用于治療和預(yù)防癌癥的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的抗體或其片段，具有與CAPRIN?1蛋白或包含7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的所述蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性。
【專利說明】用于治療和預(yù)防癌癥的藥物組合物
[00011 本申請(qǐng)是中國(guó)專利申請(qǐng)200980138959.9的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日是2009年8 月5日，發(fā)明名稱是"用于治療和預(yù)防癌癥的藥物組合物"。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及抗CAPRIN-1抗體或其片段的新藥物用途，例如，用于癌癥的治療劑和/ 或預(yù)防劑。
【背景技術(shù)】
[0003] 癌癥是導(dǎo)致死亡的主要原因。目前，對(duì)癌癥進(jìn)行的治療主要是外科手術(shù)治療，其可 與放射治療和化療法聯(lián)合。盡管近年來開發(fā)了新的手術(shù)方法和發(fā)現(xiàn)了新的抗癌劑，但是除 了一些癌癥之外，癌癥治療的結(jié)果仍未得到大的改善。隨著近年來分子生物學(xué)和癌癥免疫 學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)鑒定了與癌癥特異性反應(yīng)的抗體、細(xì)胞毒T細(xì)胞所識(shí)別的癌抗原、以及編碼 癌抗原的基因，并且對(duì)靶向抗原的特異性免疫療法的期望已經(jīng)上升(Tsuyoshi AKIY0SHI， "Gan to Kagaku Ryouhou(癌癥和化療法)"，1997,第24卷，第551-519頁(yè)（日本），（Cancer and Chemotherapy Publishers Inc·，日本））。
[0004] 為減輕副作用，在癌癥治療方法中需要被識(shí)別為靶抗原的肽、多肽或蛋白質(zhì)不存 在于幾乎所有的正常細(xì)胞中，但特異性地存在于癌細(xì)胞中。在1991年，比利時(shí)路德維希研究 所Boon等人通過cDNA表達(dá)克隆法，使用自身癌細(xì)胞系和癌癥反應(yīng)性T細(xì)胞，分離了CD8陽(yáng)性T 細(xì)胞識(shí)別的人黑素瘤抗原MAGEl(Bruggen P.等人，Science ,254:1643-1647,1991)。此后， 報(bào)道了 SEREX(通過重組表達(dá)克隆法對(duì)抗原的血清學(xué)鑒定)方法，其中可應(yīng)用基因表達(dá)克隆 技術(shù)鑒定腫瘤抗原，其中所述的腫瘤抗原可被通過應(yīng)答于癌癥患者身體中的自身癌癥而產(chǎn) 生的抗體所識(shí)別（Proc .Natl. AcacL Sci.U.S.A. ,92:11810-11813,1995;和美國(guó)專利號(hào) 5， 698，396)。通過SEREX方法，分離了 一些基本上不在正常細(xì)胞中表達(dá)但在癌細(xì)胞中特異性表 達(dá)的癌抗原（Int.J. Cancer ,72 :965-971 (1997) ;Cancer Res. ,58:1034-1041(1998); Int·J.Cancer，29:652-658(1998);Int·J.Oncol·，14:703-708(1999);Cancer Res·，56: 4766-4772( 1996);和Hum.Mol .Genet 6:33-39，1997)。此外，已經(jīng)進(jìn)行了一些應(yīng)用與癌抗原 (其為一些分離的癌抗原)特異性反應(yīng)的免疫細(xì)胞、以及使用了包含癌抗原的疫苗等的癌特 異性免疫療法的臨床試驗(yàn)。
[0005] 同時(shí)，近年來，已開始存在靶向癌細(xì)胞上抗原蛋白質(zhì)的用于癌癥治療的各種抗體 藥物。此類用作癌特異性治療劑的藥物展示出某些程度的藥效，并且因此它們已得到了關(guān) 注。然而，多數(shù)靶抗原蛋白也表達(dá)于正常細(xì)胞中。施與抗體后，不僅會(huì)損傷癌細(xì)胞，而且還會(huì) 損傷已表達(dá)了靶抗原的正常細(xì)胞，由此會(huì)引起副作用（或反作用），這成為了一個(gè)問題。因 此，人們預(yù)期，如果能夠鑒定在癌細(xì)胞表面特異性表達(dá)的癌抗原，并且將靶向此類抗原的抗 體用作藥物，則利用更少副作用的抗體藥物的治療將能實(shí)現(xiàn)。
