一種檸檬苦素類化合物在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檸檬苦素類化合物在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用。該化合物為首次報(bào)道，是一種結(jié)構(gòu)新穎的檸檬苦素類化合物，可以從干燥的枳殼中提取、分離純化得到。本發(fā)明將化合物(Ⅰ)應(yīng)用于制備治療腎癌藥物中，本發(fā)明的應(yīng)用可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制呈濃度及時(shí)間依賴性。本發(fā)明應(yīng)用中的化合物(Ⅰ)化合物(Ⅰ)為非傳統(tǒng)意義的化療藥物，對(duì)機(jī)體的損害小，而且避免了癌細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐藥性。既可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以以組合物的形式進(jìn)行應(yīng)用。
【專利說明】
一種檸檬苦素類化合物在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從干燥的枳殼中分離得到的一種檸檬苦素類 化合物在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎癌是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，又稱腎腺癌，簡稱為腎癌。包 括起源于泌尿小管不同部位的各種腎細(xì)胞癌亞型，但不包括來源于腎間質(zhì)的腫瘤和腎盂腫 瘤。早在1883年德國的病理學(xué)家Grawitz根據(jù)顯微鏡下看癌細(xì)胞形態(tài)類似于腎上腺細(xì)胞，提 出腎癌是殘存于腎臟內(nèi)的腎上腺組織起源學(xué)說。
[0003] 枳殼為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種的干燥未成熟果 實(shí)。7月果皮尚綠時(shí)采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥。味苦、辛、酸。性微寒。歸脾、 胃經(jīng)。具有理氣寬中，行滯消脹之功效。用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內(nèi)停，臟器 下垂。枳殼是中藥典型的理氣藥之一，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床。
[0004] 枳殼所含化學(xué)成分較為復(fù)雜，目前已知的有效成分主要有黃酮類、揮發(fā)油類、生物 堿類、香豆素類和一些微量元素等。枳殼中黃酮類成分主要有:橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、 柚皮蕓香苷、異柚皮苷、陳皮素、柚皮素、川陳皮素、紅橘素、去甲基川陳皮素、去甲川陳 皮素、橙黃酮、4'，5,7,8_四甲氧基黃酮、4-0-甲基黃芩素、3-羥基_3'，4'，5,6,7,8_六甲氧 基黃酮和5，6-二羥基-7，4 二甲氧基黃酮等。揮發(fā)油主要有檸檬烯、芳樟醇、2-十一烷酮、 γ-松油烯。枳殼中所含的生物堿類活性成分主要有辛弗林、N-甲基酪胺、酪胺、大麥芽堿 等。枳殼中所含的香豆素類成分主要有葡萄內(nèi)酯、傘形花內(nèi)酯、異前胡素、馬明丙酮化合物、 潑朗弗林、異米拉素、花椒毒酚、5-異戊烯氧基線呋喃香豆素、5-甲氧基線呋喃香豆素等。
[0005] 枳殼中的橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌和保肝等作用；柚皮苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、降 血糖等作用；川陳皮素具有抗炎，抗病毒，抗氧化等藥理作用；川陳皮素具有很好的抗腫瘤 的作用；柚皮素具有抗抑郁、保肝、抗氧化、改善大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙、抗血小板聚集的作用。 枳殼揮發(fā)油的主要成分是檸檬烯。在臨床上，檸檬烯膠囊已上市，主要用于膽囊炎、膽管炎、 膽結(jié)石和膽道術(shù)后綜合征等的治療。在枳殼揮發(fā)油中，另一重要成分為芳樟醇，具有防腐、 抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)靜等作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從干燥的枳殼中分離得到的一種檸檬苦素類化合物在 制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種檸檬苦素類化合物在治療腎癌藥物中的應(yīng)用，具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0009]
[0010] 進(jìn)一步地，所述化合物(I)從枳殼中分離提取獲得，包含以下操作步驟：
[0011] (a)干燥的枳殼粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依 次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和 正丁醇萃取物；
[0012] (b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再 用70%乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏；
[0013] (C)步驟(b)中70%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、 30:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；
[0014] (d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；
