豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗及其制備方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。該豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，含有BPEI/PLGA納米顆粒佐劑和攜帶有PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)粒，所述攜帶有PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)粒吸附于BPEI/PLGA納米顆粒佐劑表面。本發(fā)明還提供所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗的制備方法，包括如下步驟：將BPEI/PLGA納米顆粒佐劑與攜帶有PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)?；旌暇鶆?，靜置后得到所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗。本發(fā)明旨豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，免疫效果較好，制備方法簡單、高效。
【專利說明】
豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征的病原體，主要引起懷 孕母豬流產(chǎn)，早產(chǎn)，死胎、木乃伊胎增多，仔豬出現(xiàn)呼吸道癥狀和斷奶前死亡率增高。該病于 1987年最先在美國發(fā)現(xiàn)，并在全美迅速蔓延，隨后在短短的幾年內(nèi)，迅速遍及全球各養(yǎng)豬業(yè) 發(fā)達的國家和地區(qū)。1996年哈爾濱獸醫(yī)研究所在國內(nèi)首次分離到PRRSV，證實本病在國內(nèi)存 在，并呈現(xiàn)流行態(tài)勢。目前，PRRSV幾乎遍及世界各養(yǎng)豬國家，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟 損失。根據(jù)PRRSV基因的變異程度主要分為兩個基因型，即歐洲型(代表株為Lelystadvios， LV)和美洲型(代表株為VR-2332株），國內(nèi)分離到的大部分毒株均屬于美洲型，但是也有歐 洲型毒株的存在。此外，由于PRRSV極易發(fā)生RNA重組且存在抗原性變異，因此，對PRRSV的預 防與控制提出了嚴重的挑戰(zhàn)。
[0003] 近幾年，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展與應用，核酸疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗的研 制日益成為醫(yī)學領(lǐng)域的一大研究熱點，然而，核酸疫苗的免疫效果穩(wěn)定性方面尚存在不足， 即使采用較大劑量多次免疫也無法獲得較為理想的特異性免疫應答。針對這些問題，國內(nèi) 外學者做出了大量的努力，如通過改善疫苗遞呈，目的基因篩選修飾，添加免疫分子序列以 在體外表達免疫分子來提高免疫效果。因此，尋找一種安全有效的方法來提高DNA疫苗的免 疫效果成為當前核酸疫苗研究領(lǐng)域的主要方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在提供一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，免疫效果較好。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗的制備方法，該方法 簡單、高效。
[0006] 本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0007] -種豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，含有BPEI/PLGA納米顆粒佐劑和攜帶有 PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒，所述攜帶有PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒吸附于BPEI/PLGA納 米顆粒佐劑表面。
[0008] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述BPEI/PLGA納米顆粒為支化聚乙烯亞胺修飾的聚乳酸-羥 基乙酸共聚物，粒徑為100-600nm，所述支化聚乙烯亞胺與聚乳酸-羥基乙酸共聚物的質(zhì)量 比為 1:9-11。
[0009] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述BPEI/PLGA納米顆粒的制備方法包括以下步驟:將聚乳 酸-羥基乙酸共聚物溶于二氯甲烷，將支化聚乙烯亞胺溶于聚乙烯醇水溶液，然后將兩者混 合、乳化，除去有機溶劑，離心取沉淀，冷凍干燥，得到BPEI/PLGA納米顆粒。
[0010] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，聚乳酸-羥基乙酸共聚物與支化聚乙烯亞胺的質(zhì)量比9-11:1。