[0006] 胞質(zhì)和增殖相關(guān)蛋白l(CAPRIN-l)是當(dāng)靜止期的正常細(xì)胞被活化或發(fā)生細(xì)胞分裂 時(shí)表達(dá)的胞內(nèi)蛋白。CAPRI N-1還是已知與細(xì)胞中的RNA形成胞內(nèi)應(yīng)激顆粒并與調(diào)節(jié)mRNA運(yùn) 輸和翻譯有關(guān)的胞內(nèi)蛋白。CAPRIN-1具有不同的名稱，諸如GPI錨定的膜蛋白1和膜組分表 面標(biāo)記1蛋白（M11S1)，似乎這一蛋白被認(rèn)為是膜蛋白。這些不同的名稱源自這樣的報(bào)告： CAPRIN-1基因序列最初具有GPI結(jié)合區(qū)并且CAPRIN-1是在大腸癌細(xì)胞中表達(dá)的膜蛋白 (J.Biol.Chem.，270:20717-20723,1995)。后來報(bào)導(dǎo)了該報(bào)告中描述的CAPRIN-1基因序列 是不正確的，即，單個(gè)核苷酸從GenBank等中目前登記的CAPRIN-1基因序列中的缺失造成移 碼，因而導(dǎo)致80個(gè)氨基酸從羧基末端缺失，并且因而所得的人為產(chǎn)物(74個(gè)氨基酸)是前述 報(bào)告中所提及的GPI結(jié)合區(qū)；并且在該序列的的5'側(cè)也存在錯(cuò)誤，由此導(dǎo)致53個(gè)氨基酸從氨 基端缺失（J. Immuno 1 .，172: 2389-2400，2004)。此外，已經(jīng)報(bào)道了由GenBank等中目前所登 記CAPRIN-1基因序列編碼的蛋白質(zhì)不是細(xì)胞膜蛋白（J. Immunol .，172:2389-2400，2004)。
[0007] 此外，基于J.Biol .Chem. ,270:20717-20723,1995對(duì)CAPRIN-1 是細(xì)胞膜蛋白的報(bào) 告，US 2008/0075722和W0 2005/100998公開了名為M11S1的CAPRIN-1作為癌癥治療抗體藥 物的靶可用于癌癥治療，并且將其作為一個(gè)細(xì)胞膜蛋白；然而，實(shí)施例中沒有包含應(yīng)用抗該 蛋白的抗體治療癌癥的描述。然而，如J. Immunol. ,172:2389-2400,2004中所報(bào)道的那樣， 從US 2008/0075722申請(qǐng)以來直到現(xiàn)在，一般認(rèn)為CAPRIN-1不表達(dá)在細(xì)胞表面，并且因此， 顯然僅基于不正確信息即CAPRIN-1是細(xì)胞膜蛋白的US 2008/0075722和W0 2005/100998的 公開內(nèi)容不應(yīng)當(dāng)理解為本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識(shí)。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 發(fā)明所要解決的問題
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是鑒定在癌細(xì)胞表面特異性表達(dá)的癌抗原蛋白，以及提供靶向 此類蛋白的抗體作為癌治療劑和/或預(yù)防劑的用途。
[0011] 解決問題的手段
[0012] 通過深入的研究，通過SEREX方法，應(yīng)用衍生自睪丸組織的cDNA文庫(kù)和來自患乳腺 癌的狗的血清，本發(fā)明人已經(jīng)獲得了編碼與存在于荷瘤生物血清中的抗體相結(jié)合的蛋白質(zhì) 的cDNA。利用獲得的犬基因和與其同源的人、牛、馬、小鼠和雞的基因，現(xiàn)已制備了具有SEQ ID N0:2-30偶數(shù)編號(hào)（即，偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID N0:2-30)所示氨基酸序列的CAPRIN-1蛋白， 以及抗CAPRIN-1蛋白的抗體。此外，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)CAPRIN-1在乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋 巴癌、肺癌、食道癌、大腸癌、胃癌和腎癌細(xì)胞中特異性表達(dá)，并且CAPRIN-1蛋白的一部分在 此類腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)。此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)抗表達(dá)于癌細(xì)胞表面的CAPRIN-1部分 的抗體能夠損傷(損害)表達(dá)CAPRIN-1的癌細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)使得完成了本發(fā)明。
[0013] 因此，本發(fā)明具有以下描述的特征。
[0014] 本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的具有與 CAPRIN-1蛋白、或與包含7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的CAPRIN-1蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的 抗體或其片段，其中所述的CAPRIN-1蛋白具有偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID N0: 2-30任一項(xiàng)所示的氨 基酸序列，或與偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID N0:2-30任一項(xiàng)的氨基酸序列具有80%或更多、優(yōu)選 85 %或更多、更優(yōu)選90 %或更多、以及更優(yōu)選95 %或更多序列同一性的氨基酸序列。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴癌、肺癌、 食道癌、大腸癌、胃癌和腎癌。
