用于治療細(xì)胞增殖性疾病的alk抑制劑與cdk抑制劑的組合的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藥物組合，其分開或共同包括：(1)第一藥劑，其是ALK抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽和(2)第二藥劑，其是CDK抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。本發(fā)明還涉及這類組合在治療或防止增殖性疾病中的應(yīng)用。
【專利說明】
用于治療細(xì)胞増殖性疾病的ALK抑制劑與CDK抑制劑的組合
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及含ALK抑制劑和CDK抑制劑的藥物組合；所述組合在治療癌癥中的應(yīng) 用；治療包括人在內(nèi)的患癌溫血?jiǎng)游锏姆椒?，包括向所述需要運(yùn)類治療的動(dòng)物施用有效劑 量的ALK抑制劑和CDK抑制劑。
【背景技術(shù)】
[000。ALK抑制劑
[0003] 間變性淋己瘤激酶(ALK)是受體酪氨酸激酶的膜島素受體超家族成員。該蛋白包 括胞外結(jié)構(gòu)域、對(duì)應(yīng)單跨膜區(qū)的疏水段和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域。其在腦發(fā)育中發(fā)揮重要作用并 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的特異性神經(jīng)元產(chǎn)生影響，且通常在發(fā)育中的神經(jīng)組織內(nèi)表達(dá)。ALK的基因改變 設(shè)及造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)腫瘤的腫瘤發(fā)生。發(fā)現(xiàn)所述基因在一系列腫瘤中重排、突變或 擴(kuò)增，所述腫瘤包括間變性大細(xì)胞淋己瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和非小細(xì)胞肺癌。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤 和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中報(bào)告了全長ALK受體蛋白的異常表達(dá)；間變性大細(xì)胞淋己瘤中出現(xiàn)ALK融 合蛋白。雖然染色體重排是ALK基因中最常見的基因改變，乳腺癌和食管癌中顯示ALK擴(kuò)增。 因此，可能非常需要開發(fā)在ALK陽性腫瘤治療中選擇性祀向ALK的化合物。近年來已描述一 些ALK激酶活性的小分子抑制劑，例如W0 2008/073687 A1;其中一些目前正在進(jìn)行臨床評(píng) 估。cMET和ALK的酪氨酸激酶抑制劑克挫替尼已被批準(zhǔn)用于ALK陽性晚期非小細(xì)胞肺癌患 者;更多有效的ALK抑制劑可能很快出現(xiàn)。
[0004] CDK抑制劑
[0005] 周期蛋白依賴性激酶(CDK)是蛋白激酶的一大家族。CDK調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期的 起始、發(fā)展和完成。CDK的功能是憐酸化并因而活化或滅活某些蛋白，包括例如成視網(wǎng)膜細(xì) 胞瘤蛋白、核纖層蛋白、組蛋白H1和有絲分裂紡鍵體組分。由CDK介導(dǎo)的催化步驟包括從ATP 到大分子酶底物的憐酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
[0006] 腫瘤發(fā)展與CDK和其調(diào)節(jié)因子的基因改變與失調(diào)緊密相關(guān)，表明CDK抑制劑可能是 有用的抗癌療法。早期結(jié)果確實(shí)表明轉(zhuǎn)化和正常細(xì)胞對(duì)例如細(xì)胞周期蛋白D/CDK4/6的需求 有差異，且可能開發(fā)出新型抗腫瘤劑，其不具有使用常規(guī)細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制藥物觀察到 的普遍宿主毒性。已發(fā)現(xiàn)數(shù)組化合物（綜述于例如Fischer , P . Μ . Curr . Op in . Drug Discovery Dev. 2001，4，623-634)通過CDK特異性ATP括抗作用具有抗增殖特性。因此，可能 非常需要開發(fā)治療增殖性疾?。ㄈ绨┑膯我化煼?，使用普遍地祀向CDK或特定CDK的療法。 已知CDK抑制劑并已提交運(yùn)類抑制劑的專利申請(qǐng)，例如W02007/140222、W02010/020675和 W02011/101409。
[0007] 嘗試制備抑制ALK或CDK4/6的化合物，且本領(lǐng)域已公開許多運(yùn)類化合物。然而，鑒 于由ALK和CDK4/6介導(dǎo)的病理反應(yīng)數(shù)量，仍不斷需要有效且安全的治療劑，也需要其在聯(lián)合 療法中的優(yōu)選應(yīng)用。意外發(fā)現(xiàn)ALK抑制劑與CDK 4/6抑制劑聯(lián)合引起強(qiáng)烈抗增殖活性和體內(nèi) 抗腫瘤反應(yīng)。本發(fā)明設(shè)及特定組合療法W治療增殖性疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 一方面，本發(fā)明設(shè)及分開或共同包括W下的藥物組合：（1)第一藥劑，其是ALK抑制 劑或其藥學(xué)上可接受鹽和(2)第二藥劑，其是CDK抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。
[0009] 在第二方面，本發(fā)明設(shè)及含第一方面的藥物組合和至少一種賦形劑的藥物組合 物。
[0010] 在第Ξ方面，本發(fā)明設(shè)及治療增殖性疾病的方法，所述方法包括向需要的患者施 用治療有效量的為ALK抑制劑的第一藥劑和治療有效量的為CDK抑制劑的第二藥劑，其中第 一和第二藥劑同時(shí)、分開或依序施用。
[0011] 在第四方面，本發(fā)明設(shè)及第一方面的藥物組合W治療增殖性疾病。
[0012] 在第五方面，本發(fā)明設(shè)及第一方面的藥物組合或第二方面的藥物組合物在制造治 療增殖性疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 在第六方面，本發(fā)明設(shè)及含第一方面所述藥物組合或第二方面所述藥物組合物的 藥盒。
【附圖說明】
[0014] 圖1用假設(shè)數(shù)據(jù)顯示如何從基于Loewe加和模型的化alice軟件的輸出評(píng)價(jià)化合物 組合中的潛在協(xié)同相互作用。左圖是劑量矩陣圖，其中7巧矩陣的各獨(dú)立數(shù)據(jù)塊報(bào)告藥物治 療的抑制(細(xì)胞死亡）百分比。單一化合物單獨(dú)治療的抑制通過最左列的藥劑A和最底行的 藥劑B報(bào)告;數(shù)據(jù)根據(jù)載劑對(duì)照的抑制進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其設(shè)為0(其中藥劑A和藥劑B濃度都為0 的值）。右圖是Loewe過量矩陣圖，其中各獨(dú)立數(shù)據(jù)塊報(bào)告過量抑制，比較劑量矩陣中的實(shí)驗(yàn) 數(shù)據(jù)與Loewe加和模型產(chǎn)生的預(yù)期抑制值。根據(jù)此觀點(diǎn)，協(xié)同性定義為值〉0,加和性定義為 值=0和括抗作用定義為值<0。突出顯示的數(shù)據(jù)塊鑒別實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中觀察到協(xié)同性的組合。
[0015] 圖2顯示CHALICE矩陣圖，證明用化合物A1和化合物B(頂行）、化合物A1自交（中間 行)和化合物B自交(底行)共治療對(duì)抑制LAN-1人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的劑量效果（％抑制）。
[0016] 圖3顯示箱線圖，提供藥物組合在15個(gè)疾病(ALK突變體)和正常(野生型）神經(jīng)母細(xì) 胞瘤細(xì)胞系中協(xié)同得分的可視化概況(見表2和3的數(shù)據(jù)）。此圖中包括產(chǎn)生自ALK抑制劑(化 合物A1和A2而非A3)的協(xié)同得分。本文所用的ALK抑制劑指化合物A1或化合物A2，CDK4/6抑 制劑指化合物B。各盒代表特定治療方案(ALK X CDK，ALK自交或CDK自交）的協(xié)同得分范圍； 盒內(nèi)的水平白線代表組中值且垂直實(shí)線代表組標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)屯、圓代表異常值。
[0017]圖4A、4B和4C顯示提供"命中"協(xié)同組合的視覺識(shí)別的散點(diǎn)圖。針對(duì)ALK抑制劑和 CDK4/6抑制劑、ALK抑制劑自交和CDK4/6抑制劑自交的組合在15個(gè)疾病(ALK突變體)和正常 (野生型）神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的協(xié)同得分(見表2和3的數(shù)據(jù)），對(duì)最大組合功效值作圖。 運(yùn)些圖中僅對(duì)用化合物A1和A2產(chǎn)生的數(shù)據(jù)作圖；即本文所用的ALK抑制劑指化合物A1或化 合物A2，CDK4/6抑制劑指化合物B。圖4A是來自15個(gè)細(xì)胞系中兩種ALK抑制劑(化合物A1和 A2)自交的數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖。所述圖顯示針對(duì)ALK疾病的優(yōu)選單藥劑功效。圖4B是來自CDK抑制劑 (化合物B)自交的數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖。所述圖顯示最小的單藥劑功效或協(xié)同性。圖4C是化合物A1和 A2中任一ALK抑制劑與CDK抑制劑化合物B的組合的數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖。所述圖顯示在4個(gè)疾病 (Lan-5、Kelly、Lan-l、NB-1643)和2個(gè)正常(NB-l、SK-N-BE)細(xì)胞系中引起協(xié)同性和功效增 加的相互作用。
[0018] 圖5A、5B、5C和加顯示藥物組合圖和其基于化ou-Talalay聯(lián)合指數(shù)定理的解釋的 典型示例。圖5A是恒定組合比的化-(：1圖。由Chou定義的C巧日W下等式所述:CI = (D)i/(Dx)i +化)2/化)2,其中化x)l和化)2是單獨(dú)使用時(shí)產(chǎn)生給定抗增殖效果所需的化合物化和化的濃 度，而(D)i和(D)2是其聯(lián)用時(shí)產(chǎn)生相同抗增殖效果的濃度。聯(lián)合指數(shù)是定義為相加效應(yīng)(CI = 1)、括抗作用(CI〉1)或協(xié)同性(CK1)的藥物相互作用的定量測(cè)度。Fa指受影響部分，定義 為受給定濃度的單獨(dú)或聯(lián)合化合物影響的細(xì)胞部分。Fa = 0通過劑量根據(jù)DMS0對(duì)照測(cè)定，F(xiàn)a =1是完全反應(yīng)(沒有剩余活細(xì)胞）。通常，本文所用的化-CI圖用于評(píng)價(jià)協(xié)同性。圖5B是邸50、 E化5和抓90處的經(jīng)典等效線圖。（D)1和(D)2分別指藥物1和藥物2的濃度。EDx指產(chǎn)生X%效果 的劑量，100%效果意味著沒有剩余活細(xì)胞。圖5C是采用不同比例的組合的標(biāo)準(zhǔn)化等效線 圖。所述術(shù)語如圖5B所定義。圖加是化-DRI圖（化OU和化OU，1988;化OU和Madin，2005)，其 中DRI指劑量降低指數(shù)并根據(jù)W下等式與CI相關(guān):CI = (D)i/Dx)1+(D)2/(Dx)2 = 1/(DRI)i+1/ (DRI)2dDRI估計(jì)協(xié)同藥物聯(lián)用而仍能實(shí)現(xiàn)與各藥物單獨(dú)施用相同的效應(yīng)量時(shí)各藥物劑量 能降低的量。
[0019] 圖6A、6B、6C、抓、6E和6F顯示化合物A巧郵的組合、化合物Al、化合物B在NB-1643細(xì) 胞(疾?。┲械乃幬锝M合圖：（6A)中值-效果圖；（6B)劑量-效果曲線;ED50、ED75和抓90處的經(jīng) 典等效線圖；（6C)Fa-Cl圖；（6D)Fa-logCI圖；（6E)經(jīng)典等效線圖；和(6F)保守等效線圖。所 述圖共同證明所述組合在測(cè)試的濃度范圍中有協(xié)同作用。
[0020] 圖74、78、7(：、70、76和7。顯示化合物4巧郵的組合、單獨(dú)化合物41和單獨(dú)化合物8在 細(xì)-SY5Y(疾病）細(xì)胞中的藥物組合圖：（7A)中值-效果圖；（7B)劑量-效果曲線；（7C)Fa-Cl 圖；（7D)Fa-log(CI)圖；（7E化D50、抓75和抓90處的經(jīng)典等效線圖；和(7F)保守等效線圖。圖 7C-7F顯示所述組合在低劑量有中等協(xié)同作用，在高低劑量有加和或輕微括抗作用。
[0021] 圖8A、8B、8C、8D、8E和8F顯示化合物A1和B的組合、化合物A1、化合物B在NB1691(正 常）細(xì)胞中的藥物組合圖：（7A)中值-效果圖；（7B)劑量-效果曲線；（7C)Fa-Cl圖；（7D)Fa- log(CI)圖；（7E化D50、ED化和邸90處的經(jīng)典等效線圖；和（7F)保守等效線圖。圖8C-8F證明所 述組合在低劑量有強(qiáng)協(xié)同作用，在更高劑量有加和性，在高化合物A1劑量下有括抗作用。
[0022] 圖94、98、9(：、90、犯和9。顯示化合物41和8的組合、化合物41、化合物8在抓(：1(正 常）細(xì)胞中的藥物組合圖：（9A)中值-效果圖；（9B)劑量-效果曲線；（9C)Fa-Cl圖；（9D)Fa- log(CI)圖；（犯化D50、抓75和抓90處的經(jīng)典等效線圖；和(9F)保守等效線圖。圖9C-9F證明 所述組合在測(cè)試的濃度范圍中有協(xié)同作用。
[0023] 圖10A、10B、10C和10D顯示SH-SY5Y細(xì)胞響應(yīng)化合物A1、B1或化合物A1和B組合治療 的形態(tài)，各自處于各化合物的1C 50和治療后72小時(shí)：（a)載劑；（b)用化合物A1單獨(dú)治療； (C)用化合物B單獨(dú)治療和(d)用化合物A1和B的組合治療。
[0024] 圖11A、11B和11C與NB1643細(xì)胞調(diào)亡比較細(xì)胞活力，由ApoTox-GloTMS重檢測(cè)分 析，并用W下治療72小時(shí)：（a)單獨(dú)化合物Al;(b)單獨(dú)化合物B和(c)W均分比例(各化合物 1C 50的0、1/4、1/2、1、2和4倍)組合的化合物A1和B的組合。結(jié)果顯示藥物治療增強(qiáng)細(xì)胞死 亡，但用單獨(dú)化合物A1觀察到的細(xì)胞調(diào)亡水平與聯(lián)用化合物削寸相同。
[002引圖12A、12B和12C顯示NB1643細(xì)胞活力，由CTG檢測(cè)分析，用W下治療72小時(shí)：（a)單 獨(dú)化合物Al;(b)單獨(dú)化合物B和(C)采用均分比例的化合物A和B的組合。結(jié)果證明聯(lián)合治療 增強(qiáng)細(xì)胞死亡。
[0026] 圖13A、13B和13C與甜-SY5Y細(xì)胞調(diào)亡比較細(xì)胞活力，由ApoTox-GloTMS重檢測(cè)分 析，用W下治療72小時(shí)：（a)單獨(dú)化合物Al;(b)單獨(dú)化合物B和(c)W均分比例（各化合物1C 50的0、1/4、1/2、1、2和4倍)組合的化合物41和8的組合。結(jié)果顯示共同治療增強(qiáng)細(xì)胞死亡。 所述細(xì)胞在最高濃度下死亡更早，W致運(yùn)些濃度下無法測(cè)出細(xì)胞調(diào)亡。
