間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用。間充質干細胞來源于產(chǎn)后丟棄物人胎盤組織表面的羊膜層——人羊膜間充質干細胞。急性肺損傷是百草枯誘導的急性肺損傷。本發(fā)明采用人羊膜組織分離出來的間充質干細胞，以腹膜腔注射PQ制作急性肺損傷動物模型，經(jīng)舌下靜脈移植hAD?MSCs制劑對急性肺損傷有很好的治療效果。本發(fā)明比骨髓和臍帶來源的間充質干細胞，具有取材容易，擴增能力強，治療效果佳的優(yōu)勢。
【專利說明】
間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及間充質干細胞制劑在治療百草枯致急性肺損傷制劑中的應用，尤其涉 及人羊膜間充質干細胞制劑在治療百草枯致急性肺損傷中的應用。
【背景技術】
[0002] 百草枯(ParaqUat，PQ)是一種快速滅生型除草劑，因其具有高效的除草效果曾被 廣泛應用，但由于PQ對人體毒性極大，其吸收后隨血液循環(huán)分布至全身各組織器官，其中絕 大部分被肺組織攝取，引起廣泛的肺泡細胞損傷，從而導致急性肺損傷（acute lung in jury，ALI)以及其繼發(fā)的纖維化，其中肺組織強烈的炎癥反應是導致ALI和肺纖維化的中 心環(huán)節(jié)，口服中毒致死率達90%以上。我國雖已停止PQ水劑在國內的銷售和使用，但目前因 PQ中毒就診的患者仍屢見不鮮，目前尚無特效解毒藥。臨床上常規(guī)的治療措施主要包括:1、 抑制毒物吸收，如清洗染毒皮膚、催吐、洗胃及導泄等;2、加速體內PQ排泄，如血液灌流、血 液透析等;3、藥物治療，如清除氧自由基、減少肺纖維化，以及對癥支持等治療。但抑制炎癥 因子、改善氧合及促進肺內液體吸收等治療措施都未能有效地緩解百草枯中毒所致肺損傷 的病程進展，死亡率居高不下。
[0003] 隨著干細胞相關技術迅速發(fā)展，其所具有的低免疫原性和向多個胚層分化及旁分 泌等特點為治療肺損傷性疾病開創(chuàng)了新的思路和方法。研究發(fā)現(xiàn)移植骨髓間充質干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSCs)對PQ誘導的肺損傷具有保護作用，其可以 減輕肺水腫、脂質過氧化以及抑制炎癥介質的釋放。人臍帶間充質干細胞對百草枯中毒性 急慢性肺損傷有一定的治療作用，這種作用可能是通過旁分泌機制實現(xiàn)的。這些研究均證 實間充質干細胞對多種原因引起的ALI具有治療作用。
[0004] 近年來研究發(fā)現(xiàn)人羊膜間充質干細胞（human amnion-derived mesenchymal stem cells，hAD-MSCs)是一種比骨髓和臍帶來源間充質干細胞具有更強的擴增能力。在 特定的體外誘導培養(yǎng)條件下，hAD-MSCs可分化成來自三個胚層的所有細胞，包括神經(jīng)細胞、 心肌細胞、成骨和軟骨細胞及胰腺細胞等。作為干細胞其具有向損傷組織迀移的潛能，此 外，研究發(fā)現(xiàn)，hAD-MSCs具有免疫調節(jié)的特性，能夠抑制損傷組織炎癥反應。且hAD-MSCs來 源豐富，分離周期短，擴增能力強，性狀穩(wěn)定，療效顯著。所具有的這些特性使其在PQ中毒所 致的ALI治療中具有更大的臨床應用潛能。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明發(fā)明的目的是提供間充質干細胞制劑在治療百草枯致急性肺損傷制劑中 的應用。
[0006] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)人羊膜間充質干細胞制劑對百草枯誘導的急性肺損傷具有顯著 的治療療效，人羊膜間充質干細胞制劑可以在百草枯誘導的急性肺損傷方面實現(xiàn)應用。該 間充質干細胞來源于產(chǎn)后丟棄物人胎盤組織表面的羊膜層一一人羊膜間充質干細胞。
[0007] 本發(fā)明采用人羊膜組織分離出來的間充質干細胞，制備成人羊膜間充質干細胞制 劑；以腹膜腔注射百草枯制作急性肺損傷大鼠動物模型，經(jīng)舌下靜脈注射hAD-MSCs制劑。其 中，人羊膜間充質干細胞移植所需劑量為約5X 106個細胞/kg。
