一種栘*屬植物多酚提取物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種栘屬植物多酚提取物，所述提取物中多酚含量為91.24％～91.34％w/w。本發(fā)明還提供了所述提取物的制備方法。采用本發(fā)明提取條件能最大限度從栘屬植物中提取得到多酚類物質(zhì)，提取率高達(dá)18.54％；進(jìn)一步采用本發(fā)明純化方法對(duì)上述粗提物進(jìn)行純化后，可得到高純度的多酚和根皮苷。藥效實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明栘多酚提取物可顯著降低小鼠血清中的膽固醇TC、甘油三脂TG、高密度脂蛋白HDL?C、低密度脂蛋白LDL?C水平，表明其可有效防治機(jī)體中的血脂含量異常引起的肥胖、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等脂質(zhì)代謝異常疾病。
【專利說(shuō)明】
_種栘_棖.屬植物多酚提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種栘濃屬植物多酚提取物及其制備方法，屬于功能食品、醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 栘核是薔薇科栘核屬植物的通稱，有三個(gè)種：云南栘梭Docynia delavayi (Franch · )Schneid、栘核Docynia indica(Wall · )Dcne ·和長(zhǎng)爪栘核Docynia longiunguis Q.Luo et J.L.Liu，主要分布于云貴川等地，其中云南栘;隊(duì)是當(dāng)?shù)赜忻囊吧?br>[0003] 目前，對(duì)于栘梭屬植物的研究開(kāi)發(fā)還處于初級(jí)階段，關(guān)于栘核屬植物的基礎(chǔ)性研 究還很不足，對(duì)其有效成分的研究很少，造成了較大的資源浪費(fèi)。劉海霞等對(duì)傳統(tǒng)的Folin-Ciocalteu比色法進(jìn)行改良，建立了一種專屬性強(qiáng)的栘核多酚的測(cè)定方法，為栘濃屬植物 資源的綜合利用和開(kāi)發(fā)提供理論支持(栘梭屬植物多酚的含量測(cè)定與比較[J].食品科 學(xué).2014,35(24):295~300)。劉剛等(云南栘棟葉提取物片段抗氧化活性及成分分析[刀. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào).2014,39(9):73~81)研究發(fā)現(xiàn)云南栘被葉中含有較高活性的抗氧化成 分，其中有四種化合物是典型的黃酮類化合物，為云南栘糧抗氧化功能的開(kāi)發(fā)提供了理論 依據(jù)。
[0004] 然而，迄今尚未見(jiàn)對(duì)栘依屬植物中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行最大限度提取并進(jìn)一步分離 純化的的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種栘依屬植物多酚提取物及其制備方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種栘彳農(nóng)屬植物多酚提取物，所述提取物中多酚含量為91.24%~ 91 · 34%w/w〇
[0007] 進(jìn)一步的，所述提取物中根皮苷含量為87.49%~88.26 % w/w。
[0008] 優(yōu)選的，所述提取物中多酚含量為91.34 % w/w，根皮苷含量為87.49 % w/w。
[0009] 進(jìn)一步的，所述的栘振屬植物多酚提取物為栘核屬植物葉的多酚提取物。
[0010] 更進(jìn)一步的，所述的栘棟屬植物為栘，梭Docynia indica(Wall ·) Dene.。
[0011] 本發(fā)明提供了一種所述栘核屬植物多酚提取物的制備方法，包括如下步驟：
[0012] a、取栘梭屬植物，粉碎，乙醇超聲提取，濃縮提取液，得栘核3粗提物；
[0013] b、對(duì)D-101型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理；
[0014] c、取a步驟粗提物，上樣于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的D-101型大孔吸附樹(shù)脂，用乙醇洗脫，收集 洗脫液，濃縮，即得栘依屬植物多酚提取物。
[0015]進(jìn)一步的，
[0016] a步驟超聲提取條件為:超聲功率800W，超聲頻率40KHz，用63%v/v乙醇水溶液按 液料比20:1，于65°C提取41min，提取2次；
[0017] b步驟預(yù)處理方法為:將大孔樹(shù)脂D-101用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇水溶液密封浸泡 24h后，用超純水沖洗至無(wú)醇味;再用5%HC1溶液密封浸泡2~4h，用超純水沖洗至中性;最 后用2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超純水沖洗至中性，備用；
[0018] C步驟上樣溶液質(zhì)量濃度為25mg/mL，洗脫劑為50 % v/v乙醇水溶液，洗脫體積為1 ~8BV，洗脫流速為3mL/min。
[0019] 更進(jìn)一步的，c步驟洗脫體積為4BV。
[0020] 本發(fā)明提供了一種治療和/或預(yù)防脂質(zhì)代謝異常的藥物，它是以有效量所述的栘 核屬植物多酚提取物為活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制 劑。
[0021] 本發(fā)明提供了一種栘核屬植物多酚提取物，所述提取物中多酚含量為91.24%~ 92.12%w/w〇
[0022] 本發(fā)明還提供了所述提取物的制備方法。采用本發(fā)明提取條件能最大限度從栘濃 屬植物中提取得到多酚類物質(zhì)，提取率高達(dá)18.54%;進(jìn)一步采用本發(fā)明純化方法對(duì)上述粗 提物進(jìn)行純化后，多酚的含量由原來(lái)的（39.7 ± 0.25) %提高到(92.33 ± 0.99) %，提高了近 2.3倍，多酚回收率高達(dá)92 %，純化效果明顯。
[0023] 同時(shí)，經(jīng)測(cè)定，根皮苷的含量為(85.22±0.78) %，占多酚比例為92.3%，說(shuō)明純化 物中多酚的主要成分即為根皮苷，也即說(shuō)明栘核多酚的主要組成成分為根皮苷。
[0024] 因此，利用該工藝經(jīng)一次純化可得到高純度的多酚和根皮苷。
[0025] 藥效實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明栘棟多酚提取物可顯著降低小鼠血清中的膽固醇TC、甘油 三脂TG、高密度脂蛋白HDL-C、低密度脂蛋白LDL-C水平，表明其可有效防治機(jī)體中的血脂含 量異常引起的肥胖、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等脂質(zhì)代謝異常疾病。