[0027] 圖14AU4B和14C與邸C1細(xì)胞調(diào)亡比較細(xì)胞活力，由ApoTox-GloTMS重檢測(cè)分析， 用W下治療72小時(shí)：（a)單獨(dú)化合物A1; (b)單獨(dú)化合物B和(C) W均分比例(各化合物1C 50 的0、1/4、1/2、1、2和4倍)組合的化合物4巧郵的組合。數(shù)據(jù)顯示共同治療對(duì)細(xì)胞死亡或調(diào)亡 的增強(qiáng)較少或沒有。
[002引圖15顯示NB1643細(xì)胞中總體和pALK表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡，用W下治療20小時(shí):載劑； IC50劑量1/16、1/8、1/4和4倍的化合物A1;IC50劑量1/16、1/8、1/4和4倍的化合物B;采用各 化合物IC50劑量的1/16、1/8、1/4和4倍的化合物A1和B的組合。結(jié)果顯示共同治療在起始于 1/16X IC50劑量的NB1643細(xì)胞中大幅減少pALK蛋白表達(dá)。
[00巧]圖16顯示NB1643細(xì)胞中總肺、憐酸化Rb S780和憐酸化肺S795表達(dá)的蛋白質(zhì)印 跡，用W下治療20小時(shí):載劑；IC50劑量1/16、1/8、1/4和4倍的化合物A1;IC50劑量1/16、1/ 8、1/4和4倍的化合物B;采用各化合物IC50劑量的1/16、1/8、1/4和4倍的化合物41和8的組 合。結(jié)果顯示共同治療在起始于1/16X IC50劑量的NB1643細(xì)胞中減少P肺表達(dá)。相比pRb S795表達(dá)，所述組合更有效降低P肺S780表達(dá)。
[0030] 圖17顯示NB邸C1細(xì)胞中ALK、pALK、總肺和憐酸化肺S795表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡，用W 下治療20小時(shí):載劑；K50劑量1/4、1/2、1和4倍的化合物A1; I巧0劑量1/4、1/2、1和4倍的化 合物B;采用各化合物IC50劑量的1/4、1/2、1和4倍的化合物A1和B的組合。結(jié)果顯示共同治 療更有效降低pALK和pRb蛋白表達(dá)。
[0031] 圖18顯示對(duì)于W下治療組隨時(shí)間的CB17SCID小鼠中人神經(jīng)母細(xì)胞瘤甜-SY5Y異種 移植的相對(duì)腫瘤體積：（1)載劑對(duì)照，（2)50mg/kg化合物A1，（3) 187.5-250mg/kg化合物B，和 (4) 50mg/kg化合物A1與187.5-250mg/kg化合物B的組合。化合物B劑量起始于250mg/kg，在 第5天降低到187.5mg/kg。結(jié)果顯示用化合物A1單獨(dú)治療相較載劑對(duì)照僅引起輕微腫瘤生 長延遲。用化合物B單獨(dú)治療導(dǎo)致腫瘤生長更慢。共同治療使現(xiàn)有腫瘤有效縮小并實(shí)現(xiàn)總體 腫瘤消退。
[0032] 圖19A、19B、19C和19D顯示在上圖18所述各治療組中，個(gè)體小鼠隨著治療持續(xù)時(shí)間 (周）的腫瘤體積變化。
[0033] 圖20顯示在上圖18所述各治療組中，相比治療持續(xù)時(shí)間（周）的小鼠（百分?jǐn)?shù)）存 活。第7天，2只來自組4的小鼠死亡；第14天，1只來自化合物B組的小鼠死亡。由于腫瘤大小 而處死對(duì)照組和化合物A1組的小鼠。
[0034] 圖21是化合物A1和化合物B組合W及其各自自交在16個(gè)疾病(ALK突變體)和正常 (野生型)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的聯(lián)合藥物效應(yīng)(功效相比協(xié)同得分)散點(diǎn)圖（參見表10的 數(shù)據(jù)）。協(xié)同組合命中被鑒定為協(xié)同得分〉2且最大功效〉100(解釋參見圖4A、4B和4C)。頂部 的圖是化合物A1 (ALK抑制劑）自交，顯示針對(duì)ALK病的優(yōu)選單藥劑功效。中間的圖是化合物B (CDK抑制劑）自交，顯示最小單藥劑功效或協(xié)同性。底部的圖是化合物A1和B的組合，顯示引 起2個(gè)疾病(NB-1691、Lan-5)和1個(gè)正常(NB-1691)細(xì)胞系中協(xié)同性和功效增加的相互作用。
[0035] 圖22A、22B顯示ALK抑制劑和CDK4/6抑制劑共同治療對(duì)Kelly人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 增殖的劑量效果。圖22A顯示劑量矩陣和等效線圖，證明化合物AUALK抑制劑）和化合物B (CDK抑制劑)共同治療的劑量效果。所述組合具有中等協(xié)同性，協(xié)同得分為1.75,且等效線 圖指示極強(qiáng)的相互作用。圖22B顯示劑量矩陣和等效線圖，證明化合物A2(ALK抑制劑）和化 合物B共同治療的劑量效果。所述組合具有中等協(xié)同性，協(xié)同得分為1.48,且等效線圖指示 極強(qiáng)的相互作用。
[0036] 圖23A、23B、23C和23D顯示ALK抑制劑和CDK4/6抑制劑共同治療對(duì)Kelly和NB-1神 經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的劑量效果。圖23A顯示劑量矩陣和Loewe過量矩陣，證明化合物A1 (ALK抑制劑)和化合物B (CDK4/6抑制劑)共同治療在Ke 1 ly細(xì)胞中的劑量效果。所述組合具 有協(xié)同性，計(jì)算的協(xié)同得分為2.51。圖23B顯示劑量矩陣和Loewe過量矩陣，證明化合物A2 (ALK抑制劑)和化合物B共同治療對(duì)Kel ly細(xì)胞的劑量效果。所述組合具有協(xié)同性，協(xié)同得分 為2.29。圖23顯示劑量矩陣和Loewe過量矩陣，證明化合物Al和化合物B共同治療對(duì)NB-l人 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的劑量效果。所述組合不具有協(xié)同性。圖23D顯示劑量矩陣和Loewe 過量矩陣，證明化合物A2和化合物B共同治療對(duì)人NB-1神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的劑量效果。 所述組合不具有協(xié)同性。
[0037] 圖24A、24B、24C、24D、24E和24F顯示ALK抑制劑和CDK4/6抑制劑共同治療在Kelly、 NB-1和甜-SY5巧巾經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的劑量效果。圖24A顯示劑量矩陣和Loewe過量矩陣，證 明化合物A1 (ALK抑制劑）和化合物B共同治療對(duì)Ke 1 ly細(xì)胞增殖的劑量效果；協(xié)同得分為 0.820。圖24B顯示劑量矩陣和Loewe過量矩陣，證明化合物A2 (ALK抑制劑)和化合物B共同治 療在Kelly人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的劑量效果；協(xié)同得分為1.52。圖24C顯示劑量矩陣和 Loewe過量矩陣，證明化合物A1和化合物B共同治療在NB-1人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的劑量效 果;所述組合不具有協(xié)同性。圖24D顯示劑量矩陣和Loewe過量矩陣，證明化合物A2和化合物 B共同治療在NB-1人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的劑量效果;所述組合不具有協(xié)同性。圖24E顯示 劑量矩陣和Loewe過量矩陣，證明化合物A1和化合物B共同治療在SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤 細(xì)胞中的劑量效果。圖24F顯示劑量矩陣和Loewe過量矩陣，證明化合物A2和B共同治療在 SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的劑量效果。
【具體實(shí)施方式】 [00；3引室義
[0039] 提供下列一般定義W更好理解本發(fā)明：
[0040] "烷基"指一個(gè)基團(tuán)和其他基團(tuán)的結(jié)構(gòu)元件，例如面素取代的烷基和烷氧基，且可 W是直鏈或支鏈。本文所用的可任選取代的烷基、締基或烘基可任選面化（如CF3)，或可具 有被雜原子置換或取代的一個(gè)或多個(gè)碳，所述雜原子如NR、0或S(如-0C此C出0-、烷基硫醇、 硫代烷氧基、烷基胺等）。
[0041 ]"芳基"指含碳原子的單環(huán)或稠合雙環(huán)芳環(huán)。"亞芳基"指衍生自芳基的二價(jià)自由 基。例如，芳基可W是苯基、巧基、巧滿基、糞基或1，2,3,4-四氨糞基，其可任選在鄰位、間位 或?qū)ξ槐蝗〈?br>[0042]本文所用的"雜芳基"如上所定義的芳基，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)成員是雜原子。雜芳 基示例包括但不限于化晚基、化嗦基、嗎I噪基、嗎I挫基、哇喔嘟基、哇嘟基、苯并巧喃基、苯并 贓喃基、苯并嚷喃基、苯并[1，3]間二氧雜環(huán)戊締基、咪挫基、苯并咪挫基、喀晚基、巧喃基、 惡挫基、異惡挫基、Ξ挫基、苯并Ξ挫基、四挫基、化挫基、嚷吩基、化咯基、異哇嘟基、嚷嶺 基、嚷挫基、四嗦基、苯并嚷挫基、惡二挫、苯并惡二挫等。
[0043] 本文所用的"碳環(huán)"指飽和或部分未飽和的單環(huán)、稠合雙環(huán)或橋接多環(huán)，含有可任 選被(例如=0)取代的碳原子。碳環(huán)示例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)下基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán) 丙締、環(huán)己酬等。
[0044] 本文所用的"雜環(huán)"如上面所定義的碳環(huán)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)碳是雜原子。例如，雜 環(huán)能包含N、0、S、-N=、-S-、-S(0)、-S(0)2-或-NR-，其中R可W是氨、Cl-4烷基或保護(hù)基。雜環(huán) 示例包括但不限于嗎嘟代、化咯烷基、化咯燒-2-酬、贓嗦基、贓晚基、贓晚酬、1,4-二氧雜- 8-氮雜螺[4.引癸-8-基、1，2,3,4-四氨哇嘟等。本文所用的雜環(huán)可涵蓋雙環(huán)胺和雙環(huán)二胺。
[0045] 術(shù)語"約"或"大致"通常指給定值或范圍的20 % W內(nèi)，更優(yōu)選10 % W內(nèi)，最優(yōu)選仍 在5% W內(nèi)?；蛘咛貏e是在生物學(xué)系統(tǒng)中，術(shù)語"約"指給定值的大致一對(duì)數(shù)范圍（即一個(gè)數(shù) 量級(jí)）內(nèi)，優(yōu)選給定值的1/2-2倍內(nèi)。
[0046] 本文所用的"間變性淋己瘤激酶(ALK)抑制劑"設(shè)及抑制該酶的激酶活性的化合 物。運(yùn)類化合物稱為"ALK抑制劑"。
[0047] "ALK抗性腫瘤或癌"指不能良好響應(yīng)先前ALK抑制劑治療，或者在良好響應(yīng)ALK抑 制劑后重現(xiàn)或復(fù)發(fā)的癌或腫瘤。所述癌或腫瘤可能在治療開始時(shí)耐藥或難治或者可能在治 療期間變成耐藥或難治。
[0048] "共施用"、"共同施用"或"聯(lián)合施用"等意在涵蓋向單一患者施用選定治療劑，也 旨在包括試劑不必需通過相同施用途徑或同時(shí)施用的治療方案。
[0049] "組合"指針對(duì)聯(lián)合施用采用一個(gè)劑量單位形式的固定組合或非固定組合(或成套 藥盒），其中化合物和組合伴侶（例如下述的另一藥物，也稱為"治療劑"、"藥劑"或"合作 劑"）可同時(shí)單獨(dú)施用或在一定時(shí)間間隔內(nèi)分開施用，特別是運(yùn)些時(shí)間間隔使組合伴侶們能 顯示協(xié)作（如協(xié)同）效應(yīng)。本文所用的術(shù)語"聯(lián)合施用"等意在涵蓋向有需要的單一對(duì)象(如 患者)施用選定組合伴侶，且旨在包括多個(gè)藥劑不必通過相同施用途徑或同時(shí)施用的治療 方案。術(shù)語"固定組合"指活性成分(如式A1的化合物和組合伴侶單一實(shí)體或劑型同時(shí)施 用于患者。術(shù)語"非固定組合"或"成套藥盒"指多個(gè)活性成分(如式A1的化合物和組合伴侶） W單獨(dú)實(shí)體同時(shí)、同步或依序而沒有特定時(shí)間限制地施用于患者，其中所述施用在患者體 內(nèi)提供治療有效水平的兩種化合物。
[0050] 本文定義的"周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑"指與周期蛋白-CDK復(fù)合體相互作 用W阻斷激酶活性的小分子。
[0051] "劑量范圍"指指定治療劑含量的可接受變化的上限和下限。通常，量在指定范圍 內(nèi)的試劑劑量能施用于接受治療的患者。
[0052] 設(shè)及聯(lián)合治療的"聯(lián)合治療有效量"指各組合伴侶的量，其可一起、獨(dú)立地同時(shí)或 在合適時(shí)間間隔內(nèi)分開施用，所述組合伴侶在需要的患者中對(duì)緩解、延遲疾病發(fā)展或抑制 疾病癥狀產(chǎn)生協(xié)作的有益/治療效果。
[0053] "藥學(xué)上可接受"指在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適于接觸哺乳動(dòng)物尤其是人組織的那 些化合物、材料、組合物和/或劑型，而沒有過度毒性、刺激、過敏反應(yīng)和其它問題并發(fā)癥，并 具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比。
[0054] "藥物制品"或"藥物組合物"指含至少一種待施用于溫血?jiǎng)游锶缛说闹委焺┑幕?合物或溶液，用于防止、治療或控制影響哺乳動(dòng)物的特定疾病或病癥。
[0055] "鹽"（由"或其鹽"表示)能單獨(dú)存在或與游離化合物(如式（I)化合物)混合，并且 優(yōu)選藥學(xué)上可接受鹽。式（I)化合物的該鹽從有堿性氮原子的式（I)化合物形成，例如作為 酸加成鹽，優(yōu)選用有機(jī)或無機(jī)酸。例如，合適的無機(jī)酸是氨面酸（如鹽酸）、硫酸或憐酸。例 如，合適的有機(jī)酸是簇酸或橫酸，如富馬酸或甲橫酸。出于分離或純化目的，還能使用藥學(xué) 上無法接受的鹽，例如苦味酸鹽或高氯酸鹽。對(duì)于治療用途，僅使用藥學(xué)上可接受鹽或游離 化合物(應(yīng)用時(shí)采用藥物制劑形式），因此優(yōu)選運(yùn)些。鑒于例如在純化或鑒定新型化合物中 新型化合物游離形式與鹽形式(包括能用作中間物的那些鹽)之間的密切關(guān)系，上下文中任 何提及的游離化合物應(yīng)理解為在適當(dāng)和方便時(shí)也指對(duì)應(yīng)鹽。式（I)化合物的鹽優(yōu)選是藥學(xué) 上可接受鹽;形成藥學(xué)上可接受鹽的合適反離子是本領(lǐng)域已知的。
[0056] "單一藥物組合物"指配制成向患者遞送有效量的兩種治療劑的單一載體或載劑。 所述單一載劑被設(shè)計(jì)成遞送有效量的各藥劑，W及任何藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在 一些實(shí)施方式中，所述載劑是片劑、膠囊、藥丸或貼片。在其它實(shí)施方式中，所述載劑是溶液 或懸液。
[0057] "對(duì)象"、"患者"或"溫血?jiǎng)游?意在包括動(dòng)物。對(duì)象示例包括哺乳動(dòng)物，如人、狗、 牛、馬、豬、綿羊、山羊、貓、小鼠、兔、大鼠和轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，所述對(duì)象 是人，如患有、有風(fēng)險(xiǎn)患有、或潛在能患有腦腫瘤疾病的人。尤其優(yōu)選所述對(duì)象或溫血?jiǎng)游?是人。
