一種威靈仙有效組分及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及威靈仙有效組分及其制備方法和應(yīng)用。該方法包括威靈仙的提取、萃取和硅膠柱色譜分離三個(gè)步驟。本發(fā)明的威靈仙有效組分的提取工藝簡(jiǎn)單，成本低，易于實(shí)現(xiàn)，得到的有效組分純度高，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用顯著，具有十分重要的價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種威靈仙有效組分及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種威靈仙的有效組分及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，又稱類風(fēng)濕，是一種以慢性、炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性、全 身性免疫疾病;統(tǒng)計(jì)顯示:RA在全世界均有發(fā)病，平均發(fā)病率為0.5~1.0 %，該病可發(fā)生于 青少年、成人及老人，且女性的發(fā)病率通常為男性的2~3倍，如不給予適當(dāng)治療，通常會(huì)導(dǎo) 致關(guān)節(jié)破壞和畸形，并且影響到患者的生活質(zhì)量;現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：滑膜襯內(nèi)細(xì)胞增生或 大量炎性細(xì)胞入侵、新生微血管、形成血管翳及軟骨組織遭破壞等均可在一定程度上導(dǎo)致 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，其中，血管翳和血管翳細(xì)胞等同于類風(fēng)濕性炎癥的滑膜組織、"罩" 或血管翳/軟骨/骨結(jié)合組織，是RA關(guān)節(jié)組織破壞的主要成分和基礎(chǔ)物質(zhì)，作為類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎的早期病理現(xiàn)象，其形成尤其依賴廣泛的新生血管網(wǎng)形成。因此，通過(guò)抑制血管新生以 延緩甚至阻止血管翳形成，已成為治療RA的新思路。
[0003] 中藥威靈仙為毛茛科植物威靈仙，棉團(tuán)鐵線蓮或東北鐵線蓮的干燥根及根莖，其 中以毛茛科植物威靈仙Clematis chinensis Osbeck.為該藥主要植物來(lái)源之一，威靈仙別 名有鐵腳威靈仙、鐵掃帚、風(fēng)車等，味辛，咸，性溫，歸膀胱經(jīng)，作為傳統(tǒng)中藥，在我國(guó)本草著 作中記載其具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痹痛、消骨鯁等功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛，肢體麻 木，筋脈拘攣，關(guān)節(jié)屈伸不利，以及諸骨鯁咽，是中醫(yī)治療風(fēng)濕痹癥的最常用中藥，而以威靈 仙為原料的多個(gè)中成藥也已相繼被成功研發(fā)上市，如"頸復(fù)康膠囊"等。
[0004] 近年來(lái)，威靈仙治療"風(fēng)濕痹病"的功效備受關(guān)注和重視，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)威靈仙的 藥理作用、化學(xué)成分均進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)威靈仙對(duì)動(dòng)物急性炎癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎均具 有良好的治療作用，能降低細(xì)胞因子IL-lβ、IL-2、TNF-α、PGE2的含量，并且對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有 保護(hù)作用，表明威靈仙具有良好的"祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛"的功效。
[0005] 但目前，關(guān)于威靈仙真正有效部分的研究還鮮有報(bào)道，現(xiàn)有技術(shù)中也有從威靈仙 中提取藥物成分的，但是提取成分雜質(zhì)含量大，藥效低，不能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)資源的有效利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種威靈仙有效組 分的制備方法及由該方法制得的威靈仙有效組分。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述制得的威靈仙有效組分在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 藥物制備中的應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種威靈仙有效組分的制備方法，包括以下步驟：
