (antagonisticantibodies)，實際上已經(jīng)描述了復(fù)雜的選擇策略，該策略需要選擇和優(yōu)化 特異性的結(jié)合物，W產(chǎn)生期望的特征。至今，僅描述了一種運樣的特異性括抗物:能夠通過 富含解聚素-半脫氨酸和催化結(jié)構(gòu)域同時結(jié)合至ADAM17的抗體D1(A12KD1(A12)的括抗活 性依賴于結(jié)合富含解聚素-半脫氨酸和催化結(jié)構(gòu)域w實現(xiàn)其括抗活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在彌補祀向ADAM17的具有有效抗腫瘤活性的相關(guān)抗體的缺乏。
[0008] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種能夠結(jié)合ADAM17的抗體、或其抗原結(jié)合片段。
[0009] 在一個具體的方面，與現(xiàn)有技術(shù)中描述的抗體相反，本文中描述的抗體能夠通過 單一結(jié)構(gòu)域結(jié)合ADM17。換言之，根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合單一表位，然而現(xiàn)有技術(shù)的抗 體結(jié)合構(gòu)象表位，所述構(gòu)象表位由兩種不同的分離的結(jié)構(gòu)域(富含解聚素-半脫氨酸的結(jié)構(gòu) 域和催化結(jié)構(gòu)域)組成。
[0010] 運種性能是特別感興趣的，因為抗體的結(jié)合不依賴于根據(jù)患者的性質(zhì)、待治療病 癥的性質(zhì)、患者通常的狀態(tài)等的ADAM17的特定構(gòu)象。
[0011] 在一個實施方案中，描述了一種結(jié)合ADAM17表位并抑制至少一種ADAM17的底物的 脫落的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合片段，其中所述ADAM17表位由包含在序列是SEQ ID No. 32的膜近端結(jié)構(gòu)域(MPD)中的單一表位組成。
[0012] 在一個實施方案中，描述了一種結(jié)合ADAM17表位并抑制至少一種ADAM17的底物的 脫落的單克隆抗體、或其抗原結(jié)合片段，其中所述ADAM17表位由包含在序列是SEQ ID No. 32的膜近端結(jié)構(gòu)域(MPD)中的表位組成。
[0013] 結(jié)合ADAM17的MTO的抗體能夠通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多技術(shù)中的任一個獲 得，包括但不限于免疫接種和雜交瘤產(chǎn)生、單克隆B細(xì)胞選擇、隧菌體展示、核糖體展示、酵 母展示、結(jié)合祀標(biāo)基因合成的表達(dá)免疫應(yīng)答測序。每種方法可W使用ADAM17蛋白或選擇的 子結(jié)構(gòu)域作為祀標(biāo)抗原而進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可W從結(jié)合ADAM17細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、或更具 體地MPD的抗體群當(dāng)中選擇]\ffD結(jié)合抗體。后續(xù)的選擇和表征還可W代表對MPD結(jié)合的選擇 性步驟進行，從而對MPD或選擇的MPD的子結(jié)構(gòu)域的結(jié)合而選擇性地篩選出所有ADM17細(xì)胞 外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合物?；蛘?，所有的選擇步驟可W針對MTO或選擇的MTO的子結(jié)構(gòu)域進行，并且 利用對天然ADAM17細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合作為后續(xù)的選擇和表征步驟。
[0014] 根據(jù)一個具體的實施方案，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段的特征在于由單克隆抗 體組成。
[0015] 應(yīng)理解，"單克隆抗體"意思是來源于幾乎同質(zhì)的抗體群的抗體。更具體地，除了可 最小比例發(fā)現(xiàn)的很少可能天然出現(xiàn)的突變之外，群中的單個抗體是相同的。換言之，單 克隆抗體是由來源于單個細(xì)胞克隆(例如雜交瘤、用編碼同質(zhì)性抗體的DNA分子轉(zhuǎn)染的真核 宿主細(xì)胞、用編碼同質(zhì)性抗體的DNA分子轉(zhuǎn)染的原核宿主細(xì)胞等)生長的同質(zhì)性抗體組成， 其特征通常是一個且僅一個種類和亞類的重鏈，和僅一種類型的輕鏈。單克隆抗體是高度 特異性且針對單一抗原的。
[0016] "結(jié)合(binding)"、"結(jié)合(binds)"諸如此類意指抗體、或其抗原結(jié)合片段與抗原 形成在生理條件下相對穩(wěn)定的復(fù)合物。本領(lǐng)域中熟知用于確定兩種分子是否結(jié)合的方法， 并且包括例如平衡透析、表面等離子體共振等。為避免疑義，運不意味著所述抗體或抗原結(jié) 合片段不能W低水平結(jié)合或干擾其它抗原。作為一個優(yōu)選的實施方案，所述抗體、或其抗原 結(jié)合片段結(jié)合其抗原的親和力(affinity)比結(jié)合非特異性分子(BSA、酪蛋白等）的親和力 至少高兩倍。然而，作為另一個優(yōu)選的實施方案，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段僅結(jié)合所述 抗原。
[0017]如已經(jīng)提及的膜近端結(jié)構(gòu)域(1?0)，由人404117(序列569 10齡.29)的氨基酸結(jié) 構(gòu)域564-671組成。在本文還應(yīng)注意鼠 ADAM17對應(yīng)的Mro也由氨基酸564-671組成。
[0018] 根據(jù)一個具體的方面，本文中描述的抗體不結(jié)合金屬蛋白酶(MP)結(jié)構(gòu)域，所述MP 結(jié)構(gòu)域由序列SEQ ID No.29的氨基酸215-474組成。
[0019] 根據(jù)一個具體的方面，本文中描述的抗體不結(jié)合解聚素(DI)結(jié)構(gòu)域，所述DI結(jié)構(gòu) 域由序列SEQ ID No.29的氨基酸475-563組成。
[0020] 運一方面是令人驚奇的，由于其從未被描述或提出，即括抗物、W及更具體的抗 體，能夠降低或抑制ADAM17底物的脫落，而不干擾ADAM17的催化結(jié)構(gòu)域，已知所述催化結(jié)構(gòu) 域負(fù)責(zé)脫落活性。換言之，本文中描述的抗體能夠選擇性降低或抑制有關(guān)特定病理情況中 至少一種底物的ADAM17的酶活性，所述病理是癌癥。本文中描述的抗體的優(yōu)勢依賴運一事 實，即由于所述抗體不結(jié)合催化結(jié)構(gòu)域，所述抗體看似不抑制ADAM17的全部的催化活性，但 是其能夠降低或抑制對ADAM17全部或部分底物的ADAM17酶活性。
[0021] 在一個實施方案中，本申請描述的抗體W5(K)pM或更低的、優(yōu)選200pM或更低的、W 及更優(yōu)選10化Μ或更低的IC50抑制至少一種ADAM17底物的脫落。
[0022] 在本發(fā)明的情況中，表述"IC50"指劑量應(yīng)答評估中，實現(xiàn)最大可達(dá)到的抑制的一半 時所必需的抗體的濃度。運種IC50的評估可W通過從細(xì)胞脫落的底物評估做出，或者通過使 用重組蛋白的巧光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)膚切割測定做出。
[0023] 在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠抑制TNF-a(腫瘤壞死因子α)的脫落， 并且更優(yōu)選具有至少50化Μ或更低的、優(yōu)選20化Μ或更低的W及更優(yōu)選10化Μ或更低的IC50。
[0024] 在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠抑制TGF-a(轉(zhuǎn)化生長因子α)的脫落， 并且更優(yōu)選具有至少50化Μ或更低的、優(yōu)選20化Μ或更低的W及更優(yōu)選10化Μ或更低的IC50。
[0025] 在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠抑制雙調(diào)蛋白（AREG)的脫落，并且更 優(yōu)選具有至少50化Μ或更低的、優(yōu)選20化Μ或更低的W及更優(yōu)選10化Μ或更低的IC50。
[0026] 在一個優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的抗體能夠抑制皿-EGF(肝素結(jié)合EGF樣生長因 子）的脫落，并且更優(yōu)選具有至少5(Κ)ρΜ或更低的、優(yōu)選20化Μ或更低的W及更優(yōu)選1(Κ)ρΜ或 更低的ICso。
[0027] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的特征在于，其抑制選自TNF-a、TGF-a、AREG和 皿-EGF的至少一種ADAM17的底物的脫落。
[0028] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的特征在于，其W至少500pM或更低的、優(yōu)選 200pM或更低的W及更優(yōu)選10化Μ或更低的1C日日抑制選自TNF-a、TGF-a、AREG和皿-EGF的至少 一種ADAM17的底物的脫落。
[0029] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體的特征在于，其W至少500pM或更低的、優(yōu)選 200pM或更低的W及更優(yōu)選1 OOpM或更低的IC日日抑制TNF-a、TGF-a、AREG和皿-EGF的脫落。
[0030] 根據(jù)另一方面，所述抗體的特征在于，如通過表面等離子體共振(SPR)所確定的， 所述抗體W約1 OnM或更低、優(yōu)選約5nM或更低的Kd結(jié)合ADAM17表位。
[0031] 在另一個實施方案中，所述抗體的特征在于，如通過表面等離子體共振(SPR)所確 定的，所述抗體W約lOnM或更低、優(yōu)選約5nM或更低的、W及更優(yōu)選約2nM或更低的Kd結(jié)合 ADAM17 表位。
[00創(chuàng) "Kd"還稱為"Kd"或"邸"，指特定的抗體-抗原復(fù)合物的解離常數(shù)。Kd = K0ff/K0n，K0ff 包含抗體從抗體-抗原復(fù)合物解離的脫落率常數(shù)，W及Κηη包含抗體與抗原結(jié)合的速率(化en Y.等人，1999;J Mol Biol.1999;293(4):865-81)。
[0033] 本文必須理解，本發(fā)明不設(shè)及天然形式的抗體，換言之，所述抗體不在其天然環(huán)境 中，但是其能夠通過從天然來源純化分離或獲得，或者其它通過基因重組、或通過化學(xué)合成 獲得，并且如本文中將描述的，隨后所述抗體能夠含有非天然氨基酸。
[0034] 本發(fā)明的一個實施方案是一種能夠結(jié)合ADAM17表位的抗體、或其抗原結(jié)合片段， 并且所述抗體、或其抗原結(jié)合片段包含六個CDR(互補決定區(qū)），其中，六個CDR中的至少一 個、優(yōu)選至少兩個、優(yōu)選至少Ξ個、優(yōu)選至少四個W及更優(yōu)選至少五個選自包含氨基酸序列 SEQ ID No.l至6的CDR，或者與序列SEQ ID No.l至6經(jīng)最佳對比后具有至少80%、優(yōu)選 85%、90%、95%和98%同一性的任何序列的〔0尺。