[0058] "治療有效"優(yōu)選設(shè)及治療劑的一定量，該量對(duì)于抵御增殖性疾病進(jìn)展在治療上或 更廣義地還在預(yù)防上有效。
[0059] "治療"包括癌癥疾病或素亂的預(yù)防性和治療性處理(包括但不限于減輕、治愈、緩 解癥狀、減少癥狀）W及進(jìn)展延遲。術(shù)語"預(yù)防性"指防止癌癥發(fā)生或復(fù)發(fā)。本文所用的術(shù)語 "進(jìn)展延遲"指將所述組合施用于處于待治療癌癥病前階段(pre-stage)或早期的患者，對(duì) 應(yīng)癌癥的預(yù)形式(pre-form)已被診斷出和/或在被診斷出處于對(duì)應(yīng)癌癥可能會(huì)發(fā)展的情況 的患者中。
[0060] 。抑制"
[0061] 本發(fā)明設(shè)及分開或共同包括W下的藥物組合：（1)第一藥劑，其是間變性淋己瘤激 酶(ALK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽和(2)第二藥劑，其是周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制 劑或其藥學(xué)上可接受鹽。運(yùn)類組合可同時(shí)、分開或依序用于治療增殖性疾病。
[0062] 用于本發(fā)明組合的合適ALK抑制劑包括但不限于式A化合物：
[0063]
[0064] 或其藥學(xué)上可接受鹽;其中
[00 化]
[0066] a1和A4獨(dú)立地是C或N;
[0067] 各A2和A3是C，或當(dāng)R6和護(hù)成環(huán)時(shí)，A2和A 3之一是N;
[0068] B和C獨(dú)立地是可任選取代的5-7元碳環(huán)、芳基、雜芳基或含N、0或S的雜環(huán)；
[0069] Zi、Z2和Z3獨(dú)立地是NRii、C = 0、CR-0R、（CR2) 1-2或=C-R12;
[0070] R哺R2獨(dú)立地是面素、OR12、NR(r12)、SR12或可任選取代的。-6烷基、C2-6締基或C2-6烘 基;或Ri和R2之一是H;
[00川 R3是（邸2) 0-2SO2RI2、（ CR2) 0-2SO2NRRI2、（ CR2) 0-2CO1-2RI2、（ CR2) 0-2CONRR12或氯基；
[00巧 r4、r6、r哺3"獨(dú)立地是可任選取代的Ci-6烷基、C2-6締基或C2-6烘基;ori 2、nr(ri2)、 面素、硝基、SO2RI2、（ CR2) pRU或X;或R4、R哺31?立地是Η;
[0073] R、R哺r5'獨(dú)立地是Η或。-6烷基；
[0074] R哺R9獨(dú)立地是Ci-6烷基、C2-6締基或C2-6烘基、面素或X;或當(dāng)R哺R2成環(huán)時(shí)，R哺R 9之一是Η;前提是R8和R9之一是X;
[0075] 或者，Ri和R2、或R哺R7、R哺R8、或R哺rW，在連接碳原子時(shí)可形成可任選取代的5- 7元單環(huán)或稠合碳環(huán)、芳基、或雜芳基或者含N、0和/或S的雜環(huán);或R7、R8、R9和rW在連接N時(shí)缺 失。
[0076] Rll 是H、Ci-6烷基、C2-6締基、（CR2)pC0l-2R、（CR2)p〇R、（CR2)pR13、（CR2)pNRR12、（CR2) pCONRRU 或（CR2)pSOi-2R12;
[0077] rU和rU獨(dú)立地是可任選取代的3-7元飽和或部分未飽和碳環(huán)，或含N、0和/或S的 5-7元雜環(huán);芳基或雜芳基;或Ri2是H、Ci-6烷基；
[007引 X是（CR2) qY、氯基、COi-2R12、C0NR( r12 )、C0NR (CR2) pNR( r12 )、C0NR(CR2) p0R12、C0NR (CR2) pSR12、CONR (邸2) pS (0) 1-2R12或（邸2) i-sNR (CR2) p0R12 ;
[0079] Y是可任選取代的3-12元碳環(huán)、5-12元芳基、或5-12元雜芳基或者含N、0和/或S的 雜環(huán)，當(dāng)（CR2)qY中的q是加寸通過所述雜芳基或雜環(huán)的碳原子連接A2或A3或者兩者;和
[0080] n、p和q獨(dú)立地是0-4，
[00川在一個(gè)式A的變體中，
其中41、42、43、4 4、護(hù)、護(hù)、護(hù)、護(hù)和3"如上所 定義。
[0082]在另一變體中，所述ALK抑制劑是式A1化合物：
[0083]
[0084] 或其藥學(xué)上可接受鹽;其中
[00財(cái) R1是面素或Ci-6烷基；
[0086] r2 是H;
[0087] r3 是（CR2)o-2S〇2R12;
[008引 R4是Ci-6烷基、C2-6締基或C2-6烘基;OR"、NR(rU )、面素、硝基、S02R12，（ CR2 )pRU或X; 或R4是Η;
[0089] R6是異丙氧基或甲氧基；
[0090] r8 和 r9 之一是（CR2)qY 而另一個(gè)是。-6 烷基、氯基、C(O)〇0-iR12、CONR(r12)或 C0NR (CR2)pNR(r12);
[0091] X是(C化)qY、氯基、C(0)Oo-lRl2、CONR(Rl2)、CONR(CR2)pNR(Rl2)、CONR(CR2)pORl2、CONR (CR2) pSR12、C0NR (邸2) pS (0) 1-2R12或（邸2) i-sNR (CR2) p〇R12 ;
[0092] Υ是化咯烷基、贓晚基或氮雜環(huán)下烷基，各自通過碳原子連接苯環(huán)；
[0093] Ri哺R"獨(dú)立地是3-7元飽和或部分未飽和碳環(huán)，或含Ν、0和/或S的5-7元雜環(huán)；芳 基或雜芳基;或Ri2是Η或Ci-6烷基；
[0094] R是Η或打-6烷基；和
[0095] η 是 0-1 〇
[0096] 在另一變體中，所述ALK抑制劑是式Α2化合物：
[0097]
[0098] 或其藥學(xué)上可接受鹽;其中
[0099] Ri和R2共同形成可任選取代的5-6元芳基、雜芳基或含1-3個(gè)氮原子的雜環(huán)；
[0100] R3 是（CR2) 0-2SO2RI2、（ CR2) 0-2SO2NRRI2、（ CR2) 0-2C (0) Oo-iRU、（ CR2) 0-2CONRR12、C02N 出或 氯基；
[0101] R、R哺R5'獨(dú)立地是Η或Ci-6烷基；
[0102] R6是面素或〇(Ci-6烷基）；
[010；3] R哺R9獨(dú)立地是Ci-6烷基、C2-6締基或C2-6烘基、面素或X;或R哺R9之一是Η;前提是R 8 和R9之一是X;
[0104] X是（C化）qY、氯基、C(O)O0-lRl2、CONR(Rl2)、CONR(CR2)pNR(Rl2)、CONR(CR2)pORl2、CONR (CR2 ) pSR12、CONR (邸2 ) pS (0) i-2R12或（邸2) i-sNR ( CR2 ) p〇R12 ;
[0105] Y是可任選取代的3-12元碳環(huán)、5-12元芳基、或5-12元雜芳基或者含N、0和/或S的 雜環(huán)，當(dāng)（CR2)qY中的q是加寸通過所述雜芳基或雜環(huán)的碳原子連接A2或A3或者兩者；
[0106] Ri堪可任選取代的3-7元飽和或部分未飽和碳環(huán)，或含N、0和/或S的5-7元雜環(huán);芳 基或雜芳基;或Ri2是H、Ci-6烷基;和
[0107] P和q獨(dú)立地是0-4。
[0108] 在本發(fā)明組合的一些實(shí)施方式中，所述ALK抑制劑選自：
[0109]

[0111]或其藥學(xué)上可接受鹽。
[0112] 在本發(fā)明組合的另一實(shí)施方式中，所述ALK抑制劑選自：
[0113]


[0116] 在本發(fā)明組合的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述ALK抑制劑是如下的化合物Al，即5- 氯-N2-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(贓晚-4-基)苯基)-M-[2-(丙烷-2-橫酷)-苯基]-喀晚-2， 4-二胺：
[0117]
[0118] 或其藥學(xué)上可接受鹽。
[0119] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述ALK抑制劑是如下的化合物A2,即N6-(2-異丙氧 基-5-甲基-4-(1-甲基贓晚-4-基)苯基)-N4-(2-(異丙基橫酷)苯基)-lH-化挫并[3,4-d]喀 晚-4,6-二胺：
[0120]
[0121] 或其藥學(xué)上可接受鹽。
[0122] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述ALK抑制劑是如下的化合物A3,即(R)-3-(l-(2,6- 二氯-3-氣苯基）乙氧基)-5-( 1-(贓晚-4-基)-lH-化挫-4-基）化晚-2-胺，通常W克挫替尼 和商品名XALKORJ⑥已知：
[0123]
[0124] 或其藥學(xué)上可接受鹽。
[0125] 在所述組合的一個(gè)實(shí)施方式中，所述CDK抑制劑是CDK4或CDK6抑制劑。在一個(gè)變體 中，所述CDK抑制劑是CDK4抑制劑。在另一變體中，所述CDK抑制劑是CDK6抑制劑。在另外一 個(gè)變體中，所述CDK抑制劑是CDK4和CDK6雙重抑制劑。
[01 %]合適的CDK抑制劑包括但不限于式B化合物：
[0127]
[0128] 或其藥學(xué)上可接受鹽，其中
[0129] X 是 CR9 或 N;
[0130] r1是Ci-8烷基、CN、C(0)0R4或C0NR5R6、5-14元雜芳基或3-14元環(huán)雜芳基；
[0131] R堪Ci-8烷基、C3-M環(huán)烷基或5-14元雜芳基，其中R可用一個(gè)或多個(gè)打-偏基或0H取 代；
[0132] L是鍵、打-8亞烷基、C(0)或C(0)NRW，其中L可取代或未取代；
[0133] Y是山護(hù)、^哨13、0山或￥是部分下組
[0134]
其中Y是CR9或N;其中可存在0-3個(gè)R 8，且R8是Ci-8烷基、含氧基團(tuán)、面素， 或者兩個(gè)或更多R8可形成橋鍵烷基；
[0135] W 是 CR9或N;
[0136] R3是Η、。-8烷基、Ci-8烷基RM、C3-14環(huán)烷基、C( 0) Ci-8烷基、Ci-8面代烷基、Ci-8烷基0H、 (：(〇)^141?1日、。-8氯烷基、(：(〇地4、抗-8烷基(：(〇)〇)-8烷基^141?1日、〇)-8烷基(：(〇)〇1?14、^哨15、 SO2C1-8烷基、Cl-8烷基C3-14環(huán)烷基、C(0)Cl-8烷基C3-14環(huán)烷基、Cl-8烷氧基或0H，當(dāng)R3不是Η時(shí)其 可取代或未取代。
[0137] R9是Η或面素；
[013 引 R4、R5、R6、R7、Rl0、Rll、Rl2、Rl 3、Rl哺Rl5各獨(dú)立選自H、Cl-8烷基、C3-l4環(huán)烷基、3-14元 環(huán)雜烷基、C6-14芳基、5-14元雜芳基、烷氧基、C(0化、C(N)0H、C(N)0C出、C(0)Ci-3烷基、Cl-8燒 基畑2、Ci-6烷基OH,其中當(dāng)於、護(hù)、護(hù)、護(hù)、1?1\護(hù)、1?1哺護(hù)、1?14及1?15不是酣寸，其可取代或未取 代；
[0139] m和η獨(dú)立地是0-2;和
[0140] 其中1^、護(hù)、於、護(hù)心、護(hù)、1?"、護(hù)、1?1哺1?13、1?14及1?1可用一個(gè)或多個(gè)〇1-8烷基心-8締 基、C2-8烘基、C3-14環(huán)烷基、5-14兀雜芳基、〔6-14芳基、3-14兀環(huán)雜烷基、0Η、（0)、CN、烷氧基、 面素或NH2取代。
[0141] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述CDK抑制劑是化合物B1，即7-環(huán)戊基-N，N-二甲基-2-(巧- (贓嗦-1-基)郵晚-2-基)氨基)-7H-化咯并[2,3-d]喀晚-6-甲酯胺，如下式所述：
[0142]
[0143] 本發(fā)明藥物組合的特定實(shí)施方式包括W下：
[0144] (1)含化合物A1與化合物B1的組合；
[0145] (2)含化合物A2與化合物B1的組合;和
[0146] (3)含化合物A3與化合物B1的組合。
[0147] 本發(fā)明范圍還包括超過兩種的上述單獨(dú)活性成分的組合，即本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物 組合能包括巧巾或更多活性成分。
[0148] 除非另有說明，如果化合物結(jié)構(gòu)和其化學(xué)名不一致，W化合物結(jié)構(gòu)為準(zhǔn)。
[0149] 上式(A、A1、A2和B)的化合物，尤其是化合物A1-A3和B，可W其游離堿或其任何鹽 的形式納入本發(fā)明組合。鹽能單獨(dú)存在或與游離化合物混合，且優(yōu)選藥學(xué)上可接受鹽?；?物的所述鹽通過堿性氮原子形成，例如作為酸加成鹽，優(yōu)選用有機(jī)或無機(jī)酸。例如，合適的 無機(jī)酸是氨面酸(如鹽酸）、硫酸或憐酸。例如，合適的有機(jī)酸是班巧酸、簇酸或橫酸，如富馬 酸或甲橫酸。出于分離或純化目的也能使用藥學(xué)上無法接受的鹽，例如苦味酸鹽或高氯酸 鹽。對(duì)于治療應(yīng)用，僅使用藥學(xué)上可接受鹽或游離化合物(應(yīng)用時(shí)采用藥物制劑形式），因此 優(yōu)選運(yùn)些。
[0150] 同樣包括其藥學(xué)上可接受鹽，對(duì)應(yīng)外消旋體、非對(duì)映異構(gòu)體、對(duì)映異構(gòu)體、互變異 構(gòu)體W及上面所公開化合物的對(duì)應(yīng)晶體變體(存在時(shí)），如其中公開的溶劑合物、水合物和 多晶型物。用作本發(fā)明組合活性成分的化合物能分別如所引用文獻(xiàn)所述制備并施用。
[0151] 藥理學(xué)和效用
[0152] 應(yīng)指出本發(fā)明組合的個(gè)體伴侶是已知具有抑制活性的化合物。意外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明組 合和其藥學(xué)上可接受鹽在體外無細(xì)胞激酶測(cè)定和細(xì)胞分析W及體內(nèi)癌癥小鼠模型中測(cè)試 時(shí)，顯示有益協(xié)作(如協(xié)同）治療特性，因此是有用的，用于治療增殖性疾病尤其是癌。術(shù)語 "增殖性疾病"包括但不限于癌、腫瘤、增生、再狹窄、屯、臟肥大、免疫素亂和炎癥。
[0153] 一方面，本發(fā)明設(shè)及分開或共同包括W下的藥物組合：（a)第一藥劑，其是間變性 淋己瘤激酶(ALK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽和(b)第二藥劑，其是周期蛋白依賴性激酶 (CDK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽，用于治療增殖性疾病尤其是癌。
[0154] 另一方面，本發(fā)明提供藥物組合在制備治療增殖性疾病尤其是癌的藥物中的應(yīng) 用，所述組合分開或共同包括(a)第一藥劑，其是間變性淋己瘤激酶(ALK)抑制劑或其藥學(xué) 上可接受鹽和(b)第二藥劑，其是周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。
[0155] -方面，本發(fā)明還設(shè)及在需要的對(duì)象中治療增殖性疾病的方法，包括向所述對(duì)象 施用聯(lián)合治療有效量的藥物組合或藥物組合物，包括：（a)第一藥劑，其是間變性淋己瘤激 酶(ALK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽和(b)第二藥劑，其是周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制 劑或其藥學(xué)上可接受鹽。根據(jù)本發(fā)明，第一藥劑和第二藥劑可在單一藥物組合物中一起施 用，在分開的藥物組合物中單獨(dú)施用，或依序施用。
[0156] 本發(fā)明優(yōu)選用于治療患有增殖性疾病如癌的哺乳動(dòng)物，尤其是人。
