一種益生菌發(fā)酵玉米須的組合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種益生菌發(fā)酵玉米須的組合物及其制備方法，將玉米須烘干粉碎后，經(jīng)浸泡、益生菌發(fā)酵、加入甜味劑制得。玉米須經(jīng)過益生菌發(fā)酵后，獲得較高含量的玉米須總皂苷和較低分子量的玉米須多糖，可起到降血糖、降血脂、消腫利尿、清熱解毒、平肝利膽、改善便秘等效果。本發(fā)明的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物具有口感易于接受、不刺激胃腸道，同時(shí)由于含有益生菌菌體及其代謝產(chǎn)物，能夠調(diào)理胃腸道環(huán)境，增加了對(duì)藥物的吸收。
【專利說明】
一種益生菌發(fā)酵玉米須的組合物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及益生菌與玉米須共同發(fā)酵制備的發(fā)酵組合物以及在功能保健品或者 藥品領(lǐng)域中的應(yīng)用，屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 玉米須（StigmaMaydis)為玉米的花柱和柱頭，最早藥用記載見于1476年的《滇南 木草》，為《中華人民共和國衛(wèi)生部藥材標(biāo)準(zhǔn)》1985版(一部)收錄的常用藥材品種，我國衛(wèi)監(jiān) 督函〔2012〕306號(hào)文批復(fù)，玉米須作為普通食品管理。從20世紀(jì)20年代起，國內(nèi)外學(xué)者便對(duì) 玉米須的化學(xué)成分開始了研究，發(fā)現(xiàn)玉米須中含有多糖類、生物堿類、黃酮類、皂苷類、苦味 糖苷、留醇類、多聚戊糖、揮發(fā)性物質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)元素等多種化學(xué)成分，具有抗菌、抗腫 瘤、降血糖、血脂、利尿、降壓、增強(qiáng)免疫等功效。
[0003] 玉米須多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖和木糖所組成。 玉米須多糖能夠明顯降低四氧嘧啶及腎上腺素所造成的高血糖小鼠的血糖水平，并能增加 小鼠體內(nèi)肝糖原含量;玉米須多糖能夠增強(qiáng)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫功能，可顯著增加小 鼠抗體生成脾細(xì)胞數(shù)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞合成N0、提高巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)，提高環(huán)磷酰胺所致免 疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)及胸腺DNA含量;玉米須多糖對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)具有 一定的抑制作用，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其抑制作用呈劑量及時(shí)間依賴性;玉米須多糖還具有利 膽保肝、解熱利尿的作用。多糖的提取主要是水提方法。
[0004] 玉米須黃酮類化合物具有多種生物活性，其中最重要的是其抗氧化活性。黃酮類 化合物的抗氧化活性主要表現(xiàn)在減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基兩方面，且其清除自由基 的能力與其藥理活性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)玉米須黃酮能明顯提高病鼠超氧化物歧化酶 (S0D)活力，減少脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)的產(chǎn)生，通過抗氧化作用，減輕四氧嘧啶對(duì)胰島 β細(xì)胞損傷，或促進(jìn)已損傷的β細(xì)胞的修復(fù)，增強(qiáng)胰島的分泌功能，從而減輕高血糖反應(yīng)，并 可通過改善血液循環(huán)降低糖尿病合并心肌缺血大鼠血糖水平。玉米須總黃酮還改善缺血心 肌代謝、穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，降低藥物性心肌缺血的發(fā)生率。黃酮提取的方法主要有:熱水提 取法、堿性水溶液提取法、甲醇提取法、丙酮提取法。