[0011] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述攜帶有PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒是將PRRSV 0RF5基因 插入pcDNA3.1載體后獲得的。
[0012] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，BPEI/PLGA納米顆粒與攜帶有PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒的 質(zhì)量比為10-12:2。
[0013] 本發(fā)明還提供所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗的制備方法，包括如下步 驟:將BPEI/PLGA納米顆粒佐劑與攜帶有PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒混合均勻，靜置后得到 所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗。
[0014] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，攜帶有PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒采用如下方法制備：將攜 帶有PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞，培養(yǎng)后，獲得攜帶有PRRSV 0RF5基因的重 組質(zhì)粒。
[0015] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗為凍干粉。
[0016] 有益效果
[0017]本發(fā)明通過篩選大量佐劑和PRRSV抗原表位基因，獲得了與市售常規(guī)弱毒活疫苗 免疫效果相當?shù)暮怂嵋呙?。本發(fā)明制備的納米顆粒佐劑均勻性較好，不僅能夠高效攜帶 PRRSV 0RF5基因、轉(zhuǎn)載到細胞內(nèi)，而且具有免疫增強效果。從小鼠和豬只的免疫效果上可以 看出，本發(fā)明BPEI/PLGA吸附核酸疫苗能夠顯著提高免疫動物的體液和細胞應答，在攻毒試 驗中對免疫動物進行有效保護，與商品化疫苗保護效果相當。
【附圖說明】
[0018] 圖1為ΒΡΕ I /PLGA納米顆粒的掃描電鏡。
[0019] 圖2為BPEI/PLGA吸附核酸疫苗對免疫小鼠體液免疫和細胞免疫的影響，其中 pcDNA3.1、pcDNA3. l-Syn0RF5、PLGA-DNA、BPEI-DNA、BPEI/PLGA-DNA分別表示各組免疫小 鼠。其中，表示P〈〇.〇5; "**"表示P〈0.01; "***"表示P〈0.001。
[0020] 圖3為BPEI/PLGA吸附核酸疫苗對免疫豬體液免疫和細胞免疫的影響，其中PBS、 pcDNA3. l-Syn0RF5、BPEI/PLGA-DNA、JXAl-R分別表示各組接種的物質(zhì)。其中，V'表示P〈 0·05; 表示Ρ〈0·01; "***"表示Ρ〈0·001。
[0021] 圖4為BPEI/PLGA吸附核酸疫苗對免疫豬Τ淋巴細胞亞型分化的影響，其中PBS、 pcDNA3.1-Syn0RF5、BPEI/PLGA-DNA、JXAl-R 分別表示各組接種的物質(zhì)。圖 4A 為 CD3+CD4+T 淋 巴細胞動態(tài)變化趨勢圖，圖4B為⑶3+⑶8+T淋巴細胞動態(tài)變化趨勢圖。表示P〈0.05;"**" 表示P〈0 · 01; 表示P〈0 · 001。
[0022] 圖5為BPEI/PLGA吸附核酸疫苗對免疫豬攻毒后直腸體溫變化的影響，其中PBS、 pcDNA3.1-Syn0RF5、BPEI/PLGA-DNA、JXA1-R 分別表示各組接種的物質(zhì)。
[0023]圖6為BPEI/PLGA吸附核酸疫苗對免疫組攻毒后病毒血癥的影響，其中PBS、 pcDNA3.1-Syn0RF5、BPEI/PLGA-DNA、JXA1-R 分別表示各組接種的物質(zhì)。
[0024]圖7為BPEI/PLGA吸附核酸疫苗對免疫組攻毒后肺組織病變的影響，其中A、B、C、D 分別對應PBS空白組，單獨核酸疫苗組，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組與商品化疫苗組。
【具體實施方式】
[0025]實施例1制備豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗
[0026]從多種佐劑與豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原表位基因的復配中，篩選到以ΒΡΕΙ/ PLGA納米顆粒和攜帶編碼PRRSV GP5蛋白的0RF5基因的載體作為活性成分的核酸疫苗。 [0027] 1.制備攜帶PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒
[0028] 將編碼PRRSV GP5蛋白的0RF5基因（GeneBank登錄號：HQ832104)插入pcDNA3.1載 體，獲得攜帶PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒。攜帶PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒命名為重組質(zhì) 粒卩〇0麻3.1-3711〇1^5，構(gòu)建方法具體步驟參考文獻11]11]11111〇8611；[0;^70;1^1:116 11丨81117 pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5protein encoded by a synthetic 0RF5gene，發(fā)表于Vaccine,18,27( 13): 1957-1963。