[0026] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0027]以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)栘H多酚提取率的影響圖；
[0029] 圖2為不同的提取時(shí)間對(duì)栘彳衣多酚提取率的影響圖；
[0030] 圖3為不同的提取溫度對(duì)栘梭多酚提取率的影響圖；
[0031] 圖4為上樣濃度對(duì)栘核多酚純化工藝的影響圖；
[0032] 圖5為洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)栘核多酚純化工藝的影響圖；
[0033] 圖6為洗脫流速對(duì)栘核多酚純化工藝的影響圖；
[0034] 圖7為洗脫體積對(duì)栘棟多酚純化工藝的影響圖；
[0035] 圖8為不同體積洗脫液洗脫后所得純化物中多酚與根皮苷含量圖；
[0036]圖9為不同濃度DT溶液對(duì)胰脂肪酶活力的影響圖；
[0037]圖10為不同濃度的DC溶液對(duì)胰脂肪酶活力的影響圖；
[0038]圖11為不同濃度DT溶液對(duì)胰蛋白酶活力的影響圖；
[0039]圖12為不同濃度的DC溶液對(duì)胰蛋白酶活力的影響圖；
[0040]圖13為不同濃度DT溶液對(duì)胰淀粉酶活力的影響圖；
[0041 ]圖14為不同濃度的DC溶液對(duì)胰淀粉酶活力的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042]本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過(guò)購(gòu)買市售產(chǎn)品獲得。
[0043] 實(shí)施例1本發(fā)明栘椒屬植物多酚提取物的制備
[0044] 準(zhǔn)確稱取研磨后的移|衣Docynia indica(Wall. )Dcne.葉lkg，超聲功率800W，超聲 頻率40KHz，用63 %乙醇按液料比20:1 (mL/g)，在65 °C下提取4lmin，提取2次，合并提取液， 濃縮，得粗提物；
[0045] 對(duì)D-101型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理:將大孔樹(shù)脂D-101用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙 醇水溶液密封浸泡24h后，用超純水沖洗至無(wú)醇味;再用5 %HC1溶液密封浸泡2~4h，用超純 水沖洗至中性;最后用2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超純水沖洗至中性，備用；
[0046] 取粗提物，上樣于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的D-101型大孔吸附樹(shù)脂，上樣溶液質(zhì)量濃度為 25mg/mL，上樣體積為10BV，上樣流速為lmL/min。上樣完成后，用50%v/v乙醇水溶液洗脫， 洗脫體積為4BV(BV即樹(shù)脂床體積），洗脫流速為3mL/min，收集洗脫液，濃縮凍干，即得栘核 屬植物多酚純化物4.3g，測(cè)定其中多酚含量為91.34%，根皮苷含量為87.49 %。按所使用樣 品上樣兩種多酚含量計(jì)算，上樣多酚質(zhì)量為5.0g，所得純化物中多酚為3.9g，多酚回收率為 78% 〇
[0047] 實(shí)施例2本發(fā)明栘棟屬植物多酚提取物的制備
[0048] 準(zhǔn)確稱取研磨后的栘依Docynia indica(Wall · )Dcne ·葉lkg，超聲功率800W，超聲 頻率40KHz，用63 %乙醇按液料比20:1 (mL/g)，在65 °C下提取4lmin，提取2次，合并提取液， 濃縮，得粗提物；
[0049] 對(duì)D-101型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理:將大孔樹(shù)脂D-101用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇 水溶液密封浸泡24h后，用超純水沖洗至無(wú)醇味;再用5 % HC1溶液密封浸泡2~4h，用超純水 沖洗至中性;最后用2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超純水沖洗至中性，備用；
[0050] 取粗提物，上樣于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的D-101型大孔吸附樹(shù)脂，上樣溶液質(zhì)量濃度為 25mg/mL，上樣體積為10BV，上樣流速為lmL/min。上樣完成后，用50%v/v乙醇水溶液洗脫， 洗脫體積為8BV(BV即樹(shù)脂床體積），洗脫流速為3mL/min，收集洗脫液，濃縮凍干，即得栘依 屬植物多酚純化物4.8g，其中，多酚含量為91.24%，根皮苷含量為88.26 %。按所使用樣品 上樣兩種多酚含量計(jì)算，上樣多酚質(zhì)量為5.0g，所得純化物中多酚為4.38g，多酚回收率為 87.6%〇
[0051 ]以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)例證明本發(fā)明的有益效果。
[0052]實(shí)驗(yàn)例1超聲提取工藝各因素對(duì)栘核多酚提取率的影響 [0053] 1、材料、試劑與儀器
[0054] 材料與試劑
[0055] 移依0〇〇}〇1丨&;[11(1;[0&(￥&11.)0016.葉于2014年4月米于四川省西昌市，經(jīng)西昌學(xué) 院羅強(qiáng)教授鑒定，符合該物種的特征。
[0056] 根皮苷對(duì)照品（HPLC>98%，購(gòu)于四川省成都市植標(biāo)化純有限公司）；Folin-Ciocaileus試劑(FC試劑，購(gòu)于上海如吉生物科技有限公司）；乙醇(分析純）、無(wú)水碳酸鈉 (分析純）（購(gòu)于成都科龍有限公司）。
[0057]儀器 [0058] LUUbV」2、粒測(cè)萬(wàn)法
[0060] 2.1樣品處理
[0061]取新鮮的栘|衣葉片，用清水清洗干凈，置60°C烘箱中烘干，粉碎，過(guò)40目篩，置于陰 涼干燥處備用。
[0062] 2.2栘濃多酚含量的測(cè)定
[0063] 樣品中多酚含量的測(cè)定:將提取液濃縮定容至50mL，稀釋至一定濃度后取0.5mL， 加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的Na2C03溶液2.5mL，再加 FC顯色劑0.5mL，在55 °C條件下反應(yīng)7min，在 760nm測(cè)定吸光度，計(jì)算多酚含量。
[0064]根據(jù)下式計(jì)算多酚提取率：
[0065] 栘依多酚提取率（％)=CXNXVX100/M
[0066] 式中：C-樣液中多酚含量(yg/mL);
[0067] V-樣液的體積(mL);
[0068] N-稀釋倍數(shù)；
[0069] M-栘依葉片干粉的質(zhì)量(mg)。
[0070] 3、實(shí)驗(yàn)方法