[0157] 能用本發(fā)明組合治療的增殖性疾病示例是例如癌，包括但不限于肉瘤、神經(jīng)母細(xì) 胞瘤、淋己瘤、肺癌、支氣管癌、前列腺癌、乳腺癌(包括散發(fā)性乳腺癌和Cowden病患者）、膜 腺癌、胃腸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸腺瘤、甲狀腺癌、肝癌、肝內(nèi)膽管癌、肝細(xì)胞 癌、腎上腺癌、胃癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、黑素瘤、腎癌、腎孟癌、膀脫 癌、子宮體癌、宮頸癌、陰道癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤、食管癌、白血病、急性骨髓性白血病、 慢性髓細(xì)胞性白血病、淋己細(xì)胞性白血病、骨髓性白血病、腦腫瘤、腦癌、口腔及咽部癌、喉 癌、小腸癌、非霍奇金淋己瘤、黑素瘤、結(jié)腸絨毛腺瘤、寶生物、上皮癌、乳腺癌、基底細(xì)胞癌、 間變性大細(xì)胞淋己瘤、非小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌、光化性角化病、腫瘤疾病(包括實(shí)體瘤）、 頸部或頭部腫瘤、真性紅細(xì)胞增多、原發(fā)性血小板增多癥、髓樣化生性骨髓纖維化、炎性乳 腺癌和巨球蛋白血癥。
[0158] 其他示例包括真性紅細(xì)胞增多、原發(fā)性血小板增多癥、髓樣化生性骨髓纖維化、哮 喘、C0PD、ARDS、呂弗勒綜合征、嗜酸粒細(xì)胞性肺炎、寄生蟲(尤其是后生動(dòng)物)感染(包括熱 帶嗜酸性粒細(xì)胞增多癥）、支氣管肺曲霉病、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎（包括變應(yīng)性肉芽腫性血管 炎）、嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫、藥物反應(yīng)引發(fā)的影響氣道的嗜酸性細(xì)胞相關(guān)疾病、牛皮癖、接觸性 皮炎、特應(yīng)性皮炎、斑秀、多形性紅斑、瘤疹樣皮炎、硬皮病、白齋風(fēng)、超敏性血管炎、等麻疹、 大瘤性類天瘤瘡、紅斑狼瘡、天瘤瘡、獲得性大瘤性表皮松解、自身免疫性血液學(xué)病癥(如溶 血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞貧血和特發(fā)性血小板減少）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多軟骨 炎、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮肌炎、慢性活動(dòng)型肝炎、重癥肌無力、史蒂芬強(qiáng)森癥候群、特 發(fā)性脂肪瀉、自身免疫性炎癥性腸病(如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏?。?、內(nèi)分泌性眼病、格雷 夫斯病、結(jié)節(jié)病、牙槽炎、慢性過敏性肺炎、多發(fā)性硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎(前 部和后部）、肺間質(zhì)纖維化、牛皮癖關(guān)節(jié)炎、腎小球性腎炎、屯、血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血 壓、深靜脈血栓形成、中風(fēng)、屯、肌梗塞、不穩(wěn)定型屯、絞痛、血栓栓塞、肺栓塞、溶血栓疾病、急 性動(dòng)脈缺血、外周血栓性閉塞和冠狀動(dòng)脈疾病、再灌注損傷、視網(wǎng)膜病如糖尿病視網(wǎng)膜病變 或高壓氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變W及表征為眼壓升高或眼房水分泌的病癥如青光眼。
[0159] 提及癌、腫瘤、腫瘤疾病、肉瘤或癌癥時(shí)，或者或另外還暗指原始器官或組織和/或 任何其它位置的轉(zhuǎn)移，無論腫瘤和/或轉(zhuǎn)移的位置如何。
[0160] 本發(fā)明的ALK與CDK4/6抑制劑組合特別用于治療ALK陽性癌，即由間變性淋己瘤激 酶(ALK)介導(dǎo)/決定的癌。數(shù)據(jù)顯示本發(fā)明的組合有效治療癌尤其是神經(jīng)母細(xì)胞瘤，顯示ALK 基因和/或蛋白的過表達(dá)或擴(kuò)增和/或體細(xì)胞突變。
[0161] 本發(fā)明的ALK與CDK4/6抑制劑組合還可用于治療ALK抗性腫瘤或癌。一種用ALK抑 制劑治療時(shí)的腫瘤耐藥性機(jī)制是ALK基因中出現(xiàn)的突變。該機(jī)制在經(jīng)克挫替尼治療患有ALK 陽性腫瘤(大多是非小細(xì)胞肺癌）的患者的臨床試驗(yàn)中得到證明。一些運(yùn)類抗性突變與神經(jīng) 母細(xì)胞瘤中所見突變類似。不希望受理論約束，假設(shè)運(yùn)些抗性突變導(dǎo)致ALK活化W進(jìn)一步推 動(dòng)腫瘤增殖。例如，ALK的T1151/L1152/C1156區(qū)域和I1171/F1174區(qū)域中的突變與神經(jīng)母細(xì) 胞瘤突變類似。由于本發(fā)明的ALK抑制劑與CDK抑制劑組合對(duì)有擴(kuò)增突變的神經(jīng)母細(xì)胞瘤有 效，所述組合會(huì)對(duì)運(yùn)些ALK抗性腫瘤有效。
[0162] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合用于治療依賴于ALK基因擴(kuò)增的增殖性疾 病。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合用于治療依賴于ALK基因突變的增殖性疾病。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合用于治療依賴于ALK基因突變和擴(kuò)增的增殖性疾病。
[0163] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞增殖性疾病選自淋己瘤、骨肉瘤、黑素瘤、乳腺瘤、腎 癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、卵巢癌、膜腺癌、神經(jīng)元癌、肺癌、子宮癌或胃腸道腫 瘤、ALK抗性腫瘤、炎性乳腺癌、間變性大細(xì)胞淋己瘤、非小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0164] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞增殖性疾病是間變性大細(xì)胞淋己瘤。在另一個(gè) 優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞增殖性疾病是非小細(xì)胞肺癌。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì) 胞增殖性疾病是間變性大細(xì)胞淋己瘤。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞增殖性疾病是 神經(jīng)母細(xì)胞瘤。在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述細(xì)胞增殖性疾病是ALK抗性腫瘤。
[0165] 體外和體內(nèi)研究證明相較僅用本發(fā)明組合所用藥劑(a)或藥劑(b)之一的單一療 法，施用本發(fā)明藥物組合引起設(shè)及緩解、延遲疾病發(fā)展或抑制癥狀的有益效果，如協(xié)同治療 效果。另一益處是能采用少量的活性成分，例如劑量可更小和/或施用頻率更低，能減少副 作用發(fā)生或嚴(yán)重度，使得生活質(zhì)量提高或發(fā)病率降低。運(yùn)與待治療患者的愿望和需求一致。 下文實(shí)施例部分報(bào)告體外和體內(nèi)研究結(jié)果。
[0166] 為證明本發(fā)明的ALK抑制劑與CDK抑制劑組合特別適于有效治療增殖性疾病且有 良好治療邊際和其他優(yōu)勢(shì)，臨床試驗(yàn)?zāi)躓技術(shù)人員已知的方式完成。
[0167] 例如，合適的臨床研究是增殖性疾病患者的開放標(biāo)簽、劑量遞增研究。運(yùn)類研究特 定證明本發(fā)明組合的活性成分的協(xié)同作用。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的運(yùn)些研究結(jié)果能直 接確定有益效果。運(yùn)些研究特別適于比較使用活性成分的單一療法與本發(fā)明組合的效果。 優(yōu)選地，藥劑(a)的劑量遞增，直至達(dá)到最大耐受劑量，而藥劑(b)W固定劑量施用?；蛘?，藥 劑(a) W固定劑量施用，而藥劑(b)的劑量遞增。各患者能每天或間歇性接受一定劑量的藥 劑(a)。通過每6周(如12、18或24周后）的癥狀得分評(píng)估，可在運(yùn)些研究中測(cè)定治療功效。
[0168] 藥物組合物、施用和劑量
[0169] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供含一定量本發(fā)明各組合伴侶藥劑(a)和(b)的藥物組合 物，所述量對(duì)祀向或預(yù)防增殖性疾病聯(lián)合治療有效。
[0170] -方面，本發(fā)明設(shè)及含藥物組合的藥物組合物，所述組合分開或共同包括(a)第一 藥劑，其是間變性淋己瘤激酶(ALK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽和(b)第二藥劑，其是周期 蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽，W及至少一種賦形劑。ALK抑制劑和CDK 抑制劑適用于本發(fā)明組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述藥物組合物用于治療增殖性 疾病。根據(jù)本發(fā)明，藥劑(a)和藥劑(b)可在單一藥物組合物中一起施用，在一個(gè)組合單位劑 型或兩個(gè)分開的單位劑型中單獨(dú)施用，或依序施用。所述單位劑型還可W是固定組合。
[0171] 用于分開施用藥劑或W本發(fā)明所述固定組合（即含至少兩個(gè)組合伴侶(a)和(b)的 單一蓋侖組合物)施用的藥物組合物可W本身已知的方式制備，且適合腸部施用（如口頭或 直腸）、局部施用和胃腸外施用于包括哺乳動(dòng)物(溫血?jiǎng)游?如人在內(nèi)的對(duì)象，所述藥物組合 物包括治療有效量的至少一種(例如上述的）單獨(dú)藥物活性組合伴侶，或聯(lián)合一種或多種藥 學(xué)上可接受載體或稀釋劑，尤其適合腸部或胃腸外施用。例如，合適的藥物組合物包含約 0.1 % -約99.9 %的活性成分，優(yōu)選約1 % -約60 %。
[0172] 用于腸部施用或胃腸外施用的聯(lián)合治療的藥物組合物是例如采用單位劑型的那 些，如糖衣片劑、片劑、膠囊或栓劑、安飯、注射溶液或注射懸液。局部施用是例如施用于皮 膚或眼睛，如采用洗液、凝膠、油膏或乳膏形式，或鼻劑或栓劑形式。除非另有說明，其W本 身已知的方式制備，例如通過常規(guī)混合、造粒、包糖衣、溶解或凍干工藝。應(yīng)理解各劑型個(gè)體 劑量所含各藥劑的單位內(nèi)容物本身不需構(gòu)成有效量，因?yàn)楸匦璧挠行Я靠赏ㄟ^施用多個(gè)劑 量單位來達(dá)到。
[0173] 藥物組合物可包括一種或多種藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑，能W常規(guī)方式通過將 組合伴侶之一或兩者與藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑混合來生產(chǎn)。藥學(xué)上可接受稀釋劑的示 例包括但不限于乳糖、右旋糖、甘露醇、和/或甘油、和/或潤滑劑和/或聚乙二醇。藥學(xué)上可 接受粘合劑的示例包括但不限于娃酸儀侶、淀粉(如玉米淀粉、小麥淀粉或米淀粉）、明膠、 甲基纖維素、簇甲基纖維素鋼和/或聚乙締化咯燒酬，W及(若需要)藥學(xué)上可接受崩解劑包 括但不限于淀粉、瓊脂、藻酸或其鹽(如藻酸鋼）、和/或泡騰合劑、或吸附劑、染料、調(diào)味劑和 甜味劑。還能采用胃腸外可施用組合物或輸液形式使用本發(fā)明組合物。所述藥物組合物可 無菌和/或可包括賦形劑，例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑和/或乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓的 鹽和/或緩沖劑。
[0174] 具體地，治療有效量的本發(fā)明組合各組合伴侶可同時(shí)或依序且W任何順序施用， 且所述組分可分開或作為固定組合施用。例如，本發(fā)明所述預(yù)防或治療癌癥的方法可包括 采用聯(lián)合治療有效量(優(yōu)選協(xié)同有效量，例如對(duì)應(yīng)于本文所述量的每日或間歇性劑量)同時(shí) 或W任何順序依序：（i)施用游離或藥學(xué)上可接受鹽形式的第一藥劑;和(ii)施用游離或藥 學(xué)上可接受鹽形式的第二藥劑。本發(fā)明組合的各組合伴侶可在治療進(jìn)程中的不同時(shí)間分開 施用或者W分開或單個(gè)組合形式同步施用。此外，術(shù)語"施用"還包括使用體內(nèi)轉(zhuǎn)化成組合 伴侶本身的組合伴侶前藥。因此，本發(fā)明應(yīng)理解成涵蓋所有運(yùn)類同時(shí)或交替治療的方案且 術(shù)語"施用"也進(jìn)行相應(yīng)解釋。
[0175] 本發(fā)明組合所用各組合伴侶藥劑的有效劑量可根據(jù)所用特定化合物或藥物組合 物、施用模式、所治療病癥、所治療病癥的嚴(yán)重性而變化。因此，本發(fā)明組合的劑量方案根據(jù) 多種因素選擇，包括患者的類型、物種、年齡、體重、性別和醫(yī)療狀況;待治療病癥的嚴(yán)重性； 施用途徑；患者的腎及肝功能；和所用特定化合物。掌握普通技術(shù)的醫(yī)師、臨床醫(yī)生或獸醫(yī) 能容易確定并處方預(yù)防、抵消或阻滯病癥進(jìn)展所需的有效量藥物。達(dá)到產(chǎn)生功效范圍內(nèi)的 藥物濃度的最優(yōu)精度需要基于藥物對(duì)祀位點(diǎn)的可及性的動(dòng)力學(xué)。運(yùn)包括考慮藥物的分布、 平衡和消除。
[0176] 出于本發(fā)明目的，治療有效劑量一般是W單一或分開的劑量施用于宿主的總?cè)談?量。式（I)化合物可W例如約ο . 05-約50mg/kg受體體重的日劑量范圍施用于宿主，優(yōu)選約 0 . l-25mg/kg受體體重，更優(yōu)選約0.5-lOmg/kg受體體重。藥劑（b)可W例如約0.001- lOOOmg/kg受體體重的日劑量范圍施用于宿主，優(yōu)選1.0-lOOmg/kg受體體重，最優(yōu)選1.0- 50mg/kg受體體重。劑量單位組合物可包含所述量的因數(shù)W組成日劑量。
[0177]本發(fā)明的ALKi和CDKi組合能單獨(dú)使用或聯(lián)合至少一種藥物活性化合物W用于運(yùn) 些病理學(xué)。運(yùn)些活性化合物能合并于同一藥物制品或采用聯(lián)合制劑"成套藥盒"形式，在此 意義上所述組合伴侶可獨(dú)立施用或使用有不同量組合伴侶的不同固定組合，即同時(shí)或在不 同時(shí)間點(diǎn)施用。隨后，成套藥盒部分能同時(shí)或按時(shí)間順序交叉施用，即不同時(shí)間點(diǎn)和就成套 藥盒任何部分而言時(shí)間間隔相等或不等?？膳c本發(fā)明的ALKi和CDKi組合聯(lián)用的可引用的化 合物的非限制性示例包括細(xì)胞毒性化療藥物，如阿那曲挫、鹽酸多柔比星、氣他胺、地塞米 松、多西他賽、順銷、紫杉醇等。
[017引藥盒
[0179] 本發(fā)明設(shè)及包括W下的藥盒:選自化合物A1-A3或其藥學(xué)上可接受鹽的第一化合 物，化合物B或其藥學(xué)上可接受鹽，W及包括治療增殖性疾病指南的包裝說明書或其他標(biāo) 簽。