[0005] 研究發(fā)現(xiàn)玉米須總皂苷有較好的降糖活性，能降低正常小鼠血糖水平，對(duì)腎上腺 素、四氧嘧啶、鏈尿佐菌素所致小鼠高血糖模型也有較好的降糖作用，并且對(duì)胰島損傷有較 好的改善作用。皂苷一般可溶于水，易溶于熱水、稀醇，難溶于乙醚、苯、氯仿等親脂性有機(jī) 溶劑，在含水丁醇或戊醇中溶解度較好，并且都能與水分層。
[0006] 由于玉米須使用安全，臨床使用廣泛，推動(dòng)了對(duì)玉米須有效成分提取和應(yīng)用的研 究。中國專利CN200410092087.6公開了一種治療糖尿病的藥物包括玉米須總黃酮或者玉米 須總皂苷或者玉米須粗多糖。中國專利200910112201.Χ公開了一種改善玉米須風(fēng)味的方 法。中國專利CN201310676099.2公開了一種提取玉米須黃酮的方法，包括超微粉碎和閃式 提取方法。中國專利CN201410266447.3公開了一種利用纖維素酶、淀粉酶、果膠酶提取玉米 須總皂苷的方法。中國專利CN200810050578.2公開了一種在玉米須提取液中添加木糖醇、 蘋果酸、檸檬酸等制備的飲品。中國專利CN200910189137.5公開了一種利用釀酒酵母發(fā)酵 玉米須應(yīng)用于煙草領(lǐng)域的方法。以上研究和有關(guān)文獻(xiàn)主要涉及利用有關(guān)設(shè)備或者有機(jī)溶劑 以及相關(guān)酶類進(jìn)行玉米須化學(xué)成分的提取，藥理作用，抗氧化活性的研究，并沒有利用人體 益生菌發(fā)酵技術(shù)，來提高玉米須活性成分和功效的有關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種益生菌發(fā)酵玉米須的組合物，玉米須烘干粉碎后， 經(jīng)浸泡、益生菌發(fā)酵、加入甜味劑制得，其制備方法步驟如下： A. 取玉米須烘干，粉碎，過65~100目篩，加入藥材重量15倍的水，加入亞硒酸鈉、六水三 氯化鉻、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀，浸泡1.0小時(shí)，調(diào)pH值為7.0，115°C滅菌50分鐘； B. 當(dāng)溫度降至39°C時(shí)，先接入預(yù)培養(yǎng)好的一種體積比為0.5~1.0%的雙歧桿菌菌液，培 養(yǎng)16小時(shí)后，再接入兩種體積比各為0.5~1.0%的乳桿菌菌液，37°C培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為 4.0時(shí)，用無菌的氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵液pH值為5.0，繼續(xù)發(fā)酵至pH值為4.0，將發(fā)酵溫度調(diào)至 25°C，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵； C. 將發(fā)酵液離心，離心上清液備用;藥渣加入8倍量的75%乙醇，加熱回流提取1小時(shí)，濾 過，濾液減壓回收乙醇，醇提液與離心上清液合并，繼續(xù)減壓濃縮至60°C下相對(duì)密度1.01~ 1.05,得玉米須發(fā)酵提取液； D. 將玉米須發(fā)酵提取液中加入阿拉伯糖、塔格糖、三氯蔗糖，阿拉伯糖、塔格糖添加量 重量g/體積mL比均為1~3%;三氯蔗糖添加量重量g/體積mL比為0.015%，混合均勻，定容，過 濾后，115°C，滅菌20分鐘，即得益生菌發(fā)酵玉米須的組合物。
[0008] 本發(fā)明所述的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物中各成分的含量為： 玉米須:重量g/體積mL比為15~25%; 亞硒酸鈉:0.70yg/mL; 六水三氯化鉻：1.55μ8/ιΛ; 磷酸氫二鉀：lmg/mL; 磷酸二氫鉀：lmg/mL。
[0009]玉米須，為禾本科植物玉蜀黍Zea mays L.的花柱和柱頭。全國大部分地均產(chǎn)。 夏、秋果實(shí)成孰時(shí)收集，除去雜質(zhì)。鮮用或曬干生用。味甘、淡，性平。歸膀胱、肝、膽經(jīng)。
[0010]優(yōu)選的，所述的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物中玉米須的重量g/體積mL比為20%。