[0008] 人羊膜間充質干細胞制劑為注射劑，主要由人羊膜間充質干細胞和LG-DMEM組成， 細胞濃度至少為5 X 106個細胞/ml。人羊膜間充質干細胞冷凍保存、復蘇使用，其冷凍保存 液由20%胎牛血清、10%二甲基亞砜、LG-DMEM和終濃度為10 ng/ml bFGF組成，復蘇液由2mM L_谷氨酰胺、10%胎牛血清、LG-DMEM和終濃度為10 ng/ml bFGF組成。復蘇液懸浮后繼續(xù)培 養(yǎng)擴增或在緊急需要時用生理鹽水涮洗后，用LG-DMEM重懸制備成注射液使用。百草枯劑量 為30 mg/kg，造模時含20%百草枯的水溶液一次性腹腔內注射。人羊膜間充質干細胞移植時 機為造模后4h。
[0009] 本發(fā)明原代人羊膜間充質干細胞按5X105/ml接種最多可達40瓶(25 cm2培養(yǎng)瓶）， 細胞總數(shù)可達1 X 1 〇8個，細胞制劑用無血清的LG-DMEM懸浮，可以使用含20%胎牛血清和10% 二甲基亞砜添加到終體積70%的LG-DMEM中細胞凍存液中液氮中凍存，并經(jīng)復蘇后重新懸浮 于無血清的LG-DMEM使用，也可以在緊急需要時用生理鹽水涮洗后，用LG-DMEM重懸制備成 注射液直接使用。經(jīng)擴增后，3-6代細胞總數(shù)最多可達6.4 X 109個。
[0010] 本發(fā)明采用人羊膜組織分離出來的間充質干細胞，以腹膜腔注射PQ制作急性肺損 傷動物模型，經(jīng)舌下靜脈移植hAD-MSCs制劑對急性肺損傷有很好的治療效果。
[0011] 本發(fā)明比骨髓和臍帶來源的間充質干細胞，具有取材容易，擴增能力強，治療效果 佳的優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0012] 圖1表示hAD-MSCs生長形態(tài)； 圖2表示P3代hAD-MSCs的流式細胞術檢測(一）； 圖3表示P3代hAD-MSCs的流式細胞術檢測(二）； 圖4表示P3代hAD-MSCs的流式細胞術檢測(三）； 圖5表示Kaplan-Meier生存分析法； 圖6表示肺組織H.E染色； 圖7表示肺組織Masson染色； 圖8表示肺組織天狼星紅染色； 圖9表示各組大鼠血清中TGF-βΙ、HYP濃度(一）； 圖10表示各組大鼠血清中IL-10、IL-17濃度(二）。
【具體實施方式】
[0013] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0014] 實施例1: hAD-MSCs的分離、培養(yǎng)與擴增:在無菌條件下，用鑷子將羊膜從胎盤上剝離，用含雙抗 (終濃度為青霉素：100 IU/ml，鏈霉素:0.1 mg/ml，現(xiàn)配現(xiàn)用）的D-roS液沖洗一遍后，用不 含有雙抗的D-PBS液反復沖洗羊膜組織，去除殘留的血漬和粘液。剪碎羊膜，加入0.05%胰蛋 白酶-0.02%EDTA-2Na溶液，37°C恒溫水平搖床(200 rpm/min)消化30 min，200目不銹鋼濾 網(wǎng)過濾，棄濾液，剩余羊膜組織碎片用D-PBS液沖洗，加入Ο . 75 mg/ml Π 型膠原酶-0.075 mg/ml DNasel消化液，37 °C、200 rpm/min消化2~3 h，至組織消化完全，200目不銹鋼濾網(wǎng) 過濾，收集細胞濾液，2400 rpm/min，離心16 min，棄上清，沉淀用含2mM L-谷氨酰胺、10%胎 牛血清和終濃度為10 ng/ml bFGF的LG-DMEM培養(yǎng)基混懸，即hAD-MSCs懸液，2%臺盼藍染色 檢測細胞活力，根據(jù)細胞活力接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內，細胞密度按按5 X 105/ml接種，置于37 °C、5% C02，飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h后更換新培養(yǎng)基，待貼壁細胞融合約80%~90%時，D-PBS液沖洗，加入0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na消化液，37 °C孵育1 min，顯微鏡下觀察消 化情況，待細胞開始收縮時用含有10%FBS的培養(yǎng)基終止消化，收集細胞并行傳代擴增培養(yǎng)， 倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。