[0180] 本發(fā)明還設(shè)及包括W下的藥盒:選自化合物A1-A3的第一化合物或其藥學(xué)上可接 受鹽，和包裝說明書或其他標(biāo)簽，包括通過共施用化合物B或其藥學(xué)上可接受鹽來治療增殖 性疾病的指南。
[0181] 實(shí)施例
[0182] 下列實(shí)施例闡明上述發(fā)明；但不意在W任何方式限制發(fā)明范圍。本發(fā)明藥物組合 的有益效果還能由相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它測(cè)試模型確定。
[0183] 實(shí)施例A:基于Loewe加和模型通過高通量篩選鑒定協(xié)同組合
[0184] 用化alice軟件[CombinatoRx,馬薩諸塞州劍橋]基于Loewe加和模型評(píng)價(jià)藥物組 合的協(xié)同相互作用。參見Leh紅J,Krueger AS,Avery W等.，2009,《協(xié)同藥物組合趨向于提 高'治療相關(guān)選擇 t生》（Synergistic drug combinations tend to improve therapeutically relevant selectivity),化t Biotechnol.27:659-66。所述軟件針對(duì)藥 物自身劑量加和參照模型化oewe加和模型），比較兩種藥劑組合的藥物治療反應(yīng)(細(xì)胞活力 的％抑制或％降低）與單獨(dú)作用藥劑的反應(yīng)。劑量加和的偏差能通過定量組合效應(yīng)的總強(qiáng) 度的"協(xié)同得分"用數(shù)值評(píng)價(jià)。協(xié)同得分〉〇指示協(xié)同組合。為確保僅選擇強(qiáng)協(xié)同組合，接受準(zhǔn) 則設(shè)為更高水平。強(qiáng)協(xié)同組合定義為協(xié)同得分〉2和最大功效>100,前者是背景(非協(xié)同）模 型所預(yù)測(cè)2倍的協(xié)同得分，后者是等于如生長抑制計(jì)算所測(cè)定的靜態(tài)的值。
[0185] W下20個(gè)廣泛鑒定的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（表1)用化合物A1、A2、A3和B獨(dú)立處 理，W及用W下組合處理：
[0186] (1)化合物A1與化合物B;
[0187] (2)化合物A2與化合物B;和
[0188] (3)化合物A3與化合物B。
[0189] 治療后，通過下文測(cè)定部分所述C細(xì)Tit知-Glo敏（CTG)發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)(普洛麥 格(Promega))測(cè)定各試驗(yàn)混合物的細(xì)胞活力（活細(xì)胞的量）。20個(gè)細(xì)胞系中的15個(gè)產(chǎn)生高質(zhì) 量初篩數(shù)據(jù)，其他5個(gè)細(xì)胞系無法生長或所得數(shù)據(jù)噪聲過大因而不納入分析。用化alice軟 件[CombinatoRx，馬薩諸塞州劍橋]分析治療反應(yīng)（％細(xì)胞活力降低）。用Microsoft Excel 軟件和化alice軟件實(shí)施數(shù)據(jù)評(píng)估和圖形生成。
[0190] 3個(gè)試驗(yàn)組合的協(xié)同得分列表示于表2和表3。在LANUF117化）、LAN5(R1275Q)、NB- 1643(R1275Q)、NB-SD(F117化)和NB-1691(WT)細(xì)胞中觀察到A1與B組合的協(xié)同性。應(yīng)注意共 同治療在LAN-5細(xì)胞中協(xié)同性尤為顯著。在Kelly(F117A)、LAN-5(R1275Q)、SK-N-BE(2) (WT)和NB-1691 (WT)中觀察到A2與B組合的協(xié)同性?；衔顰2自交組合在NB-1 (ALK擴(kuò)增的） 細(xì)胞系中也被鑒定為有協(xié)同作用，運(yùn)可能是由于該化合物在此細(xì)胞系中的有效單藥劑活 性。在任何試驗(yàn)細(xì)胞系中都沒有觀察到A3與B組合的協(xié)同性。
[0191] 表2.Alx B組合在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的協(xié)同得分
[0192]
[0193] 根據(jù)組合的協(xié)同得分〉2和最大組合效應(yīng)>100, W粗體顯示的值鑒定為協(xié)同相互作 用。
[0194]
[01巧]藥物治療的效果由化alice矩陣證明。圖2顯示LAN-1細(xì)胞的畑alice劑量矩陣和 Loewe(ADD)過量抑制，所述LAN-1細(xì)胞用化合物A1和B的組合(頂行）、化合物A自交（中間行） 及化合物B自交(底行)處理。通過藥物治療的％抑制(細(xì)胞活力降低)記錄于劑量矩陣（左） 的數(shù)據(jù)塊;單藥劑治療在最左列和底行，組合在剩余的6x6組合數(shù)據(jù)塊中。Loewe過量矩陣報(bào) 告了劑量矩陣數(shù)據(jù)與Loewe模型所產(chǎn)生的預(yù)期抑制值之間的差異。在此過量抑制矩陣中，協(xié) 同性定義為值〉〇;即抑制大于簡(jiǎn)單加和相互作用所預(yù)期。括抗作用定義為值<0;即抑制大于 簡(jiǎn)單加和相互作用所預(yù)期。考慮矩陣內(nèi)的全部6x6組合數(shù)據(jù)塊，計(jì)算藥物治療的協(xié)同得分。 化合物Alx B、化合物AlxAl和化合物BxB在Lan-1細(xì)胞中的所得協(xié)同得分各為2.26、1.01和 1.32dA1xB組合在Lan-1細(xì)胞中有協(xié)同作用。
[0196] 表2和3所列協(xié)同得分的統(tǒng)計(jì)變異由箱線圖直觀說明（圖3)。僅納入來自3種ALK抑 審IJ劑中兩種的數(shù)據(jù)；如此圖所用，ALK抑制劑指化合物A1或化合物A2，CDK4/6抑制劑指化合 物B。在ALK疾病細(xì)胞中，ALKxCDK4/6組合具有強(qiáng)協(xié)同作用，協(xié)同得分為2.26且標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.9dALK X ALK和CDK4/6 X CDK4/6組合具有中等協(xié)同作用，協(xié)同得分各為1.011(sd = 0.4) 和1.16(sd = 0.43)。在ALK正常細(xì)胞中，組合和自交治療不具有協(xié)同作用，協(xié)同得分為約 0.5,但標(biāo)準(zhǔn)偏差差不多大。
[0197] 為了可視鑒別強(qiáng)協(xié)同組合物，表2和3的數(shù)據(jù)W散點(diǎn)圖（圖4A-C)呈現(xiàn)，其中最大組 合功效相對(duì)協(xié)同得分作圖。僅納入來自巧巾ALK抑制劑中的兩種即化合物A1和A2的數(shù)據(jù)。散 點(diǎn)圖中，垂直移動(dòng)指示相加效應(yīng);右移指示協(xié)同相互作用且對(duì)角線移動(dòng)指示功效增強(qiáng)的協(xié) 同性。協(xié)同組合命中是右上象限中協(xié)同得分〉2且最大功效>100的那些。相比ALK正常細(xì)胞 系，兩種ALK抑制劑(化合物A1和A2)顯示對(duì)ALK疾病細(xì)胞系的優(yōu)選單藥劑功效（圖4A)。CDK抑 制劑(化合物B)顯示在2個(gè)疾病細(xì)胞系和1個(gè)正常細(xì)胞系中的單藥劑功效(〉100)(圖4B)dALK 與CDK4/6抑制劑的組合產(chǎn)生相互作用，在所測(cè)試15個(gè)細(xì)胞系的7個(gè)中引起協(xié)同性和功效增 加，并在ALK疾病細(xì)胞中優(yōu)選。
[0198] 所述結(jié)果支持ALK抑制劑與CDK抑制劑的組合在治療ALK陽性癌(特別是神經(jīng)母細(xì) 胞瘤）中的應(yīng)用。
[0199] 實(shí)施例B:基于化ou-Talalay模型測(cè)定組合藥物效應(yīng)
[0200] ALK和CDK4/6抑制劑組合的聯(lián)合藥物效應(yīng)使用CalcuSyn v2軟件(Biosoft，英國劍 橋），用Qiou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法(Trends Pharmacol Sci 4,450-454)定量。
[0201] 選擇4個(gè)廣泛鑒定的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系NB1643(R1275Q)、SHSY5Y(F117A)、 NB169UWT)和抓Cl(WT)用于研究。所述細(xì)胞系W組合形式采用恒定均等比例一式Ξ份給 藥，其中組合伴侶化合物A1和化合物BW其個(gè)體IC50劑量的4^、2^、1^、1/2和1/4與各化合物 單獨(dú)組合。用xCE化igence系統(tǒng)測(cè)量兩種組合伴侶（首先單獨(dú)隨后組合)抗增殖效果的濃度 依賴性。各治療的CI通過化IcuSyn v2軟件(Biosoft，英國劍橋)計(jì)算。
[0202] 表巧良告了 ALK突變細(xì)胞系NB1643(R1275Q)的CI。應(yīng)理解0.9-1.1的(：1指示加和相 互作用，小于0.9的值指示協(xié)同作用，大于1.1的值指示括抗作用。數(shù)據(jù)顯示除了2個(gè)W外的 所有測(cè)試組合的CI小于0.9;因此，化合物A與化合物B的試驗(yàn)組合具有協(xié)同作用。
[0203] 表5.來自實(shí)驗(yàn)值的NB1643細(xì)胞的CI
[0204]
[0205]
[0206] 圖6A-D描繪AlxB組合在NB-1643細(xì)胞中的聯(lián)合藥物效應(yīng)。對(duì)運(yùn)些圖的解釋參見圖 5A-加和下文測(cè)定部分。各圖直觀顯示化合物A1與B的組合在NB-1643細(xì)胞中表現(xiàn)出協(xié)同效 應(yīng)。特別地，F(xiàn)a-CI圖（圖6C和D)顯示所有測(cè)試組合的CI遠(yuǎn)低于1(加和）。此外，等效線圖（圖 6E)顯示共同治療的邸90和邸75劑量遠(yuǎn)低于其各自等效線圖。
[0207] 協(xié)同組合的眾多優(yōu)勢(shì)之一是能用更少量藥物或更低的施用頻率來實(shí)現(xiàn)相同功效， 副作用減少。劑量降低指數(shù)(DRI，化OU和化OU，1988)可從實(shí)驗(yàn)值或計(jì)算估計(jì)。對(duì)于NB1643細(xì) 胞，來自實(shí)驗(yàn)值的劑量降低指數(shù)(DRI)示于表6，來自計(jì)算的示于表7。
[020引表6.化合物A1和B共同治療NB1643細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)值的DRI
[0209]
[0211]
[0210] 表7.化合物A1和B共同治療NB1643細(xì)胞的計(jì)算值的DRI
[0212]
[0213] 化合物A1與B的組合在甜SY5Y(F1174L)細(xì)胞中的效果示于表8。數(shù)據(jù)顯示所述組合 在低到中等濃度具有中等協(xié)同作用，而在高濃度有括抗作用。
[0214] 表8.實(shí)驗(yàn)值的甜SY5Y細(xì)胞的CI
[0215]
[0216] 圖7A-F標(biāo)繪化合物A1與B的組合在細(xì)SY5Y(F117化)細(xì)胞中的效果。所述圖直觀顯 示該組合具有輕微到中等協(xié)同作用;Fa-CI圖（圖7C)中的CI值略低于1，抓90濃度僅高于抓90 等效線圖。
[0217]圖8A-F標(biāo)繪化合物A1與B的組合在NB169UWT)細(xì)胞中的效果?；?CI圖（圖8C)顯示 CI在化合物濃度較低時(shí)小于1且在化合物濃度較高時(shí)大于1，表明藥物組合在低濃度范圍具 有協(xié)同作用而在較高濃度范圍具有加和或輕微括抗作用。該解釋由等效線圖（圖8E)支持， 顯示邸50和邸75組合有協(xié)同性，但抓90組合有括抗性。
[0218]化合物A1與B的組合在N邸DCl(WT)細(xì)胞中的效果示于表9。數(shù)據(jù)顯示所述組合在低 到中等濃度具有中等協(xié)同到協(xié)同作用，在高濃度有極強(qiáng)協(xié)同作用。
[0219] 表9.實(shí)驗(yàn)值的NB-EBC1細(xì)胞的CI
[0220]
[0221] 圖9A-F標(biāo)繪化合物A1與B的組合在NB抓Cl(WT)細(xì)胞中的效果。Fa-CI圖（圖9C)顯 示CI都低于1，表明該藥物組合在所測(cè)試濃度范圍中具有協(xié)同作用。此解釋由等效線圖（圖 犯)支持，顯示邸50、邸75和抓90組合都有協(xié)同性。
[0222] 根據(jù)化ou-Talalay聯(lián)合指數(shù)模型，上述數(shù)據(jù)證明ALK抑制劑(化合物A1)與CDK抑制 劑(化合物B)的組合在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中具有協(xié)同作用。ALK陽性細(xì)胞系和野生型細(xì)胞系 中都呈現(xiàn)協(xié)同性。
[0223] 實(shí)施例C:共同治療對(duì)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞死亡的效果
[0224] 本發(fā)明組合的協(xié)同抗增殖效果通過光學(xué)顯微鏡呈現(xiàn)。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y (F1174L)細(xì)胞用W下處理：各為IC50濃度的化合物A1和B，W及其中各化合物濃度為IC50的 化合物A1與B的組合。治療后72小時(shí)，通過光學(xué)顯微鏡比較處理過的樣品與未處理樣品（載 劑）并記錄于顯微照片（圖10A-D)。相比未處理樣品（圖10A)，由化合物A1單獨(dú)處理的樣品 (圖10B)顯示完整細(xì)胞數(shù)顯著降低。由化合物B單獨(dú)處理的樣品（圖10C)顯示對(duì)細(xì)胞數(shù)和細(xì) 胞形態(tài)影響甚微。由化合物A1與B組合（圖10D)處理的樣品顯示幾乎沒有完整細(xì)胞。運(yùn)些顯 微照片清楚地證明相較獨(dú)立的單一化合物治療，本發(fā)明組合在提高細(xì)胞死亡中的協(xié)同性。
[0225] 實(shí)施例D:共同治療對(duì)細(xì)胞死亡的效果
[0226] 本發(fā)明組合顯示增強(qiáng)細(xì)胞死亡的協(xié)同效應(yīng)，但細(xì)胞調(diào)亡沒有。本發(fā)明組合治療對(duì) 細(xì)胞活力和細(xì)胞調(diào)亡的效果使用ApoTox-GloTMS重檢測(cè)在3個(gè)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系： NB1643(R1275Q)、SH-SY5Y(F117化)和邸C1(WT)中評(píng)估。為了確認(rèn)，對(duì)細(xì)胞活力的治療效果 也使用CellTiter-Glo(CTG)發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)在NB1643(R1275Q)中評(píng)估。所述檢測(cè)如下文 所述。
[0227] 用DMS0載劑、化合物A1和化合物B(獨(dú)立，與用于聯(lián)合治療的劑量相同）W及化合物 A1和B組合(恒定均分比組合，為各藥劑IC50值的1/4、1/2、1、2和4倍)對(duì)細(xì)胞系一式立份給 藥?；衔顰1和化合物B的IC5G分別預(yù)先測(cè)定為222nM和749.5nM。給藥后72小時(shí)評(píng)估試驗(yàn)混 合物，圖11A-C、12A-C、13A-C和14A-C標(biāo)繪結(jié)果。
[0。引圖11A、11B和11C顯示對(duì)NB1643細(xì)胞活力和細(xì)胞調(diào)亡的效果。細(xì)胞活力和細(xì)胞調(diào)亡 表示為針對(duì)化合物濃度的倍數(shù)分?jǐn)?shù)變化。數(shù)據(jù)顯示單獨(dú)化合物A1(圖11A)或組合(圖11c)有 效導(dǎo)致細(xì)胞死亡和細(xì)胞調(diào)亡，單獨(dú)化合物B(圖11B)僅略微有效。比較特定劑量的化合物A1 單獨(dú)和組合時(shí)的反應(yīng)（圖11C)，數(shù)據(jù)顯示共同治療顯著增強(qiáng)細(xì)胞死亡，但觀察到相同水平的 細(xì)胞調(diào)亡。