[0011] 所述的雙歧桿菌選自短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌或青春雙歧桿菌;所述的乳桿菌選 自嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、唾液乳桿菌或干酪乳桿菌。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供本發(fā)明的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物在制備用于降 血糖、降血脂、消腫利尿、清熱解毒、平肝利膽、改善便秘等藥品、保健品中的應(yīng)用。玉米須經(jīng) 過益生菌發(fā)酵后，獲得較高含量的玉米須總皂苷和較低分子量的玉米須多糖，添加醫(yī)藥上 可接受的添加劑，制得的發(fā)酵組合物，達(dá)到利尿、降糖、降脂、改善便秘等效果。
[0013] 有益效果： 本發(fā)明的益生菌發(fā)酵中藥組合物具有口感易于接受、不刺激胃腸道，同時(shí)由于含有益 生菌菌體及其代謝產(chǎn)物，能夠調(diào)理胃腸道環(huán)境，增加了對(duì)藥物的吸收。
[0014] 腸道益生菌參與了人體的生理、生化、病理和藥理過程。因此，益生菌發(fā)酵玉米須 組合物可以調(diào)理機(jī)體的腸道健康，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)藥物成分的吸收。
[0015] 為了揭示益生菌發(fā)酵對(duì)玉米須成分的分子化學(xué)修飾作用，通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證 實(shí)，經(jīng)過益生菌發(fā)酵代謝轉(zhuǎn)化，發(fā)酵玉米須組合物中低分子量玉米須多糖明顯增加、玉米須 總皂苷含量明顯高于未發(fā)酵的玉米須組合物。
[0016] 為檢測(cè)本發(fā)明的發(fā)酵玉米須組合物降血糖效果，實(shí)驗(yàn)觀察了發(fā)酵玉米須組合物與 未發(fā)酵玉米須組合物對(duì)大鼠高血糖模型的空腹血糖的影響。結(jié)果表明，與模型組、未發(fā)酵玉 米須組合物比較，本發(fā)明的發(fā)酵玉米須組合物，可以顯著性的降低大鼠的空腹血糖、有明顯 的降低血糖的作用，具有顯著性差異。
[0017] 為了檢測(cè)本發(fā)明的發(fā)酵玉米須組合物改善便秘的效果，實(shí)驗(yàn)觀察了發(fā)酵玉米須組 合物與未發(fā)酵組合物對(duì)小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型對(duì)照組與空白對(duì) 照組相比，小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率明顯降低0.01)，說明造模成功;與模型對(duì)照組相比， 未發(fā)酵高劑量及發(fā)酵組合物高、中劑量組小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率均顯著性升高。說明玉米 須達(dá)到一定劑量本身具有一定功效，并且發(fā)酵組合物中劑量開始起效;發(fā)酵組合物中、高劑 量組與未發(fā)酵中、高劑量組之間有顯著性差異0.05)。說明玉米須經(jīng)益生菌發(fā)酵處理后 改善便秘功效明顯增強(qiáng)。
[0018] 本發(fā)明模擬正常人的腸道微生態(tài)環(huán)境，利用在人體內(nèi)分布廣泛并且作用確切的多 種腸道益生菌與本發(fā)明使用的玉米須一起發(fā)酵，以實(shí)現(xiàn)益生菌對(duì)他們的修飾。經(jīng)與益生菌 共同發(fā)酵處理后，玉米須總皂苷、低分子量多糖含量明顯提高，其降血糖活性、改善便秘的 作用得到了顯著提高和改善。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但不應(yīng)看作對(duì)本發(fā)明的限制。
[0020] 實(shí)施例1:益生菌發(fā)酵玉米須的組合物A的制備 玉米須烘干，粉碎，過65目篩，稱取玉米須粉20g，加入藥材重量15倍的水、亞硒酸鈉70μ g、六水三氯化絡(luò)155yg、磷酸氫二鉀100mg、磷酸二氫鉀100mg，浸泡1 ·0小時(shí)，調(diào)pH值為7.0， 115°C滅菌50分鐘;溫度降至39°C時(shí)，接入預(yù)培養(yǎng)好的短雙歧桿菌(AS 1.2213)菌液，接種量 為1%(體積/體積），37°C培養(yǎng)16小時(shí)后、再接入嗜酸乳桿菌(AS 1.1854)菌液、植物乳桿菌 (AS 1.19)菌液，接種量均為0.5%(體積/體積）。