[0035] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段，包含六個CDR，序列 為SEQ ID No.l至6,或者與序列SEQ ID No.l至6經(jīng)最佳對比后具有至少80%、優(yōu)選85%、 90%、95%和98%同一性的任何序列。
[0036] 在另一個實施方案中，本發(fā)明設(shè)及一種結(jié)合ADAM17表位的單克隆抗體、或其抗原 結(jié)合片段，所述抗體包含：
[0037] -重鏈，所述重鏈包含氨基酸序列分別為SEQ ID No.l、2和3的CDR-Hl、CDR-H2和 CDR-冊；和
[003引-輕鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列分別為SEQ ID No.4、5和6的CDR-Ll、CDR-L2和 CDR-L3。
[0039] 在本發(fā)明的一個實施方案中，CDR-H1包含序列SEQ ID No.l,其中稱為Xi的殘基選 自極性氨基酸。所述極性氨基酸優(yōu)選選自天冬酷胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酷胺 (Gin或Q)、絲氨酸（Ser或S)、谷氨酸(Glu或E)、精氨酸(Arg或R)、賴氨酸(Lys或K)、組氨酸 化is或H)、色氨酸(T巧或W)、酪氨酸(Tyr或Y)或蘇氨酸(Thr或T)。
[0040] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，殘基Xi選自小體積極性氨基酸。小體積極性氨基酸 優(yōu)選選自天冬酷胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、絲氨酸(Ser或S)或蘇氨酸(Thr或T)。
[0041 ]在另一個優(yōu)選的實施方案中，殘基Xi是天冬酷胺(Asn或N)。
[0042] 本申請的抗體主題的特征在于，CDR-H1的氨基酸序列是SEQ ID No.7。
[0043] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，殘基Xi是天冬氨酸(Asp或D)。
[0044] 本申請的抗體主題的特征在于，CDR-H1的氨基酸序列是SEQ ID No.8。
[0045] 表述抗體的"抗原結(jié)合片段"意指保留了結(jié)合祀標(biāo)(通常也被稱為抗原）的能力、通 常是結(jié)合相同表位的能力的所述抗體的任何膚、多膚或蛋白，并且包含所述抗體的氨基酸 序列的至少5個連續(xù)的氨基酸殘基、至少10個連續(xù)的氨基酸殘基、至少15個連續(xù)的氨基酸殘 基、至少20個連續(xù)的氨基酸殘基、至少25個連續(xù)的氨基酸殘基、至少40個連續(xù)的氨基酸殘 基、至少50個連續(xù)的氨基酸殘基、至少60個連續(xù)的氨基酸殘基、至少70個連續(xù)的氨基酸殘 基、至少80個連續(xù)的氨基酸殘基、至少90個連續(xù)的氨基酸殘基、至少100個連續(xù)的氨基酸殘 基、至少125個連續(xù)的氨基酸殘基、至少150個連續(xù)的氨基酸殘基、至少175個連續(xù)的氨基酸 殘基或至少200個連續(xù)的氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0046] 在優(yōu)選的實施方案中，所述抗原結(jié)合片段包含至少一種其衍生來自的抗體的CDR。 在更優(yōu)選的實施方案中，所述抗原結(jié)合片段包含其衍生來自的抗體的2、3、4或5個CDR、更優(yōu) 選6個CDR。
[0047] "抗原結(jié)合片段'可W選自，但不限于:Fv、scFv(sc代表單鏈）、Fab、F(ab'）2、Fab'、 scFv-化片段或雙體，或具有無序膚的融合蛋白例如XTEN(延伸重組多膚)或PAS基序，或通 過化學(xué)修飾增加半衰期的任何片段，例如添加聚亞烷基二醇，如聚乙二醇Γ聚乙二醇化"） (聚乙二醇化的片段稱為Fv-陽G、ScFv-PEG、Fab-陽G、F(ab '）2-陽G或Fab ' -陽G)('枕護代表 聚乙二醇），或通過并入脂質(zhì)體，所述片段具有至少一種根據(jù)本發(fā)明的抗體的特征性CDR。優(yōu) 選地，所述"抗原結(jié)合片段?尋組成有或?qū)渌苌鷣碜缘目贵w的重或輕可變鏈的部分 序列，對于祀標(biāo)，所述部分序列足W保留與其所來自的抗體相同的結(jié)合特異性和足夠的親 和力，優(yōu)選地至少等于其所來自的抗體的親和力的1/100,更優(yōu)選地方式是至少1/10。
[0048] 術(shù)語"表位"是抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。表位可W定義為結(jié)構(gòu)性或功能性。功能性表 位通常是結(jié)構(gòu)性表位的子集，并且具有直接促成相互作用的親和力的那些殘基。表位還可 W是構(gòu)象的。在某些實施方案中，表位可W包括分子的化學(xué)活性表面基團的決定因素，例如 氨基酸、糖側(cè)鏈、憐酷基或橫酸醋基，并且在某些實施方案中，可W具有特定的Ξ維結(jié)構(gòu)特 征，和/或特定的電荷特征。
[0049] 為避免疑義，表述"單一表位"不一定意指線性表位。
[0050] 為避免疑義，在本文中無相反指示時，表述乂 DR"意指IMGT所定義的抗體的重鏈和 輕鏈的高度可變區(qū)。
[0051] 無論抗原受體、鏈類型或物種如何，都將IMGT唯一的編號定義為比較可變結(jié)構(gòu)域 [Lefr曰nc M.-P.,Immunology Today 18,509(1997)/Lefr曰nc M.-P.,The Immunologist, 7,132-136(1999)/Lefranc,M.-P.,Pommi有，C.,Ruiz,M.,Giudicelli,V.,Foulquier,E., Truong,L.,Thouvenin-Contet,V.和Lefranc,Dev.Comp. Immunol.,27,55-77(2003)]。在 IMGT唯一編號中，保守性氨基酸總是具有相同位置，例如半脫氨酸23(第1個CYS)、色氨酸41 (保守性TRP)、疏水性氨基酸89、半脫氨酸104(第2個CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118(J-P皿或 J-TRP)。所述IMGT唯一編號提供了框架區(qū)（FR1-IMGT:位置 1 至26，F(xiàn)R2-IMGT: 39至55，F(xiàn)R3- IMGT: 66至 104 和 FR4-IMGT: 118至 128)和互補決定區(qū)CDR1-IMGT: 27至 38，CDR2-IMGT: 56至65 和CDR3-IMGT:105至117的標(biāo)準(zhǔn)化定界。由于空位(gap)代表未占用的位置，CDR-IMGT長度 (在括號之間顯示，并用點分開，例如[8.8.切）成為關(guān)鍵信息。在2D圖解中使用IMGT唯一編 號，命名為IMGT Colliers de Pe;rles[Ruiz,M.和 Lefranc,M.-P.,Immunogenetics,53, 857-883(2002)/Kaas,Q.和Le打anc,M.-P.'Qirrent Bioinformatics,2,21-30(2007)]，并 在IMGT/3D結(jié)構(gòu)-DB中的3D結(jié)構(gòu)中使用[Kaas，Q.，Ruiz，M.和Lefranc，M.-P.，Tcell receptor and MHC structural data.Nucl.Acids.Res.,32,D208-D210(2004)]。
[0052] 存在Ξ種重鏈CDR和Ξ種輕鏈CDR。根據(jù)情況，本文所使用的術(shù)語CDR或CDRs表示含 有大多數(shù)氨基酸殘基的運些區(qū)域中的一個或數(shù)個、或者甚至全部運些區(qū)域，所述大多數(shù)氨 基酸殘基負(fù)責(zé)抗體對其識別的抗原或表位的親和力結(jié)合。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段還可W描述為包含：i)包含CDR-H1、 CDR-肥和CDR-冊的重鏈，所述CDR-HUCDR-肥和CDR-冊分別包含氨基酸序列SEQ ID No. 1、2 和3,或者與序列SEQ ID No. 1、2和3經(jīng)最佳對比后具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和 98%同一性的序列；和ii)包含CDR-LUCDR-L2和CDR-L3的輕鏈，所述CDR-LUCDR-L2和CDR- 13分別包含氨基酸序列5日〇10齡.4、5和6，或者與序列5日〇10齡.4、5和6經(jīng)最佳對比后具 有至少80 %、優(yōu)選85 %、90 %、95 %和98 %同一性的序列。
[0054] 在本發(fā)明的意義上，兩條核酸或氨基酸序列之間的"百分比同一性"或"％同一性" 指兩條進行比較的序列之間在最佳比對后獲得的相同核巧酸或氨基酸殘基的百分比，該百 分比是純粹統(tǒng)計學(xué)上的，并且兩條序列之間的差異沿其長度隨機分布。兩條核酸或氨基酸 序列之間的比較通常在已對其進行最佳比對后通過比較序列而進行，所述比較能夠分段進 行或使用"比對窗口"進行。用于比較的序列的最佳比對，除手工比較之外，還可W通過 Smith和Waterman的局部同源性算法（1981) (Ad. App .Math . 2 : 482)、通過Neddleman和 Wunsch的局部同源性算法（1970)( J.Mol .Biol .48:443)、通過化arson和Lipman的相似性捜 索法（1988)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)或通過使用運些算法的計算機軟件(威斯 康星遺傳學(xué)軟件包，遺傳學(xué)計算機組，575Science Dr.，Madison，WI的GAP、BESTFIT、FASTA 和TFASTA，或通過比較軟件BLAST NR或BLAST P)進行。
[0055] 通過比較兩條最佳比對的序列確定兩條核酸或氨基酸序列之間的百分比同一性， 其中與用于兩條序列之間最佳比對的參照序列相比，待比較的核酸或氨基酸序列可具有添 加或缺失。通過如下方法計算百分比同一性:確定兩條序列、優(yōu)選兩條全長序列之間相同氨 基酸、核巧酸或殘基的位置數(shù)目，將相同位置的數(shù)目除W在比對窗口中的位置總數(shù)，并將結(jié) 果乘W100W獲得兩條序列之間的百分比同一性。
[0化6]例如，從網(wǎng)站ht1:p: //www. ncbi .nlm.nih. gov/go;rf/bl2. html上可獲得的BLAST程 序"BLAST 2序列"（Tatusova等人，"Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences",陽MS Microbiol,1999，Lett.174:247-250)，可W 與缺省參數(shù)一起使用(特別是參數(shù)"開放空位罰分"：5,和"延伸空位罰分"：2;所選的矩陣是 例如程序建議的"BL0SUM 62"矩陣）；直接通過所述程序計算兩條待比較序列之間的百分比 同一'性。
[0化7] 對于表現(xiàn)出與參照氨基酸序列具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性 的氨基酸序列而言，優(yōu)選的實例包括包含參照序列，某些修飾，特別是至少一個氨基酸的缺 失、添加或置換，截短或延伸的那些。在置換一個或多個連續(xù)或不連續(xù)氨基酸的情況下，優(yōu) 選其中被置換的氨基酸被"等同的"氨基酸所取代的置換。在此，表述"等同的氨基酸"指可 能被結(jié)構(gòu)性氨基酸之一所置換的，然而并未改變相應(yīng)抗體的生物活性的任何氨基酸和下述 限定的那些具體實例。