[0229] 所述共同治療顯著增強(qiáng)細(xì)胞死亡的發(fā)現(xiàn)通過CTG檢測(cè)經(jīng)處理的NB1643細(xì)胞單獨(dú)確 認(rèn)。在特定劑量點(diǎn)，聯(lián)合治療（圖12C)相較單藥劑治療（圖12A和B)顯著增強(qiáng)細(xì)胞死亡。
[0230] 圖13A-C顯示治療甜SY5Y(F1174L)細(xì)胞的效果。相較單藥劑治療（圖13A和B)，聯(lián)合 治療（圖13C)再次顯示對(duì)細(xì)胞活力的協(xié)同效應(yīng)，但在低化合物濃度的細(xì)胞調(diào)亡水平相同。應(yīng) 指出細(xì)胞在更高濃度下死亡更早，因而細(xì)胞調(diào)亡無法測(cè)出且未評(píng)價(jià)。
[0231] 圖14A-C顯示藥物治療EBCl(WT)細(xì)胞的效果。用化合物A1單獨(dú)（圖14A)或共同治療 (圖14C)處理細(xì)胞時(shí)，觀察到相同的細(xì)胞死亡水平。所述組合對(duì)邸C1細(xì)胞沒有協(xié)同效應(yīng)。
[0232] 此研究證明本發(fā)明組合，尤其是化合物A1與化合物B的組合，在ALK陽性神經(jīng)母細(xì) 胞瘤細(xì)胞中具有協(xié)同抗增殖效果。本發(fā)明組合用于治療ALK陽性增殖性疾病，尤其是ALK陽 性神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0233] 實(shí)施例E:共同治療大幅降低pALK和P肺蛋白表達(dá)
[0234] pALK和pRb分別是ALK和CDK活化的生物標(biāo)記物。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（肺)是腫瘤 抑制蛋白，其通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程來防止過度細(xì)胞生長。通過多種機(jī)制依賴于活化cdk4 或C化6的細(xì)胞增殖應(yīng)該顯示憐酸化Rb蛋白（pRB)增加；抑制CDK導(dǎo)致pRb減少和細(xì)胞周期停 滯。抑制ALK降低ALK憐酸化(pALK)表達(dá);pALK減少導(dǎo)致伴有細(xì)胞調(diào)亡最后終點(diǎn)的增殖減少。
[0235] 蛋白質(zhì)印跡用于測(cè)定藥物治療在ALK+和野生型神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中對(duì)總Rb蛋白 和憐酸化Rb蛋白W及總ALK和憐酸化ALK含量的效果，并使運(yùn)些數(shù)據(jù)與采用IC50分?jǐn)?shù)的化合 物劑量相關(guān)聯(lián)。選擇ALK+細(xì)胞系NB1643(R1275Q)和野生型細(xì)胞系邸C1用于研究。
[0236] NB1643(R1275Q)細(xì)胞用單獨(dú)和組合的化合物A1及化合物B處理，所述組合的恒定 均分比為各化合物IC50濃度的1/16、1/8、1/4和4倍。制備經(jīng)載劑和無化合物處理的樣品并用 作對(duì)照。治療后20小時(shí)分析細(xì)胞混合物。
[0237] 邸Cl(WT)細(xì)胞用單獨(dú)和組合的化合物A1及化合物B處理，所述組合的恒定均分比 為各化合物IC50濃度的1/4、1/2、1和4倍。制備經(jīng)載劑和無化合物處理的樣品并用作對(duì)照。治 療后72小時(shí)分析細(xì)胞混合物。
[023引圖15顯示經(jīng)處理的NB1643細(xì)胞的總ALK(tALK)和pALK狀態(tài)。數(shù)據(jù)顯示單獨(dú)或組合 治療在劑量范圍中對(duì)總ALK的影響很小。通過單獨(dú)或組合藥劑治療可降低起始于1/16倍IC50 劑量的pALK蛋白的量;然而，組合治療產(chǎn)生更顯著的減少效果。應(yīng)進(jìn)一步指出減少程度取決 于憐酸化位置。酪氨酸1604密碼子處的憐酸化pALK顯示減少多于酪氨酸1278密碼子處的憐 酸化pALK。
[0239] 圖16顯示經(jīng)處理NB1643細(xì)胞的總Rb和pRb狀態(tài)。通過單獨(dú)或組合的兩種藥劑治療 可降低總Rb和pRb蛋白表達(dá)。聯(lián)合治療的降低更大。治療效果也取決于憐酸化位置，pRB S795的治療效果顯著高于P肺S780。
[0240] 圖17顯示經(jīng)處理的EBCl(WT)細(xì)胞的總和pALK狀態(tài)W及總和pRb狀態(tài)。印跡顯示共 同治療有效減少pALK和pRb蛋白表達(dá)。
[0241] 上述研究確鑿地證明了共同治療減少pALK和pRb蛋白表達(dá)。相較獨(dú)立的單藥劑治 療，共同治療的效果增強(qiáng)。因此，本發(fā)明組合在ALK+和野生型細(xì)胞中表現(xiàn)出協(xié)同性。
[0242] 實(shí)施例F:共同治療在CB17SCID小鼠中提高針對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療效果
[0243] 在CB17SCID小鼠中針對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤甜-SY5Y(攜帶F117化ALK突變)異種移植 體內(nèi)進(jìn)行功效增強(qiáng)研究。小鼠分成4個(gè)研究組：
[0244] 1)僅用溶劑載劑處理的對(duì)照組；
[0245] 2)僅用50mg/kg劑量化合物A1經(jīng)口服灌胃，0D處理的組(所述劑量先前顯示在此小 鼠模型中無效）；
[0246] 3)僅用250mg/kg化合物B處理并從第5天開始減少（為了降低毒性)至187.5mg/kg 的組。治療安排為經(jīng)口服灌胃，0D，和
[0247] 4)用藥物組合(50mg/kg化合物A1和250mg/kg并在第5天減少到187.5mg/kg的化合 物B)處理的組。
[0248] 此研究結(jié)果示于圖18、19A-D和20。
[0249] 在用化合物A1與化合物B組合處理的組4小鼠中，腫瘤體積顯示相對(duì)于其他組的明 顯下降（圖18)。當(dāng)測(cè)試組中各試驗(yàn)小鼠的腫瘤體積針對(duì)時(shí)間作圖（圖19A-19D)時(shí)，顯示組4 (共同治療）小鼠中的腫瘤體積隨著時(shí)間而減少；而所有其他組中腫瘤體積隨著時(shí)間而增 加。圖20顯示試驗(yàn)小鼠隨著時(shí)間的％存活。組4中，2只小鼠在第7天死亡，剩余的在整個(gè)治療 期內(nèi)存活。組3(用單獨(dú)化合物B處理）中，1只小鼠在第14天死亡，剩余的在整個(gè)治療期內(nèi)存 活。在組1和2的小鼠中，腫瘤生長過大，分別在第11/2和3周處死小鼠。
[0250] 結(jié)果證明針對(duì)人SY5Y NB異種移植所實(shí)現(xiàn)的功效，聯(lián)合治療大于各藥物單獨(dú)治療。 令人難忘地，用50mg/kg藥理相關(guān)劑量的化合物A1與B組合治療荷NB SY5Y腫瘤的SCID小鼠 (先前顯示不響應(yīng)單獨(dú)ALK抑制劑治療），引起已建立腫瘤收縮并實(shí)現(xiàn)總體腫瘤消退，而 50mg/kg單獨(dú)化合物A1治療相較該SY5Y異種移植模型的載劑對(duì)照僅引起輕微腫瘤生長延 遲。
[0251] 實(shí)施例G:在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中篩選化合物A1與B的強(qiáng)協(xié)同相互作用。
[0252] 為鑒定神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的強(qiáng)協(xié)同組合物，針對(duì)一組16個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 系測(cè)試化合物A1與B的組合，其中10個(gè)攜帶活化ALK突變或擴(kuò)增(表10)。如下文測(cè)定部分所 述，所述組合用帶細(xì)胞增殖讀數(shù)的1536孔模式中的7 X 7劑量矩陣塊一式二份檢測(cè)?；衔?A1和B自身組合W測(cè)定試驗(yàn)噪聲對(duì)預(yù)期劑量加和相互作用的協(xié)同評(píng)價(jià)參數(shù)的影響。同樣用 NCI法計(jì)算評(píng)價(jià)化合物加入時(shí)的細(xì)胞數(shù)/活力，用于確定試驗(yàn)內(nèi)觀察到的最大生長抑制。
[0253] 所有協(xié)同性計(jì)算用來自Zalicus的CHALICE軟件包進(jìn)行，化合物組合間的潛在協(xié)同 相互作用根據(jù)Loewe加和模型所述的過量抑制2D矩陣評(píng)估并W協(xié)同得分報(bào)告(表lOKLeh紅 等）。強(qiáng)協(xié)同組合鑒定為具有（1)協(xié)同得分大于2,協(xié)同得分為背景(非協(xié)同）模型所預(yù)測(cè)的2 倍和(2)從生長抑制計(jì)算所測(cè)定的最大功效>100,即大致等同于靜態(tài)的值。所有評(píng)價(jià)組合的 藥物效果示于散點(diǎn)圖（圖21)。觀察到化合物A1自交治療(頂部)對(duì)ALK疾病細(xì)胞系亞組的單 藥劑功效優(yōu)于ALK WT細(xì)胞系?；衔顱自交治療（中間）顯示在任何所測(cè)試細(xì)胞系中沒有單 藥劑功效。用化合物A1和化合物B共同治療(底部)產(chǎn)生相互作用，在16個(gè)所測(cè)試細(xì)胞系的3 個(gè)中引起協(xié)同性和功效增加，并且在ALK疾病細(xì)胞系中優(yōu)選。
[0254] 表10.化合物A1與化合物B組合在16個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的協(xié)同得分和最大 組合功效
[ο 巧5]
[Ο 巧 6]
[Ο巧7] *協(xié)同相互作用。
[025引實(shí)施例H:ALK抑制劑和CDK4/6抑制劑共同治療在Kelly神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的劑 量效果。
[0259] 研究ALK抑制劑(化合物A1或A2)和CDK4/6抑制劑(化合物B)共同治療在Ke 1 ly神經(jīng) 母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的劑量效果。所述試驗(yàn)作為更大規(guī)模篩選的部分進(jìn)行。Kel ly細(xì)胞獲自諾華 (Novadis)細(xì)胞庫，并用化合物A1與BW及化合物A2與B的組合處理。除了用9 X 9劑量矩陣 替代，所述試驗(yàn)如下文測(cè)定部分所述。組合用9 X 9劑量矩陣塊一式二份檢測(cè)。單藥劑在最 左列和底行中給藥，剩余8x8組合塊用3倍連續(xù)稀釋系列化合物給藥，其中用于化合物A1、A2 和B的儲(chǔ)液最高濃度分別是1.67mM、5mM和5mM。細(xì)胞抑制讀數(shù)如下文測(cè)試部分所述。數(shù)據(jù)分 析用CHALICE軟件進(jìn)行，化合物組合間的潛在協(xié)同相互作用根據(jù)Loewe加和模型評(píng)價(jià)并報(bào)告 為協(xié)同得分。同樣評(píng)價(jià)化合物加入時(shí)的細(xì)胞數(shù)/活力，并用NCI法計(jì)算用于測(cè)定試驗(yàn)內(nèi)觀察 到的最大生長抑制。結(jié)果列于表11并直觀示于圖22A和22B。
[0260] 表11.化合物A1與B組合W及化合物A2與B在Kelly(ALK+F1174L)細(xì)胞中的協(xié)同得 分和最大組合功效
[0%1]組合 協(xié)同得分最大功效
[0%2] A1+B 1.75 70.7
[0%3] A 化B 1.48 74.5
[0264]任一 ALK抑制劑與CDK抑制劑的組合有效抑制Kelly細(xì)胞增殖，尤其是在較高化合 物濃度下。協(xié)同得分中等，但等效線圖指示極強(qiáng)相互作用。
[0265] 實(shí)施例1:ALK抑制劑和CDK4/6抑制劑共同治療在Kelly和NB-1神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 中的劑量效果。
[0266] 研究ALK抑制劑(化合物A1或B)和CDK4/6抑制劑(化合物B)共同治療在Kelly(ALK +、Amp和F117化)和NB-l(ALK+、Amp)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的劑量效果。進(jìn)行試驗(yàn)W確認(rèn)W上 實(shí)施例Η的結(jié)果。Kelly細(xì)胞和NB-1細(xì)胞獲自諾華細(xì)胞庫，并用化合物A1與BW及化合物A2與 B的組合處理。此實(shí)驗(yàn)中，組合一式二份用9 X 9劑量矩陣塊檢測(cè)，其中組合塊用3倍連續(xù)稀 釋系列施用?；衔顰1、A2和B用于Kelly細(xì)胞的儲(chǔ)液最高濃度各是5mM。化合物A1、A2和B用 于NB-1細(xì)胞的儲(chǔ)液最高濃度分別是0.56mM、0.56mM和5mM。細(xì)胞抑制讀數(shù)如下文測(cè)定部分所 述。數(shù)據(jù)分析用CHALICE軟件進(jìn)行，化合物組合間的潛在協(xié)同相互作用根據(jù)Loewe加和模型 評(píng)價(jià)并報(bào)告為協(xié)同得分。同樣評(píng)價(jià)化合物加入時(shí)的細(xì)胞數(shù)/活力，并用NCI計(jì)算法用于測(cè)定 試驗(yàn)內(nèi)觀察到的最大生長抑制。由于化合物轉(zhuǎn)移中跳過的孔，未給藥塊的結(jié)果不納入?yún)f(xié)同 得分和最大組合功效的計(jì)算。結(jié)果列于表12并直觀示于圖23A、23B、23C、23D。 惦67] 表12.化合物A1與B組合W及化合物A2與B在Kelly(ALrF117化)和NB-l細(xì)胞中的 協(xié)同得分和最大組合功效
[0%引
[0269] 任一 ALK抑制劑與CDK抑制劑的組合有效抑制Kelly細(xì)胞增殖，且藥物相互作用具 有強(qiáng)協(xié)同性。
[0270] 任一 ALK抑制劑與CDK抑制劑的組合對(duì)抑制NB-1細(xì)胞增殖無效，且所述組合不具有 協(xié)同性。
[0271] 實(shí)施例J:ALK抑制劑和CDK4/6抑制劑共同治療在Kelly、NB-l和甜-SY5巧巾經(jīng)母細(xì) 胞瘤細(xì)胞中的劑量效果。
[0272] 用不同濃度的藥物化合物重復(fù)實(shí)驗(yàn)W測(cè)定ALK抑制劑(化合物A1或A2)和CDK4/6抑 審lJ劑(化合物B)共同治療在Kelly(ALK+、Amp和F117化）、NB-l(ALK+、Amp)中的劑量效果；SH- SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞也納入實(shí)驗(yàn)。所有巧巾細(xì)胞系獲自諾華細(xì)胞庫或ATCC。
[0273] 細(xì)胞用化合物A1與BW及化合物A2與B的組合處理。此實(shí)驗(yàn)中，組合用9 X 9劑量矩 陣塊一式二份檢測(cè)，其中組合塊用3倍連續(xù)稀釋系列給藥。化合物A1、A2和B用于Kelly細(xì)胞 的儲(chǔ)液最高濃度各是2.5mM。化合物A1、A2和B用于NB-1細(xì)胞的儲(chǔ)液最高濃度分別是0.28mM、 0.28mM和2.5mM?；衔顰1、A2和B用于SH-SY5Y細(xì)胞的儲(chǔ)液最高濃度各是2.5mM。細(xì)胞抑制讀 數(shù)如下文測(cè)定部分所述。數(shù)據(jù)分析用CHALICE軟件進(jìn)行，化合物組合間的潛在協(xié)同相互作用 根據(jù)Loewe加和模型評(píng)價(jià)并報(bào)告為協(xié)同得分。同樣評(píng)價(jià)化合物加入時(shí)的細(xì)胞數(shù)/活力，并用 NCI計(jì)算法用于測(cè)定試驗(yàn)內(nèi)觀察到的最大生長抑制。