[0015] (e)步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (1)〇
[0016] 進(jìn)一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0017]進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0018] -種藥物組合物在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用，該藥物組合物含有治療有效量的 上述化合物（I)和藥學(xué)上可接受的載體。
[0019] 本發(fā)明應(yīng)用中的化合物（I)用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式 使用。以藥物組合物應(yīng)用時(shí)，藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物（I )，其余為藥物 學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0020] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時(shí)，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0022] 本發(fā)明將化合物（I)應(yīng)用于制備治療腎癌藥物中，本發(fā)明的應(yīng)用可以抑制腎癌細(xì) 胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，抑制呈濃度及時(shí)間依賴性。本發(fā)明應(yīng)用中的化合物（I)化合物 α)為非傳統(tǒng)意義的化療藥物，對(duì)機(jī)體的損害小，而且避免了癌細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的耐藥 性。，既可以單獨(dú)應(yīng)用，也可以以組合物的形式進(jìn)行應(yīng)用。
【附圖說明】
[0023]圖1為化合物(I)結(jié)構(gòu)式；
[0024]圖2為化合物（I)理論E⑶值與實(shí)驗(yàn)E⑶值比較。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0026]實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0027] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0028]制備方法：（a)將干燥的枳殼(8kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(25L X 3次），合并 提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次)和水飽和的正丁 醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70% 乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏（129g);(c) 步驟(b)中70%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個(gè)柱體積）、50:1(8 個(gè)柱體積）、30:1(6個(gè)柱體積）、10:1(8個(gè)柱體積)和1:1(5個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到5個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4(31g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1 (8個(gè)柱體積）、10:1(10個(gè)柱體積)和5:1(6個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組 分；（e)步驟（d)中組分2(14g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (I)(48mg)〇
[0029] 結(jié)構(gòu)確證:無色晶體（甲醇），冊(cè)43頂3顯示[1+他]+為111/2 523.2314，結(jié)合核磁特 征可得分子式為C28H36〇8，不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρηι，DMS0_d6，500MHz):H-1 (4.85，d，J = 7.5)，H-2(2.72，dd，J=16.0,7.5)，H-2(3.43，d，J=16.0)，H-5(2.39，d，J = 13.5)，H-6(1.57，d，J = 13.5)，H-6(1.85，t，J=13.5)，H-7(3.33，d，J = 4.5)，H-9(1.96，s)， H-ll(3.78，br，s)，H-12(3.34，d，J = 6.0)，H-14(2.89，s)，H-16(2.41，dd，J=19.0,9.0)，H-16(2.20，dd，J=19.0,9.0)，H-17(4.19，t，J=10.0)，H-18(0.61，s)，H-19(1.41，s)，H-21 (7.45，s)，H-22(6.46，d，J=1.0)，H-23(7.47，t，J=1.5)，H-28(1.22，s)，H-29(1.39，s)，H-30(1.16,8)，7-0!1(4.69，(1，了 = 4.5)，1-(^〇(1.87,8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)6。