[0071 ] (1)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)栘核多酚提取率的影響
[0072 ]準(zhǔn)確稱取研磨后的栘棟葉5份，每份10.0g，按1:20 (g/mL)料液比分別加入蒸餾水、 30 %、50 %、70 %、95 %乙醇，常溫、800W、40KHz、超聲提取30min，抽濾，收集濾液，濃縮蒸干 得浸膏，再用70%乙醇稀釋定容至50mL，放置備用。精密移取0.5mL樣品溶液，測(cè)定溶液多酚 含量，計(jì)算出多酚的提取率，每個(gè)處理重復(fù)三次，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0073] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在0%-70%濃度范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度的增加，栘核多酚的提取率隨之 增加；當(dāng)乙醇濃度超過(guò)70%，提取率下降。
[0074] (2)提取時(shí)間對(duì)栘梭多酚提取率的影響
[0075] 準(zhǔn)確稱取研磨后的栘棖葉5份，每份10 . OOOOg，按1: 20(g/mL)料液比加入70 %乙 醇，常溫、800W、40KHz，分別超聲提取 1511^11、3〇1^11、451^11、6〇1^11、751^11，抽濾，收集濾液濃 縮蒸干得浸膏，再用70%乙醇稀釋定容至50mL，放置備用。精密移取0.5mL樣品溶液，測(cè)定溶 液多酚含量，計(jì)算出多酚的提取率，每個(gè)處理重復(fù)三次，結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0076]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在75min內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增加，提取率先增加后趨于平緩。但35min 后再延長(zhǎng)時(shí)間則對(duì)多酚的提取率影響不大。
[0077] (3)提取溫度對(duì)栘權(quán)多酚提取率的影響
[0078] 準(zhǔn)確稱取研磨后的栘核葉6份，每份10.0 OOOg，按1: 20 (g/mL)料液比加入70 %乙 醇，分別在常溫、35、45、55、65、75 °C下，800W、40KHz，超聲提取30min，抽濾，收集濾液濃縮蒸 干得浸膏，再用70 %乙醇稀釋定容至50mL，放置備用。精密移取0.5mL樣品溶液，測(cè)定溶液多 酚含量，計(jì)算出多酚的提取率，每個(gè)處理重復(fù)三次，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0079]實(shí)驗(yàn)結(jié)果：隨著溫度的增加，提取率總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到65 °C時(shí)，提取 率達(dá)到最大，溫度再上升，提取率有微弱的降低。
[0080] 實(shí)驗(yàn)例2不同超聲提取條件下栘核多酚提取率的對(duì)比
[0081] 共設(shè)計(jì)16個(gè)試驗(yàn)組，分別采用本發(fā)明最佳超聲提取條件(試驗(yàn)組16)及其他提取條 件對(duì)栘核葉進(jìn)行提取，并對(duì)比其所得栘核多酚提取率，檢測(cè)方法同實(shí)驗(yàn)例1，結(jié)果見(jiàn)表1。本 實(shí)驗(yàn)主要對(duì)比了乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比三種因素對(duì)提取率的影響，其他提取條件參數(shù) 為:各組均在8001，401(抱，65°(：下超聲提取2次。
[0082] 表1不同超聲提取條件下栘棟多酚提取率的對(duì)比
[0083]
[0084] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:試驗(yàn)組16多酚提取率最高，達(dá)18.54%，其他試驗(yàn)組即使對(duì)乙醇濃度、提 取時(shí)間或液料比作略微的調(diào)整都會(huì)導(dǎo)致多酚提取率降低。
[0085]以上實(shí)驗(yàn)表明，僅有在本發(fā)明最佳提取條件下，即：用63%乙醇水溶液按液料比20 :1，在65°C下提取41min，提取2次，才能得到最高的多酚提取率。
[0086] 實(shí)驗(yàn)例3不同純化條件對(duì)栘核多酚純化效果的影響
[0087] 1、材料、試劑與儀器
[0088] 移核0〇〇}〇1丨&;[11(1;[0&(此11.)0016.葉于2014年4月米于四川省西昌市，經(jīng)西昌學(xué) 院羅強(qiáng)教授鑒定，符合該物種特征。將葉用蒸餾水清洗3次，于50°C烘箱中烘干，粉碎，過(guò)40 目篩，備用。
[0089] D-101、AB-8、NKA-9型大孔吸附樹(shù)脂成都市萇鉦化玻有限公司（樹(shù)脂基本理化性質(zhì) 見(jiàn)下表）；？〇1111-(^0〇&116118試劑（？(：試劑）上海如吉生物科技有限公司；根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品 (HPLC>98% )四川省成都市植標(biāo)化純有限公司，批號(hào)：141027;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 [0090] 三種樹(shù)脂理化性質(zhì)對(duì)比
[0091]
[0092] 2、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
[0093] 2.1栘棟葉乙醇提取物的制備
[0094] 稱取栘棟葉粉末，按料液比1: 20的比例加入65 %的乙醇溶液，常溫下超聲提取 40min，過(guò)濾，將濾液濃縮、凍干為粉末，即為栘棟葉提取物(DT)，并將其放置于陰涼干燥處 備用。
[0095] 2.2多酚含量的測(cè)定
[0096]采用實(shí)驗(yàn)例1檢測(cè)方法測(cè)定栘棟多酚含量。未經(jīng)純化的栘核葉乙醇提取物凍干 后，經(jīng)測(cè)定其多酚含量為(39.7± 1.25) %。
[0097] 2.3根皮苷含量的測(cè)定
[0098] HPLC法色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18柱（4.6X250mm，5ym);流 動(dòng)相為A: C=乙腈:超純水，線性梯度洗脫:0-10min，15 % -50 % A: 85 % -50 % C;流速為lmL/ min，柱溫為25 °C，進(jìn)樣量為6yL，檢測(cè)波長(zhǎng)為285nm。
[0099] 以根皮苷為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定不同濃度根皮苷溶液的峰面積，并以根皮苷質(zhì)量濃度為 橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得線性回歸方程y = 0.2147X+1.0425，R2 = 0.9999， 用于檢測(cè)洗脫液中根皮苷的質(zhì)量濃度。