[0029] 重組質(zhì)粒pcDNA3 · l-Syn0RF5的擴增和鑒定：將pcDNA3 · l-Syn0RF5轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸 桿菌Trans5a，克隆后擴增，并用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限 公司，貨號：DPI 17)對pcDNA3. l-Syn0RF5進行提取，獲得大量重組質(zhì)粒pcDNA3. l-Syn0RF5。 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Syn0RF5提取產(chǎn)物經(jīng)Xhol和ΚρηΙ酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0030] 2.制備BPEI/PLGA吸附核酸疫苗
[0031] (1)通過改良的復乳溶劑揮發(fā)法制備BPEI/PLGA納米顆粒，并將DNA吸附于ΒΡΕΙ/ PLGA納米顆粒表面獲得BPEI/PLGA吸附核酸疫苗。
[0032] BPEI/PLGA納米顆粒的制備:將10mg的PLGA(聚乳酸-羥基乙酸共聚物，數(shù)均分子量 為38，000-54，000，其中乳酸與羥基乙酸的質(zhì)量比為50:50，購自sigma-aldrich，貨號:71， 990-0)溶于5mL的二氯甲烷中，lmg ΒΡΕΙ (支化聚乙烯亞胺，分子量：25，000，購自aldrich chemistry，貨號:408727)溶于5mL濃度為20 g//L的PVA(聚乙烯醇，分子量為9，000-10，000， 購自s i g m a - a 1 d r i c h，貨號：3 6 0 6 2 7)水溶液中，將上述兩種溶液混合，用IK A乳化儀15， OOOrpm乳化10min。然后將乳化好的溶液加入50mL、5g/L的PVA水溶液中，混合后，用IKA乳化 儀15，OOOrpm乳化2min，將乳化好的溶液200rpm攪拌過夜以去除有機溶劑；隨后15，000rpm 離心30min，取沉淀，用去離子水洗3次，接著真空冷凍干燥，得到ΒΡΕΙ修飾的PLGA，呈納米顆 粒狀，縮寫為BPEI/PLGA納米顆粒。BPEI/PLGA納米顆粒中，ΒΡΕΙ物理吸附于PLGA表面。ΒΡΕΙ/ PLGA納米顆粒的掃描電鏡圖如圖1所示，可以看到納米顆粒的粒徑為100-600納米，粒徑較 為均勻。BPEI/PLGA納米顆粒置-20°C保存長期保存?zhèn)溆谩?br>[0033] BPEI/PLGA吸附核酸疫苗的制備：將BPEI/PLGA納米顆粒溶于本實施例標題1制備 的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Syn0RF5溶液（1μg/μL)中，BPEI/PLGA納米顆粒與重組質(zhì)粒的質(zhì)量比 為11:2，渦旋30s混合均勻，室溫（18-25 °C)下靜置30min，可用于直接免疫或真空冷凍干燥， 得到BPEI/PLGA吸附核酸疫苗(記為BPEI/PLGA-DNA)，置-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] (2)BPEI/PLGA吸附核酸疫苗用量:小鼠，650yg/只；豬，3.25mg/頭。
[0035] 3.制備對照疫苗
[0036] (l)PLGA吸附核酸疫苗
[0037] 將10mg的PLGA溶于5mL的二氯甲烷中，隨后加入至5mL 20g/L的PVA水溶液中，混 合，用IKA乳化儀15,000印111乳化101^11。然后將乳化好的溶液加入至501^、58/1的?￥4水溶液 中，混合，用IKA乳化儀15，OOOrpm乳化2min，將乳化好的溶液200rpm攪拌過夜以去除有機溶 劑;隨后15，OOOrpm離心30min，取沉淀，用去離子水洗3次，得到PLGA納米顆粒。將PLGA納米 顆粒溶于標題1制備的重組質(zhì)粒pcDNA3. l-Syn0RF5溶液（1μg/μL)中，PLGA與DNA的質(zhì)量比為 10:2，渦旋3〇8，室溫下靜置3〇11^11，得到?11^吸附核酸疫苗(記為?11^-〇嫩）。
[0038] (2)BPEI吸附核酸疫苗
[0039] 將lmg ΒΡΕΙ溶于標題1制備的重組質(zhì)粒pcDNA3. l-Syn0RF5溶液（1μg/μL)中，ΒΡΕΙ 與DNA的質(zhì)量比為1:2,渦旋30s混合均勻，室溫下靜置30min，得到ΒΡΕΙ吸附核酸疫苗(記為 BPEI-DNA)。
[0040] 實施例2核酸疫苗對小鼠的免疫效果
[00411 采用實施例1制備的BPEI/PLGA吸附核酸疫苗、PLGA吸附核酸疫苗和ΒΡΕΙ吸附核酸 疫苗分別進行免疫接種實驗。
[0042] 1、小鼠免疫分組
[0043] 將35只Balb/c小鼠隨機分為5組：空白組(接種空質(zhì)粒pcDNA3.1)，單純核酸疫苗組 (接種pcDNA3 · l-Syn0RF5)、PLGA吸附核酸疫苗組(接種PLGA-DNA)、BPEI吸附核酸疫苗組(接 種ΒΡΕ I-DNA)和ΒΡΕ I /PLGA吸附核酸疫苗組（接種ΒΡΕ I /PLGA-DNA)。