37°(：繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值4.0時(shí)，用無菌 的氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵液pH值為5.0，繼續(xù)發(fā)酵至pH值為4.0，將發(fā)酵溫度調(diào)至25°C，繼續(xù)培養(yǎng) 24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。離心取上清液，備用。將沉淀加入8倍藥渣重量的75%乙醇，加熱回流提取 1小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，醇提液與發(fā)酵離心上清液合并，并減壓濃縮至相對(duì)密度為 1.01~1.05 (60 °C )，分別加入重量體積比為2%的塔格糖、重量體積比為2%的阿拉伯糖、重量 體積比為0.015%的三氯蔗糖，混合均勻，最后定容至100mL，過濾后，115°C，滅菌20分鐘，即 得發(fā)酵玉米須的組合物A。
[0021 ]實(shí)施例2:益生菌發(fā)酵玉米須的組合物B的制備 玉米須烘干，粉碎，過80目篩，稱取玉米須粉15g，加入藥材重量15倍的水、亞硒酸鈉70μ g、六水三氯化絡(luò)155yg、磷酸氫二鉀100mg、磷酸二氫鉀100mg，浸泡1 ·0小時(shí)，調(diào)pH值為7.0， 115 °C滅菌50分鐘;溫度降至39 °C時(shí)，接入預(yù)培養(yǎng)好的長(zhǎng)雙歧桿菌長(zhǎng)亞種(AS 1.5014)菌液， 接種量為1%(體積/體積），37°C培養(yǎng)16小時(shí)后，再接入德氏乳桿菌(AS1.1480)、鼠李糖乳桿 菌(AS1.22)菌液，接種量均為0.5%(體積/體積）。37°(：繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值4.0時(shí)，用無菌 的氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵液pH值為5.0，繼續(xù)發(fā)酵至pH值為4.0，將發(fā)酵溫度調(diào)至25°C，繼續(xù)培養(yǎng) 24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。離心取上清液，備用。將沉淀加入8倍藥渣重量的75%乙醇，加熱回流提取 1小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，醇提液與發(fā)酵離心上清液合并，并減壓濃縮至相對(duì)密度為 1.01~1.05(60°C )，分別加入重量體積比為1.5%的塔格糖、重量體積比為2.5%的阿拉伯糖、 重量體積比為〇. 015%的三氯蔗糖，混合均勻，最后定容至lOOmL，過濾后，115°C，滅菌20分 鐘，即得發(fā)酵玉米須的組合物B。
[0022]實(shí)施例3:益生菌發(fā)酵玉米須的組合物C的制備 玉米須烘干，粉碎，過1〇〇目篩，稱取玉米須粉25g，加入藥材重量15倍的水、亞硒酸鈉70 yg、六水三氯化絡(luò)155yg、磷酸氫二鉀lOOmg、磷酸二氫鉀lOOmg，浸泡1 ·0小時(shí)，調(diào)pH值為7.0， 115°C滅菌50分鐘;溫度降至39 °C時(shí)，接入預(yù)培養(yǎng)好的青春雙歧桿菌(AS 1.2190)菌液，接種 量為1%(體積/體積），37°C培養(yǎng)16小時(shí)后、再接入唾液乳桿菌唾液亞種(AS 1.1881)菌液、干 酪乳桿菌(AS 1.29)菌液，接種量均為0.5%(體積/體積）。37°(：繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值4.0 時(shí)，用無菌的氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵液pH值為5.0，繼續(xù)發(fā)酵至pH值為4.0，將發(fā)酵溫度調(diào)至25 °C，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。離心取上清液，備用。將沉淀加入8倍藥渣重量的75%乙醇， 加熱回流提取1小時(shí)，濾過，濾液減壓回收乙醇，醇提液與發(fā)酵離心上清液合并，并減壓濃縮 至相對(duì)密度為1.01~1.05(60°C)，分別加入重量體積比為3%的塔格糖、重量體積比為1.0% 的阿拉伯糖、重量體積比為0.015%的三氯蔗糖，混合均勻，最后定容至100mL，過濾后，115 °C，滅菌20分鐘，即得發(fā)酵玉米須的組合物C。
[0023]實(shí)驗(yàn)例1益生菌發(fā)酵玉米須的組合物與未發(fā)酵玉米須組合物多糖分子量分布變化 選用實(shí)施例制備的發(fā)酵玉米須的組合物A，B、C為試驗(yàn)樣品，并以同濃度同樣方法制備 但未經(jīng)益生菌發(fā)酵的玉米須組合物a、b、c為對(duì)照。