(卯111，0130-(1 6， 125MHz):70.7(CH，1-C)，34.5(CH2,2-C)，169.6(C，3-C)，85.1(C，4-C)，38.9(CH，5-C)，27.8 (CH2,6-C)，68.8(CH，7-C)，44.0(C，8-C)，36.2(CH，9-C)，41.7(C，10-C)，70.6(CH，n-C)， 70.1(CH，12-C)，44.0(C，13-C)，57.2(CH，14-C)，220.1(C，15-C)，41.8(CH2，16-C)，34.9 (CH，17-C)，21.1(CH3，18-C)，22.9(CH 3，19-C)，123.3(C，20-C)，140.8(CH，21-C)，111.2(CH， 22-C) ,141.7(CH,23-C), 33.8(CH3,28-0,17.7(CH3,29-C) ,19.3(CH3,30-C) ,169.1(C,1- OAc)，20.3(CH3，l-0Ac);碳原子標(biāo)記參見圖1。紅外波譜表明該化合物含有羥基(3526CHT 1)， 羰基（1732cm-〇和烯烴（1685cm-〇等基團(tuán)。1H NMR譜顯示六個(gè)甲基信號(hào)(δΗΙ · 87，1 ·41，1 · 39， 1.22，1.16,〇.61，各3!1，8)，0型取代的呋喃環(huán)0!17.45,8;6.46，(1，了=1.〇!^和7.47，^ = 1.5Hz)，以及一個(gè)乙酰氧基[δΗΙ. 87(3Η，s) ]。13C NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有28個(gè)碳信號(hào)， 包括六甲基，三個(gè)亞甲基，十一個(gè)次甲基（四個(gè)含氧碳和三個(gè)烯烴碳），以及八個(gè)季碳(三個(gè) 羰基碳，一個(gè)含氧碳和一個(gè)烯烴碳）。上述數(shù)據(jù)表示，該化合物為檸檬苦素類化合物，再結(jié)合 不飽和數(shù)可知該化合物為五環(huán)結(jié)構(gòu)。HMBC譜中，H-1 (δΗ4.85，d，J = 7.5)與C-2 (SC34.5)和兩 個(gè)羰基碳[SC169.1(0Ac)和169.6(C-3)]的相關(guān)性表明，C-1位連有一個(gè)乙酰氧基。HMBC譜中 H-1 與 C-3，C-5 和 C-10，H2-2 與 C-3，Me-28 和 Me-29 與 C-4，Me-19 與 C-1 的相關(guān)性表明 A 環(huán)為七 元內(nèi)酯環(huán)。HMBC譜中，質(zhì)子(4.69，d，J = 4.5)與C-7(SC68.8)的相關(guān)性表明B環(huán)的C-7位連有 一個(gè)羥基。此外，兩個(gè)含氧碳信號(hào)SC70.6(CH，11-C)和70.1(CH，12-C)表明C環(huán)存在一個(gè)11， 12-環(huán)氧基團(tuán)。HMBC譜中，H-14和H 2-16與酮羰基C-15(SC220.1)的相關(guān)性表明D環(huán)為五元環(huán)。 通過HMBC譜中H-17與C-20，C-21和C-22,以及H 2-16與C-20的相關(guān)性可知呋喃環(huán)位于C-17位 上。R0ESY 譜中，Η-6β 與 Me-19，Me-19 與 Me-29，Me-19 與 Me-30，Me-30 與 H-7，Me-30 與 H-12 和 H-12 與 H-17 的相關(guān)性表明 H-7，H-12，H-17，Me-19，Me-29和Me-30為β構(gòu)型。此外，H-6α與H-5，H-5與Me-28，H-5與H-9，H-9與H-14，H-14與7-OH，以及H-14與Me-18的相關(guān)性表明它們均為α構(gòu) 型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化 合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。
[0030]實(shí)施例2:化合物（I)藥理作用試驗(yàn) [0031] -、材料和儀器
[0032] 人腎癌RC-2細(xì)胞株購于ATCC細(xì)胞庫(美國）。分析純蔗糖購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公 司。重水(D20)購于青島騰龍微波科技有限公司。1^8、303、30%丙烯酰胺單體、1'冊(cè)61120購 于重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所實(shí)驗(yàn)室。小牛血清、RPMI-1640購于美國Gibco公司。Centriplus 離心超濾管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管（100kD)、PVDF膜購于 Mi 11 ipore公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海安亭科學(xué)儀器廠。5 X SDS-PAGE蛋白質(zhì) 上樣緩沖液、BeyoECL熒光檢測(cè)試劑、考馬斯亮藍(lán)G250、考馬斯亮藍(lán)R250購于碧云天生物技 術(shù)研究所?；衔铮↖)自制，HPLC歸一化純度大于98%。鼠抗人批？70單克隆抗體、兔抗人 ICAM-1單克隆抗體、兔抗人G250多克隆抗體購于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗體武 漢博士德生物有限公司。
[0033] 超凈工作臺(tái)（蘇州華新空調(diào)凈化有限公司），自動(dòng)平衡離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器 廠），光學(xué)顯微鏡(NIKON，日本），透射電子顯微鏡(LeicaTCS-NT，德國），低溫高速離心機(jī)（日 立公司，日本），低溫超高速離心機(jī)H-80B(日立公司，日本）。垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)槽(北京六一 廠，中國）。臺(tái)式高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀(上海安亭科學(xué)儀器廠，中國）。96孔培養(yǎng)板(Corning公 司，美國）。凝膠儀、PCR擴(kuò)增儀(BI0-RAD，美國）。
[0034]二、試驗(yàn)方法
[0035] 1、MTT檢測(cè)化合物（I)不同濃度48h對(duì)腎癌細(xì)胞株RC-2增殖的影響