[0015] hAD-MSCs的純度鑒定：取第3代hAD-MSCs，1000 rpm/min離心5 min，棄上清，D-PBS 洗滌一次，混懸，調整細胞密度為2.0X106 cells/ml。取細胞懸液200 μL按組合方案加10 μ 1 熒光素標記的 〇)44、0)73、0)90、0)105、0)34、0)45、0)14、0)19、0)80丄086和!11^-〇財允體震 蕩混勻，室溫避光孵育30 min，每管加入2ml含有0.1%BSA的D-PBS，混勻，1000 rpm/min離心 5 min，棄上清，震蕩懸浮細胞。每管加入200 μL 1%多聚甲醛，混勻，2~8 °C避光保存，24小 時內用流式細胞儀檢測分析。每份樣品的采集細胞數(shù)均多2X104個，Cell Quest軟件分析。 同型對照抗體為相應熒光素標記的小鼠 IgG。
[0016] 急性肺損傷模型制備：SPF級雄性SD大鼠（200 ± 20g)40只，標準飼料喂養(yǎng)，不限飲 水，飼養(yǎng)1周后用于實驗。實驗前12 h禁食，按30 mg/kg 20%百草枯水溶液一次性腹膜腔內 注射，隨機分為hAD-MSCs移植組（17只）、模型組（15只）和空白對照組(8只）。
[0017] hAD-MSCs移植:造模后4 h，經(jīng)0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na消化液消化，用LG-DMEM培養(yǎng)基懸浮的hAD-MSCs，制備成200 μL注射劑（含約1 X 106個細胞），各組大鼠按0.3 ml/100g腹膜腔內注射10%水合氯醛溶液麻醉，固定于自制鼠板，暴露大鼠口腔，用鑷子將大 鼠舌頭拉出，將注射器連接采血針，經(jīng)舌下靜脈穿刺，模型組經(jīng)舌下靜脈緩慢注射等量的 LG-DMEM培養(yǎng)基，無菌棉球局部壓迫、止血，術后予以5%葡萄糖灌胃。
[00?8] 大鼠血清和肺組織標本米集:hAD-MSCs移植7 d后，將各實驗組未死亡大鼠10%水 合氯醛麻醉，固定于鼠板，剪除大鼠胸腹部鼠毛，碘伏和75%酒精消毒，打開并向兩側牽拉胸 腔，暴露心臟，采血針從右心室穿刺采集4 ml靜脈血于促凝管中，室溫放置10~20 min，待 血液凝固，2000 rpm/min，離心20 min，收集上層血清分裝于無菌EP管中，-80°C冰箱儲存， 待測血清中的TGF-βΙ、HYP、IL-10、IL-17含量。分離肺組織，0.9%生理鹽水沖洗，每只大鼠均 取右下肺，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋后行病理切片，待行H.E、Mass 〇n和天狼星紅染色。
[0019] 肺組織病理學檢查和移植細胞示蹤 ① HE染色 A. 將石蠟切片放入60 °C恒溫烘箱中約45 min; B. 待烤干后，二甲苯脫蠟，梯度酒精入水； C. 蘇木素染色5~10 min，自來水沖洗； D. 1%鹽酸酒精分化1~3 s，自來水沖洗； E. 飽和碳酸鋰水溶液返藍后，1%伊紅液染色5~10 min; F. 梯度酒精脫水，二甲苯透明； G. 中性樹脂封片，顯微鏡下觀察肺組織結構變化。
[0020] ② Masson染色 A. 將石蠟切片放入60 °C恒溫烘箱中約45 min; B. 待烤干后，二甲苯脫蠟，梯度酒精入水； C. 30~40 °C溫熱水漂洗2次，每次60 s; D. 核染液染色60 s，倒丟，沖洗液沖洗30 s; E. 漿染液染色30~60 s，倒丟，沖洗液沖洗30 s; F. 分色液分色6~8 min，棄分色液； G. 復染液染色5 min，倒丟，無水乙醇沖洗干凈； Η.待切片干后，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。
[0021] ③天狼星紅染色 A. .二甲苯脫蠟，梯度酒精入水； B. 天狼星紅染色液滴染1 h; C. 流水稍沖洗，去除切片表面染液； D. Mayer蘇木素染色液染細胞核8~10 min; E. 流水沖洗10 min; F. 梯度酒精脫水，二甲苯透明； G. 中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。