[0100] 2.4大孔樹(shù)脂預(yù)處理
[0101] 分別將三種極性不同的大孔樹(shù)脂D-101、AB-8、NKA-9用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶 液密封浸泡24h后，用超純水沖洗至無(wú)醇味;再用5 %HC1溶液密封浸泡2~4h，用超純水沖洗 至中性;最后用2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超純水沖洗至中性，備用。
[0102] 3、實(shí)驗(yàn)方法
[0103] 3.1、靜態(tài)吸附與解吸附
[0104] 分別準(zhǔn)確稱取3種經(jīng)預(yù)處理后的樹(shù)脂3g，用濾紙吸干表面水分，放入100 mL具塞磨 口錐形瓶中，加入DT溶液5mL，常溫下140r/min震蕩24h進(jìn)行靜態(tài)吸附后，取上清液于760nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，計(jì)算其中多酚的質(zhì)量濃度，按式（1)、（2)計(jì)算吸附量和吸附率;將充分吸 附的樹(shù)脂過(guò)濾，用蒸餾水沖洗后濾干，置于l〇〇mL具塞三角瓶中，加入30mL 70%乙醇，室溫 下在120r/min條件下振蕩24h解析后，取上清液于760nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，計(jì)算其中多酚的 質(zhì)量濃度，按式(3 )、（ 4)計(jì)算其解析率和多酚回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109] 式中：C0-DT溶液中多酚的質(zhì)量濃度(mg/mL);
[0110] Cl-吸附后上清液中多酚的質(zhì)量濃度(mg/mL);
[0111] C2-解析后上清液中多酚的質(zhì)量濃度(mg/mL);
[0112] V0-DT溶液的上樣體積(mL);
[0113] VI-洗脫液的體積(mL);
[0114] Μ-樹(shù)脂的質(zhì)量(g)。
[0115] 表2三種不同樹(shù)脂對(duì)栘核多酚的靜態(tài)吸附與解析性能
[0116]
[0117] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:三種樹(shù)脂的吸附率相差不大，均在95%以上。D-101樹(shù)脂的吸附率、吸附 量與AB-8和NKA-9樹(shù)脂的吸附率、吸附量差異極顯著(P<0.01)，AB-8樹(shù)脂與NKA-9樹(shù)脂的吸 附率、吸附量差異不顯著（P>〇.〇5);而D-101樹(shù)脂與AB-8樹(shù)脂的解析率無(wú)顯著差異（P> 0.05 )，與NKA-9樹(shù)脂的解析率差異顯著(P<0.05)。其中，D-101樹(shù)脂的吸附率、吸附量和解 吸率分別為（96.60±0.29)%、（6.28±0.02)11^/^和（89.21±2.33)%，均大于厶8-8和疆八-9 樹(shù)脂的吸附率、吸附量和解吸率。同時(shí)，經(jīng)過(guò)D-101樹(shù)脂純化后的多酚回收率為（86.17 ± 2.38)%，也大于48-8和疆4-9樹(shù)脂對(duì)多酚的回收率。
[0118] 以上實(shí)驗(yàn)表明，D101樹(shù)脂用于純化栘依多酚效果最佳。
[0119] 3.2、不同上樣濃度對(duì)栘梭多酚純化工藝的影響
[0120] 稱取適量DT粉末，用超純水溶解、配置成質(zhì)量濃度不同的DT溶液(5、10、15、20、25、 30mg/mL)，冷藏備用。稱取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的D-101型大孔吸附樹(shù)脂濕法裝柱（Φ 1.5cmX40cm)， 以一定的流速上樣DT溶液至整個(gè)層析柱(上樣量為10mL)，然后靜態(tài)吸附lh，使吸附平衡后， 用蒸餾水洗至流出液為無(wú)色，再用50%乙醇溶液勻速進(jìn)行洗脫，洗脫流速為2mL/min，并分 別收集洗脫液200mL，濃縮后定容至50mL，測(cè)定濃縮液中多酚的質(zhì)量濃度，按式(4)計(jì)算多酚 的回收率，以回收率對(duì)上樣溶液中多酚的質(zhì)量濃度作圖，繪制洗脫曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0121]實(shí)驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)上樣溶液的質(zhì)量濃度在5~25mg/mL之間時(shí)，多酚回收率總體呈現(xiàn)增 長(zhǎng)的趨勢(shì)，但增長(zhǎng)幅度不大，僅從(82.34± 1.61) %增加到(93.14± 1.05)%，當(dāng)上樣溶液質(zhì) 量濃度達(dá)到25mg/mL時(shí)，多酚回收率出現(xiàn)最大值，為(93.14± 1.05) %。但隨著上樣溶液質(zhì)量 濃度的進(jìn)一步增加，多酚回收率卻隨之下降，當(dāng)上樣溶液質(zhì)量濃度為30mg/mL時(shí)，多酚回收 率降至（79·36±1·27)%。
[0122] 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上樣溶液的最佳質(zhì)量濃度為25mg/mL。
[0123] 3.3、不同洗脫條件對(duì)栘棟多酚純化工藝的影響
[0124] 按上述最佳上樣條件上樣并吸附平衡后，通過(guò)動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，分別考察不同乙醇體積 分?jǐn)?shù)的洗脫劑、洗脫體積和洗脫流速對(duì)多酚純化的影響。
[0125] 3.3.1、乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察
[0126] 質(zhì)量濃度為25mg/mL的DT溶液上樣10mL并吸附平衡后，以不同體積分?jǐn)?shù)（0%、 10%、30%、50%、70%、90% )的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分別收集200mL洗脫液，計(jì)算多酚的回 收率，并以多酚回收率對(duì)乙醇的體積分?jǐn)?shù)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。