[0024] 試驗(yàn)的目的是檢驗(yàn)經(jīng)過益生菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化后，玉米須多糖分子量分布情況。在多糖 的提取實(shí)驗(yàn)中，醇沉是多糖分離純化的第一步操作，而醇沉是依據(jù)分子量大小進(jìn)行分離純 化的。在醇沉濃度較小時(shí)，能夠沉淀下來的多糖往往是分子量較大的多糖。醇沉濃度不同， 多糖分子量的組成和得率不同，通過不同濃度的乙醇沉淀多糖，可以了解多糖分子量的分 布范圍。
[0025] 多糖含量測(cè)定:按照"NY/T 1676食用菌中粗多糖含量的測(cè)定"規(guī)定的方法進(jìn)行。 [0026]分級(jí)醇沉:取發(fā)酵玉米須的組合物與未發(fā)酵組合物樣品，離心取上清液各5份，每 份1.001111，乙醇沉淀多糖，最終醇濃度為20%、40%、60%、80%和90%，總體積251111。將沉淀用 蒸餾水溶解，并定容至25ml，按照"NY/T1676食用菌中粗多糖含量的測(cè)定"規(guī)定的方法測(cè)定 各樣品多糖含量。
[0027] 分步醇沉：取發(fā)酵玉米須的組合物與未發(fā)酵組合物離心上清液各1份，每份 1.00ml，分別加乙醇調(diào)醇濃度為20%進(jìn)行醇沉淀，總體積為25ml，收集沉淀；用蒸餾水溶解 并定容至25ml，檢測(cè)多糖含量。將離心上清液水浴蒸干，用1.0ml蒸餾水溶解后，醇沉，使最 終酒精濃度為40%，總體積為25ml。依此類推至醇濃度為90 %進(jìn)行醇沉，收集沉淀，用蒸餾 水溶解并定容至25ml，按照"NY/T1676食用菌中粗多糖含量的測(cè)定"規(guī)定的方法測(cè)定個(gè)樣 品多糖含量。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0028]表1玉米須發(fā)酵組合物不同酒精濃度多糖含量測(cè)定結(jié)果
從表1分級(jí)醇沉的試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，發(fā)酵玉米須的組合物與未發(fā)酵玉米須組合物 樣品，其分級(jí)醇沉的試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出基本相同的變化趨勢(shì)，即各級(jí)醇沉對(duì)應(yīng)的多糖提取率 隨醇濃度的升高而呈增加的趨勢(shì)；當(dāng)醇濃度為20%，只能沉淀出少量多糖，隨著乙醇濃度 的增加，各級(jí)醇沉對(duì)應(yīng)的多糖得率隨醇濃度的升高而呈增加的趨勢(shì)。但是在乙醇濃度80% 以下時(shí)，發(fā)酵玉米須的組合物樣品多糖含量明顯低于未發(fā)酵玉米須組合物樣品，而在乙醇 濃度達(dá)到90%時(shí)，發(fā)酵玉米須的組合物樣品多糖含量顯著高于未發(fā)酵組合物樣品，說明發(fā) 酵玉米須的組合物中的多糖分子量較小，在乙醇濃度較高時(shí)，才能夠沉淀出來。
[0029] 分步醇沉實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，發(fā)酵玉米須的組合物樣品與未發(fā)酵組合物樣品， 在乙醇濃度為20%時(shí)，沉淀出的玉米須多糖較少，酒精濃度為40%和60%時(shí)，沉淀出的多糖較 多，但是發(fā)酵玉米須的組合物樣品中多糖的含量低于未發(fā)酵組合物樣品，說明發(fā)酵玉米須 的組合物樣品分布在20%~60%醇沉濃度范圍的較大分子量的多糖所占比例低于未發(fā)酵 組合物樣品大分子量的多糖含量。在酒精濃度為80%和90%時(shí)，沉淀出的多糖較少，但是發(fā)酵 玉米須的組合物樣品多糖的含量高于未發(fā)酵組合物樣品，說明發(fā)酵玉米須的組合物樣品分 布在80%~90%醇沉濃度范圍的較小分子量的多糖所占比例高于未發(fā)酵組合物樣品小分 子量的多糖含量。
[0030] 通過對(duì)益生菌發(fā)酵玉米須的組合物與未發(fā)酵組合物分級(jí)醇沉和分步醇沉試驗(yàn)，結(jié) 果顯示，發(fā)酵玉米須的組合物樣品與未發(fā)酵組合物樣品比較，多糖分子量分布發(fā)生了明顯 的變化，其大分子量多糖含量明顯降低，小分子量多糖含量明顯提高。