[0044] 2、小鼠免疫方式:采用后退肌肉注射的免疫方式，每組每次接種劑量如表1所示， 每次間隔2周，共免疫2次。
[0045] 表1小鼠的免疫分組及接種劑量
[0046]
[0047]~3、指標體系 '
' '
[0048] 檢測首免后14天、28天和42天的中和抗體。檢測首免后42天小鼠淋巴細胞增殖活 性、IFN- γ mRNA和IFN- γ 水平。
[0049] (1)核酸疫苗對免疫小鼠 GP5中和抗體的影響
[0050] GP5中和抗體檢測方法:各組小鼠進行眼球采血，分離收集血清，經(jīng)56°C滅活30min 后，在96孔細胞板上，用13.37mg/mL的DMEM培養(yǎng)液(DMEM粉末購自Gibco公司，培養(yǎng)液根據(jù)說 明書配制）將血清作連續(xù)倍比稀釋，從1:2至1:256，每個稀釋度作4個重復，每孔50yL。用 DMEM培養(yǎng)液將已測TCID5Q的PRRSV稀釋為100TCID5Q，加入到所有加有被檢血清的培養(yǎng)孔中， 每孔50yL，置37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中作用lh。然后再于每孔中滴加1 OOyL Marc-145細胞懸液 (2-5X105個/mL)，輕輕搖勻后，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6天。同時設(shè)有血清毒性對照，標 準陰、陽性血清對照，以及病毒對照和正常細胞對照。逐天觀察并記錄CPE(細胞病變)情況， 直至結(jié)果穩(wěn)定。在對照成立條件下，按Reed-Muench兩氏法，計算被檢血清抗PRRSV的特異性 中和抗體的滴度，以能夠完全保護細胞不發(fā)生病變的血清最高稀釋倍數(shù)作為被檢血清樣品 的中和效價。
[0051] GP5中和抗體檢測結(jié)果：結(jié)果見圖2A，首免后第14天，對照組與實驗組均可誘導產(chǎn) 生中和抗體，然而中和抗體滴度均不高，兩組之間差異不顯著（P>〇. 05)。首免后第28和42 天，兩組中和抗體水平持續(xù)增高，首免后第42天，ΒΡΕΙ/PLGA-DNA誘導產(chǎn)生的中和抗體滴度 可達1:19.43，顯著高于pcDNA3. l-Syn0RF5誘導產(chǎn)生的中和抗體滴度（1:10.67)，差異顯著 (P〈0.05);且同時高于PLGA-DNA (1:13.33)或ΒΡΕ I -DNA (1:16)誘導產(chǎn)生的中和抗體水平。表 明BPEI/PLGA可以顯著增強核酸疫苗誘導產(chǎn)生特異性中和抗體的水平。
[0052] (2)核酸疫苗對小鼠淋巴細胞增殖的影響
[0053] 脾淋巴細胞懸液的制備:末次免疫后28天，頸椎脫位法處死小鼠，置70%酒精中浸 泡3-5min全身消毒滅菌，取出小鼠以右側(cè)臥放在無菌平皿，消毒左側(cè)背腹交界處皮膚，無菌 取出脾臟，置于不含牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(不完全1640培養(yǎng)液）中清洗一次，轉(zhuǎn)入無菌 勻漿器中，加少許不完全1640培養(yǎng)液，輕輕研磨。然后補加不完全1640培養(yǎng)液混勻，豎直靜 放2-3min，待脾臟組織塊下沉后輕輕吸取上清液入10mL離心管中，lOOOrpm離心10min，棄上 清，加入5mL無菌NH4CI水溶液，lOOOrpm離心10min，沉淀用含有10 %小牛血清(FCS)的RPMI-1640(完全1640培養(yǎng)液)調(diào)整細胞濃度為4X106個/mL，得到脾淋巴細胞懸液。
[0054]于96孔細胞培養(yǎng)板各孔中加入20yL完全1640培養(yǎng)液或純化的經(jīng)紫外線照射滅活 的PRRSV作刺激原，分別作為對照孔或試驗孔，各設(shè)4個重復對照。。然后將脾淋巴細胞懸液 加至各孔內(nèi)，每孔內(nèi)l〇〇yL。將96孔細胞培養(yǎng)板放置37°C、5%C0 2溫箱中培養(yǎng)72h。然后每孔 加入20yL MTT(噻唑藍，購自南京助研生物技術(shù)有限公司，貨號:0793)，混勻繼續(xù)培養(yǎng)4-6h 后，每孔加入l〇〇yL DMS0(二甲基亞砜，購自南京助研生物技術(shù)有限公司，貨號:0231)混勻， 用自動酶標測定儀測0D492·值。以刺激指數(shù)(Stimulation Index，SI)判斷淋巴細胞增殖滴 度。SI值的計算:試驗孔0D492·均值/對照孔0D492·均值。
[0055] 結(jié)果見圖2B，對照組均可誘導小鼠脾淋巴細胞增殖，然而ΒΡΕ I /PLGA-DNA誘導產(chǎn)生 最強的淋巴細胞增殖（SI :6.173)，顯著強于單純核酸疫苗組（SI :4.105)，差異極顯著（Ρ〈 0.001 )，說明BPEI/PLGA納米顆粒作為佐劑可以顯著刺激免疫小鼠脾淋巴細胞的增殖。 [0056] (3)核酸疫苗對免疫小鼠脾淋巴細胞IFN- γ mRNA表達水平和IFN- γ分泌水平的影 響