[0127] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在洗脫劑中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0~30%之間時(shí)，多酚回收率增加幅度很 小，僅從(5.08±0.94) %增加到（10.04± 1.33) %。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，多酚回 收率迅速增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50 %時(shí)達(dá)到最大值，為(74.72 ± 1.41) %。但隨著乙醇體 積分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加，多酚回收率未見(jiàn)明顯提升。
[0128] 以上實(shí)驗(yàn)表明，洗脫劑乙醇溶液的最佳體積分?jǐn)?shù)為50%。
[0129] 3.3.2、洗脫流速對(duì)解析的影響
[0130]質(zhì)量濃度為2511^/11^上樣溶液上樣1〇11^并吸附平衡后，體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶 液以不同洗脫流速（1 mL/m i η、2mL/m i η、3mL/m i η、4mL/m i η)進(jìn)行洗脫，分別收集2 0 OmL洗脫 液，濃縮后定容至50mL，計(jì)算多酚回收率，并以多酚回收率對(duì)乙醇的洗脫流速作圖，結(jié)果見(jiàn) 圖6〇
[0131 ]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)所選各洗脫流速下，多酚的回收率均差距不大，均在90 %左右。但 隨著洗脫流速的增加，多酚回收率卻呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；若洗脫流速太慢，又會(huì)延長(zhǎng)洗脫時(shí) 間。
[0132] 因此，綜合考慮時(shí)間與成本等因素，選擇3mL/min的洗脫流速作為最佳洗脫流速， 此時(shí)多酚回收率為(89.92± 1.92) %。
[0133] 3.3.3、洗脫體積對(duì)解析的影響
[0134] 質(zhì)量濃度為2511^/11^上樣溶液上樣1〇11^并吸附平衡后，體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶 液以3mL/min的洗脫流速進(jìn)行洗脫，分段(0.5BV)收集洗脫液，濃縮后定容至50mL，計(jì)算多酚 的回收率，并以多酚回收率對(duì)洗脫體積作圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。
[0135] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：當(dāng)洗脫體積由0.5BV增加到第1.5BV之間時(shí)，多酚回收率迅速?gòu)?3.13 土 1.25) %增加到（34.49±2.1) %。但隨著洗脫體積的不斷增加，多酚回收率卻越來(lái)越小；當(dāng) 洗脫體積達(dá)到4BV時(shí)，多酚回收率為(0.98±0.96) % ;洗脫體積繼續(xù)增加到5BV，多酚回收率 基本為0。
[0136] 因此，綜合考慮成本及洗脫效果等因素，確定其最佳洗脫體積為4BV，此時(shí)多酚總 回收率為(94·15±1·35)%。
[0137] 實(shí)驗(yàn)例4栘核多酚提取物中主要成分的確定
[0138] 稱取適量DT粉末，用蒸餾水溶解、配制成質(zhì)量濃度為25mg/mL的DT溶液，上樣10ml 并吸附平衡后，體積分?jǐn)?shù)為50 %的乙醇溶液以3mL/min的洗脫流速進(jìn)行洗脫，分別收集不同 體積（1BV、2BV、3BV、4BV，BV即樹(shù)脂床體積)洗脫液，濃縮凍干，得不同的純化物，測(cè)定其多酚 和根皮苷含量，結(jié)果見(jiàn)表3,圖8。
[0139] 表3不同體積洗脫液洗脫后所得純化物中多酚與根皮苷含量
[0140]
[0141] 對(duì)洗脫第1到第4個(gè)BV的洗脫液進(jìn)行濃縮凍干，測(cè)定其中多酚含量為91.34%，根皮 苷含量為87.49% ;合并第5到第8個(gè)BV的洗脫液，濃縮凍干測(cè)定其中多酚含量為91.24%，根 皮苷含量為88.26 % ;合并第11到第14個(gè)BV的洗脫液，進(jìn)行濃縮凍干，測(cè)定其中多酚含量為 92.12 %，根皮苷含量為89.21 %。
[0142] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:純化栘梭總多酚的最佳方法為:采用D-101樹(shù)脂，上樣溶液最佳質(zhì)量濃 度為25mg/mL的溶液，以層析柱裝柱后的最大上樣量上樣，洗脫液為50 %乙醇，洗脫體積為 8BV，洗脫流速為3mL/min。
[0143] 經(jīng)該工藝方法一次純化后，多酚的含量由原來(lái)的（39.7 ±0.25) %提高到(92.33 土 0.99) %，提高了近2.3倍，多酚回收率高達(dá)92 %，純化效果明顯。
[0144] 同時(shí)，經(jīng)測(cè)定，根皮苷的含量為(85.22 ± 0.78) %，占多酚比例為92.3 %，說(shuō)明純化 物中多酚的主要成分即為根皮苷，也即說(shuō)明栘棟多酚的主要組成成分為根皮苷。
[0145] 因此，利用該工藝經(jīng)一次純化可得到高純度的多酚和根皮苷。
[0146] 實(shí)驗(yàn)例5本發(fā)明栘梭多酚提取物抑制胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶的藥效實(shí)驗(yàn)
[0147] 1、材料與試劑
[0148] 栘依葉粗提物(DT):按實(shí)施例1所述工藝條件提取、干燥所得的粗提物浸膏粉。
[0149] 栘依葉多酚純化物(DC):按實(shí)施例1所述純化工藝純化干燥所得干粉。
[0150] 胰酶(USP級(jí)，上海晶純生化科技股份有限公司生產(chǎn)）、大黃提取物（由實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)偉 老師提供）、鹽酸、氫氧化鈉、三羥甲基甲烷、橄欖油、阿拉伯膠、牛膽鹽、茚三酮、甘氨酸、酪 蛋白、乙酸鈉、乙酸、氯化鈣、硼砂、硼酸、氯化鈉、三氯乙酸、95%乙醇、無(wú)水碳酸鈉(均為分 析純，購(gòu)于成都科龍有限公司）。
[0151] 分別稱取一定量的DT、DC粉末，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶解并定容，再用50%的 乙醇稀釋成不同濃度的溶液，即為栘梭多酚供試樣品溶液。
[0152] 三羥甲基甲烷緩沖溶液:準(zhǔn)確稱取三羥甲基甲烷606.02mg，用45.7mL的0. lmol/L 的HC1溶液溶解，用蒸餾水定容至100mL容量瓶中，搖勻，調(diào)節(jié)pH值至7.1，置于4°C冰箱中保 存，備用。
[0153] 橄欖油乳液:稱取阿拉伯膠7.50001g，加入4mL橄欖油，緩慢加蒸餾水研磨，使溶液 中90 %的乳粒直徑小于3μηι，且其中最大乳粒直徑不得超過(guò)ΙΟμπι，轉(zhuǎn)移并用蒸餾水定容至 1 OOmL容量瓶中?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