[0022] ELISA檢測大鼠血清細胞因子含量 ① TGF-m具體檢測步驟如下： A. 凍存血清4 °C冰箱緩慢解凍，待完全溶解后于室內恢復至室溫； B. TGF-m標準品按180 ng/L、120 ng/L、60 ng/L、30 ng/L、15 ng/L 5個濃度梯度稀 釋，以繪制標準曲線； C. 分別于酶標包被板孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加入各組血清10 μL，調零孔加10 μL D-PBS，每組均設2個復孔，37°C孵育30 min; D. 洗滌液洗板5次，拍干，每孔加入酶標試劑50 μL，調零孔除外； Ε.封板膜封板后37°C孵育30 min; F. 洗滌液洗板5次，拍干，每孔加入顯色劑，輕輕震蕩混勻，37 °C避光顯色15min; G. 每孔加入終止液50 μL，終止反應； Η.以調零孔調零，酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度(0D值）。
[0023] I.用繪圖軟件CurveExpert 1.4繪制TGF-βΙ的標準曲線，并計算出標準曲線的直 線回歸方程式，計算檢測樣品的TGF-m含量。
[0024] ②大鼠血清HYP、IL-10、IL-17含量檢測： A. 凍存血清4 °C冰箱緩慢解凍，待完全溶解后平衡至室溫； B. HYP、IL-10、IL-17標準品按說明書推薦的5個濃度梯度稀釋，以繪制標準曲線； C. 分別于酶標包被板孔中先加樣品稀釋液40 μL，再加入各組血清10 μL，調零孔加10 μL D-PBS，每組均設2個復孔，37°C孵育30 min; D. 洗滌液洗板5次，拍干，每孔加入酶標試劑50 μL，調零孔除外； Ε.封板膜封板后37°C孵育30 min; F.洗滌液洗板5次，拍干，每孔加入顯色劑，輕輕震蕩混勻，37 °C避光顯色15min; G.每孔加入終止液50 μL，終止反應； Η.以調零孔調零，酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度(OD值）。
[0025] I.用繪圖軟件CurveExpert 1.4繪制HYP、IL-10、IL-17的標準曲線，并計算出標準 曲線的直線回歸方程式，計算檢測樣品的HYP、IL-10、IL-17含量。
[0026]統(tǒng)計學方法:實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量數(shù)據(jù)用均數(shù)土 標準差G:土S)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，大鼠生存率采用Kaplan-Meier生存分析 法，α=0·05。
[0027]結果： hAD-MSCs的生長形態(tài)和表型特征： hAD-MSCs具有貼壁生長的特性，原代培養(yǎng)時細胞貼壁較慢，培養(yǎng)3d左右原代細胞可融 合80%以上，細胞形態(tài)具有多樣性，呈多邊形、梭形等（圖1中A部分）。隨著細胞傳代純化培 養(yǎng)，hAD-MSCs的形態(tài)逐漸呈梭形或纖維樣，呈放射樣或漩渦樣生長(圖1中B部分）。
[0028] FCM分析表明，第3代hAD-MSCs高表達間充質細胞表面標志⑶44,同時還高表達 0)73、0)90、0)105，不表達0)14丄019、0)34丄045、!11^-〇1?(圖2-圖4)等造血干細胞和腿(：-11 類分子等表面標志。
[0029] hAD-MSCs移植對急性肺損傷大鼠生存率的影響： 各組大鼠均觀察7天，統(tǒng)計記錄7天內（包含第7天)各組大鼠死亡數(shù)量，以Kaplan-Meier 生存分析法比較各組大鼠7天以內的生存率。模型組、移植組和空白對照組大鼠的生存率表 1所示。模型組、移植組和空白對照組分別對應表1和圖3的1、2和3組，各組大鼠7天內（包括7 天）的生存率分別為：1組40.0%、2組76.5%、3組100%(表1)。各組間生存率分別對比可以發(fā) 現(xiàn)：1組與2組比較，P<0.05,生存率組間差異有統(tǒng)計學意義；1組與3組比較，P<0.01，生存 率組間有顯著差異;2組與3組比較，P>0.05,生產(chǎn)率無統(tǒng)計學差異（圖5)。
[0030] hAD-MSCs移植后大鼠肺組織病理學變化： 模型組大鼠肺組織H.E染色（圖6，A、B)見肺間質顯著增厚，各肺泡之間相互融合，結構 明顯破壞，原有肺泡結構消失，可見大量肺間質毛細血管擴張，伴有彌漫性肺出血，肺毛細 血管周圍和肺泡腔可見大量炎性細胞浸潤;Masson染色（圖7，A、B)顯示肺泡腔大量破壞，肺 泡間質大量纖維細胞增生，肺泡壁增厚;天狼星紅染色（圖8，A、B)同樣發(fā)現(xiàn)大量肺泡原有的 結構明顯破壞，大量纖維細胞增生，肺間質彌漫性增厚。