[0036]用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(含有0.1 %青霉素、鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)人腎 癌細(xì)胞株RC-2，根據(jù)細(xì)胞生長密度1~2天換液一次，3天傳代一次。取對(duì)數(shù)期生長細(xì)胞，按照 如下步驟操作：（1)接種細(xì)胞:胰酶消化對(duì)數(shù)生長期的腎癌RC-2細(xì)胞，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液lmL制成單細(xì)胞懸液，混勻后用移液管按照體積100μL7孔，即接種腎癌細(xì) 胞數(shù)目5 X 103個(gè)/孔，加入96孔培養(yǎng)板中。每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；（2)培養(yǎng)細(xì)胞:將培養(yǎng)板小 心置入孵箱中（37 °C、5 % C02)培養(yǎng)3天；（3)處理細(xì)胞:分別按空白組(加5yL DMS0液）、0.25、 0.5、0.75、lymol/L化合物（I)處理組分組后加藥處理48h; (4)顯色：在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，予以每 孔各加入MTT溶液20yL，之后繼續(xù)放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔內(nèi)培養(yǎng)液用注射器吸 去;對(duì)于當(dāng)天接種的細(xì)胞而言，離心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后將孔內(nèi)培養(yǎng)液移除。之后把 150yL DMS0加入每孔，使其充分振蕩lOmin后，把結(jié)晶物溶解完全；（5)比色:在全自動(dòng)酶標(biāo) 儀上檢測(cè)各孔在580nm波長下的光密度值[(D580)]，按公式測(cè)定細(xì)胞活力:D(580)實(shí)驗(yàn)孔/D (580)對(duì)照孔 XI00 %。
[0037] 2、MTT檢測(cè)0.5μΜ化合物（I)不同時(shí)間對(duì)腎癌細(xì)胞株RC-2增殖的影響
[0038] 接種和處理細(xì)胞及顯色和比色步驟同上（1)、（2)、（4)、（5)，處理細(xì)胞:分別按空白 組（加5yL DMS0液）、0.5μΜ化合物（I)處理24h、48h、72h分組。
[0039] 3、制備 exosomes
[0040] (1)細(xì)胞分組：取6份細(xì)胞計(jì)數(shù)相近的人腎癌RC-2細(xì)胞株體外常規(guī)培養(yǎng)，其中三份 為對(duì)照組（CE)，另外三份為實(shí)驗(yàn)組（CE2)，等細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長時(shí)，兩組細(xì)胞株按照3 X 106/ 100mL重新傳代至新的培養(yǎng)瓶，嚴(yán)格控制每組細(xì)胞培養(yǎng)基的體積一致;在實(shí)驗(yàn)組，等細(xì)胞培 養(yǎng)48h后加入0.5μΜ的化合物（I)處理細(xì)胞48h，之后收集培養(yǎng)上清液各150mL;對(duì)照組不加藥 物，加入與實(shí)驗(yàn)組等量的DMS0，48h后收集培養(yǎng)上清液各150mL，置于-20°C冰箱保存；（2)提 取exosomes:培養(yǎng)上清液150mL，300g低溫離心(4°C) 10min去除細(xì)胞;800g低溫離心30min獲 取上清l〇〇〇〇g低溫離心30min獲取上清通過100kD MW⑶Centriplus離心超濾管濃縮超濾 (MWC0:分子量截留），以1000g離心30min，得到約20mL超濾液。將超濾液分別移至2mL含30g/ L的蔗糖重水墊的10mL的離心管中，100000g低溫超速離心lh。收集離心管底部的緩沖墊用 PBS稀釋，置于100kD MWC0高回收率高流速切向流超濾離心管中1000g離心30min，得到3mL exosome。。. 22μηι濾膜過濾除菌，_80°C保存?zhèn)溆迷O(shè)置對(duì)照組細(xì)胞(CE1)來源的exosomes為 EX1 組 exosomes，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞(CE2)來源的 exosomes 為EX2 組 exosomes。
[0041] 4、BCA法檢測(cè)exosomes蛋白含量
[0042] (1)測(cè)定方法:取96孔酶標(biāo)板，按下表加入試劑并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0043]
[0044] 上述試劑加完后，準(zhǔn)確吸取10yL樣品溶液于酶標(biāo)孔中，加入BCA試劑200yL，輕搖， 于37°C保溫30min，冷卻至室溫后，以空白為對(duì)照，在酶標(biāo)儀上562nm處比色，以牛血清白蛋 白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對(duì)照，根據(jù)樣品的 吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)濃度；（2)計(jì)算方法:exosome濃縮液總蛋白質(zhì)含量 (mg)=濃縮后的總體積XBCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，取平均值做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 [0045] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0046] 使用軟件GRAGHPAD PRISM 5.0進(jìn)行圖表制作及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以1±8表 示，比較組間差異使用方差分析或t檢驗(yàn)。