[0016] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0017] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述抗體是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗 體或雙特異性抗體。
[0018] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述抗體是具有與下述多肽、或與該多肽的片段的 免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體，其中所述的多肽具有SEQ ID N0:37或SEQ ID N0:136所示的氨基酸 序列、或與該氨基酸序列具有80%或更多、優(yōu)選85%或更多、更優(yōu)選90%或更多、以及更優(yōu) 選95%或更多序列同一性的氨基酸序列。
[0019] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，在包含作為活性成分的抗體的治療和/或預(yù)防癌癥 的藥物組合物中，上述抗體是下述抗體(a)至(k)任一項(xiàng)、且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué) 反應(yīng)性的抗體：
[0020] (a)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 44、45和46所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0021] (b)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 50、51和52所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0022] (c)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 55、56和57所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0023] (d)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 60、61和62所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0024] (e)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 65、66和67所不序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0025] (f)包含有包含SEQIDN0:70、71和72所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQID N0:74、75和76所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0026] (g)包含有包含SEQ ID N0:80、81和82所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 84、85和86所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0027] (h)包含有包含SEQ ID N0:90、91和92所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 94、95和96所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0028] (i)包含有包含SEQ ID N0:100、101和102所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 104、105和106所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0029] (j)包含有包含SEQ ID N0:110、111和112所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 114、115和116所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體；
[0030] (k)包含有包含SEQ ID N0:120、121和122所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 124、125和126所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體。
[0031] 發(fā)明效果
[0032] 本發(fā)明使用的抗CAPRIN-1抗體損傷(或損壞）癌細(xì)胞。因此，此類抗CAPRIN-1抗體 可用于治療或預(yù)防癌癥。
[0033] 附圖簡(jiǎn)述
[0034]圖1顯示了編碼CAPRIN-1蛋白的基因在正常組織和腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)模式。在 這一附圖中，參考編號(hào)1代表每一編碼CAPRIN-1蛋白的基因的表達(dá)模式，并且參考編號(hào)2代 表GAPDH基因的表達(dá)模式。