[0010](一)提取:取威靈仙粉碎，加入6-8倍量90-95 %乙醇回流提取60-90分鐘，過(guò)濾，得 到第一提取液和第一濾渣;取第一濾渣，在第一濾渣中再加入6-8倍量90-95%乙醇回流提 取60-90分鐘，過(guò)濾，得到第二提取液和第二濾渣;合并第一濾渣和第二濾渣，得到第三濾 渣；
[0011] 在第三濾渣中，加入6-8倍量40-55 %乙醇回流提取60-90分鐘，過(guò)濾，得到第三提 取液和第三濾渣;再在第三濾渣中加入6-8倍量40-55%乙醇回流提取60-90分鐘，過(guò)濾，得 到第四提取液和第四濾渣；
[0012] 合并第一提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液， 減壓濃縮，得到威靈仙總提取物浸膏；
[0013 ](二)萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚萃取3-5 次，分離除去石油醚層，得到萃余液;再按照體積比為1:1的比例在萃余液中加入乙酸乙酯， 萃取3-5次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物；
[0014](三)將威靈仙乙酸乙酯萃取物過(guò)硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相進(jìn)行梯 度洗脫，分段收集洗脫液，并于254nm處對(duì)洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并餾分，得到威靈仙 有效組分。
[0015]在步驟(一）中，取威靈仙粉碎，加入8倍量95 %乙醇回流提取90分鐘，過(guò)濾，得到第 一提取液和第一濾渣;取第一濾渣，在第一濾渣中再加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘， 過(guò)濾，得到第二提取液和第二濾渣;合并第一濾渣和第二濾渣，得到第三濾渣；
[0016] 在第三濾渣中，加入8倍量50%乙醇回流提取90分鐘，過(guò)濾，得到第三提取液和第 三濾渣;再在第三濾渣中加入8倍量50 %乙醇回流提取90分鐘，過(guò)濾，得到第四提取液和第 四濾渣。
[0017] 在步驟(二）中，按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚萃 取3次，分離除去石油醚層，得到萃余液;再按照體積比為1:1的比例在萃余液中加入乙酸乙 酯，萃取3次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物。
[0018] 在步驟(三）中，用石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的具體步驟為：
[0019] 將石油醚和乙酸乙酯分別按照體積為20:1、6:1、2:1、1:2和0:1的比例依次進(jìn)行梯 度洗脫，每次洗脫3個(gè)柱體積。
[0020] 采用上述制備方法制備得到的威靈仙有效組分。
[0021 ]上述威靈仙有效組分在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物制備中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明的有益效果為：
[0023] 本發(fā)明在威靈仙的提取步驟中，首先用95%乙醇提取，得到極性小的醇溶性物質(zhì)， 再采用50%乙醇提取，得到皂苷類等極性大的物質(zhì)，使得威靈仙中極性大和極性小的物質(zhì) 均被提取出來(lái)，提取率高，提取更完全。
[0024] 本發(fā)明在萃取步驟中，先采用石油醚進(jìn)行萃取，除去石油醚萃取物雜質(zhì)，再采用乙 酸乙酯進(jìn)行萃取，大大提高了萃取率，有效提高了威靈仙有效組分的純度。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1至圖14分別為本發(fā)明威靈仙有效組分Fra. 1~Fra. 14各個(gè)餾分對(duì)HUVEC細(xì)胞增 殖的抑制效果圖；
[0026]圖15為本發(fā)明威靈仙有效組分Fra.6的HPLC分析圖；
[0027]圖16為本發(fā)明威靈仙有效組分Fra. 11的HPLC分析圖；
[0028]圖17為本發(fā)明威靈仙有效組分Fra. 12的HPLC分析圖；
[0029]圖18為本發(fā)明威靈仙有效組分Fra. 13的HPLC分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施例及 相應(yīng)的附圖對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。