[0047]三、結(jié)果及結(jié)論
[0048] 1、MTT顯示不同濃度化合物（I)作用腎癌細(xì)胞株RC-2后細(xì)胞活力變化 [0049] MTT結(jié)果顯示當(dāng)化合物（I)濃度0·75μΜ作用細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞活力（71·32±4·68%)與 化合物（I)濃度〇·5μΜ及0·25μΜ作用細(xì)胞時(shí)細(xì)胞組（91.43±2.74%;94.67±1.21%)相比， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈〇. 05)。
[0050] 2、ΜΤΤ顯示0.5μΜ化合物（I)不同時(shí)間作用腎癌細(xì)胞株RC-2后細(xì)胞活力變化 [0051 ] ΜΤΤ結(jié)果顯示當(dāng)0.5μΜ化合物（I)作用細(xì)胞72h組（71.34±1.64%)與作用4811組 (91 ·04±6· 23% )、24h組(94.56± 1 · 13% )對(duì)比，細(xì)胞活力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ρ〈0·05)。 [0052] 3、Exosomes計(jì)數(shù)和蛋白定量
[0053] 電鏡下實(shí)驗(yàn)組(EX2)和對(duì)照組(EXl)exosomes計(jì)數(shù)和exosomes蛋白定量結(jié)果:經(jīng)化 合物（I)處理后，RC-2細(xì)胞產(chǎn)生的exosomes數(shù)量和exosome蛋白含量較未經(jīng)藥物處理組都明 顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05)。結(jié)果見表1。
[0054]結(jié)果說明，化合物⑴能夠抑制腎癌細(xì)胞株RC-2增殖，這種抑制呈濃度及時(shí)間依賴 性。經(jīng)化合物（I)處理后，透射電鏡觀察腎癌細(xì)胞株RC-12源性exosomes形態(tài)未見明顯改變， 其分泌量和蛋白含量較處理前明顯增加(P<〇.05)，這些說明化合物（I)對(duì)腎癌細(xì)胞株RC-12的抑制作用與化合物（I)引起的腎癌細(xì)胞RC-2表達(dá)野生型p53mRNA上調(diào)有關(guān)。
[0055] 表1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分泌exosomes數(shù)量及蛋白含量對(duì)比
[0056] Luud/j 頭施例3
[0058] 片劑的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0059] 實(shí)施例4
[0060] 口服液制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服 液。
[0061 ] 實(shí)施例5
[0062] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0063] 實(shí)施例6
[0064] 注射液的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0065] 實(shí)施例7
[0066] 無菌粉針的制備:按實(shí)施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0067] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檸檬苦素類化合物在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:具有下述結(jié)構(gòu) 式的化合物(I)，2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述化合物（I)從枳殼中分離提取獲得，包 含以下操作步驟： (a) 將干燥的枳殼粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次 用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正 丁醇萃取物； (b) 步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用 70%乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏； (c) 步驟(b)中70%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、30: 1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」5個(gè)組分； (d) 步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分； (e) 步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的 甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并 提取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。5. -種藥物組合物在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:該藥物組合物含有治 療有效量的權(quán)利要求1所述的化合物(I)和藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61K31/585GK106038573SQ201610389578
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】董秋月
【申請(qǐng)人】杭州更藍(lán)生物科技有限公司