[0057]檢測方法:于24孔細胞板各孔中加入20yL純化的經(jīng)紫外線照射滅后的PRRSV，然后 將用完全1640培養(yǎng)液稀釋為4 X106個/mL的脾淋巴細胞懸液加至各孔中，每孔lml。將24孔 細胞培養(yǎng)板放置37°C、5%⑶ 2溫箱中培養(yǎng)18或72h后，分別收獲上清和細胞。其中上清利用 小鼠 IFN- γ ELI SA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司）檢測各組小鼠脾淋巴細胞IFN- γ 含量。細胞用來提取RNA，利用紫外分析光度儀測RNA濃度，然后按照常規(guī)方法檢測小鼠 IFN-ymRNA的表達水平。首先，以提取的RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，20yL反轉(zhuǎn)錄體系中含 0.4ygRNA。然后以cDNA產(chǎn)物為模板，利用ABI7500熒光定量PCR儀進行實時熒光相對定量 PCR，以Mouse-f3-actin基因為內(nèi)參，檢測用引物見表2。
[0058]表2為檢測小鼠脾淋巴細胞IFN- γ mRNA表達水平所用到的引物
[0059]
[0060] 檢測結(jié)果:見圖2C和2D。對照組與實驗組相對于空白組均可提高IFN-ymRNA的轉(zhuǎn) 錄表達水平，其中BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組與空白組和單純核酸疫苗組相比，差異均極顯 著(P〈0.001);且BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組IFN-γ mRNA的轉(zhuǎn)錄表達水平顯著高于PLGA吸附 核酸疫苗組和PLGA吸附核酸疫苗組。與之相對應，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組誘導的IFN-γ 分泌水平(678.833pg/mL)與空白組（28.433pg/mL)和單純核酸疫苗組（268.5pg/mL)相比， 差異均極顯著(P〈〇.〇〇l) ;BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組誘導的IFN- γ分泌水平顯著高于PLGA 吸附核酸疫苗組和ΒΡΕΙ吸附核酸疫苗，差異顯著(P〈0.01)。說明BPEI/PLGA納米顆粒作為疫 苗佐劑，與ΒΡΕΙ或PLGA相比，可以顯著增強核酸疫苗誘導產(chǎn)生的細胞免疫應答。
[0061] 實施例3核酸疫苗對豬只的免疫效果
[0062] 采用實施例1制備的BPEI/PLGA吸附核酸疫苗、商品化疫苗(廣東大華農(nóng)動物保健 品股份有限公司生產(chǎn)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，JXA1-R株)分別進行免疫接 種實驗。
[0063] 1、豬只免疫分組
[0064]將20只3周齡豬只（PRRSV抗原和抗體均為陰性）隨機分為4組：空白組(接種roS緩 沖液），ΒΡΕ I /PLGA吸附核酸疫苗組（接種ΒΡΕ I /PLGA-DNA)和單純核酸疫苗組（接種 pcDNA3.1-Syn0RF5)及商品化疫苗組。每組5只豬，采用頸部肌肉注射的方式進行免疫，商品 化疫苗僅在實驗組初次免疫時進行免疫，其它各組均免疫2次，每次間隔2周。免疫劑量見表 3〇
[0065]表3豬只分組及免疫劑量 [0066]
[0067] 2、豬體攻毒保護試驗
[0068] 首免后第28天，對所有分組豬只進行攻毒，頸部肌肉注射JSKM毒株(GeneBank登錄 號：HQ832104)2mL，TCID5〇 為 10-5.0/mL〇
[0069] 3、免疫效果
[0070] 指標體系:GP5特異性抗體水平和PRRSV中和抗體水平，淋巴細胞增殖活性，IFN- γ mRNA和IFN- γ水平，Τ淋巴細胞亞型分化水平，豬只攻毒后直腸體溫、病毒血癥和肺組織病 變水平。
[0071] (1)核酸疫苗對免疫豬GP5特異性抗體和PRRSV中和抗體的影響
[0072] GP5特異性抗體水平檢測方法:具體步驟參考文獻(Enhanced immunogenicity of the modified GP5of porcine reproductive and respiratory syndrome virus發(fā)表于 Virus Genes，32(l):5_ll〇
[0073] GP5特異性抗體水平檢測結(jié)果:見圖3A。首免后第14、28、35天，BPEI/PLGA吸附核酸 疫苗組和商品化疫苗組誘導產(chǎn)生的GP5特異性抗體水平逐漸升高，首免后第35天，兩組特異 性抗體水平分別達到1:800和1:960。然而，首免后第42天，兩組特異性抗體水平均有所下 降，可能與PRRSV在豬只體內(nèi)增殖有關(guān)。在所有時間點，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗誘導產(chǎn)生的 GP5特異性抗體水平略低于商品化疫苗，然而差異均不顯著(P>0.05)。說明BPEI/PLGA納米 顆粒作為佐劑可以增強核酸疫苗誘導產(chǎn)生特異性抗體的水平，而且與商品化疫苗相比，誘 導產(chǎn)生的GP5特異性抗體水平無差異(P>0.05)。
[0074] 血清PRRSV中和抗體水平檢測方法:分別于首免后第14、28、35、42和49天，對各組 豬只進行前腔靜脈采血，分離收集血清，經(jīng)56 °C滅活30min后，在96孔細胞板上，用DMEM細胞 培養(yǎng)液將血清作連續(xù)倍比稀釋，稀釋度為1:2至1:256，每個稀釋度作4個重復，每孔50yL。用 DMEM培養(yǎng)液將已測TCID5Q的PRRSV稀釋為100TCID5Q，加入到所有加有被檢血清的培養(yǎng)孔中， 每孔50yL，37°C、5 %⑶2培養(yǎng)箱中作用lh。然后再于每孔中滴加100yL Marc-145細胞懸液 (2-5X105個/mL)，輕輕搖勻后，放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-6天。同時設(shè)有血清毒性對照，標 準陰、陽性血清對照，以及病毒對照和正常細胞對照。逐天觀察并記錄CPE情況，直至結(jié)果穩(wěn) 定。在對照成立條件下，按Reed-Muench兩氏法，計算被檢血清抗PRRSV的特異性中和抗體的 滴度，以能夠完全保護細胞不發(fā)生病變的血清最高稀釋倍數(shù)作為被檢血清樣品的中和效 價。