[0058] 等同氨基酸可根據(jù)其與被置換氨基酸的結(jié)構(gòu)同源性或根據(jù)可能產(chǎn)生的各種抗體 之間生物活性的比較性測試結(jié)果而確定。
[0059] 作為非限制性實例，下表1概述可進行卻沒有引起相應(yīng)經(jīng)修飾的抗體的生物活性 發(fā)生顯著改變的可能置換;在相同條件下，反向置換自然是可能的。
[0060] 皇
[0061]

[0062] 根據(jù)本發(fā)明，所述抗體、或其任何抗原結(jié)合片段還可W描述為包含：i)包含CDR- HUCDR-H2和CDR-H3的重鏈，所述CDR-HUCDR-H2和CDR-H3分別包含氨基酸序列SEQ ID No. 7、2和3,或者與序列SEQ ID No. 7、2和3經(jīng)最佳對比后具有至少80 %、優(yōu)選85 %、90 %、 95 %和98 %同一性的序列；和i i)包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的輕鏈，所述CDR-L1、CDR-L2 和〔03寸3分別包含氨基酸序列569 10齡.4、5和6，或者與序列569 10齡.4、5和6經(jīng)最佳對 比后具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明，所述抗體、或其任何抗原結(jié)合片段還可W描述為包含：i)包含CDR- HUCDR-H2和CDR-H3的重鏈，所述CDR-HUCDR-H2和CDR-H3分別包含氨基酸序列SEQ ID No. 8、2和3,或者與序列SEQ ID No. 8、2和3經(jīng)最佳對比后具有至少80 %、優(yōu)選85 %、90 %、 95 %和98 %同一性的序列；和i i)包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的輕鏈，所述CDR-L1、CDR-L2 和〔03寸3分別包含氨基酸序列569 10齡.4、5和6，或者與序列569 10齡.4、5和6經(jīng)最佳對 比后具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0064] 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段包含序列含有氨基酸序 列沈Q ID No.9的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，或者與序列SEQ ID No.9經(jīng)最佳比對后具有至少80%， 優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0065] 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段包含序列含有氨基酸序 列SEQ ID No. 11的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，或者與序列SEQ ID No. 11經(jīng)最佳比對后具有至少 80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0066] 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段包含序列含有氨基酸序 列SEQ ID No. 12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，或者與序列SEQ ID No. 12經(jīng)最佳比對后具有至少 80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0067] 在一個實施方案中，所述抗體的特征在于，所述抗體包含序列含有氨基酸序列SEQ ID No.9、11或12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0068] 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段包含序列含有氨基酸序 列SEQ ID No. 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，或者與序列SEQ ID No. 10經(jīng)最佳比對后具有至少 80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0069] 在一個實施方案中，所述抗體的特征在于，所述抗體包含序列含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0070] 根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的抗體、或其抗原結(jié)合片段包含
[0071] i)重鏈可變結(jié)構(gòu)域，其序列含有選自SEQ ID No.9、11或12的氨基酸序列，或者與 序列SEQ ID齡.9、11或12經(jīng)最佳比對后具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性 的序列，W及
[0072] ii)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其序列含有氨基酸序列SEQ ID No.lO，或者與序列SEQID No. 10經(jīng)最佳比對后有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。
[0073] 更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種抗體，其特征在于，所述抗體包含序列含有氨基酸序列 56〇10齡.9、11或12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域;和序列含有氨基酸序列56〇10齡.10的輕鏈可變 結(jié)構(gòu)域。
[0074] 在一個實施方案中，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段包含i)序列含有氨基酸序列SEQ ID No.9的重鏈可變結(jié)構(gòu)域;和ii)序列含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0075] 在一個實施方案中，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段包含i)序列含有氨基酸序列SEQ ID No. 11的重鏈可變結(jié)構(gòu)域;和ii)序列含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0076] 在一個實施方案中，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段包含i)序列含有氨基酸序列SEQ ID No. 12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域;和ii)序列含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。
[0077] 在一個實施方案中，所述抗體由鼠抗體組成。在運個情況中，所述抗體被稱為 ml022C3〇
[0078] 在一個實施方案中，所述抗體由嵌合抗體組成。在運個情況中，所述抗體被稱為 C1022C3。
[0079] 在一個實施方案中，所述抗體由人源化抗體組成。在運個情況中，所述抗體被稱為 hzl022C3。
[0080] 在一個實施方案中，所述抗體由人抗體組成。在運個情況中，所述抗體被稱為 hl022C3。
[0081 ] 表述1022C3還可W用于指與起源無關(guān)的抗體，意指其包含m/c/h/hz 1022C3。
[0082] 為了更清楚，下表2總結(jié)了本發(fā)明的抗體對應(yīng)的不同的氨基酸序列。
[0083] 整
[0084]
[0085] 在另一方面，所述抗體、或其抗原結(jié)合片段由嵌合抗體組成。
[0086] 嵌合抗體是運樣的一種抗體，其含有衍生自給定物種的抗體的天然可變區(qū)（輕鏈 和重鏈)與所述給定物種異質(zhì)的物種的抗體的輕鏈和重鏈的恒定區(qū)相結(jié)合。
[0087] 所述抗體、或其嵌合片段可W通過使用基因重組技術(shù)制備。例如，嵌合抗體可W通 過克隆重組DNA產(chǎn)生，所述重組DNA含有啟動子和編碼本發(fā)明的非人(特別是鼠）單克隆抗體 可變區(qū)的序列、W及編碼人抗體恒定區(qū)的序列。例如，通過運樣一種重組基因編碼的根據(jù)本 發(fā)明的嵌合抗體可W是鼠-人嵌合體，運種抗體的特異性由衍生自鼠 DNA的可變區(qū)決定，并 且所述抗體的同種型由衍生自人DNA的恒定區(qū)決定。用于制備嵌合抗體的方法參考 Verhoeyn等人（BioEssays ,8:74,1988)。
[0088] 本發(fā)明的一個特定的方面設(shè)及一種嵌合抗體、或其抗原結(jié)合片段，包含：
[0089] i)含有CDR-H1、CDR-肥和CDR-冊的重鏈，所述CDR-H1、CDR-H2和CDR-冊分別含有氨 基酸序列沈Q ID No. 1、2和3,或者與序列沈Q ID No. 1、2和3經(jīng)最佳比對后具有至少80%， 優(yōu)選85 %、90 %、95 %和98 %同一性的序列；
[0090] ii)含有 CDR-LUCDR-L2 和 CDR-L3 的輕鏈，所述 CDR-LUCDR-L2 和 CDR-L3 分別含有 氨基酸序列SEQIDNo.4、5和6，或者與序列SEQIDNo.4、5和6經(jīng)最佳比對后具有至少 80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列;和
[0091] iii)所述抗體還包含衍生自與鼠異質(zhì)的物種的抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)。
[0092] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述與鼠異質(zhì)的物種是人(也可稱為人類）。
[0093] 作為一個實例，根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體的特征在于，其包含序列含有氨基酸序列 SEQ ID No.33的重鏈;和/或序列含有氨基酸序列SEQ ID No.35的輕鏈。
[0094] 作為一個實例，根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體的特征在于，其包含序列含有氨基酸序列 SEQ ID No.34的重鏈;和任選地序列含有氨基酸序列SEQ ID No.35的輕鏈。
[0095] 在一個更優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的嵌合抗體的特征在于，其包含序列含 有氨基酸序列SEQ ID No.33或34的重鏈;和序列含有氨基酸序列SEQ ID No.35的輕鏈。
[0096] 在另一方面，本發(fā)明設(shè)及一種由人源化抗體組成的抗體、或其抗原結(jié)合片段。
[0097] "人源化抗體"意指含有衍生自非人起源的抗體的CDR區(qū)的抗體，抗體分子的其它 部分衍生自一種(或多種)人抗體。此外，一些骨架段殘基(稱為FR)可W被修飾W保留結(jié)合 親和力（Jones 等人,Na1:ure, 321:522-525,1986 ;Ve;rhoeyen 等人，Science, 239:1534-1536, 1988;Riechmann等人，Na1:ure,332:323-327,1988)。