[0035] 圖2顯示了抗CAPRIN-1抗體（或抗-CAPRIN-1抗體）對(duì)表達(dá)CAPRIN-1基因的乳腺癌 細(xì)胞系（T47D)的細(xì)胞毒活性。在這一附圖中，參考編號(hào)3顯示了添加抗-CAPRIN-1抗體后的 活性，參考編號(hào)4顯示了添加對(duì)照抗體后的活性，以及參考編號(hào)5顯示了不存在任何抗體時(shí) 的活性。
[0036] 圖3顯示了抗CAPRIN-1抗體（或抗-CAPRIN-1抗體）對(duì)表達(dá)CAPRIN-1基因的乳腺癌 細(xì)胞系(MDA-MB-157)的細(xì)胞毒活性。在這一附圖中，參考編號(hào)6顯示了添加抗-CAPRIN-1抗 體后的活性，參考編號(hào)7顯示了添加對(duì)照抗體后的活性，以及參考編號(hào)8顯示了不存在任何 抗體時(shí)的活性。
[0037] 圖4顯示了對(duì)表達(dá)CAPRIN-1基因的乳腺癌MDA-MB-157細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，其中該 細(xì)胞毒性由與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-1單克隆抗體（即單克隆抗體#1至#11)所顯示。 具體地，這一附圖顯示了添加#1抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)9)、#2抗CAPRIN-1單克隆 抗體(參考編號(hào)10)、#3抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)11)、#4抗CAPRIN-1單克隆抗體(參 考編號(hào)12)、#5抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)13)、#6抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào) 14)、#7抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)15)、#8抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)16)、#9 抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)17)、#10抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)18)、以及#11 抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)19)后的活性水平，添加與CAPRIN-1蛋白本身反應(yīng)但不與 癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體后的活性水平（參考編號(hào)20)，以及添加 PBS代替每一抗體后 的活性水平(參考編號(hào)21)。
[0038] 圖5a至5c顯示了與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-1單克隆抗體（即單克隆抗體#1 至#11)對(duì)Balb/c小鼠的抗腫瘤活性，其中向該小鼠移植了表達(dá)CAPRIN-1的小鼠癌CT26細(xì)胞 系。這些附圖顯示了施與#1抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)22)、#2抗CAPRIN-1單克隆抗 體(參考編號(hào)23)、#3抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)24)、#4抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考 編號(hào)25)、#5抗CAPRIN-1單克隆抗體（參考編號(hào)26)、#6抗CAPRIN-1單克隆抗體（參考編號(hào) 27)、#7抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)28)、#8抗CAPRIN-1單克隆抗體（參考編號(hào)29)、#9 抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)30)、#10抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)31)、以及#11 抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)32)后的小鼠腫瘤大小，施與和CAPRIN-1蛋白本身反應(yīng)但 不與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體后的小鼠腫瘤大小(參考編號(hào)33)，以及施與PBS代替每 一抗體后的小鼠腫瘤大小(參考編號(hào)34)。