[0075] 血清中和抗體水平檢測結(jié)果：見圖3B。首免后第14和28天，BPEI/PLGA吸附核酸疫 苗組和商品化疫苗組誘導產(chǎn)生的中和抗體滴度逐漸升高，首免后第28天，兩組中和抗體水 平分別為1:21.33和1:18.67;首免后第35天，中和抗體水平均下降，可能與中和豬只體內(nèi) PRRSV有關(guān)，然后中和抗體水平又呈現(xiàn)上升趨勢。在所有時間點，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組 和商品化疫苗組誘導產(chǎn)生的中和抗體水平均十分相近，差異不顯著。表明BPEI/PLGA納米顆 ?？梢燥@著增強核酸疫苗誘導產(chǎn)生的特異性中和抗體水平。
[0076] (2)核酸疫苗對免疫豬淋巴細胞增殖、PBMCs IFN- γ mRNA表達水平和IFN- γ分泌 水平的的影響
[0077]免疫豬外周血單核巨噬細胞(PBMCs)的分離:分別于首免后28天和42天，無菌采集 豬的前腔靜脈抗凝血，與不含牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)液(不完全1640培養(yǎng)液)進行 1 : 1混勻，取5mL混合液小心加入5mL的細胞分離液液面之上（總共10mL);以500g(約 1800rpm)離心20min;此時離心管中自上而下細胞分為四層:第一層為血漿層;第二層為環(huán) 狀乳白色淋巴細胞層;第三層為透明分離液層;第四層為紅細胞層。使用2mL針式注射器收 集第二層細胞(約2mL)放入10mL的離心管中，加入不完全1640培養(yǎng)液至總體積為10mL，充分 混勻后，以500g離心5min，棄去上清留沉淀細胞，使用5mL NH4C1水溶液重新懸起，700rpm離 心5min，用不完全1640培養(yǎng)液洗滌3次，700rpm離心5min，最后使用含10%牛血清的RPMI-1640(完全1640)培養(yǎng)液重懸，調(diào)整濃度為4 X106個/mL，得到PBMCs懸液。
[0078] 豬淋巴細胞增殖試驗方法:于96孔細胞培養(yǎng)板各孔中加入20yL完全1640培養(yǎng)液或 純化的經(jīng)紫外線照射滅活的PRRSV作刺激原，分別作為對照孔或試驗孔，各設(shè)4個重復對照。 然后將PBMCs懸液加至各孔內(nèi)，每孔內(nèi)100yL。將96孔細胞培養(yǎng)板放置37°C、5 %C02溫箱中培 養(yǎng)72h。然后每孔加入20yL MTT，混勻繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后，每孔加入100yL DMS0混勻，用自動酶 標測定儀測〇D492nm值。以刺激指數(shù)(Stimulation Index，SI)判斷淋巴細胞增殖滴度。SI值的 計算:試驗孔0D492?均值/對照孔0D492r?均值。
[0079] 豬淋巴細胞增殖試驗檢測結(jié)果：見圖3C。首免后第28天，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗 組誘導的淋巴細胞增殖(SI: 1.18)略低于商品化疫苗組(SI: 1.39)，然而差異不顯著；首免 后第42天，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組誘導的淋巴細胞增殖(SI: 1.28)略高于商品化疫苗組 (SI: 1.23)，差異仍不顯著。說明，BPEI/PLGA納米顆粒作為佐劑，可以刺激免疫小鼠脾淋巴 細胞的增殖，且增殖水平與商品化疫苗相當。
[0080] 免疫豬PBMCs IFN-ymRNA表達水平和IFN-γ分泌水平的檢測方法:于24孔細胞板 各孔中加入20yL純化的經(jīng)紫外線照射滅后的PRRSV，然后將PBMCs懸液加至各孔中，每孔 lmL。將24孔細胞培養(yǎng)板放置37°C、5%⑶2溫箱中培養(yǎng)18或72h后，分別收獲細胞或上清，其 中上清利用豬IFN-yELISA試劑盒(購自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，貨號：SEA049P〇)檢測各 組IFN- γ含量，細胞用來提取RNA以檢測PBMCs IFN- γ mRNA表達水平，檢測方法同實施例1 中，不同之處在于實時熒光相對定量PCR中使用的引物及內(nèi)參基因，具體見表4。
[0081 ]表4為檢測豬IFN- γ mRNA表達水平所用到的引物
[0082]