[0031 ]實(shí)驗(yàn)例2益生菌發(fā)酵玉米須的組合物總皂苷的含量測(cè)定 皂苷是玉米須中的主要活性成分之一，具有較好的降糖活性，能降低正常小鼠血糖水 平，對(duì)腎上腺素、四氧嘧啶、鏈尿佐菌素所致小鼠高血糖模型也有較好的降糖作用，并且對(duì) 胰島素?fù)p傷有較好的改善作用。為了觀察益生菌發(fā)酵對(duì)玉米須總皂苷含量的影響，利用分 光光度法試驗(yàn)了發(fā)酵玉米須的組合物與未發(fā)酵組合物的總皂苷含量。
[0032]總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：稱取干燥至恒重的人參皂苷Rbl對(duì)照品3.Omg，用甲醇溶 解并定容至10mL，作為對(duì)照品溶液，分別準(zhǔn)確移取對(duì)照品溶液0. lmL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、 0.5mL、0.6mL于具塞試管中，揮干溶劑，加入5 %香草醛一冰乙酸溶液0.2ml，再加0.8ml的高 氯酸，塞蓋搖勻，放入6 0°C恒溫水浴鍋中2 Omin，取出后立刻放入冰水浴中靜置5min，再加 入冰乙酸4ml，搖勻，靜置10mi η，空白試管中溶液作為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定光吸收值， 以吸光度為縱坐標(biāo)，皂苷含量(mg)為橫坐標(biāo)，得總皂苷的回歸方程。Y=37.027x-0.0793，R= 0.9998 供試品的制備：以實(shí)施例制備的發(fā)酵玉米須的組合物A、B、C為實(shí)驗(yàn)樣品，以未發(fā)酵的玉 米須組合物a、b、c為對(duì)照，比較玉米須經(jīng)過益生菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化后其總皂苷含量的變化。
[0033] 各樣品取10ml，依次用10mL的乙醚萃取三次，棄去乙醚層，然后用10mL的水飽和的 正丁醇萃取4次，保留正丁醇層，回收溶劑，甲醇溶解殘留物，定容于10mL的容量瓶中至刻 度，得供試品溶液。
[0034]檢測(cè):精密取供試品溶液10uL于試管中，揮干溶劑，以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備， 在540nm處測(cè)定光吸收值，根據(jù)回歸方程，得出玉米須總皂苷的含量。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。 [0035]表2玉米須總皂苷的含量
從表2可以看出，經(jīng)過益生菌發(fā)酵玉米須的組合物，根據(jù)藥材回收率計(jì)算，其總皂苷含 量明顯高于未發(fā)酵玉米須組合物總皂苷含量。
[0036] 實(shí)驗(yàn)例3益生菌發(fā)酵玉米須的組合物改善便秘實(shí)驗(yàn) 本實(shí)施例旨在利用對(duì)小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)，舉例描述按本發(fā)明方法制備的發(fā)酵玉米須組 合物，與未經(jīng)發(fā)酵的玉米須組合物改善便秘的效果比較。
[0037] 選用實(shí)施例制備的發(fā)酵玉米須的組合物A，B、C為試驗(yàn)樣品，并以同濃度同樣方法 制備但未經(jīng)益生菌發(fā)酵的玉米須組合物a、b、c為對(duì)照。取體重18~22g的雄性小鼠140只，隨 機(jī)分為14組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、便秘模型對(duì)照組、未發(fā)酵a、b、c高劑量組、未發(fā) 酵a、b、c中劑量組、發(fā)酵A、B、C高劑量組、發(fā)酵A、B、C中劑量組。兩個(gè)劑量組分別相當(dāng)于人體 推薦量l〇〇mL/人/天的20倍、30倍即33.3、50mL/kg. bw/d。分別經(jīng)口給予受試樣品，對(duì)照組同 樣途徑給水，每日1次，連續(xù)10天。10天后，各組小鼠禁食12小時(shí)（期間自由飲水），試驗(yàn)組和 模型組分別給予復(fù)方地芬諾酯(50mg/kg bw)，空白對(duì)照組給予蒸餾水，0.5小時(shí)后各組小鼠 經(jīng)口給予墨汁，20分鐘后立即脫頸椎處死動(dòng)物，打開腹腔分離腸系膜，完整取出胃噴門至直 腸末端段，置于木板上，將小腸自然擺成直線，分別測(cè)量從幽門到回盲部和墨汁前沿的距 離，計(jì)算小腸推進(jìn)率。
[0038] 小腸推進(jìn)率(％)=幽門至墨汁前沿的距離(cm)/幽門到回盲部距離(cm) X 100% 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所不： 表3:發(fā)酵玉米須組合物與未發(fā)酵玉米須組合物對(duì)小鼠小腸運(yùn)動(dòng)功能的影響