[0039] 圖6a至6c顯示了與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-1單克隆抗體（即單克隆抗體#1 至#11)對(duì)Balb/c小鼠的抗腫瘤活性，其中向該小鼠移植了表達(dá)CAPRIN-1的小鼠癌N1E細(xì)胞 系。這些附圖顯示了施與#1抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)35)、#2抗CAPRIN-1單克隆抗 體(參考編號(hào)36)、#3抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)37)、#4抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考 編號(hào)38)、#5抗CAPRIN-1單克隆抗體（參考編號(hào)39)、#6抗CAPRIN-1單克隆抗體（參考編號(hào) 40)、#7抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)41)、#8抗CAPRIN-1單克隆抗體（參考編號(hào)42)、#9 抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)43)、#10抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)44)、以及#11 抗CAPRIN-1單克隆抗體(參考編號(hào)45)后的小鼠腫瘤大小，施與和CAPRIN-1蛋白本身反應(yīng)但 不與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體后的小鼠腫瘤大小(參考編號(hào)46)，以及施與PBS代替每 一抗體后的小鼠腫瘤大小(參考編號(hào)47)。
[0040] 實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案
[0041] 如下所述，可通過體內(nèi)檢查荷瘤動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)抑制，或通過體外檢查是否展示 了對(duì)表達(dá)下述多肽的腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性，從而評(píng)估本發(fā) 明中使用的偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO:2-30任一項(xiàng)所示多肽的抗體的抗腫瘤活性。
[0042] 此外，編碼由偶數(shù)編的SEQ ID N0:2至30(即，SEQ ID N0:2、4、6. . .28和30)所示氨 基酸序列組成的蛋白的多核苷酸序列分別顯示于奇數(shù)編號(hào)的SEQ ID N0:1至29(即，SEQ ID Ν0:1、3、5··.27和29)。
[0043] 本發(fā)明公開的序列表中SEQ ID如:6、8、10、12和14所示的氨基酸序列是0?1?1^1 蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其是通過SEREX方法，應(yīng)用衍生自犬睪丸組織的cDNA文庫(kù)以及來自患 乳腺癌的犬的血清，作為能與特異性地存在于來自荷瘤犬的血清中的抗體結(jié)合的多肽，從 而分離得到的；SEQ ID N0: 2和4中顯示的氨基酸序列是作為所述犬多肽的人同源物而分離 的CPRIN-1蛋白質(zhì)氨基酸序列；SEQ ID N0:16顯示的氨基酸序列是作為所述犬多肽的牛同 源物而分離的CPRIN-1蛋白質(zhì)氨基酸序列；SEQ ID N0:18顯示的氨基酸序列是作為所述犬 多肽的馬同源物而分離的CPRIN-1蛋白質(zhì)氨基酸序列；SEQ ID N0:20至28(偶數(shù)編號(hào)）顯示 的氨基酸序列是作為所述犬多肽的鼠科動(dòng)物同源物而分離的CPRIN-1蛋白質(zhì)氨基酸序列； 以及SEQ ID N0:30顯示的氨基酸序列是作為所述犬多肽的雞同源物而分離的CPRIN-1蛋白 質(zhì)氨基酸序列（參見以下描述的實(shí)施例1)。已知當(dāng)處于靜止期的正常細(xì)胞發(fā)生活化或細(xì)胞 分裂時(shí)表達(dá)CAPRIN-1。
[0044]已知CAPRIN-1不在細(xì)胞表面表達(dá)。然而，作為與本發(fā)明相關(guān)的檢查的結(jié)果，現(xiàn)已揭 示CAPRIN-1的某些部分表達(dá)于多種癌細(xì)胞表面。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用與CAPRIN-1蛋白中 在癌細(xì)胞表面表達(dá)的那部分結(jié)合的抗體。CAPRIN-1蛋白中在癌細(xì)胞表面表達(dá)的部分肽的實(shí) 例包括由序列表中偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID N0:2至30(SEQ ID N0:6和18除外）任一項(xiàng)所示氨基 酸序列的氨基酸殘基No.(或氨基酸(aa))50-98,或氨基酸殘基No. (aa) :233-305的區(qū)域中7 個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸組成的多肽。其具體的實(shí)例包括SEQ ID N0: 37或136所示氨基酸序 列（優(yōu)選地，SEQ ID N0:136所示氨基酸序列中SEQ ID N0:137或138所示的氨基酸序列區(qū) 域），或與所述氨基酸序列具有80%或更多、優(yōu)選85%或更多、更優(yōu)選90%或更多、以及更優(yōu) 選95%或更多序列同一性的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體包括能與上述肽結(jié)合且具有抗腫瘤 活性的所有抗體。