[0098] 本發(fā)明的人源化抗體或其片段可W通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)制備(例如， 例如在文件Singer等人，J. Immun. , 150:2844-2857, 1992;Mountain等人， Bio techno 1 .Genet .Eng. Rev. , 10 :1-142,1992;和 Bet)bington 等人，Bio/Techno logy, 10: 169-175,1992中所描述的那些）。運種人源化抗體對于它們在設(shè)及體外診斷或預(yù)防和/或體 內(nèi)治療處理的方法中使用是優(yōu)選的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還已知其它人源化技術(shù)，例如，例如 PDL在專利EP 0 451 26UEP 0 682 040、EP 0 939 127、EP 0566 647或US 5,530，101、US 6，180，370、US 5，585，089和US 5，693，761中描述的"CDR接枝"技術(shù)。還可W引用美國專利 5,639,641或6,054,297、5,886,152和5,877,293。
[0099] 本發(fā)明的一個特定的方面設(shè)及一種人源化抗體、或其抗原結(jié)合片段，包含：
[0100] i)含有CDR-HUCDR-肥和CDR-冊的重鏈，所述CDR-HUCDR-H2和CDR-冊分別含有氨 基酸序列沈Q ID No. 1、2和3,或者與序列沈Q ID No. 1、2和3經(jīng)最佳比對后具有至少80%， 優(yōu)選85 %、90 %、95 %和98 %同一性的序列；
[0101] ii)含有 CDR-LUCDR-L2 和 CDR-L3 的輕鏈，所述 CDR-LUCDR-L2 和 CDR-L3 分別含有 氨基酸序列SEQIDNo.4、5和6，或者與序列SEQIDNo.4、5和6經(jīng)最佳比對后具有至少 80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列;和
[0102] iii)所述抗體還包含衍生自人的抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)。
[0103] 在一個實施方案中，描述了一種人源化抗體、或其抗原結(jié)合片段，包含i)含有CDR- HUCDR-H2和CDR-H3的重鏈，所述CDR-HUCDR-H2和CDR-H3分別含有氨基酸序列SEQ ID No. 1、2和3，ii)含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的輕鏈，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別含 有氨基酸序列SEQ ID No.4、5和6;和iii)所述抗體還包含衍生自人的抗體的輕鏈和重鏈恒 定區(qū)。
[0104] 在一個實施方案中，描述了一種人源化抗體、或其抗原結(jié)合片段，包含i)含有CDR- HUCDR-H2和CDR-H3的重鏈，所述CDR-HUCDR-H2和CDR-H3分別含有氨基酸序列SEQ ID No. 7、2和3，ii)含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的輕鏈，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別含 有氨基酸序列SEQ ID No.4、5和6;和iii)所述抗體還包含衍生自人的抗體的輕鏈和重鏈恒 定區(qū)。
[0105] 在一個實施方案中，描述了一種人源化抗體、或其抗原結(jié)合片段，包含i)含有CDR- HUCDR-H2和CDR-H3的重鏈，所述CDR-HUCDR-H2和CDR-H3分別含有氨基酸序列SEQ ID No. 8、2和3，ii)含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的輕鏈，所述CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3分別含 有氨基酸序列SEQ ID No.4、5和6;和iii)所述抗體還包含衍生自人的抗體的輕鏈和重鏈恒 定區(qū)。
[0106] 在一個優(yōu)選的方式中，衍生自人抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)分別是λ或K和丫 -1、丫- 2或丫-4區(qū)。
[0107] 描述了一種單克隆抗體、或其抗原結(jié)合片段，其特征在于由獲得自雜交瘤1-4686 的單克隆抗體1022C3組成，所述雜交瘤1-4686于2012年10月18日保藏在CNCM，法國，己黎 75725郵政編碼15，Docteur Roux路25號，己斯德研究所。
[0108] 根據(jù)另一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種能夠分泌根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體的鼠雜交 瘤，特別是在2012年10月18日提交于法國微生物培養(yǎng)物保藏中屯、(CNCM，己斯德研究所，己 黎，法國）編號為1-4686的鼠源性雜交瘤。所述雜交瘤通過融合免疫的Ba化/C小鼠脾細(xì)胞和 骨髓瘤Sp 2/0-Ag 14系的細(xì)胞獲得。
[0109] 在一個具體的實施方案中，本文中描述的抗體的特征在于，其能夠結(jié)合ADAM17的 單一表位，所述ADAM17的單一表位包含在序列是SEQ ID齡.32的膜近端結(jié)構(gòu)域(1?0)內(nèi)。
[0110] 所述抗體的另一個優(yōu)選的性能是其抑制至少一種ADAM17的底物脫落，具有至少 500pM或更低的、優(yōu)選20化Μ或更低的W及更優(yōu)選10化Μ或更低的IC50,所述至少一種ADAM17 的底物優(yōu)選選自TNF-a、TGF-a、AREG和/或皿-EGF。
[0111] 在另一個實施方案中，所述抗體的特征在于，如通過表面等離子體共振(SPR)所確 定的，所述抗體W約lOnM或更低的、優(yōu)選約5nM或更低的、W及更優(yōu)選約2nM或更低的Kd結(jié)合 ADAM17 表位。
[0112] 本發(fā)明的另一方面是一種抑制腫瘤細(xì)胞的生長和/或增殖的方法，其中所述方法 包含向有需要的患者施用有效量的上述抗體、或其抗原結(jié)合片段的步驟。
[0113] 在另一個實施方法中，描述了所述抗體用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長和/或增殖的方 法中，所述腫瘤細(xì)胞選自表達(dá)ADAM17的腫瘤細(xì)胞。
[0114] 本領(lǐng)域技術(shù)人員通過已知的技術(shù)例如細(xì)胞計數(shù)、免疫組織化學(xué)、抗體結(jié)合能力 (ABC)等將很容易確定ADAM17的表達(dá)水平。
[0115] 作為一個非限制性的實例，可W通過細(xì)胞計數(shù)測量標(biāo)記抗體對ADAM17的抗體結(jié)合 能力(ABC)來確定表達(dá)水平。
[0116] 在一個實施方案中，具有至少5000的ABC，則認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表達(dá)ADAM17。
[0117] 在另一個實施方案中，具有至少10000的ABC，則認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表達(dá)ADAM17。
[0118] 本發(fā)明的另一個方面設(shè)及一種鼠雜交瘤1-4686,其于2012年10月18日保藏在 CNCM，法國己斯德研究所。
[0119] 本發(fā)明的另一方面設(shè)及一種分離的核酸，其特征在于，所述分離的核酸選自W下 核酸：
[0120] a)編碼上述抗體、或其抗原結(jié)合片段的核酸；
[0121] b)含有序列沈Q ID No. 13至28的核酸，或與沈Q ID No. 13至28和36至38經(jīng)最佳對 比后顯示至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%百分比同一性的序列的核酸。
[0122] 本發(fā)明設(shè)及一種分離的核酸，其特征在于，所述分離的核酸選自W下核酸：
[0123] a)編碼上述抗體、或其抗原結(jié)合片段的DNA或RNA;和
[0124] b)含有選自沈Q ID No. 13-28和36至38的序列之一的DNA，優(yōu)選含有編碼CDR H1、 H2、H3和L1、L2、L3的6種核酸，或者編碼重鏈和/或輕鏈的核酸，優(yōu)選選自SEQ ID No.13-28 和36至38的抗ADAM17抗體可變結(jié)構(gòu)域。
[0125] 下表3總結(jié)了設(shè)及本發(fā)明的抗體的不同的核巧酸序列。
[0126] 整
[0127]
[0128] 術(shù)語"核酸"、"核序列"、"核酸序列"、"多核巧酸"、"寡核巧酸"、"多核巧酸序列"和 "核巧酸序列"在本說明書中可互換使用，表示無論有無修飾的確定核酸的片段或區(qū)域的精 確核巧酸序列，其含有或不含非天然核巧酸，是雙鏈DNA、單鏈DNA或所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0129] 在本文還應(yīng)包括，本發(fā)明不設(shè)及在天然染色體環(huán)境、即天然狀態(tài)中的核巧酸序列。 本發(fā)明的序列已經(jīng)被分離和/或純化，即例如通過復(fù)制，它們被直接地或間接地取樣，它們 的環(huán)境已經(jīng)至少部分改變。在本文還提及了例如通過宿主細(xì)胞的基因重組的方式獲得分離 核酸，或者通過化學(xué)合成獲得。
[0130] 。和優(yōu)選序列最佳比對后表現(xiàn)出至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%百分比同 一性的核序列"表示，就參照核序列而言，表現(xiàn)出某些修飾，比如，尤其是缺失、截短、延長、 嵌合融合和/或置換，特別是點突變(punctual)的核序列。優(yōu)選地，運些是編碼與參照序列 相同氨基酸序列的序列，運設(shè)及遺傳密碼的簡并、或優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下傾向于和參 照序列特異性雜交的互補性序列。
[0131] 還描述了一種包含上述核酸的載體。
[0132] 本發(fā)明特別設(shè)及含有運種核巧酸序列的克隆和/或表達(dá)載體。
[0133] 本發(fā)明的載體優(yōu)選含有在給定的宿主細(xì)胞中允許核巧酸序列轉(zhuǎn)錄/翻譯表達(dá)和/ 或分泌的元件，導(dǎo)致編碼的蛋白的表達(dá)/分泌。因此所述載體必須含有啟動子、翻譯啟動和 終止信號、W及合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。在一個優(yōu)選的實施方案中，運種載體應(yīng)該能夠在宿主細(xì) 胞中W穩(wěn)定的方式維持，并且可任選地具有指導(dǎo)（specify)翻譯蛋白分泌的特定信號。根據(jù) 所使用的宿主細(xì)胞本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇和最佳化運些不同的元件。為了運個目的，核巧酸 序列可w插入在選擇的宿主中的自復(fù)制載體中，或者選擇的宿主的整合載體。
[0134] 通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的典型的方法制備運種載體，并且產(chǎn)生的克隆可W通 過標(biāo)準(zhǔn)的方法例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔、熱沖擊或化學(xué)方法引入合適的宿主。
[0135] 例如，載體是質(zhì)粒或病毒起源的載體。為克隆或表達(dá)本發(fā)明的核巧酸序列，使用載 體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