[0031] 實(shí)施例1
[0032](一)提取:取威靈仙粉碎，加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘，過(guò)濾，得到第一提 取液和第一濾渣;在第一濾渣中加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘，得到第二提取液和第 二濾渣，這兩次提取，主要提取威靈仙中的醇溶性物質(zhì);再在第二濾渣中加入8倍量50%乙 醇回流提取90分鐘，得到第三提取液和第三濾渣;在第三濾渣中加入8倍量50 %乙醇回流提 取90分鐘，得到第四提取液和第四濾渣，這兩次提取主要提取威靈仙中的皂苷類大極性物 質(zhì);合并第一提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液，再進(jìn)行 減壓濃縮，除去乙醇，得到威靈仙總提取物浸膏；
[0033](二)萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚，搖勻混 勻后，靜置分層，下層為水層，上層為石油醚層，分離出石油醚層，按照上述同樣的方法，萃 取3次，以除去威靈仙總提取物中的脂肪類物質(zhì)，收集萃余液;再按照體積比為1:1的比例在 萃余液中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取三次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物；
[0034](三)將威靈仙乙酸乙酯萃取物過(guò)硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相依次按 照體積為20 :1、6 :1、2 :1、1: 2和0 :1的比例進(jìn)行梯度洗脫，每500ml收集一次洗脫液，再于 254nm處對(duì)洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并餾分，得到洗脫餾分Fra. 1~14，即威靈仙有效組 分。
[0035] 實(shí)施例2
[0036](一)提取:取威靈仙粉碎，加入6倍量90%乙醇回流提取60分鐘，過(guò)濾，得到第一提 取液和第一濾渣;在第一濾渣中加入6倍量90%乙醇回流提取60分鐘，得到第二提取液和第 二濾渣;在第二濾渣中加入6倍量55 %乙醇回流提取60分鐘，得到第三提取液和第三濾渣； 在第三濾渣中加入6倍量55%乙醇回流提取60分鐘，得到第四提取液和第四濾渣;合并第一 提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液，再進(jìn)行減壓濃縮，得 到威靈仙總提取物浸膏；
[0037](二)萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚，搖勻混 勻后，靜置分層，下層為水層，上層為石油醚層，分離出石油醚層，按照上述同樣的方法，萃 取5次，以除去威靈仙總提取物中的脂肪類物質(zhì)，收集萃余液;再按照體積比為1:1的比例在 萃余液中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取5次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物；
[0038](三)將威靈仙乙酸乙酯萃取物過(guò)硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相依次按 照體積為20 :1、6 :1、2 :1、1: 2和0 :1的比例進(jìn)行梯度洗脫，每500ml收集一次洗脫液，再于 254nm處對(duì)洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并餾分，得到洗脫餾分Fra. 1~14，即威靈仙有效組 分。
[0039] 實(shí)施例3
[0040](一)提取:取威靈仙粉碎，加入7倍量93%乙醇回流提取80分鐘，過(guò)濾，得到第一提 取液和第一濾渣;在第一濾渣中加入7倍量93%乙醇回流提取80分鐘，得到第二提取液和第 二濾渣;在第二濾渣中加入7倍量40 %乙醇回流提取70分鐘，得到第三提取液和第三濾渣； 在第三濾渣中加入7倍量40%乙醇回流提取70分鐘，得到第四提取液和第四濾渣;合并第一 提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液，再進(jìn)行減壓濃縮，得 到威靈仙總提取物浸膏；
[0041 ](二)萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚，搖勻混 勻后，靜置分層，下層為水層，上層為石油醚層，分離出石油醚層，按照上述同樣的方法，萃 取4次，以除去威靈仙總提取物中的脂肪類物質(zhì)，收集萃余液;再按照體積比為1:1的比例在 萃余液中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取5次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物；