與正常對(duì)照組相比，?λ與模型對(duì)照組相比，v ?λ㈨ 與未發(fā)酵同劑量組相比，※
[0039] 從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，小鼠的小腸墨汁推進(jìn) 率明顯降低〇.〇1)，說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，各組未發(fā)酵高劑量及發(fā)酵組合 物高、中劑量組小鼠的小腸墨汁推進(jìn)率均顯著性升高〇.05-0.01)。說明玉米須達(dá)到一 定劑量本身具有一定功效，并且發(fā)酵的組合物中劑量開始起效;各試驗(yàn)樣品發(fā)酵的組合物 中、高劑量組與未發(fā)酵中、高劑量組之間有顯著性差異0.05)。說明玉米須經(jīng)益生菌發(fā) 酵處理后改善便秘功效明顯增強(qiáng)。
[0040] 實(shí)施例4益生菌發(fā)酵玉米須組合物降血糖實(shí)驗(yàn) 本實(shí)施例旨在利用大鼠的高血糖模型，舉例描述按本發(fā)明方法制備益生菌發(fā)酵玉米須 的組合物降血糖效果。
[0041] 空腹降血糖實(shí)驗(yàn):選用實(shí)施例制備的發(fā)酵玉米須的組合物A，B、C為試驗(yàn)樣品，并以 同濃度同樣方法制備但未經(jīng)益生菌發(fā)酵的玉米須組合物a、b、c為對(duì)照。強(qiáng)生血糖測(cè)定儀測(cè) 定血糖值。
[0042]取體重180±20g的雄性大鼠150只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，隨機(jī)取出10只單獨(dú)喂養(yǎng)，為空 白對(duì)照組，其余140只按照60mg/kg的劑量尾靜脈注射鏈尿霉素，48小時(shí)后測(cè)定空腹血糖，若 低于12mmol/L，適量補(bǔ)加注射鏈尿霉素，6天后禁食3小時(shí)，測(cè)血糖，血糖值大于15 mmol/L為 高血糖模型成功動(dòng)物。選高血糖模型成功動(dòng)物130只，按照禁食3小時(shí)的血糖水平，隨機(jī)分為 13組，每組10只。分別為高血糖模型組、發(fā)酵組合物A、B、C高劑量組、發(fā)酵組合物A、B、C中劑 量組、未發(fā)酵組合物a、b、c高劑量組、未發(fā)酵組合物a、b、c中劑量組。高劑量組為人體推薦量 的20倍，即每日每只大鼠口服2.9ml(濃縮，相當(dāng)于原組合物5.8ml)沖劑量組為人體推薦量 的10倍，即每日每只大鼠口服2.9ml;高血糖模型組和空白對(duì)照組給予蒸餾水，連續(xù)給藥30 天后，禁食3小時(shí)后測(cè)定空腹血糖值，比較各組動(dòng)物血糖值。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
[0043]表4益生菌發(fā)酵玉米須的組合物與未發(fā)酵組合物對(duì)大鼠空腹血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果
與空白對(duì)照組相比:?λ d與高血糖模型比?λ 05,與未發(fā)酵同劑量組比較 0.05。
[0044]給藥前：空白對(duì)照組與其他組間有顯著性差異，各實(shí)驗(yàn)組間無顯著性差異，說明造 模成功。給藥四周后，高血糖模型組與發(fā)酵A、Β、C高劑量組、發(fā)酵A、Β、C中劑量組、未發(fā)酵a、 b、c高劑量組、未發(fā)酵a、b、c中劑量組、有顯著性差異，發(fā)酵組A、B高、中劑量組與未發(fā)酵a、b 高、中劑量組比較，有顯著性差異;發(fā)酵組C高劑量組與未發(fā)酵c高劑量組比較，有顯著性差 異，說明益生菌發(fā)酵玉米須可以提高玉米須的降糖作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種益生菌發(fā)酵玉米須的組合物，其特征在于，將玉米須烘干粉碎后，經(jīng)浸泡、益生 菌發(fā)酵、加入甜味劑制得，其制備方法步驟如下： A. .取玉米須烘干，粉碎，過65~100目篩，加入藥材重量15倍的水，加入亞硒酸鈉、六水 三氯化鉻、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀，浸泡1.0小時(shí)，調(diào)pH值為7.0，115°C滅菌50分鐘； B. 