[0136] 本發(fā)明還設(shè)及包含上述載體的宿主細(xì)胞。
[0137] 所述宿主細(xì)胞選自原核或真核系統(tǒng)，例如細(xì)菌細(xì)胞，還例如酵母細(xì)胞或動物細(xì)胞， 特別是哺乳動物細(xì)胞。也可W使用昆蟲或植物細(xì)胞。
[0138] 本申請的另一個主題包括一種除人W外的轉(zhuǎn)基因動物，其包含至少一種由上述抗 體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
[0139] 根據(jù)本說明書，因此還描述了一種用于產(chǎn)生抗體、或其抗原結(jié)合片段的方法，其特 征在于包含W下階段：
[0140] a)在介質(zhì)和合適的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)上述細(xì)胞;和
[0141] b)從培養(yǎng)介質(zhì)或所述培養(yǎng)的細(xì)胞開始，回收所產(chǎn)生的所述抗體、或其抗原結(jié)合片 段。
[0142] 根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于根據(jù)本發(fā)明的重組多膚的制備方法。用于W重組的形 式制備根據(jù)本發(fā)明的多膚的方法也包含在本發(fā)明中，其特征在于，所述方法使用根據(jù)本發(fā) 明的載體和/或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是在允許前述多膚 表達(dá)、和回收所述重組膚的條件下培養(yǎng)的。
[0143] 如已經(jīng)提及的，宿主細(xì)胞可W選自原核或真核系統(tǒng)。特別的，可W鑒定在運種原核 或真核系統(tǒng)中促進分泌的本發(fā)明的核巧酸序列。載有運種序列的根據(jù)本發(fā)明的載體，因此 能夠有利地用于產(chǎn)生待分泌的重組蛋白。實際上，重組蛋白存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中而不 是宿主細(xì)胞內(nèi)的事實，將促進運些感興趣的重組蛋白的純化。
[0144] 本發(fā)明的多膚也可W通過化學(xué)合成制備。運種制備方法也是本發(fā)明的主題。本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知用于化學(xué)合成的方法，例如固相技術(shù)(特別參見Steward等人，1984，Solid phase peptides synthesis,Pierce Chem.Company,Rockford, 111,第二片反）或者部分固相 技術(shù)，通過片段縮合(condensation)或通過在溶液中常規(guī)合成。通過化學(xué)合成獲得的且能 夠含有相應(yīng)的非天然氨基酸的多膚也包含在本發(fā)明中。
[0145] 通過本發(fā)明的方法可能獲得的抗體、或其抗原結(jié)合片段也包含在本發(fā)明中。
[0146] 本發(fā)明設(shè)及上述抗體、或其抗原結(jié)合片段用作藥物。
[0147] 本發(fā)明還設(shè)及一種組合物，其特征在于，所述組合物還包含另一種由抗腫瘤化合 物組成的治療有效的化合物。
[0148] 在一個實施方案中，本申請設(shè)及一種包含上述抗體的組合物。
[0149] 在一個實施方案中，所述組合物的特征在于，作為組合產(chǎn)品，所述組合物還包含治 療有效量的細(xì)胞毒性劑。
[0150] 組成組合的成分可W同時地、分別地或順序地施用，W便獲得組合的最大效能；可 能對于每次施用，快速施用和持續(xù)灌注的持續(xù)時間是變化的。
[0151] 如本文所使用的"同時施用"指根據(jù)組合物的兩種化合物W單一和唯一藥物形式 施用。
[0152] 如本文所使用的"分別施用"指在相同的時間，將根據(jù)本發(fā)明的組合物的兩種化合 物W不同的藥物形式施用。
[0153] 如本文所使用的"順序施用"指將根據(jù)本發(fā)明的組合物的兩種化合物，每種W不同 的藥物形式依次施用。
[0154] 如本文中所使用的"治療有效量"指有效預(yù)防、緩解、減少或改善疾病癥狀或延長 被治療患者的生存的一種(或多種化合物)的最低濃度或量。治療有效量還是治療有利作用 超過試劑的任何有毒或有害作用的量。更具體地，關(guān)于癌癥治療，治療有效量指具有W下作 用的量(1)減小腫瘤的尺寸(或優(yōu)選消除）；（2)抑制（即，在一定程度上減緩，優(yōu)選停止)腫瘤 轉(zhuǎn)移；（3)在一定程度上抑制（即，在一定程度上減緩，優(yōu)選停止)腫瘤生長;和/或，（4)在一 定程度上減輕(或優(yōu)選消除)一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀。
[0155] 在一個實施方案中，所述組合物的特征在于，作為綴合產(chǎn)品，所述組合物還包含治 療有效量的細(xì)胞毒性劑。
[0156] 在本發(fā)明的觀點中，表述"綴合"通常指包含物理連接有一種或多種細(xì)胞毒性劑的 至少一種上述抗體的組合物，因此產(chǎn)生高度祀向的化合物。
[0157] 在一個實施方案中，所述抗體通過接頭化學(xué)連接細(xì)胞毒性劑。"接頭"、"接頭單元" 或"連接"意指含有共價鍵或原子鏈的化學(xué)半簇，其將結(jié)合蛋白共價與至少一種細(xì)胞毒性劑 連接。所述接頭可W是"不可切割的"或"可切割的"。
[0158] 本發(fā)明的組合物還可含有多種稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑和本領(lǐng) 域熟知的其它材料。
[0159] 在另一個實施方案中，所述組合物是藥物組合物，還包含藥學(xué)可接受的載體。
[0160] 如本文中所使用的"藥學(xué)可接受的載體（vehicle)"或"藥學(xué)可接受的載體 (carrier r包括生理上兼容的W下項的任何和全部:溶劑、緩沖劑、鹽溶液、分散劑介質(zhì)、包 衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑等。載體的類型可W基于預(yù)期施用途徑選擇。在 不同的實施方案中，載體適合于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、局部、透皮或口服施用。藥學(xué) 可接受的載體包括無菌水溶液或分散劑，W及用于即時制備無菌注射溶液或分散劑的無菌 粉末。本領(lǐng)域熟知用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑的使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將熟知或顯而 易見制備可非腸道施用的化合物的方法，并且在例如Remington ' S F*ha;rmaceutical Science,第十屯版,MackPublishing Company ,E；aston,Pa. (1985),和其第十八版和第十九 版中更詳細(xì)的描述，其通過參考并入本文中。
[0161] "細(xì)胞毒性劑"或"細(xì)胞毒素"意指當(dāng)向受試者施用時，通過抑制或預(yù)防細(xì)胞功能 和/或引起細(xì)胞死亡而治療或預(yù)防細(xì)胞增殖的發(fā)展、優(yōu)選受試者機體中癌癥的發(fā)展的試劑。
[0162] 已經(jīng)分離或合成了許多細(xì)胞毒性劑，并且使得能夠抑制細(xì)胞增殖、或者如果不明 確則至少顯著地破壞或減少腫瘤細(xì)胞。
[0163] 更優(yōu)選地，所述細(xì)胞毒性劑優(yōu)選可W由藥物、毒素、放射性同位素等組成，但不限 于此。
[0164] 根據(jù)另一個方面，描述了所述組合物用于抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或增殖的方法。
[0165] 本發(fā)明還包含所述組合物用于制備旨在預(yù)防或治療癌癥的藥物中的用途。
[0166] 本發(fā)明還設(shè)及上述抗體、或通過上述方法獲得的抗體、或上述組合物用于治療癌 癥的用途，所述癌癥是選自表達(dá)ADAM17的癌癥的癌癥。
[0167] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述癌癥是選自卵巢癌、乳癌、腎癌、肝癌、膜腺癌、肺 癌、頭頸癌和表皮樣癌的癌癥。
[0168] 用于治療應(yīng)用，本發(fā)明的組合物W例如W上討論的那些藥學(xué)上可接受劑型向哺乳 動物優(yōu)選人施用，包括可W靜脈推注向人施用，或者通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、 關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、銷內(nèi)、口、局部或吸入途徑通過持續(xù)一段時間持續(xù)灌注向人施用的那些。本 發(fā)明所述的組合物還適合通過腫瘤內(nèi)、腫瘤周圍、病灶內(nèi)、或病灶周圍的途徑施用，W發(fā)揮 局部W及系統(tǒng)治療作用。
[0169] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢在具有實施例和附圖的說明書中進一步體現(xiàn)，W下顯示 附圖的說明。
【附圖說明】
[0170] 圖1:FRET膚切割測定。
[0171] 圖 2:mAb 1022C3 對 A431-TGFa-Nluc 細(xì)胞的 TGFa-Nluc 釋放的作用。
[017。圖 3:mAb 1022C3 對 A431-AREG-N1UC 細(xì)胞的 AREG-Nluc 釋放的作用。
[0173] 圖 4:mAb 1022C3 對 A431-TNFa-Nluc 細(xì)胞的 TNFa-Nluc 釋放的作用。
[0174] 圖 5:mAb 1022C3 對 A431-HB-EGF-N1UC 細(xì)胞的 HB-EGF-Nluc 釋放的作用。
[0175] 圖6:對1022C3變體的FRET膚切割測定。
[0176] 圖7:糖基化和酶促去糖基化的ml022C3對腫瘤細(xì)胞系NCI-H1299的結(jié)合。
[0177] 圖8:mAb 1022C3對MC巧細(xì)胞上AREG脫落的抑制。
[017引圖9:mAb 1022C3對MC巧細(xì)胞上AREG脫落的劑量作用。
[01巧]圖10:1022C3對建立的A431異種移植的體內(nèi)活性。
[0180] 圖11:1022C3對片段A431異種移植模型的體內(nèi)活性。
[0181] 圖12:ml022C3(鼠形式)和cl022C3(嵌合形式)對A431異種移植模型的比較。
[0182] 圖13:1022C3對建立的化0V-3異種移植的體內(nèi)活性。
[0183] 圖14:1022C3對建立的0VI沈異種移植的體內(nèi)活性。
[0184] 圖15:1022C3對建立的BxPC3異種移植的體內(nèi)活性。
[0185] 圖16:1022C3對建立的BICR-22異種移植的體內(nèi)活性。
[01化]圖17:1022C3對建立的JIMT-1異種移植的體內(nèi)活性。
[0187] 圖18:1022C3對建立的NCI-肥92異種移植的體內(nèi)活性。
【具體實施方式】
[0刪實施例1:抗體的產(chǎn)生
[0189] 為產(chǎn)生針對人ADAM17的鼠單克隆抗體(mAb)，使用15-20yg的人ADAM17重組蛋白（R and D Systems，ref: 930-ADB，rhADAM17)，皮下免疫5只BALB/c小鼠 Ξ次。進行首次免疫時 存在完全弗氏佐劑（Sigma,圣路易斯，馬里蘭州，美國）。之后的免疫添加不完全弗氏佐劑 (Sigma)。