[0154] 8%牛膽鹽溶液:準(zhǔn)確稱取8.00004g牛膽鹽，用溫水溶解并定容于100mL容量瓶中， 備用。
[0155] 0. lmol/L氫氧化鈉溶液:準(zhǔn)確稱取0.40009g氫氧化鈉于50mL燒杯中，加入30mL蒸 餾水溶解，待溶液冷卻后，轉(zhuǎn)移至l〇〇mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。
[0156] 0. lmol/L HC1溶液:準(zhǔn)確吸取4.15mL濃鹽酸溶液至500mL容量瓶中，加入蒸餾水定 容至刻度。
[0157] 胰酶溶液:精密稱定0.10006g胰酶放置于乳缽中，加入少量冷至5°C以下的三羥甲 基甲烷緩沖溶液，研磨均勾，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用緩沖液定容，得2.012mg/mL的胰酶溶 液，備用。
[0158] 大黃溶液:準(zhǔn)確稱取5.00003g大黃提取物，加入蒸餾水溶解并定容于50mL容量瓶 中，備用。
[0159] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0160] 栘依多酚對(duì)胰脂肪酶的抑制作用實(shí)驗(yàn)參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2010版）中的 胰脂肪酶活力測(cè)定方法（國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出 版社，2010:848-849)。
[0161] 栘依多酚對(duì)胰蛋白酶的抑制作用實(shí)驗(yàn)參照王曉宇的胰蛋白酶活力測(cè)定方法(王曉 宇.大黃復(fù)方治療單純性肥胖癥的初步研究[D].成都：四川師范大學(xué)，2012)。
[0162] 栘棟多酚對(duì)胰淀粉酶的抑制作用實(shí)驗(yàn)參照曹建康的淀粉酶活性的測(cè)定方法(曹建 康，姜微波，趙玉梅.果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2011:81-84)〇
[0163] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0164] 3.1不同濃度DT溶液對(duì)胰脂肪酶的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表4、圖9。
[0165] 表4不同濃度DT溶液對(duì)胰脂肪酶活力的影響
[0166]
[0167]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:胰酶中原脂肪酶活力為（1932.17±208.04)/g;當(dāng)加入不同濃度的DT溶 液時(shí)，胰脂肪酶的活力均有所下降，說(shuō)明DT對(duì)脂肪酶具有抑制作用。當(dāng)DT溶液濃度在2.5~ 20mg/mL時(shí)，隨著溶液濃度的增大，其抑制率明顯呈增加趨勢(shì)，抑制率從(31.50± 1.19) %增 加至（52.08 ±6.25) %，當(dāng)DT溶液濃度為20mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最大值，為（52.08 土 6.25) %，之后隨DT溶液濃度的增加，抑制率反而開(kāi)始下降，最終趨于穩(wěn)定，抑制率值為30% 左右。
[0168] 3.2不同濃度DC溶液對(duì)胰脂肪酶的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表5、圖10。
[0169] 表5不同濃度的DC溶液對(duì)胰脂肪酶活力的影響
[0170]
[0171] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:胰酶中脂肪酶活力為（1932.17± 208.04)/g;當(dāng)加入不同濃度的DC溶液 時(shí)，胰脂肪酶的活力均有所下降，說(shuō)明DC對(duì)脂肪酶具有抑制作用。當(dāng)DC溶液濃度在1.25~40 yg/mL時(shí)，隨著溶液濃度的增大，抑制率可從(36.92±3.95)%增加至(89.66±2.59)%，當(dāng) DC溶液濃度在20yg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最大值，之后隨濃度的增大開(kāi)始下降，說(shuō)明DC濃度對(duì) 脂肪酶的抑制并無(wú)明顯的量效關(guān)系。
[0172] DC溶液與DT溶液相比較(見(jiàn)3.1、3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果），DC溶液對(duì)脂肪酶的最高抑制率大 約為DT溶液的2倍，說(shuō)明隨著栘:梭多酚純度的提高對(duì)脂肪酶的抑制率也逐漸增大。
[0173] 100mg/mL的大黃溶液與5mg/mL的DT溶液對(duì)脂肪酶的抑制作用相當(dāng)，抑制率為大約 為37% ; 1.25yg/mL的DC溶液對(duì)脂肪酶的抑制率為(69.83±2.99) %，明顯優(yōu)于大黃溶液。這 表明栘核多酚對(duì)胰脂肪酶具有很好的抑制作用。
[0174] 3.3不同濃度DT溶液對(duì)胰蛋白酶的抑制，結(jié)果見(jiàn)表6、圖11。
[0175] 表6不同濃度DT溶液對(duì)胰蛋白酶活力的影響
[0176]
[0177] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:胰酶中蛋白酶活力為(0 · 224±0 · 001 )mg/min · g;不同濃度的DT溶液對(duì) 胰蛋白酶均有抑制作用，當(dāng)DT溶液濃度在2.5~5mg/mL時(shí)，抑制率有明顯的增加，抑制率從 (31.22±1.21)%增加至(40.00 ±1.52)%，當(dāng)DT溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，抑制率有緩慢下降 的趨勢(shì)，當(dāng)DT溶液濃度增加至10mg/mL，抑制率為（35.00±0.91) %，后隨著溶液濃度的增 加，抑制率基本保持不變。
[0178] 3.4不同濃度DC溶液對(duì)胰蛋白酶的抑制，結(jié)果見(jiàn)表7、圖12。
[0179] 表7不同濃度的DC溶液對(duì)胰蛋白酶活力的影響
[0180]
[0181] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:胰酶中蛋白酶活力為(0 · 224±0 · 001 )mg/min · g;不同濃度的DC溶液對(duì) 胰蛋白酶的抑制率不同，當(dāng)DC溶液濃度在1.25~20yg/mL時(shí)，隨著溶液濃度的增大，抑制率 從(46.22 ± 1.87) %增加至(82.54±0.16) %，當(dāng)DC溶液濃度在20yg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最大 值，為(82.54±0.16)%，之后隨濃度的增大對(duì)胰蛋白酶的抑制反而開(kāi)始下降，當(dāng)其濃度為 160yg/mL時(shí)，抑制率為（56·85±3·97)%。