[0083] IFN-ymRNA表達水平和IFN-γ分泌水平檢測結(jié)果：見圖3D和E。首免后第28天，商 品化疫苗組誘導的IFN- γ mRNA水平(2.824)雖高于BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組(2.418)，但 是差異不顯著(P>〇. 05);而首免后第42天，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組誘導的IFN- γ mRNA水 平（1.925)顯著高于商品化疫苗組（1.696)，差異顯著(P〈0.01);首免后第28和42天，ΒΡΕΙ/ PLGA吸附核酸疫苗組和商品化疫苗組IFN-γ的表達水平均十分接近，差異不顯著（Ρ> 0.05)。說明BPEI/PLGA納米顆粒作為疫苗佐劑，可以增強核酸疫苗誘導產(chǎn)生的細胞免疫應 答，且BPEI/PLGA吸附核酸疫苗誘導產(chǎn)生的細胞免疫應答水平與商品化疫苗無顯著差異。 [0084] ⑶4+和⑶8+T細胞亞類檢測方法:取1 X 106個制備的PBMCs加入1.5mL離心管中，用 lmL熒光洗液（pH7.4、濃度為0.15M的PBS緩沖液中添加有終濃度為2%的新生牛血清）， 1500rpm離心3-5min，棄上清，用300yL熒光洗液重懸細胞，分別加入FITC標記的鼠抗豬⑶3 抗體(購自美國Southern Biotech公司，貨號:4510-2)，PE標記的鼠抗豬CD8抗體(購自美國 Southern Biotech公司，貨號：4515-09)和SPRD標記的鼠抗豬CD4熒光抗體（購自美國 Southern Biotech公司，貨號:4520-13)，充分混勻后，4°C避光孵育30min;用熒光洗液洗滌 2次，每次lmL，1500rpm離心5min，棄上清；管底細胞用500yL熒光保存液（pH7.4、濃度為 0.15M的PBS緩沖液中添加有終濃度為2 %的葡萄糖、1 %的甲醛和0.1 %的NaN3)重懸，利用 流式細胞儀檢測5000-10000個細胞中CD3+CD4+，CD3 +CD8+陽性細胞數(shù)。
[0085] CD4+和CD8+T細胞亞類檢測結(jié)果：見圖4A和4B。首免后第14、28、35和42天，分離獲得 的PBMCs利用熒光抗體進行標記，利用流式細胞儀檢測⑶3+CD4+和⑶3+⑶8+T淋巴細胞動態(tài) 變化。首免后第28天，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組和商品化疫苗組⑶3+⑶4+T淋巴細胞比例達 到最高值，分別為30.08%和25.77%，兩組之間差異極顯著(P〈0.001);首免后第35天，兩組 CD3+CD4+T淋巴細胞比例均出現(xiàn)下降，可能與PRRSV在豬只體內(nèi)有關(guān);首免后第42天，ΒΡΕΙ/ PLGA吸附核酸疫苗組⑶3+CD4+T淋巴細胞比例持續(xù)下降，而商品化疫苗組⑶3+CD4+T淋巴細 胞比例略有回升。首免后第35天，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組和商品化疫苗組⑶3+⑶8+T淋巴 細胞比例達到最高值，分別為41.2%和29.56%，兩者差異顯著(P〈0.05);首免后第42天，兩 組⑶3+⑶8+T淋巴細胞比例均出現(xiàn)下降趨勢。說明ΒΡΕ I /PLGA顆粒作為疫苗佐劑，可以提高 ⑶3+CD4+和⑶3+⑶8+T淋巴細胞的比值，進而增強機體抵抗病毒感染的能力。
[0086] (3)攻毒后臨床表現(xiàn)及直腸體溫檢測
[0087] 二免后14天進行豬體攻毒試驗。攻毒后每天進行臨床癥狀觀察，且每天早上，動物 進食后一個小時，動物處于安靜狀態(tài)時測量直腸體溫。根據(jù)各組五頭豬體溫測量平均值，繪 制體溫變化趨勢曲線，作為疫苗免疫保護力評價的參考指標。
[0088] 結(jié)果見圖5。首免后第28天對豬只進行攻毒保護試驗，攻毒后，PBS空白組豬只體溫 上升明顯，攻毒后第7天迅速升高至41°C，且表現(xiàn)出一定的臨床癥狀，表現(xiàn)為食欲不振，精神 沉郁，被毛粗亂，眼瞼水腫，呼吸加深加重，個別豬只出現(xiàn)腹式呼吸，輕微腹瀉，且攻毒后第 18天有一只豬發(fā)生死亡;單純核酸疫苗組豬只體溫上升，攻毒后第6天體溫達到40°C以上， 且持續(xù)升高，豬只表現(xiàn)為食欲不佳，精神不振等;而BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組豬只體溫變 化趨勢與商品化疫苗免疫組相仿，僅首免后第37和45天豬只平均體溫達到40.5 °C以上，臨 床表現(xiàn)輕微，持續(xù)時間短。商品化疫苗免疫組體溫略有升高，但沒有超過40°C，無明顯臨床 表現(xiàn)。表明，BPEI/PLGA納米顆粒作為核酸疫苗佐劑，可以提供一定的免疫保護力。
[0089] (4)病毒血癥檢測
[0090] 于首免后第28、31、33、35、38、42和49天分別采集血液，分離血清，取200yL血清提 取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用Probe qRT-PCR方法檢測PRRSV病毒的載量，擴增片段位于 0RF7。其中Real time-PCR反應體系配制如下：
[0091]
[0092] 其中 Primer F序列為：TCAGCTGTGCCAAATGCTGG，Primer R序列為： AAATGGGGCTTCTCCGGGTTTT，TaqMan?Probe 為 FAM-TCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-TARAM。所需試劑 購自Takara公司。