[0190] 在融合前3天，2只免疫的小鼠（基于血清滴定選擇)使用15-2化g的riiADAM17蛋白 和不完全弗氏佐劑加強(boosted)。通過切碎近端淋己結(jié)制備淋己細(xì)胞，然后將淋己細(xì)胞與 SP2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞Wl:4的比例(淋己細(xì)胞:骨髓瘤)融合(ATCC，羅克維爾，馬里蘭州， 美國）。融合過程由Kohler和Milstein(1975)描述，最后，接種50個96孔板。然后融合細(xì)胞經(jīng) 歷代謝HAT選擇。在融合后大約10天，篩選雜交細(xì)胞的克隆。對于初步篩選，使用ELISA評估 雜交瘤的上清液中針對人ADAM17產(chǎn)生的mAb分泌。
[0191] 簡要地，使用在PBS中0.7μg/ml的重組人ADAM17蛋白（R and D Systems，ref: 930Α0Β)，Κ50μ1/孔涂布96孔化ISA板(Costar 3690，(：〇^1叫，紐約，美國），在4°(：過夜。然 后使用含有0.5% 明膠(#22151，Serva Electrophoresis GmbH,海德堡，德國）的PBS在37°C 將板封閉2小時。一經(jīng)通過甩(flicking)板丟棄飽和緩沖液，則在化ISA板中添加50μ1的樣 本(雜交瘤上清液或純化的抗體），并且在37 °C解育1小時。在Ξ次洗涂后，5化1綴合辣根過 氧化物酶的多克隆羊抗鼠 IgG(#l 15-035-164,Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc.，西格羅夫，賓夕法尼亞州，美國）W1/5000稀釋度添加至含有0.1 %明膠和0.05%吐溫 20(w:w)的PBS中，在37°C解育1小時。將ELISA板洗涂Ξ次，并且添加 TMB(#UP664782， Uptima，IntercMm，法國）底物。在室溫解育10分鐘后，使用1M硫酸終止反應(yīng)，并且在450皿 光密度測量。
[0192] 作為第二篩選步驟，通過FACS分析能夠結(jié)合表達(dá)在A172人腫瘤細(xì)胞的表面的細(xì)胞 形式的ADAM17的mAb，評估選擇的雜交瘤上清液。對于通過流式細(xì)胞術(shù)選擇，在4°C，在含有 1 %BSA和0.01 %疊氮化鋼的PBS(FACS緩沖液）中，在96孔板的每孔中鋪2xl05個細(xì)胞。W 200化pm離屯、2分鐘后，移除緩沖液，并且添加待測試的雜交瘤上清液。在4°C解育20分鐘后， 洗涂細(xì)胞兩次，并且添加在FACS緩沖液(#A11017，Molecular Probes Inc.，尤金，美國）中 1/500稀釋的綴合Alexa 488的羊抗鼠抗體，并且在4°C解育20分鐘。最后使用FACS緩沖液洗 涂后，在每管中添加終濃度40μg/ml的艦化丙晚后，通過FACS(Facscalibu;r ,Becton- Dickinson)分析細(xì)胞。包括僅含有細(xì)胞的孔和與第二綴合Alexa 488的抗體解育的細(xì)胞作 為陰性對照。在每次實驗中使用同種型對照（Sigma，ref M9035IMG)。對至少5000個細(xì)胞進 行評估W計算平均巧光強度值(MFI)。
[0193] 盡快通過有限稀釋克隆選擇的雜交瘤。對每一編碼準(zhǔn)備一個96孔板。每孔裝載在 克隆特定的培養(yǎng)介質(zhì)中調(diào)整至8個細(xì)胞/ml的10化1體積的細(xì)胞懸液。在第7天，在使用10化1 的克隆特定的培養(yǎng)介質(zhì)再接種前，用顯微鏡檢測孔W確保克隆和鋪板有效。在第9-10天，隨 后篩選雜交瘤上清液對rhADAM17蛋白的反應(yīng)性。然后使用同種型試劑盒（Isotyping kit) (cat#5300.05, Southern Biotech,伯明翰，亞拉己馬州，美國）將克隆的mAb進行同種型分 型（isotyped)。選擇從每個雜交瘤獲得的一個克隆，并且擴增W確認(rèn)它們針對riiADAM17和 人腫瘤細(xì)胞(A172)的結(jié)合特異性。
[0194] 實施例2:FRET膚切割測定
[0195] 在黑色的96孔板中，40μ1/孔的重組人ADAM17(R&D Systems，ref:930ADB)(250ng/ ml)與不同濃度的10μ1的抗ADAM17mAb(ml022C3)或無關(guān)mAb(9G4)在室溫下解育10分鐘。然 后添加50μ1的ΙΟμΜ的對應(yīng)于pr〇-TNFaADAM17特異性切割位點的底物膚溶液，所述底物膚在 每端標(biāo)記5-FAM和TAMRA(5-FAM-SPLAQAVRSSS服-TAMRA)。然后在37°C不同的解育時間（t = 0、2、6和24小時），在Be;rthold Mithras酶標(biāo)儀(plate reader)上依次測量巧光（激發(fā)濾光 片（excitation fliter)485nm，發(fā)身才濾光片（emission fliter)530nm，會長量燈（energy lamp) :7000,讀取時間:0.2s/孔）。巧光增強反映 ADAM17活性，因為5-FAM的巧光被未切割的 底物膚上的TAMRA澤滅。
[01%] 抗ADArnmAb ml022C3顯示對底物膚切割抑制的劑量依賴性(圖1)。
[0197] 實施例3:ADAM17使重組底物從腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)431脫落
[019引產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A431細(xì)胞系，在它們的質(zhì)膜上表達(dá)各自融合于NaiioL胞祗rase? (Promega)的91'0-了6化、91'0-皿斗6。、91'0-雙調(diào)蛋白或突變的91'0-了^日。在運些細(xì)胞的質(zhì)膜 上ADAM17活性導(dǎo)致融合于NalioLuciferase液的成熟底物釋放在培養(yǎng)介質(zhì)中。在培養(yǎng)介質(zhì)樣 本中的化noLuciferase活性的時間依賴性測量反映了ADAM17活性。在96孔培養(yǎng)板中W30 000個細(xì)胞/孔接種A431底物-Nluc細(xì)胞。兩天后，移除培養(yǎng)介質(zhì)，并更換為20化1新鮮的培養(yǎng) 介質(zhì)，其中稀釋有不同濃度的抗ADM17mAb(ml022C3)或無關(guān)mAb(9G4)，在培養(yǎng)24小時后(37 °C，C02 5 % )，從所有實驗孔收集扣1的培養(yǎng)介質(zhì)，并且分布至白色半?yún)^(qū)（half-area)96孔板 的孔中。在添加15μ1的（PBS稀釋的）Nan0-Glo?巧光素酶底物(furimazine)后，在Be;rthold Mit虹as LB940多模酶標(biāo)儀上，在0.1秒期間，讀取每實驗總發(fā)光（1皿inescence)。
[0199] 抗ADAM17mAb ml022C3誘導(dǎo)W下項的劑量依賴降低i)在培養(yǎng)介質(zhì)中的TG化-Nluc 釋放（圖2)，i i)在培養(yǎng)介質(zhì)中的AREG-Nluc釋放（圖3)，i i i)在培養(yǎng)介質(zhì)中的TNFa-Nluc釋放 (圖4)和iv)在培養(yǎng)介質(zhì)中的皿-EGF-Nluc釋放（圖5)。使用mAb ml022C3抑制TG化、pro-皿- EGF、pro-雙調(diào)蛋白或突變的pro-TN化的脫落所獲得的IC日日值，與文獻(xiàn)中發(fā)表的相比較(表 4)。證實對比參照化合物，mAb ml022C3對所有測試底物的細(xì)胞脫落的抑制顯著高10倍、優(yōu) 選高20倍、優(yōu)選高30倍、優(yōu)選高40倍、W及優(yōu)選高50倍。
[0200] 表 4
[0201]
[0202] *結(jié)果獲得自專利申請W02012/104581p40-41表S1。
[020：3]實施例 4:mAb 1022C3 結(jié)合 ADAM17
[0204] 通過蛋白質(zhì)印跡(western blot)和表面等離子體共振確定mAb 1022C3對人、鼠和 嵌合的ADAM17的結(jié)合譜。若干ADAM17子結(jié)構(gòu)域和人/鼠嵌合蛋白作為人Fc融合蛋白從 肥K293細(xì)胞中表達(dá)。在SDS-PAGE分離后，測試經(jīng)Pr01 e iη A純化的蛋白的結(jié)合，之后用 ml022C3進行蛋白質(zhì)印記分析和表面等離子體共振。產(chǎn)生的蛋白和用于測試結(jié)合的蛋白在 表4中詳細(xì)說明。引用的氨基酸位置參照人ADAM17:登錄號P78536，W及鼠 ADAM17:登錄號 AAI38421。表達(dá)的人起源的ADAM17結(jié)構(gòu)域W大寫字母書寫，鼠起源的結(jié)構(gòu)域W小寫字母。結(jié) 構(gòu)域名稱如W下縮寫:P，pr〇-結(jié)構(gòu)域;C，催化結(jié)構(gòu)域;D，解聚素結(jié)構(gòu)域;MPD，膜近端結(jié)構(gòu)域。 通過片段化的結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氨基末端(Nter)或簇基末端(Cter)的位置指示片段 化的結(jié)構(gòu)域。
[02化]蛋白質(zhì)印記結(jié)合測定:
[0206] 在非還原條件下，通過4-15%SDS-聚丙締酷胺凝膠解析(resolved)等量的純化的 蛋白，并且轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。通過使用1%脫脂乳在含有0.05%吐溫20的Tris緩沖生理鹽 水(TBSKTBS-T)中解育膜進行封閉。然后使用在TBS-T中的化g/ml ml022C3抗體，在連續(xù)攬 動的條件下，在室溫解育膜1小時，然后使用在TBS-T中W1: 3000稀釋的綴合辣根過氧化物 酶的抗鼠 IgG，在連續(xù)攬動的條件下，在室溫解育膜1小時。根據(jù)制造商的說明，通過增強化 學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)試劑盒使免疫反應(yīng)性蛋白質(zhì)可視化。
[0207] BIAcore 結(jié)合測j 定:
[0208] 該實驗在Biacore X100裝置上進行。mAb 1022C3用作配體，并且ADAM17片段和嵌 合構(gòu)建物用作分析物。在25Γ，Κ?0μ1/分鐘在兔抗鼠多克隆抗體（鼠抗體捕獲試劑盒 (Mouse antibody capture kit),BR-1008-38,GE Healthcare)上運行實驗，所述兔抗鼠多 克隆抗體使用氨基偶聯(lián)試劑盒(amine coupling kit) (BR-1000-50,GE胎althcare)共價 連接于CM5傳感忍片（sensorchip)(BR-1000-12)的兩種流動池的基質(zhì)，使用皿S-EP+緩沖液 (BR-1008-26，GE Healthcare)作為運行緩沖液。運種緩沖液還用于配體和分析物的稀釋。
[0209] 在1分鐘期間，將15μg/ml濃度的mAb 1022C3溶液注射在第二流動池（工作面)上。 在每個周期，在3分鐘期間，W25化Μ的濃度將ADAM17嵌合結(jié)構(gòu)之一(在C端位置具有人化結(jié) 構(gòu)域)注射在兩種流動池上:無任何ml022C3的參照(FC1)和具有大約700I?U的ml022C3的工 作池(FC2)。登記信號(registered signal)對應(yīng)于FC2和FC1響應(yīng)之差。
[0210] 陽性響應(yīng)在90RU至140RU。陰性響應(yīng)低于10RU。在每個周期結(jié)束，通過在3分鐘期間 注射lOmM甘氨酸、肥1 pH 1.7緩沖液(來自鼠抗體捕獲試劑盒)移除ml022C3。
[0211] 表5
[0212] _
[0213] 實施例5:使用表面等離子體共振實驗確定ADAM-17的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與單克隆抗體 1022C3結(jié)合的解離常數(shù)