[0042](三)將威靈仙乙酸乙酯萃取物過(guò)硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相依次按 照體積為20 :1、6 :1、2 :1、1: 2和0 :1的比例進(jìn)行梯度洗脫，每500ml收集一次洗脫液，再于 254nm處對(duì)洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并餾分，得到洗脫餾分Fra. 1~14，即威靈仙有效組 分。
[0043] 實(shí)施例4
[0044] 將實(shí)施例1至3制得的威靈仙有效組分作為藥物活性成分制備成用于治療類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物;該藥物組合物包括威靈仙有效組分Fra. 1~14,根據(jù)需要還可以加 入藥物可接受的載體，通過(guò)將威靈仙有效組分Fra. 1~14和藥物可接受的載體混合制備得 到。
[0045] 實(shí)施例5:利用HUVEC模型評(píng)價(jià)威靈仙有效組分的各餾分活性
[0046]以實(shí)施例1制得的威靈仙有效組分Fra. 1~14為例，采用HUVEC模型評(píng)價(jià)威靈仙有 效組分的各餾分活性；
[0047] HUVEC細(xì)胞采用 1640培養(yǎng)基（含 10%FBS、100U · mL-1 青霉素、100yg · mL-1 鏈霉素）、 放置于37°C、含5%C02的飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用 0.25 %胰酶與0.02 % EDTA( V: V= 1:1)進(jìn)行消化，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0048] 選取第4-5代HUVEC細(xì)胞，用0.25 %胰酶消化成單細(xì)胞懸液后，離心去上清，調(diào)整細(xì) 胞濃度為3 X 104個(gè)· ml/1，接種于96孔板，每孔100yL，培養(yǎng)24h后，分別加入實(shí)施例1制備得 到的威靈仙有效組分Fra. 1~14(終濃度為0.3、0.1、0.03、0.01 mg · mL-1)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì) 照，繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后每孔加入MTS 20yL，培養(yǎng)4h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A490，以A實(shí)驗(yàn)組/A空白 組作為指標(biāo)評(píng)判威靈仙乙酸乙酯部位餾分Fra. 1~14對(duì)HUVEC增殖的影響，結(jié)果如圖1至圖 14所示：
[0049] 從圖1至圖14中可以看出，威靈仙有效組分Fra. 1~14對(duì)HUVEC細(xì)胞的增殖均有一 定的抑制效果，其中，F(xiàn)ra. 6及Fra. 11~13對(duì)HUVEC細(xì)胞的抑制效果最好，說(shuō)明以上威靈仙有 效組分可通過(guò)抑制HUVEC細(xì)胞的增殖而發(fā)揮抑制血管新生的作用，從而阻止血管翳的生成， 達(dá)到對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療和預(yù)防效果。
[0050] 實(shí)施例6:對(duì)Fra. 6餾分的成分分析
[0051 ] 利用液相進(jìn)行有效組分精制，色譜柱為YMC-Pack 0DS-A/S-5um/12nm(250mm* 10.0mm)，流速為2mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm;
[0052] Fra. 6餾分洗脫條件：甲醇:0.2 %乙酸溶液=65:35，色譜圖如圖15所示;Fra. 6餾 分經(jīng)甲醇溶解，經(jīng)制備液相色譜儀分離，收集36min~66min洗脫液，減壓濃縮得到Fra. 6精 制餾分;其成分表如下：
[0053]
[0054] 實(shí)施例7:對(duì)Fra. 11餾分的成分分析
[0055] Fra. 11餾分洗脫條件：乙腈:0.2 %乙酸溶液=15:85，色譜圖如圖16所示；
[0056] Fra. 11餾分經(jīng)甲醇溶解，經(jīng)制備液相色譜儀分離，收集63.5min~82.4min洗脫液， 減壓濃縮得到Fra. 11精制餾分，其成分表如下：
[0057]
[0058]
[0059] 實(shí)施例8:對(duì)Fra. 12餾分的成分分析
[0060] Fra. 12餾分洗脫條件：乙腈:0.2 %乙酸溶液=18:82，色譜圖如圖17所示；