[0274] 觀察到數(shù)據(jù)質(zhì)量問題。Kelly細(xì)胞中對(duì)A1和A2的單藥劑劑量反應(yīng)相較實(shí)施例1低于 預(yù)期。較低給藥濃度可能引起協(xié)同得分低;但其他因素如化合物鹽析或細(xì)胞系不穩(wěn)定也能 起作用。未測(cè)定此實(shí)驗(yàn)中組合的最大組合功效。Kelly和NB-1細(xì)胞系的協(xié)同得分列于表13且 治療的劑量效果直觀示于圖24A-D"SH-SY5Y細(xì)胞系的數(shù)據(jù)質(zhì)量問題更嚴(yán)重，使得解釋數(shù)據(jù) 困難(圖24E和24巧。未測(cè)定此細(xì)胞系的協(xié)同得分。
[0275] 表13.化合物A1與B組合W及化合物A2與B在Kelly(ALrF117化)和NB-l細(xì)胞中的 協(xié)同得分和最大組合功效
[0276]
[0277] ND表示未測(cè)定
[0278] A1 X B和A2 X B組合的協(xié)同得分為低到中等，低于強(qiáng)協(xié)同組合的標(biāo)準(zhǔn)(協(xié)同得分〉 2)。任一ALK抑制劑與CDK抑制劑的組合在NB-1細(xì)胞中不具有協(xié)同性。應(yīng)理解由于觀察到的 數(shù)據(jù)問題，數(shù)據(jù)可能是不可靠的。
[0279] 列舉的實(shí)施方式
[0280] 本文描述本發(fā)明的多個(gè)列舉實(shí)施方式。應(yīng)認(rèn)識(shí)到各實(shí)施方式指定的特征可聯(lián)合其 他指定特征W提供更多的本發(fā)明實(shí)施方式。
[0281] 實(shí)施方式1.此實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分開或共同包括W下的藥物組合：（1)第一 藥劑，其是間變性淋己瘤激酶(ALK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽和(2)第二藥劑，其是周期 蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽。
[0282] 實(shí)施方式2.如實(shí)施方式1所述的藥物組合，其中所述ALK抑制劑是下式A1描述的化 合物A1:
[0283]
[0284] 實(shí)施方式3.如實(shí)施方式1所述的藥物組合，其中所述ALK抑制劑是下式A2描述的化 合物A2:
[0285]
[0286] 實(shí)施方式4.如實(shí)施方式1-3中任一項(xiàng)所述的藥物組合，其中所述CDK抑制劑是CDK4 或CDK巧Φ制劑。
[0287] 實(shí)施方式5.如實(shí)施方式1-3中任一項(xiàng)所述的藥物組合，其中所述CDK抑制劑是CDK4 和CDK6雙重抑制劑。
[0288] 實(shí)施方式6.如實(shí)施方式1-5中任一項(xiàng)所述的藥物組合，其中所述CDK抑制劑是下式 B1描述的化合物B:
[0289]
[0290] 實(shí)施方式7.如實(shí)施方式1所述的藥物組合，其中兩種藥劑選自：
[0291] 化合物A1和化合物B;和
[0292] 化合物A2和化合物B。
[0293] 實(shí)施方式8.本發(fā)明還設(shè)及含實(shí)施方式1-7中任一項(xiàng)所述藥物組合和至少一種賦形 劑的藥物組合物。
[0294] 實(shí)施方式9.本發(fā)明還設(shè)及治療細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向需要的對(duì) 象施用聯(lián)合治療有效量的實(shí)施方式1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合或?qū)嵤┓绞?所述的藥物 組合物。
[02M]實(shí)施方式10.如實(shí)施方式9所述的方法，其中所述第一藥劑和第二藥劑共同、獨(dú)立 或依序施用。
[0296] 實(shí)施方式11.如實(shí)施方式9和實(shí)施方式10所述的方法，其中所述細(xì)胞增殖性疾病是 ALK陽性癌。
[0297] 實(shí)施方式12.如實(shí)施方式11所述的方法，其中所述癌依賴于ALK基因突變。
[0298] 實(shí)施方式13.如實(shí)施方式11所述的方法，其中所述癌依賴于ALK基因擴(kuò)增。
[0299] 實(shí)施方式14.如實(shí)施方式11-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述癌選自淋己瘤、骨 肉瘤、黑素瘤、乳腺瘤、腎癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、卵巢癌、膜腺癌、神經(jīng)元癌、 肺癌、子宮癌或胃腸道腫瘤、炎性乳腺癌、間變性大細(xì)胞淋己瘤、非小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì) 胞瘤。
[0300] 實(shí)施方式15.如實(shí)施方式14所述的方法，其中所述癌是神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
[0301] 實(shí)施方式16.如實(shí)施方式14所述的方法，其中所述癌是間變性大細(xì)胞淋己瘤。
[0302] 實(shí)施方式17.如實(shí)施方式14所述的方法，其中所述癌是非小細(xì)胞肺癌。
[0303] 實(shí)施方式18.如實(shí)施方式14所述的方法，其中所述癌是炎性乳腺癌。
[0304] 實(shí)施方式19.本發(fā)明還設(shè)及實(shí)施方式1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合W用于治療增 殖性疾病。
[0305] 實(shí)施方式20.本發(fā)明還設(shè)及實(shí)施方式1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合或?qū)嵤┓绞?所 述的藥物組合物在制備治療增殖性疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0306] 實(shí)施方式21.本發(fā)明還設(shè)及藥盒，包括實(shí)施方式1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合或?qū)?施方式8所述的藥物組合物W及提供治療增殖性疾病說明的包裝說明書或其他標(biāo)簽。
[0307] 測(cè)定
[0308] 制備ALK和CDK抑制劑
[0309] 本文公開的化合物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過普通化學(xué)合成。
[0310] 化合物A1即5-氯-N2-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(贓晚-4-基）苯基)-N4-[2-(丙烷- 2-橫酷)-苯基]-喀晚-2,4-二胺被W02010/020675的實(shí)施例66具體公開，并通過其中所述合 成過程制備。
[03川化合物A2即N6-(2-異丙氧基-5-甲基-4-(1-甲基贓晚-4-基）苯基)-N4-(2-(異丙 基橫酷)苯基)-lH-化挫并[3,4-d]喀晚-4,6-二胺被W02010/020675的實(shí)施例231具體公開， 并通過其中所述合成過程制備。
[0312] 化合物A3通常稱為克挫替尼，商品名為XALKO民瞄，由輝瑞公司（Pfizer Co巧） 銷售并且市售可得。
[0313] 化合物B即7-環(huán)戊基-N，N-二甲基-2-((5-(贓嗦-1-基)郵晚-2-基)氨基)-7H-郵咯 并[2,3-d]喀晚-6-甲酯胺被W02010/02067的實(shí)施例74公開，并通過其中所述合成過程制 備。
[0314] 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)
[0315] 用于此研究的細(xì)胞系是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤源性并獲自諾華內(nèi)部細(xì)胞庫、ATCC和/或 費(fèi)城兒童醫(yī)院(CHoP)的兒童腫瘤組參考實(shí)驗(yàn)室。常規(guī)測(cè)試CHoP細(xì)胞系的支原體感染并進(jìn)行 基因分型(Amp化STR identifier集合，生命技術(shù)公司）從而確保完整性和防止交叉污染。另 夕h細(xì)胞系具有Illumina皿550 SNP忍片上測(cè)定的全基因組DNA拷貝數(shù)狀態(tài)和Illumina表 達(dá)忍片上測(cè)定的全基因組外顯子水平的基因表達(dá)。細(xì)胞系可根據(jù)本領(lǐng)域已知的推薦培養(yǎng)基 條件（如化iele,C. J."神經(jīng)母細(xì)胞瘤"（化uroblastoma):收錄于（編)Masters,J.《人細(xì)胞培 養(yǎng)KHuman Cell Culture).英國蘭卡斯特的克呂韋爾學(xué)術(shù)出版公司化luwer Academic Publishers) .1998,卷1，第21-53頁.）維持。特別地，細(xì)胞可在37°C和5%C〇2下維持于含 10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和谷氨酷胺的RPMI-1640培養(yǎng)基?；蛘?，細(xì)胞可冷凍 保存并在使用前重溶。
[0316] 細(xì)胞系被選擇成同樣代表初生組織中的ALK祀狀態(tài):ALK突變陽性，ALK突變陰性但 野生型ALK的基因組擴(kuò)增和過表達(dá)，W及ALK突變陰性和正?？截悢?shù)。ALK突變陽性的細(xì)胞系 代表間變性淋己瘤激酶(ALK)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的3個(gè)獨(dú)特突變。用桑格測(cè)序的外顯子組測(cè) 序確認(rèn)ALK酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中存在突變。此外，鑒定細(xì)胞系的MycN、TP53、ALK、TrldM^TrkB 狀態(tài)，結(jié)果概括于下表1。
[0317] 表1:人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和鑒定
[031 引
[0320] 應(yīng)理解有其他神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系適用于本發(fā)明組合測(cè)試。關(guān)于運(yùn)些細(xì)胞系的信 息可獲自：Thiele CJ.神經(jīng)母細(xì)胞瘤"：收錄于(編)Masters, J.《人細(xì)胞培養(yǎng)》.英國蘭卡 斯特的克呂韋爾學(xué)術(shù)出版公司.1998,卷1，第21-53頁。
[0321] 細(xì)胞活力檢測(cè)
[0322] 細(xì)胞活力通過使用CellTiter-Glo瑕（CTG)發(fā)光法細(xì)胞活力檢測(cè)(普洛麥格)測(cè)量細(xì) 胞ATP含量測(cè)定。將CTG試劑加入經(jīng)試驗(yàn)化合物處理的細(xì)胞，通過酶標(biāo)儀(如Viewlux，巧金埃 爾默(Perkin Elmer))記錄所得發(fā)光。計(jì)算相對(duì)于未處理(對(duì)照）細(xì)胞的降低和提高的發(fā)光 信號(hào)值(反應(yīng)），計(jì)算的信號(hào)值與細(xì)胞活力成比例。
[0323] 鑒定在高通量篩選中基于Loewe加和模型的的協(xié)同治療組合
[0324] 基于Loewe加和模型鑒定協(xié)同組合。為測(cè)量藥物組合對(duì)細(xì)胞活力的效果，將來自上 表1所列20個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞W每孔300個(gè)細(xì)胞的密度、7化的終體積接種于1536孔試驗(yàn)板，在 GNF系統(tǒng)培養(yǎng)箱中于37°C、95%畑和5%C02下解育過夜。
[03巧]在有3倍連續(xù)稀釋系列的384孔EC冊(cè)相容性源板(Labcyte P-05525)中制備試驗(yàn)化 合物的六點(diǎn)劑量反應(yīng)曲線。例如，對(duì)于六點(diǎn)劑量反應(yīng)曲線和5mM的最高化合物濃度，源板中 的化合物濃度為 5mM、1.67mM、0.56mM、0.19mM、0.06mM和 0.02mM。
[03%] 接種后約18小時(shí)，化合物組合如下即刻產(chǎn)生：用整合于ACP-1系統(tǒng)上的Labcyte ECH0555從預(yù)稀釋源板中轉(zhuǎn)移7.5nL化合物，每個(gè)細(xì)胞系有重復(fù)板;每孔的終DMS0濃度是 0.2%。應(yīng)指出孔中的總體積是化L。
[0327]為W無偏方式評(píng)估所有組合的抗增殖活性并鑒定所有可能濃度下的協(xié)同效應(yīng)，在 7巧矩陣(早期實(shí)驗(yàn)中的9x9)孔(塊）中給藥，所述孔(塊)采用六(或8)點(diǎn)連續(xù)稀釋試驗(yàn)劑的 所有可能排列。單藥劑曲線如下產(chǎn)生:在組合塊的第一列（左手)和第一行(底部)的前6個(gè)孔 中獨(dú)立施用兩種藥劑;各孔接受7.5nL試驗(yàn)化合物和7.5nL DMS0，化合物濃度朝左下角逐步 降低。第一列和第一行交叉處的孔未接受化合物，其用2x 7.5nL DMS0給藥并作為對(duì)照。通 過在每孔中W其完整劑量范圍施用各7.5nL的兩種化合物來產(chǎn)生組合曲線，化合物濃度再 次朝左下角逐步降低。
[03%]加入化合物后，將板放回培養(yǎng)箱120小時(shí)。通過用ACP-1系統(tǒng)上的GNF瓶閥分配器加 入Cell Titer Glo(普洛麥格G7573)評(píng)價(jià)所述組合對(duì)細(xì)胞活力的效果;板隨后在室溫解育 10分鐘并在集成式巧金埃爾默Viewlux上讀取(2秒曝光，2x bin,高敏感度）。原始數(shù)據(jù)用各 板內(nèi)DMS0處理的細(xì)胞對(duì)照孔進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。同樣評(píng)價(jià)化合物加入時(shí)的細(xì)胞數(shù)/活力，并用NCI 計(jì)算法用于測(cè)定試驗(yàn)內(nèi)觀察到的最大生長抑制。參見Boyd,M.R.;化ull ,K.D. ;Rubinstein, L.R.《細(xì)胞毒性抗癌藥：藥物開發(fā)和發(fā)展的模型和概念》（切totoxic Anticancer Drugs : Models and Concepts for Drug Discovery and Development);Vleriote,F.A.; Corbett，T. H. ; Baker，L.H.編；馬薩諸塞州欣厄姆的克呂韋爾學(xué)術(shù)出版公司化luwer Academic), 1992;第11-34 頁和 Monks, A. ;Scudie;ro, D. A. ;Skehan,P. ; Shoemaker,!?. Η.; Pauli,K.D.;Vistica,D.T.;Hose,C.;Langley,J.;Cronice,P.;Vaigro-WoIf,M.;Gray- Goodrich,M.;Campbell,H.;Mayo,M.R.JNCI,J.Natl.(Mincer Inst.1991,83,757-766。
[0329] 所有協(xié)同性計(jì)算用來自Zalicus的CHALICE軟件進(jìn)行。參見Leh紅J,Krueger AS, Ave巧W等.，2009,《協(xié)同藥物組合趨向于提高治療相關(guān)選擇性》，化t Biotechnol.STiGSg- ee?；衔锝M合間的潛在協(xié)同相互作用根據(jù) Loewe 加和模型用過量抑制 2D 矩陣評(píng)價(jià)并報(bào)告 為協(xié)同得分。