[0214] 將抗體(配體)結(jié)合于Biacore CM5傳感忍片(GE Healthcare)的第二流動池，所述 Biacore CM5傳感忍片的兩個流動池上使用共價連接于簇甲基葡聚糖基質(zhì)的兔抗鼠（RAM) IgG化+L)激活。通過兩倍稀釋方案獲得濃度范圍在400至12.5nM的可溶的ADAM17(分析物） (假設(shè)分子量是52kDa)，在120秒脈沖(聯(lián)合)加額外的180秒延遲中，Κ30μ1/分鐘的流速注 射在表面，用于解離相的測量。使用化0Η 30mM、化C1 150mM和lOmM甘氨酸HC1 pH 1.5緩沖 溶液再生RAM表面。在每個濃度獲得的曲線是雙參照的，通過首先減去來自參照FCl表面(無 任何鼠抗TACE mAb的RAM)的信號，隨后減去從注射的運行緩沖液(Biacore皿S-EP緩沖液） 獲得的信號。
[0215] 使用運用l:lLangmuir模型的BIAevaluation 3.1軟件處理數(shù)據(jù)。通過必須趨于零 和K2值的折射率(Refractive Index，RI)值測量擬合(fit)的適宜性。
[0216] 結(jié)果在下表6中總結(jié)。
[0217] 表6 [021 引
[0219] 實施例6:去糖基化CDRH1的結(jié)合評估和FRE巧審制
[0220] mAb 1022C3具有N-糖基化位點，該位點是在分泌蛋白中的翻譯后修飾，其位于 CDRH1。為確定糖基化位點的影響，ml022C3經(jīng)酶促去糖基化，該方法將天冬酷胺殘基轉(zhuǎn)換為 天冬氨酸。
[0221] W順序方式使用兩種糖巧酶將mAb ml022C3去糖基化。將化L的神經(jīng)氨酸巧酶(New 化gland Biolabs，P0720S，50 OOOU/mL)添加至20yg的Img/mL mAb溶液，并且在輕攬動下， 于37°C將混合物解育過夜。然后添加化L的膚-N-糖巧酶F(化W England Biolabs，P0704S， 500 OOOU/mL)，隨后在37°C進行另一個解育步驟過夜。
[0222] 在FRET膚切割測定的體外評估中，ml022C3的酶促去糖基化不減少ml022C3的抑制 活性(圖6)，保留了親本mAb的抑制水平。
[0223] 評估了酶促去糖基化1022C3對腫瘤細(xì)胞系NCI-H1299的結(jié)合，并且顯示保留了親 本抗體的結(jié)合能力（圖7)。 帷4] 實施例7:雙調(diào)蛋白脫落測定
[0225] ADM17設(shè)及一系列EGFR配體的脫落，包括雙調(diào)蛋白（AREG)。為了確定ml022C3是否 能夠抑制ADAM17誘導(dǎo)的AREG的切割，在MCF-7雌性激素依賴型乳癌細(xì)胞的上清液中已給予 (dosed)該配體。簡要地，將16 000個MCF-7細(xì)胞接種于96孔板的每孔中的2(Κ)化的完全培養(yǎng) 介質(zhì)(RPMI 1640無酪紅+10%5￥。+1%心谷氨酷胺）中。接種48小時后，移除介質(zhì)，用PBS(憐 酸緩沖鹽)洗涂細(xì)胞，并將待測試化合物添加至0.5 % SFV介質(zhì)。在運些實驗中TAPI 1作為抑 制的陽性對照（參照化合物)被誘導(dǎo)，并且包括mlgGl或hlgGl同種型對照，其作為依賴于測 試抗體的形式的陰性對照。PMA也被用作AREG脫落的陽性對照。然后將細(xì)胞解育額外的48小 時，之后收集上清液，并通過化ISA DUO SET定量測定(R&D Systems)AREG的劑量。同時，使 用Cell Titer Glo發(fā)光方法評估細(xì)胞活力(viability)，W確保AREG的釋放過程不是由細(xì) 胞死亡導(dǎo)致。
[02%]圖8是3個獨立實驗的平均值。正如預(yù)期的，顯示參照化合物TAPI1誘導(dǎo)AREG脫落的 顯著抑制(62%)，然而作為脫落的陽性對照而引入的PMA，在此設(shè)置中能夠誘導(dǎo)AREG急劇脫 落。同種型對照或用作TAPI 1溶解的載體的DMSO均不能干設(shè)AREG脫落。作為鼠同種型對照 進入的對照mAb 9G4對AREG脫落無作用。ml022C3如參照化合物一樣有效抑制AREG脫落。然 后測試ml022C3的劑量范圍（圖9)。證實ml022C3在低至0.15μg/ml的劑量有效。
[0。7] 實施例8:體內(nèi)評估m(xù)Abl022C3
[0228] 對于所有的體內(nèi)評估，使用6至8周齡的無胸腺小鼠。它們居住在無菌的頂部設(shè)置 過濾器的(filter-topped)籠子中，維持在無菌條件中，并且根據(jù)法國和歐洲指南操作。
[0229] 通過染色確定ADAM17表達(dá)水平，在FACS緩沖液(含有1%BSA和0.01%疊氮化鋼的 口85)中，將1別〇5細(xì)胞/1〇〇41與增加濃度的]^89301(克隆111633，1?&〇373161113)在4°(：解育 20分鐘，W確定飽和濃度。然后在FACS緩沖液中將細(xì)胞洗涂Ξ次。重懸細(xì)胞，并與羊抗鼠 IgG-Alexa 488抗體（Invitrogen Co巧oration,蘇格蘭，#A11017)在4°C解育20分鐘。然后 用FACS緩沖液將細(xì)胞洗涂Ξ次。然后將標(biāo)記的細(xì)胞重懸于10化1的FACS緩沖液中，之后使用 化cscalibur細(xì)胞儀(Becton Dickinson,勒蓬德克萊，法國）分析。添加艦化丙晚，用W僅分 析活細(xì)胞。同時，通過流式細(xì)胞術(shù)和單克隆抗體結(jié)合，使用QIFIKIT珠確定每細(xì)胞的抗體結(jié) 合和抗原密度。QIFIIQT含有一系列直徑ΙΟμπι且涂布有不同的、但確定量的鼠 mAb分子的珠。 珠模擬具有不同抗原密度的細(xì)胞，所述細(xì)胞已經(jīng)使用初始鼠 mAb標(biāo)記。定量的抗原在抗體結(jié) 合能力(ABC)單元中表達(dá)。
[0230] 8.1 A431異種移植模型:建立腫瘤。
[0231] 選擇表皮樣癌細(xì)胞系A(chǔ)431用于體內(nèi)評估，A431表達(dá)ADAM17(ABC=17 000)。在第0 天使用lOxlO6個細(xì)胞皮下注射小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約200mm3(腫瘤細(xì)胞注射后20天），將動物 分為具有相當(dāng)?shù)哪[瘤尺寸的兩組6只小鼠，并且使用20mg/kg的負(fù)荷劑量、然后每周使用 lOmg/kg的維持劑量的ml022C3單克隆抗體腹腔內(nèi)處理。對照組僅接受載體，如先前在該模 型中進行的實驗所證實的，使用載體處理的小鼠和使用同種型對照注射的小鼠間觀察到腫 瘤生長無差異。隨訪小鼠觀察異種移植的增長率。通過式:K/6X長度X寬度X高度計算腫 瘤體積。
[0232] 獲得的結(jié)果總結(jié)在圖10中。結(jié)果顯示通過ml022C3mAb介導(dǎo)的急劇的腫瘤抑制（在 第49天97%)，在所有處理的小鼠中觀察到腫瘤消退，并且在第49天，在6只小鼠中的2只實 現(xiàn)完全消退。
[0233] 8.2使用腫瘤片段建立A431異種移植模型
[0234] 為確定觀察到的mAb ml022C3的抗腫瘤活性的穩(wěn)健性(robustness)，首先通過如 上述的細(xì)胞植入產(chǎn)生腫瘤。然后當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到大約200-300mm3時，無菌切除腫瘤，切碎為 1mm3片段，小屯、避開壞死區(qū)域，并且然后將運些片段用于在新的系列的無胸腺小鼠中的腫 瘤傳播。進行Ξ次傳播周期，W使腫瘤生長和特征穩(wěn)定，然后產(chǎn)生具有達(dá)到大約145mm3的腫 瘤（腫瘤細(xì)胞注射后14天）的兩組6只小鼠。一組使用20mg/kg的負(fù)荷劑量、然后每周使用 lOmg/kg的維持劑量的ml022C3單克隆抗體腹腔內(nèi)處理。第二組僅接受載體。隨訪小鼠觀察 異種移植的增長率。通過式:V6 X長度X寬度X高度計算腫瘤體積。
[0235] 獲得的結(jié)果總結(jié)于圖11中。從片段建立的腫瘤的生長比由細(xì)胞植入 (engraftment)引起的腫瘤的生長快。運個觀察與運些腫瘤更多的侵襲性表型相一致。在運 個更侵襲性的設(shè)置中，ml022C3仍然顯著有效，在第35天具有達(dá)73%的腫瘤抑制。
[0236] 8.3在A431異種移植模型上比較鼠1022C3(ml022C3)與其IgGl嵌合形式（C1022C3)
[0237] 為比較ml022C3與其嵌合形式，如上述通過對無胸腺小鼠細(xì)胞植入(engraftment) 建立A431異種移植模型。圖12中顯示的結(jié)果證實，兩種化合物是相當(dāng)?shù)?，ml022C3和C1022C3 的腫瘤抑制分別達(dá)到82%和75%。
[023引 8.4化0V3異種移植模型:建立腫瘤
[0239] 選擇卵巢癌細(xì)胞系化0V-3用于體內(nèi)評估，CaOV-3表達(dá)ADAM17(ABC = 20000)。在第0 天使用7xl06個細(xì)胞皮下注射小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約120mm3(腫瘤細(xì)胞注射后18天），將動物 分為具有相當(dāng)?shù)哪[瘤尺寸的兩組5只小鼠，并且使用lOmg/kg的負(fù)荷劑量、然后每周使用 5mg/kg的維持劑量的ml022C3單克隆抗體腹腔內(nèi)處理。對照組僅接受載體，如先前在該模型 中進行的實驗所證實的，使用載體處理的小鼠和使用同種型對照注射的小鼠間觀察到腫瘤 生長無差異。隨訪小鼠觀察異種移植的增長率。通過式:V6X長度X寬度X高度計算腫瘤 體積。
[0240] 獲得的結(jié)果總結(jié)在圖13中。結(jié)果顯示通過ml022C3mAb介導(dǎo)的急劇的腫瘤抑制，在 所有處理的小鼠中觀察到腫瘤消退，并且從第69天在5只小鼠中的1只實現(xiàn)完全消退。在第 84天腫瘤抑制達(dá)94 %。
[0241] 8.5 0VI沈異種移植模型:建立腫瘤
[0242] 選擇卵巢癌細(xì)胞系0VISE用于體內(nèi)評估，0VISE表達(dá)ADAM17(ABC = 49 000)。在第0 天使用7xl06個細(xì)胞皮下注射小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約100mm3(腫瘤細(xì)胞注射后28天），將動物 分為具有相當(dāng)?shù)哪[瘤尺寸的兩組6只小鼠，并且使用lOmg/kg的負(fù)荷劑量、然后每周使用 5mg/kg的維持劑量的ml022C3單克隆抗體腹腔內(nèi)處理。對照組僅接受載體，如先前在該模型 中進行的實驗所證實的，使用載體處理的小鼠和使用同種型對照注射的小鼠間觀察到腫瘤 生長無差異。隨訪小鼠觀察異種移植的增長率。通過式:V6X長度X寬度X高度計算腫瘤 體積。
[0243] 獲得的結(jié)果總結(jié)在圖14中。結(jié)果顯示通過mAb ml022C3介導(dǎo)的急劇的腫瘤抑制，在 第53天，所有處理的小鼠中觀察到腫瘤消退，腫瘤抑制達(dá)58%。
[0244] 8.6_BxPC3異種移植腫瘤
[0245] 選擇膜腺癌細(xì)胞系BxPC3用于體內(nèi)評估，BxPC3表達(dá)ADAM17(ABC=12600)。在第0天 使用7xl06個細(xì)胞皮下注射小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約100mm3(腫瘤細(xì)胞注射后25天），將動物分 為具有相當(dāng)?shù)哪[瘤尺寸的兩組6只小鼠，并且使用20mg/kg的負(fù)荷劑量、然后每周使用lOmg/ kg的維持劑量的ml022C3單克隆抗體腹腔內(nèi)處理。對照組僅接受載體，如先前在該模型中進 行的實驗所證實的，使用載體處理的小鼠和使用同種型對照注射的小鼠間觀察到腫瘤生長 無差異。隨訪小鼠觀察異種移植的增長率。通過式:V6X長度X寬度X高度計算腫瘤體積。