[0093]結(jié)果見圖6。從圖6可以看到單純核酸疫苗組血清中病毒RNA載量與roS空白組變化 趨勢一致，除首免后第31天外，其余各時間點與BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組相比，血清中病 毒含量差異顯著(P〈0.05)，BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組與商品化疫苗組血清中病毒RNA載量 變化趨勢相一致，且僅首免后第38和42天，血清中病毒含量差異顯著(P〈0.05)，其余時間點 差異不顯著(P>〇. 05)。表明BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組可以在豬只攻毒后，一定程度上抑制 病毒在豬只血液中的增殖，為機體提供免疫保護力。
[0094] (5)肺臟病理學檢查
[0095]采用常規(guī)方法對各組免疫豬只進行解剖，制作肺臟組織病理切片。結(jié)果見圖7,可 以看到攻毒后四組豬只的肺臟都發(fā)生了病理變化，PBS空白組豬只的肺臟組織病理變化最 明顯，表現(xiàn)為肺泡壁變厚，淋巴細胞浸潤，間質(zhì)變寬;單純核酸疫苗組肺臟組織變化次之，表 現(xiàn)為肺泡壁變厚，間質(zhì)變寬;而BPEI/PLGA吸附核酸疫苗組和商品化疫苗組僅表現(xiàn)為輕微的 間質(zhì)變寬，無其他明顯變化。表明，BPEI/PLGA納米顆粒作為核酸疫苗佐劑，可以使豬體獲得 更多的免疫保護。
[0096] 綜上所述，BPEI/PLGA納米顆粒一方面作為PRRSV DNA疫苗的遞呈系統(tǒng)，避免DNA被 降解，另一方面發(fā)揮佐劑的活性，以提高DNA疫苗的免疫原性。從小鼠和豬只的免疫效果上 可以看出，本發(fā)明BPEI/PLGA吸附核酸疫苗能夠顯著提高免疫動物的體液和細胞應答，在攻 毒試驗中對免疫動物進行有效保護，與商品化疫苗保護效果相當。
【主權(quán)項】
1. 一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，其特征在于含有BPEI/PLGA納米顆粒佐劑 和攜帶有PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒，所述攜帶有PRRSV 0RF5基因的重組質(zhì)粒吸附于 BPEI/PLGA納米顆粒佐劑表面。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，其特征在于所述BPEI/PLGA 納米顆粒為支化聚乙烯亞胺修飾的聚乳酸-羥基乙酸共聚物，粒徑為100-600 nm，所述支化 聚乙烯亞胺與聚乳酸-羥基乙酸共聚物的質(zhì)量比為1:9-11。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，其特征在于所述ΒΡΕΙ/ PLGA納米顆粒的制備方法包括以下步驟:將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于二氯甲烷，將支化 聚乙烯亞胺溶于聚乙烯醇水溶液，然后將兩者混合、乳化，除去有機溶劑，離心取沉淀，冷凍 干燥，得到BPEI/PLGA納米顆粒。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，其特征在于聚乳酸-羥基乙 酸共聚物與支化聚乙烯亞胺的質(zhì)量比9-11:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，其特征在于所述攜帶有 PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)粒是將PRRSV ORF5基因插入pcDNA3.1載體后獲得的。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗，其特征在于BPEI/PLGA納米 顆粒與攜帶有PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)粒的質(zhì)量比為10-12:2。7. 權(quán)利要求1所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗的制備方法，其特征在于包括如 下步驟:將BPEI/PLGA納米顆粒佐劑與攜帶有PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)?；旌暇鶆颍o置后 得到所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗的制備方法，其特征在于攜 帶有PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)粒采用如下方法制備:將攜帶有PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化宿主細胞，培養(yǎng)后，獲得攜帶有PRRSV ORF5基因的重組質(zhì)粒。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗的制備方法，其特征在于 所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸疫苗為凍干粉。
【文檔編號】A61K39/12GK106039302SQ201610450557
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月21日
【發(fā)明人】李彬, 杜露平, 何孔旺, 俞正玉, 逄鳳嬌, 徐向偉, 范寶超, 溫立斌
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學院