[0182] 通過(guò)對(duì)DT溶液與DC溶液對(duì)胰蛋白酶的抑制作用比較可知（見(jiàn)3.3、3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果）， DT溶液對(duì)胰蛋白酶活力的影響明顯優(yōu)于DC溶液，說(shuō)明隨著栘t衣多酚純度的增加，對(duì)胰蛋 白酶的抑制作用逐漸增強(qiáng)，但其抑制率并不與栘棟多酚濃度呈正向相關(guān)。
[0183] 與陽(yáng)性對(duì)照組大黃溶液（100mg/mL)相比，DT溶液對(duì)胰蛋白酶的抑制作用較差，20μ g/mL的DC溶液對(duì)胰蛋白酶的抑制作用較高，但其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大黃溶液，即DC溶液對(duì)胰蛋 白酶的抑制作用更佳。
[0184] 3.5不同濃度DT溶液對(duì)胰淀粉酶的抑制，結(jié)果見(jiàn)表8、圖13。
[0185]表8不同濃度DT溶液對(duì)胰淀粉酶活力的影響
[0186]
[0187]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:胰酶中原淀粉酶活力為(42.57±0.18)mg/min.g;當(dāng)加入不同濃度的DT 溶液時(shí)，胰淀粉酶的活力均有所下降，說(shuō)明DT對(duì)淀粉酶具有抑制作用。當(dāng)DT溶液濃度在2.5 ~10mg/mL時(shí)，隨著溶液濃度的增大，抑制率從（31.50 ± 1.19) %增加至(42.33 ± 1.45) %， 之后隨濃度增加抑制率開(kāi)始下降，最后趨于穩(wěn)定。
[0188] 3.6不同濃度DC溶液對(duì)胰淀粉酶的抑制，結(jié)果見(jiàn)表9、圖14。
[0189]表9不同濃度的DC溶液對(duì)胰淀粉酶活力的影響 [0190]
[0191] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:胰酶中淀粉酶活力為(0.224±0.001)mg/min · g;不同濃度的DT溶液對(duì) 胰淀粉酶的抑制率不同，當(dāng)DC溶液濃度在1.25~40yg/mL時(shí)，隨著溶液濃度的增大，抑制率 明顯呈增加趨勢(shì)，其抑制率可從(31.48±0.42) %增加至（56.35± 1.27)%，當(dāng)DC溶液濃度 在40yg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最大值，為（56.35± 1.27) %，之后隨溶液濃度的增大抑制率開(kāi) 始下降，最后趨于穩(wěn)定。
[0192] 通過(guò)DT溶液和DC溶液對(duì)胰淀粉酶的抑制作用比較可知（見(jiàn)3.5、3.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果），DC 溶液對(duì)淀粉酶的抑制作用明顯優(yōu)于DT溶液，說(shuō)明隨著栘核多酚純度的提高，對(duì)淀粉酶的抑 制作用也逐漸增強(qiáng)。
[0193] 與陽(yáng)性對(duì)照大黃溶液（100mg/mL)相比，DT溶液對(duì)淀粉酶的抑制作用相當(dāng)，DC溶液 對(duì)淀粉酶有較強(qiáng)的抑制作用。
[0194] 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:栘依多酚對(duì)胰脂肪酶、胰蛋白酶、胰淀粉酶都具有良好的抑制 作用，尤其是純化后的栘依多酚在低劑量情況下(微克級(jí))也具有很好的抑制胰酶活性的作 用，說(shuō)明栘依多酚可以通過(guò)對(duì)減少人體食物中的脂肪、蛋白質(zhì)、糖類的消化吸收，達(dá)到降低 血糖、血脂和防治肥胖等的作用。
[0195] 實(shí)驗(yàn)例6本發(fā)明栘彳農(nóng)多酚提取物降血脂的藥效實(shí)驗(yàn)
[0196] 1、材料、試劑與儀器
[0197] 1.1材料
[0198] 栘棟葉多酚純化物(DC):按實(shí)施例1所述純化工藝純化干燥所得干粉。
[0199] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)昆明系小鼠，體重：18~22g，購(gòu)于四川省成都市成都達(dá)碩生物科 技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(川）2013-24。
[0200] 小鼠基礎(chǔ)飼料:購(gòu)于四川省成都市成都達(dá)碩生物科技有限公司。
[0201] 小鼠高脂飼料:80 %小鼠基礎(chǔ)飼料、10 %豬油、10 %蛋黃。
[0202] 1.2藥物與試劑配制
[0203] 0.5%(CMC-Na)的配制:稱取5.00018g羧甲基纖維素鈉(成都市科龍化工試劑廠生 產(chǎn))至燒杯中，加蒸餾水加熱使溶解，冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移于l〇〇〇mL容量瓶中，加入蒸餾水定 容至刻度。
[0204]陽(yáng)性對(duì)照藥物混懸液的配制：稱取膠囊(批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字20103180,重慶華森制藥 有限公司生產(chǎn)）中的粉末0.60023g，用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成濃度6mg/mL的奧利司 他混懸液，灌胃劑量為60mg/kg · bw。
[0205] 栘濃多酚(DC)混懸液的配制：分別稱取1.00001、3·00002、5· 00001、7· 5001 lg的 DC，用0.5 %的羧甲基纖維素鈉溶液配制成濃度為10、30、50、75mg/mL的DC混懸液。
[0206] 2、實(shí)驗(yàn)方法
[0207] 2.1造模及分組
[0208] 實(shí)驗(yàn)將48只昆明系小鼠（雌雄各半，體重為18~22g)每只一籠飼養(yǎng)于濕度為64% RH，溫度為27 °C的適宜的動(dòng)物觀察室內(nèi)，給小鼠投食基礎(chǔ)飼料，使其適應(yīng)環(huán)境，3d后，隨機(jī) 分為6組:空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8只小 鼠。其中空白對(duì)照組喂食小鼠普通飼料，其余5組喂食高脂飼料，按每只每天10g的進(jìn)食量投 食，自由飲水。每隔三天稱重一次，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，直至實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組體重有顯 著差異，造模成功。
[0209] 2.2給藥方法
[0210]小鼠喂食2周（14d)高脂飼料后，體重明顯增加，與空白組有顯著性差異，說(shuō)明造模 成功。從第15d開(kāi)始灌胃實(shí)驗(yàn)藥物和陽(yáng)性藥物進(jìn)行抗肥胖實(shí)驗(yàn)。