[0246] 獲得的結(jié)果總結(jié)在圖15中。結(jié)果顯示在第47天，通過mAb ml022C3介導(dǎo)的急劇的腫 瘤抑制達(dá)76 %。
[0247] 8.7 BICR-22異種移植模型：建立腫瘤
[0248] 選擇舌鱗癌細(xì)胞系BICR-22用于體內(nèi)評估，BICR-22表達(dá)ADAM17(ABC=16000)。在 第0天使用7xl06個細(xì)胞皮下注射小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約100mm3(腫瘤細(xì)胞注射后11天），將動 物分為具有相當(dāng)?shù)哪[瘤尺寸的兩組6只小鼠，并且使用lOmg/kg的負(fù)荷劑量、然后每周使用 5mg/kg的維持劑量的ml022C3單克隆抗體腹腔內(nèi)處理。對照組僅接受載體，如先前在該模型 中進行的實驗所證實的，使用載體處理的小鼠和使用同種型對照注射的小鼠間觀察到腫瘤 生長無差異。隨訪小鼠觀察異種移植的增長率。通過式:V6X長度X寬度X高度計算腫瘤 體積。
[0249] 獲得的結(jié)果總結(jié)在圖16中。結(jié)果顯示通過ml022C3mAb介導(dǎo)的急劇的腫瘤抑制（第 33天86% )。
[0250] 8.8 JIMT-1異種移植模型:建立腫瘤
[0251] 選擇已知對皿R2祀向治療抵抗的乳癌細(xì)胞系JIMT-1用于體內(nèi)評估，JIMT-1表達(dá) ADAM17(ABC = 30 000)。在第0天使用7xl06個細(xì)胞皮下注射小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約100mm3(月中 瘤細(xì)胞注射后14天），將動物分為具有相當(dāng)?shù)哪[瘤尺寸的兩組6只小鼠，并且使用20mg/kg的 負(fù)荷劑量、然后每周使用lOmg/kg的維持劑量的ml022C3單克隆抗體腹腔內(nèi)處理。對照組僅 接受載體，如先前在該模型中進行的實驗所證實的，使用載體處理的小鼠和使用同種型對 照注射的小鼠間觀察到腫瘤生長無差異。隨訪小鼠觀察異種移植的增長率。通過式:V6X 長度X寬度X高度計算腫瘤體積。
[0252] 獲得的結(jié)果總結(jié)在圖17中。結(jié)果顯示通過ml022C3mAb介導(dǎo)的腫瘤抑制（第33天 41%)。
[0253] 8.9 NCI-肥92異種移植模型:建立腫瘤
[0254] 選擇肺粘液表皮樣癌細(xì)胞系NCI-肥92用于體內(nèi)評估，NCI-肥92表達(dá)ADAM17(ABC = 12 000)。在第0天使用7xl06個細(xì)胞皮下注射小鼠。當(dāng)腫瘤達(dá)到大約150mm3(腫瘤細(xì)胞注射后 9天），將動物分為具有相當(dāng)?shù)哪[瘤尺寸的兩組6只小鼠，并且使用20mg/kg的負(fù)荷劑量、然后 每周使用lOmg/kg的維持劑量的ml022C3單克隆抗體腹腔內(nèi)處理。對照組僅接受載體，如先 前在該模型中進行的實驗所證實的，使用載體處理的小鼠和使用同種型對照注射的小鼠間 觀察到腫瘤生長無差異。隨訪小鼠觀察異種移植的增長率。通過式:V6X長度X寬度X高 度計算腫瘤體積。
[0巧日]獲得的結(jié)果總結(jié)在圖18中。結(jié)果顯示通過ml022C3mAb介導(dǎo)的腫瘤抑制（第26天 50%)。
【主權(quán)項】
1. 一種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合ADAM17 表位并抑制至少一種ADAM17的底物的脫落，其特征在于，所述ADAM17表位由包含在序列SEQ ID No. 32的膜近端結(jié)構(gòu)域(MPD)中的表位組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體以500pM或更低的、優(yōu)選200pM或 更低的、以及更優(yōu)選ΙΟΟρΜ或更低的IC 5Q抑制至少一種ADAM17的底物的脫落。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體，其特征在于，所述至少一種ADAM17的底物選自了冊-α、TGF_a、AREG和HB-EGF。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的抗體，其特征在于，通過表面等離子體共振(SPR) 所確定的，所述抗體以約1 OnM或更低的、優(yōu)選約5nM或更低的Kd結(jié)合ADAM17表位。5. -種單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合ADAM17 表位，其特征在于包含： i) 重鏈，所述重鏈包含氨基酸序列分別為SEQ ID No.l、2和3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3;和 ii) 輕鏈，所述輕鏈包含氨基酸序列分別為SEQ ID No.4、5和6的CDR-Ll、CDR-L2和CDR-L306. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于，所述⑶R-H1的氨基酸序列是SEQ ID No.7。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于，所述⑶R-H1的氨基酸序列是SEQ ID No.8。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含重鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述重鏈 可變結(jié)構(gòu)域的序列含有氨基酸序列SEQ ID No.9、11或12。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，所述輕鏈 可變結(jié)構(gòu)域的序列含有氨基酸序列SEQ ID No. 10。10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗體，其特征在于，所述抗體包含序列含有氨基酸序列SEQ ID No.9、11或12的重鏈可變結(jié)構(gòu)域;和序列含有氨基酸序列SEQ ID No. 10的輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域。11. 一種單克隆抗體、或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述單克隆抗體、或其抗原結(jié)合 片段由獲得自雜交瘤1-4686的單克隆抗體1022C3組成，所述雜交瘤1-4686于2012年10月18 日保藏在法國CNCM，巴斯德研究所。12. 根據(jù)權(quán)利要求5至11中任一項所述的抗體，其特征在于，所述抗體能夠結(jié)合ADAM17 的單一表位，所述ADAM17的單一表位包含在序列是SEQ ID如.32的膜近端結(jié)構(gòu)域(10^)中。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的抗體，其特征在于，所述抗體以500pM或更低的、優(yōu)選200pM 或更低的、以及更優(yōu)選1 〇〇pM或更低的IC5Q抑制至少一種ADAM17的底物的脫落。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，其特征在于，所述至少一種ADAM17的底物選自TNF-a、 TGF-a、AREG和HB-EGF。15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的抗體，其特征在于，通過表面等離子體共振(SPR)所確定的， 所述抗體以約1 OnM或更低的、優(yōu)選約5nM或更低的Kd結(jié)合ADAM17表位。16. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的抗體用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長和/或增殖的方 法中。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的抗體，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞選自表達(dá)ADAM17的腫瘤細(xì) 胞。18. 鼠雜交瘤1-4686，其于2012年10月18日保藏在法國CNCM，巴斯德研究所。19. 一種分離的核酸，其特征在于，所述分離的核酸選自以下的核酸： a) DNA或RNA，其編碼權(quán)利要求1至15中任一項所述的抗體、或其抗原結(jié)合片段;和 b) DNA，其含有選自序列SEQ ID No.13至28和36至38中至少一種的序列。20. -種載體，其包含權(quán)利要求19所述的核酸。21. -種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求20所述的載體。22. -種除人以外的轉(zhuǎn)基因動物，其包含至少一種轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求20所述載體的細(xì)胞。23. -種用于產(chǎn)生權(quán)利要求1至15中任一項所述的抗體、或其抗原結(jié)合片段的方法，其 特征在于，包含以下階段： a) 在介質(zhì)和合適的培養(yǎng)條件中，培養(yǎng)權(quán)利要求21所述的細(xì)胞;和 b) 從培養(yǎng)介質(zhì)或所述培養(yǎng)的細(xì)胞開始，回收所產(chǎn)生的所述抗體、或其抗原結(jié)合片段。24. -種組合物，其包含權(quán)利要求1至15中任一項所述的抗體。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述組合物作為組合產(chǎn)品還包含細(xì)胞 毒性劑。26. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述組合物作為綴合產(chǎn)品還包含細(xì)胞 毒性劑。27. 根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物是還包含藥 學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。28. 根據(jù)權(quán)利要求24至27中任一項所述的組合物，其用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長和/或增 殖的方法中。29. 權(quán)利要求1至15中任一項所述的抗體或通過權(quán)利要求23的所述方法獲得的抗體或 權(quán)利要求24至27任一項所述的組合物用于治療癌癥的用途。30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的用途，其特征在于，所述癌癥是選自表達(dá)ADAM17的癌癥的癌 癥。31. 根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的用途，其特征在于，所述癌癥是選自卵巢癌、乳癌、腎 癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、頭頸癌和表皮樣癌的癌癥。
【文檔編號】A61P35/00GK106029094SQ201480074117
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月24日
【發(fā)明人】P·勒韋
【申請人】皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司