[0031] 移植組大鼠顯微鏡下也可見部分肺泡結構破壞、融合，少量肺間質毛細血管充血， 周圍見少量紅細胞滲出，肺毛細血管周圍和肺泡腔見炎性細胞浸潤，但浸潤的炎癥細胞明 顯要少于模型組，Masson染色和天狼星紅染色可見，少量肺泡壁斷裂相互融合，斷裂融合的 肺泡周圍見肺間質輕度纖維細胞增生，肺泡壁增厚，但損傷程度較模型組有顯著減輕。
[0032] 大鼠血清中細胞因子和氨基酸的含量： ELISA檢測結果顯示(表2、圖9和10)，模型組大鼠血清中纖維化標志性細胞因子TGF-βΙ 含量顯著高于hAD-MSCs移植組和空白對照組(？<〇.〇1，？<〇.〇1)，而后兩組之間了6?-01含 量無顯著性差異(P>〇.〇5);模型組中膠原纖維中的主要成分HYP含量較hAD-MSCs移植組和 空白對照組，均升高(P<〇. 05，P<0.05)，而hAD-MSCs移植組仍高于空白對照組(P<0.05); 血清中IL-10含量，hAD-MSCs移植組和空白對照組顯著低于模型組（P<0.01，P<0.01)， hAD-MSCs移植組也低于空白對照組(P<0.01) ;hAD-MSCs移植組和空白對照組IL-17含量均 高于模型組(？<0.05，？<0.01)，前兩組血清中11^-17含量無顯著性差異(？>0.05)。
[0033] 當然，以上只是本發(fā)明的具體應用范例，本發(fā)明還有其他的實施方式，凡采用等同 替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發(fā)明所要求的保護范圍之內。
【主權項】
1. 間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用，其特征 在于：間充質干細胞來源于產(chǎn)后丟棄物人胎盤組織表面的羊膜層一一人羊膜間充質干細 胞。3. 根據(jù)權利要求1所述的間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用，其特征 在于:采用人羊膜組織分離出來的間充質干細胞，制備成人羊膜間充質干細胞制劑；以腹膜 腔注射百草枯制作急性肺損傷大鼠動物模型，經(jīng)舌下靜脈注射hAD-MSCs制劑。4. 根據(jù)權利要求3所述的間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用，其特征 在于:人羊膜間充質干細胞移植所需劑量為約5 X 106個細胞/kg。5. 根據(jù)權利要求3所述的間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用，其特征 在于:人羊膜間充質干細胞制劑為注射劑，由人羊膜間充質干細胞和LG-DMEM組成，細胞濃 度至少為5 X 106個細胞/ml。6. 根據(jù)權利要求3所述的間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用，其特征 在于:人羊膜間充質干細胞冷凍保存、復蘇使用，其冷凍保存液由20%胎牛血清、10%二甲基 亞砜、LG-DMEM和終濃度為10 ng/ml bFGF組成，復蘇液由2mM L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、 LG-DMEM和終濃度為10 ng/ml bFGF組成。7. 根據(jù)權利要求6所述的間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用，其特征 在于:復蘇液懸浮后繼續(xù)培養(yǎng)擴增或在緊急需要時用生理鹽水涮洗后，用LG-DMEM重懸制備 成注射液使用。8. 根據(jù)權利要求3所述的間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用，其特征 在于:百草枯劑量為30 mg/kg，造模時含20%百草枯的水溶液一次性腹腔內注射。9. 根據(jù)權利要求3所述的間充質干細胞在制備治療急性肺損傷制劑中的應用，其特征 在于:人羊膜間充質干細胞移植時機為造模后4h。
【文檔編號】A61K35/28GK106038597SQ201610359976
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】宮黎明, 周滿紅, 徐紹華, 李曉飛, 肖建輝, 楊智敏, 羅克燕
【申請人】遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院