[0211]稱量每只小鼠體重，確定已建立小鼠單純性肥胖模型。每只小鼠仍按造模期一樣 喂食，每天定量投食飼料。空白對(duì)照組每天投食之前先灌胃〇.2mL的0.5%羧甲基纖維素鈉 溶液；陽(yáng)性對(duì)照組小鼠灌胃人日服劑量10倍的奧利司他60mg/kg.bw(即每千克體重給藥 60mg);低、中、高劑量組分別按300、500、750mg/kg · bw的量灌胃DC混懸液。
[0212] 2.3實(shí)驗(yàn)小鼠的指標(biāo)測(cè)定
[0213] 20天后，禁食12h，稱量各組小鼠體重，斷尾采血。將所取的各小組小鼠血液， 3000r/min離心9min，取出血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各血清中的甘油三酯(TG)、膽固 醇(TG)、高密度脂蛋白（HDL-C)、低密度脂蛋白（LDL-C)濃度。
[0214] 2.4統(tǒng)計(jì)與分析
[0215]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SpSS17.0軟件處理，組間比較用方差分析，多重比較用最小顯著差數(shù) (least significant difference，LSD)法。
[0216] 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0217] 栘棖多酚(DC)對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)表13。
[0218] 表13栘棟多酸對(duì)肥胖小鼠血清生化指標(biāo)的影響(η = 8，X 土 s)
[0219]
[0220] 注:與空白組比較，#ρ<0.05差異顯著;##ρ<0.01;差異極顯著。
[0221 ] 與模型組比較，*ρ<0.05,差異顯著;**ρ<0.01，差異極顯著。
[0222] 與陽(yáng)性對(duì)照組比較，Δρ彡〇.〇5,差異顯著；Δ Δρ<〇.01，差異極顯著。
[0223] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：小鼠給藥20天后，與模型組小鼠比較其余各組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)均有降 低。其中低劑量組的膽固醇與模型組表現(xiàn)出顯著差異(Ρ<〇.05)，中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組 的膽固醇較模型組有極顯著差異(Ρ<〇. 01);高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的甘油三酯較模型組 有極顯著差異(Ρ<〇.01)，中劑量組的與模型組有顯著差異(Ρ<〇.05);低、中、高劑量組和 陽(yáng)性對(duì)照組的高密度脂蛋白與模型組的有極顯著差異(Ρ<〇.01)。高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組 的各項(xiàng)生化指標(biāo)差異不大。
[0224] 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明栘依多酚提取物可降低小鼠血清中的膽固醇TC、甘油 三脂TG、高密度脂蛋白HDL-C、低密度脂蛋白LDL-C。機(jī)體中的TC、TG、HDL-C、LDL-C含量異常 可引起肥胖、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等脂質(zhì)代謝異常疾病，而本發(fā)明栘核多酚提 取物可有效的降低這些生化指標(biāo)，表明其可有效防治此類疾病。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種栘t衣屬植物多酚提取物，其特征是：所述提取物中多酚含量為91.24%~ 91 ? 34%w/w〇2. 如權(quán)利要求1所述的栘依屬植物多酚提取物，其特征是:所述提取物中根皮苷含量為 87.49% ~88.26%w/w。3. 如權(quán)利要求1或2所述的栘糧屬植物多酚提取物，其特征是:所述提取物中多酚含量 為91.34 % w/w，根皮苷含量為87.49 % w/w。4. 如權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的栘核屬植物多酚提取物，其特征是:所述的栘棟屬 植物多酚提取物為栘核屬植物葉的多酚提取物。5. 如權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)所述的栘核屬植物多酚提取物，其特征是:所述的栘彳農(nóng)屬 植物為移植Docynia indica(Wall ? )Dcne ? 〇6. -種權(quán)利要求1~5任意一項(xiàng)所述栘依屬植物多酚提取物的制備方法，其特征是:包 括如下步驟： a、 取栘梭屬植物，粉碎，乙醇超聲提取，濃縮提取液，得栘梭::粗提物； b、 對(duì)D-101型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理； c、 取a步驟粗提物，上樣于經(jīng)過(guò)預(yù)處理的D-101型大孔吸附樹(shù)脂，用乙醇洗脫，收集洗脫 液，濃縮，即得栘梭屬植物多酚提取物。7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征是： a步驟超聲提取條件為：超聲功率800W，超聲頻率40KHz，用63% v/v乙醇水溶液按液料 比20:1，于65 °C提取41min，提取2次； b步驟預(yù)處理方法為：將大孔樹(shù)脂D-101用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇水溶液密封浸泡24h 后，用超純水沖洗至無(wú)醇味;再用5 %HC1溶液密封浸泡2~4h，用超純水沖洗至中性;最后用 2 % NaOH溶液密封浸泡2~4h，用超純水沖洗至中性，備用； c步驟上樣溶液質(zhì)量濃度為25mg/mL，洗脫劑為50 % v/v乙醇水溶液，洗脫體積為1~ 8BV，洗脫流速為3mL/min。8. 如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征是:c步驟洗脫體積為4BV。9. 一種治療和/或預(yù)防脂質(zhì)代謝異常的藥物，其特征是:它是以有效量權(quán)利要求1~5任 意一項(xiàng)所述的栘糧屬植物多酚提取物為活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分 制備而成的制劑。
【文檔編號(hào)】A61P3/06GK106038738SQ201610244471
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年4月18日
【發(fā)明人】張曉喻, 劉剛, 王戰(zhàn)國(guó), 嚴(yán)春新, 任蘭, 楊軍
【申請(qǐng)人】四川師范大學(xué), 攀枝花麗新園藝技術(shù)有限公司