當(dāng)溫度降至39°C時(shí)，先接入預(yù)培養(yǎng)好的一種體積比為0.5~1.0%的雙歧桿菌菌液，培 養(yǎng)16小時(shí)后，再接入兩種體積比各為0.5~1.0%的乳桿菌菌液，37°C培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為 4.0時(shí)，用無菌的氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵液pH值為5.0，繼續(xù)發(fā)酵至pH值為4.0，將發(fā)酵溫度調(diào)至 25°C，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵； C. 將發(fā)酵液離心，離心上清液備用;藥渣加入8倍量的75%乙醇，加熱回流提取1小時(shí)，濾 過，濾液減壓回收乙醇，醇提液與離心上清液合并，繼續(xù)減壓濃縮至60°C下相對(duì)密度1.01~ 1.05, 得玉米須發(fā)酵提取液； D. 將玉米須發(fā)酵提取液中加入阿拉伯糖、塔格糖、三氯蔗糖，混合均勻，定容，過濾后， 115°C，滅菌20分鐘，即得益生菌發(fā)酵玉米須的組合物； 所述的玉米須在發(fā)酵玉米須的組合物中的重量g/體積mL比為15~25%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物，其特征在于，所述的玉米須在發(fā) 酵玉米須的組合物中的重量g/體積mL比為20%。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物，其特征在于，所述的亞硒酸 鈉在益生菌發(fā)酵玉米須的組合物中的含量為0. TOyg/mL;所述的六水三氯化鉻在益生菌發(fā) 酵玉米須的組合物中的含量為1.55^^/!^;所述的磷酸氫二鉀在益生菌發(fā)酵玉米須的組合 物中的含量為lmg/mL;所述的磷酸二氫鉀在益生菌發(fā)酵玉米須的組合物中的含量為lmg/ mL〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物，其特征在于，所述的雙歧桿 菌選自短雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌或青春雙歧桿菌;所述的乳桿菌選自嗜酸乳桿菌、德氏乳桿 菌、植物乳桿菌、唾液乳桿菌或干酪乳桿菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物，其特征在于，所述的阿拉伯 糖和塔格糖的添加量均為重量g/體積mL比1~3%;所述的三氯蔗糖的添加量為重量g/體積mL 比0.015%。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物的制備方法，其特征在于，步 驟如下： A. .取玉米須烘干，粉碎，過65~100目篩，加入藥材重量15倍的水，加入亞硒酸鈉、六水 三氯化鉻、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀，浸泡1.0小時(shí)，調(diào)pH值為7.0，115°C滅菌50分鐘； B. 當(dāng)溫度降至39°C時(shí)，先接入預(yù)培養(yǎng)好的一種體積比為0.5~1.0%的雙歧桿菌菌液，培 養(yǎng)16小時(shí)后，再接入兩種體積比各為0.5~1.0%的乳桿菌菌液，37°C培養(yǎng)至發(fā)酵液pH值為 4.0時(shí)，用無菌的氫氧化鈉調(diào)整發(fā)酵液pH值為5.0，繼續(xù)發(fā)酵至pH值為4.0，將發(fā)酵溫度調(diào)至 25°C，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵； C. 將發(fā)酵液離心，離心上清液備用;藥渣加入8倍量的75%乙醇，加熱回流提取1小時(shí)，濾 過，濾液減壓回收乙醇，醇提液與離心上清液合并，繼續(xù)減壓濃縮至60°C下相對(duì)密度1.01~ 1.05, 得玉米須發(fā)酵提取液； D. 將玉米須發(fā)酵提取液中加入阿拉伯糖、塔格糖、三氯蔗糖，混合均勻，定容，過濾后， 115°C，滅菌20分鐘，即得益生菌發(fā)酵玉米須的組合物。7.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的益生菌發(fā)酵玉米須的組合物在制備用于降血糖、降血脂、 消腫利尿、清熱解毒、平肝利膽、改善便秘的藥品、保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K36/899GK106039050SQ201610354987
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月26日
【發(fā)明人】吳炳新, 孫筱林, 陸繼臣, 褚新紅
【申請(qǐng)人】三株福爾制藥有限公司