[00611 Fra. 12餾分經(jīng)甲醇溶解，經(jīng)制備液相色譜儀分離，收集9.5min~41.2min洗脫液， 減壓濃縮得到Fra. 11精制餾分，其成分表如下：
[0062]
[0063]
_[_I_j_······> .._
[0064] 實(shí)施例9:對(duì)Fra. 13餾分的成分分析
[0065] Fra. 13餾分洗脫條件：甲醇:0.2 %乙酸溶液=85:15，色譜圖如圖18所示：
[0066] Fra. 13餾分經(jīng)甲醇溶解，經(jīng)制備液相色譜儀分離，收集12. lmin~42min洗脫液，減 壓濃縮得到Fra. 13精制餾分，其成分表如下：
[0067]
[0068] 綜上所述，本發(fā)明的威靈仙有效組分的提取工藝簡(jiǎn)單，成本低，易于實(shí)現(xiàn)，得到的 有效組分純度高，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用顯著，具有十分重要的價(jià)值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種威靈仙有效組分的制備方法，其特征是，包括以下步驟： (一） 提?。喝⊥`仙粉碎，加入6-8倍量90-95%乙醇回流提取60-90分鐘，過(guò)濾，得到第 一提取液和第一濾渣;取第一濾渣，在第一濾渣中再加入6-8倍量90-95%乙醇回流提取60-90分鐘，過(guò)濾，得到第二提取液和第二濾渣;合并第一濾渣和第二濾渣，得到第三濾渣； 在第三濾渣中，加入6-8倍量40-55%乙醇回流提取60-90分鐘，過(guò)濾，得到第三提取液和 第三濾渣;再在第三濾渣中加入6-8倍量40-55%乙醇回流提取60-90分鐘，過(guò)濾，得到第四提 取液和第四濾渣； 合并第一提取液、第二提取液、第三提取液和第四提取液，得到威靈仙總提取液，減壓 濃縮，得到威靈仙總提取物浸膏； (二） 萃取:按照體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚萃取3-5次， 分離除去石油醚層，得到萃余液;再按照體積比為1:1的比例在萃余液中加入乙酸乙酯，萃 取3-5次，分離后，得到威靈仙乙酸乙酯萃取物； (三) 將威靈仙乙酸乙酯萃取物過(guò)硅膠柱，用石油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗 脫，分段收集洗脫液，并于254nm處對(duì)洗脫液進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并餾分，得到威靈仙有效 組分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的威靈仙有效組分的制備方法，其特征是，在步驟(一）中，取威 靈仙粉碎，加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘，過(guò)濾，得到第一提取液和第一濾渣;取第一 濾渣，在第一濾渣中再加入8倍量95%乙醇回流提取90分鐘，過(guò)濾，得到第二提取液和第二濾 渣;合并第一濾渣和第二濾渣，得到第三濾渣； 在第三濾渣中，加入8倍量50%乙醇回流提取90分鐘，過(guò)濾，得到第三提取液和第三濾 渣；再在第三濾渣中加入8倍量50%乙醇回流提取90分鐘，過(guò)濾，得到第四提取液和第四濾 渣。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的威靈仙有效組分的制備方法，其特征是，在步驟(二）中，按照 體積比為1:1的比例在威靈仙總提取物浸膏中加入石油醚萃取3次，分離除去石油醚層，得 到萃余液;再按照體積比為1:1的比例在萃余液中加入乙酸乙酯，萃取3次，分離后，得到威 靈仙乙酸乙酯萃取物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的威靈仙有效組分的制備方法，其特征是，在步驟(三）中，用石 油醚和乙酸乙酯作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫的具體步驟為： 將石油醚和乙酸乙酯分別按照體積為20:1、6:1、2:1、1:2和0:1的比例依次進(jìn)行梯度洗 脫，每次洗脫3個(gè)柱體積。5. 采用權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的威靈仙有效組分。6. 權(quán)利要求5所述的威靈仙有效組分在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物制備中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P19/02GK106038728SQ201610365432
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】付強(qiáng), 鄭玉忠, 袁海梅, 陳江
【申請(qǐng)人】成都大學(xué)