[0330] 化合物自身組合W測(cè)定試驗(yàn)噪聲對(duì)預(yù)期劑量加和相互作用的協(xié)同評(píng)價(jià)參數(shù)的影 響。協(xié)同組合命中（強(qiáng)協(xié)同）被鑒定為具有協(xié)同得分〉2,協(xié)同得分為背景(非協(xié)同）模型所預(yù) 測(cè)的2倍，W及最大功效>100,從生長抑制計(jì)算所測(cè)定的值等同于靜態(tài)。
[0331] 從CHALICE軟件2D矩陣輸出目測(cè)評(píng)價(jià)協(xié)同相互作用。圖1顯示假定生長抑制實(shí)驗(yàn)的 2D矩陣圖。劑量矩陣圖（左)是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的化alice表示，其中單藥劑劑量反應(yīng)曲線示于最左 列和底行，組合塊的右上角表示各藥劑最高濃度。Loewe過量抑制圖（右)代表上面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 與單藥劑曲線所產(chǎn)生Loewe模型的比較。劑量加和模型計(jì)算組合矩陣中各塊的預(yù)期抑制值。 所述過量抑制圖中協(xié)同性定義為值〉〇;即抑制大于簡(jiǎn)單加和相互作用的預(yù)期。括抗作用定 義為值<0;即抑制小于簡(jiǎn)單加和相互作用所預(yù)期。
[0332] 藥物組合研究視覺顯示數(shù)據(jù)的其他常用替代方式包括塊圖（圖3)和散點(diǎn)圖（圖4A、 4B和4C)。箱線圖用于比較治療方案的協(xié)同得分。散點(diǎn)圖用于呈現(xiàn)化合物之間相互作用的趨 勢(shì)并鑒定強(qiáng)協(xié)同相互作用。
[0333] 基于化ou-Talalay聯(lián)合指數(shù)定理測(cè)定聯(lián)合藥物效果 [0扣4] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0335]此實(shí)驗(yàn)所用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系如上面細(xì)胞培養(yǎng)部分和表1所述。特別地，細(xì)胞在 37°C和5%C02下維持于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和1%心谷氨酷胺的RPMI-1640 培養(yǎng)基。 陶]用化合物A1和化合物B單一療法的體外生長IC50
[0337] 使用測(cè)量"細(xì)胞指數(shù)"的96孔實(shí)時(shí)細(xì)胞電子傳感xCELLigence系統(tǒng)（加利福尼亞州 圣地亞哥的ACEA)現(xiàn)憶五(5)個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的體外抑制活性。細(xì)胞指數(shù)獲自電阻 抗改變，因?yàn)榧?xì)胞與各孔的生物相容性微電極表面相互作用W測(cè)量底物貼壁增殖。根據(jù)生 長動(dòng)力學(xué)，每孔接種 W下細(xì)胞密度：NB1643 :20,000 ;SHSY5Y: 6,000 ;SKBE2C: 10,000; NB邸C1:11，000;NB1691:30,000。24小時(shí)后，接種的細(xì)胞用所示各劑量的試驗(yàn)化合物或DMS0 載劑對(duì)照一式Ξ份處理?；衔顰1W每孔lnM-10，OOOnM給藥，而化合物B W每孔0.6nM-6， OOOnM或lnM-10,000nM給藥。藥物暴露后72小時(shí)，記錄細(xì)胞指數(shù)。
[0338] 用GraphPad Prism 5.0四參數(shù)可變斜率擬合計(jì)算1C日日?；衔顰1和化合物B在選定 細(xì)胞系中的IC50概括于下表4。運(yùn)些值用于隨后的組合研究給藥。
[0扣9] 體外藥物組合研究
[0340]使用化ou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法（Trends 曲armacol Sci 4,450-454)和化IcuSyn v2軟件(密蘇里州的Biosoft)測(cè)定4個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的藥物組合效果和協(xié)同性量 化。接種細(xì)胞并用上述xC化Ligence系統(tǒng)測(cè)量體外增殖。細(xì)胞用恒定均分藥物組合(其中兩 種藥劑如化合物A1和化合物8^4^、2^、^、1/2和1/4的個(gè)體1〔50劑量混合)和各單獨(dú)藥劑一 式Ξ份給藥。
[CX341]各單獨(dú)藥劑的抗增殖能力通過中效劑量Dm估計(jì)。如"中效"圖上的X軸截距所定義， Dm是產(chǎn)生中效的化合物濃度，其中根據(jù)W下定義X=l〇g(D)，y = l〇g(fa^u):
[ο%2] D:藥物劑量；
[0343] Fa:受影響部分定義為受單獨(dú)或組合化合物的給定濃度影響的細(xì)胞部分。Fa = 0是 基于DMS0對(duì)照通過劑量測(cè)定，F(xiàn)a= 1是完全響應(yīng)(沒有剩余活細(xì)胞）
[0344] 和
[0345] Fu:未受劑量影響的部分，其中化=1-化。
[0346] 化合物A1和化合物B在選定細(xì)胞系中的Dm概括于下表4。
[0%7] 表4:選定神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中化合物A1和化合物B的IC50和Dm概述
[0；34 引
[0349]組合藥物效果的影響用化OU所定義的聯(lián)合指數(shù)(CI)根據(jù)W下等式測(cè)定：
[0；350] CI = (D)i/(Dx)i+(D)2/化 x)2
[0351] 其中（Dx)i和(Dx)2是化合物化和化獨(dú)立使用時(shí)產(chǎn)生給定抗增殖效果水平所需的濃 度，而化)1和化)2是其聯(lián)用時(shí)產(chǎn)生相同抗增殖效果的濃度。聯(lián)合指數(shù)是藥物相互作用的定量 測(cè)度，定義為相加效應(yīng)(CI = 1)、括抗作用(CI〉1)或協(xié)同作用(CK1)。通常，本文所用的CI范 圍用于評(píng)價(jià)協(xié)同性。0.9-1.1的聯(lián)合指數(shù)指示加和相互作用，低于0.9的值指示協(xié)同作用，大 于1.1的值指示括抗作用。W下是CI范圍的描述：
[0352] <0.1+++++極強(qiáng)協(xié)同作用
[0353] 0.1-0.3++++強(qiáng)協(xié)同作用
[Ο%4] 0.3-0.7+++協(xié)同作用
[Ο%5] 0.7-0.85++中等協(xié)同作用
[0356] 0.85-0.90+輕微協(xié)同作用
[0：357] 0.90-1.10 ±接近加和
[0巧引1.10-1.20-輕微括抗作用
[0359] 1.20-1.45--中等括抗作用
[0360] 聯(lián)合指數(shù)用于評(píng)價(jià)劑量降低指數(shù)(DRI)(化0U和化011,1988)，其中：
[0361] cI = (D)i/(Dx)i+(D)2/Dx)2 = 1/(DRI)i+1/化 RI)2
[0362] DRI估計(jì)聯(lián)用協(xié)同藥物而仍實(shí)現(xiàn)與各藥物單獨(dú)施用相同的效應(yīng)量的各藥物劑量能 降低的量。
[0363] 藥物組合效果可直觀顯示?；诨痮u-Talalay聯(lián)合指數(shù)定理的藥物組合圖的典型 示例包括(a)"Fa-CI圖"，（b)經(jīng)典等效線圖，（C)不同組合比的組合的標(biāo)準(zhǔn)等效線圖，和(d) 化-PRI圖（化OU和Mad in, 2005)。不同圖的解釋概括于圖5A-D。對(duì)于評(píng)價(jià)協(xié)同效應(yīng)，F(xiàn)a-Cl圖 和等效線圖更相關(guān)。
[0364] 通過半脫天冬酶-Glo 3/7檢測(cè)的體外活力和細(xì)胞調(diào)亡
[0365] 使用ApoTox-GloTMS重檢測(cè)分析(加利福尼亞州的普洛麥格）同時(shí)測(cè)定3個(gè)神經(jīng)母 細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的體外細(xì)胞活力和半脫天冬酶-Glo 3/7。24小時(shí)時(shí)，細(xì)胞用DMS0載劑、化合 物A1或化合物B-式Ξ份處理，所述化合物W與聯(lián)合治療所用的相同劑量單獨(dú)處理或用所 示劑量的恒定均分比組合。藥物暴露72小時(shí)后，加入巧光底物GF-AFC。試驗(yàn)混合物解育10分 鐘，在380-400nm激發(fā)和505nm發(fā)射測(cè)量AFC巧光。GF-AFC在蛋白酶切割后發(fā)巧光，所述蛋白 酶在胞內(nèi)時(shí)有活性而失去細(xì)胞膜完整性后則失活，因此GF-AFC巧光與細(xì)胞活力相關(guān)。
[0366] 測(cè)量活細(xì)胞巧光后，向同一孔加入發(fā)光半脫天冬酶-Glo 3/7底物和巧光素酶。在 30分鐘解育段后測(cè)量發(fā)光。半脫天冬酶-3/7切割底物后釋放蛋光素，因而發(fā)光信號(hào)與半脫 天冬酶活性成比例。
[0367] 蛋白質(zhì)印跡
[0368] 各細(xì)胞系生長至70-80%置信水平，用化合物A1、化合物B或采用均分比的組合如 所示處理20小時(shí)或72小時(shí)。用冰冷憐酸鹽緩沖鹽水洗兩次，如所述通過免疫印跡法用W下 抗體分析全細(xì)胞蛋白裂解物(Mosse等.《鑒定ALK作為主要家族神經(jīng)母細(xì)胞瘤易感基因》 (Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition 邑ent)，2008，化化re卷455): ALK，1:1000; pALK Tyri6〇4，1:1000; pALK Tyri278，1:2000; RB，1: 2000;pRBS78〇，1:2000;pRBS795，i: 2000;細(xì)胞周期蛋白 Dl，l: 1000;細(xì)胞周期蛋白 D3,1:1000 (細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)公司（Cell Si即aling));CDK4，1:2000;和CDK6，1:3000(圣克魯斯生物技術(shù) 公司（Santa Cruz))。
[0369] 體內(nèi)腫瘤生長抑制
[0370] CB17scid雌性小鼠（Taconic化rms)用于增殖皮下植入神經(jīng)母細(xì)胞瘤。腫瘤直徑 用電子游標(biāo)卡尺每周測(cè)兩次，腫瘤體積用球體公式(p/6)Xd3計(jì)算，其中d代表平均直徑。一 旦腫瘤體積超過200mm3,小鼠隨機(jī)(n=10/組)每日接受載劑、化合物A1(每劑50mg/kg)、化 合物B(每劑150mg/kg)或聯(lián)合的化合物A1 (每劑50mg/kg)與化合物B(每劑150mg/kg)，口服 灌胃持續(xù)7周。腫瘤體積超過3000mm3或7周研究結(jié)束時(shí)，處死小鼠。招募時(shí)控制腫瘤大小，用 混合效應(yīng)線性模型評(píng)價(jià)治療和載劑組之間隨時(shí)間的腫瘤體積。無事件生存概率用Kaplan- Meier法估計(jì)，存活曲線用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（SAS 9.3和Stata 12.1)比較。事件定義為腫瘤體積 >3000mm的時(shí)間，檢查第7周后的腫瘤體積。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)的操作和 條件維持小鼠。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種藥物組合，所述組合分開或共同包括（a)第一藥劑，其是間變性淋巴瘤激酶 (ALK)抑制劑或其藥學(xué)上可接受鹽和(b)第二藥劑，其是周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑 或其藥學(xué)上可接受鹽。2. 如權(quán)利要求1所述的組合，其特征在于，所述ALK抑制劑是下式Al描述的化合物Al:3. 如權(quán)利要求1所述的組合，其特征在于，所述ALK抑制劑是下式A2描述的化合物A2:4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合，其特征在于，所述CDK抑制劑是CDK4或CDK6抑 制劑。5. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的組合，其特征在于，所述⑶K抑制劑是⑶K4和⑶K6雙 重抑制劑。6. 如權(quán)利要求1 _5中任一項(xiàng)所述的組合，其特征在于，所述CDK抑制劑是下式B描述的化 合物B:7. 如權(quán)利要求1所述的組合，其特征在于，所述兩種藥劑選自： (a) 化合物Al和化合物B;和 (b) 化合物A2和化合物B。8. -種藥物組合物，所述組合物包括權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合和至少一 種賦形劑。9. 一種治療細(xì)胞增殖性疾病的方法，所述方法包括向需要的對(duì)象施用聯(lián)合治療有效量 的權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合或權(quán)利要求8所述的藥物組合物。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一藥劑和第二藥劑共同、獨(dú)立或依序 施用。11. 如權(quán)利要求9和10所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞增殖性疾病是ALK陽性癌。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌依賴于ALK基因突變。13. 如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述癌依賴于ALK基因擴(kuò)增。14. 如權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述癌選自淋巴瘤、骨肉瘤、 黑素瘤、乳腺瘤、腎癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、甲狀腺癌、卵巢癌、胰腺癌、神經(jīng)元癌、肺癌、 子宮癌或胃腸道腫瘤、炎性乳腺癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述癌是神經(jīng)母細(xì)胞瘤。16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述癌是間變性大細(xì)胞淋巴瘤。17. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述癌是非小細(xì)胞肺癌。18. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述癌是炎性乳腺癌。19. 一種如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合，所述組合用于治療增殖性疾病。20. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合或權(quán)利要求9所述的藥物組合物在制備治 療增殖性疾病的藥物中的應(yīng)用。21. -種藥盒，所述藥盒包括權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合或權(quán)利要求8所述 的藥物組合物以及提供治療增殖性疾病說明的包裝說明書或其他標(biāo)簽。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK106029099SQ201480059490
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2014年8月28日
【發(fā)明人】J·L·哈里斯, N·李, T·R·史密斯, Y·莫斯, A·伍德
【申請(qǐng)人】諾華股份有限公司