[0045]如上所述的可用于本發(fā)明的抗CAPRIN-1抗體可以是任意類型的抗體，只要它們能 夠展示出抗腫瘤活性。其實(shí)例包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、多特異性抗體、人抗 體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體(scFV)、及其片段，諸如Fab和F(ab'） 2。可通過本領(lǐng)域 公知的方法制備這些抗體及其片段。在本發(fā)明中，能夠與CAPRIN-1蛋白質(zhì)特異結(jié)合的抗體 是所期望的。此類抗體優(yōu)選為單克隆抗體，然而，只要能穩(wěn)定地產(chǎn)生同質(zhì)抗體，也可使用多 克隆抗體。此外，如果受試者是人，則人抗體或人源化抗體是所期望的，以避免或抑制免疫 排斥。
[0046]本文所使用的詞語(yǔ)"與CAPRIN-1蛋白特異結(jié)合"是指目的抗體與CAPRIN-1蛋白特 異性地結(jié)合并且基本上不與其他蛋白質(zhì)結(jié)合。
[0047] 如下所述，可通過體內(nèi)檢查荷瘤動(dòng)物的腫瘤生長(zhǎng)抑制，或通過體外檢查是否展示 了對(duì)表達(dá)所述多肽的腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞介導(dǎo)的或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性，從而評(píng)估本發(fā) 明所使用的抗體的抗腫瘤活性。
[0048] 此外，需要本發(fā)明的癌癥治療和/或預(yù)防的受試者是哺乳動(dòng)物，諸如人、寵物、家畜 或競(jìng)技動(dòng)物。優(yōu)選的受試者是人。
[0049] 以下將解釋本發(fā)明相關(guān)的抗原的制備、抗體以及藥物組合物的制備。
[0050] 〈用于制備抗體的抗原的制備〉
[0051] 本發(fā)明中使用的用作敏化抗原以獲得抗CAPRIN-1抗體的蛋白質(zhì)或其片段不限于 其來源，諸如動(dòng)物，例如人、犬、牛、馬、小鼠、大鼠和雞。然而，優(yōu)選根據(jù)與用于細(xì)胞融合的親 本細(xì)胞的相容性選擇此類抗體或其片段。通常優(yōu)選衍生自哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)，尤其優(yōu)選衍 生自人的蛋白質(zhì)。例如，如果CAPRIN-1是人CAPRIN-1，可使用人CAPRIN-1蛋白，其部分肽，或 能夠表達(dá)人CAPRIN-1的細(xì)胞。
[0052] 例如可通過登錄GenBank(NCBI，USA)和應(yīng)用BLAST或FASTA算法（Karlin和 Altschul，Proc·Natl.Acad·Sci·USA，90:5873-5877，1993;Altschul等，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，1997)獲得人CAPRIN-1和其同源物的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)將人CAPRIN-1的核苷酸序列（SEQ ID N0:1或3)或氨基酸序列（SEQ ID N0: 2或4)用作基礎(chǔ)序列時(shí)，靶標(biāo)是每一個(gè)由與該基礎(chǔ)核苷酸序列或氨基酸序列的0RF或 成熟部分的核苷酸序列或氨基酸序列具有70%_100%、優(yōu)選80%-100%、更優(yōu)選90%-100%、以及更優(yōu)選95%-100% (例如，97%-100%，98%-100%，99%-100%或99.5%-100%)序列同一性的序列組成的核酸或蛋白質(zhì)。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"％序列同一性"是指， 在引入或不引入缺口以比對(duì)兩個(gè)序列從而達(dá)到最大相似度的情況下，同一的氨基酸(或核 苷酸)數(shù)對(duì)氨基酸(或核苷酸)總數(shù)的百分比（％)。
[0054] CAPRIN-1蛋白的片段長(zhǎng)度為由抗體識(shí)別的抗原最小單位的表位(或抗原決定簇） 氨基酸長(zhǎng)度至小于該蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)。所述表位是指在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選在人中具有抗原性或 免疫原性的多肽片段。該多肽片段的最小單位由約7至12個(gè)氨基酸組成，例如8至11個(gè)氨基 酸。其具體的實(shí)例是SEQ ID NO:37、SEQ ID N0:137或SEQ ID N0:138所示氨基酸序列，或與 所述氨基酸序列具有80 %或更多、優(yōu)選85 %或更多、更優(yōu)選90 %或更多、以及更優(yōu)選95 %或 更多序列同一性的氨基酸序列。
[0055]包含前述人CAPRIN-1蛋白及其部分肽的多肽可根據(jù)化學(xué)合成方法合成，諸如Fmoc 法(荷甲氧羰基法)或tBoc法(叔丁氧羰基法)法(Japanese Biochemical Society(編著）， 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（Seikagaku Jikken Kouza)l，蛋白質(zhì)化學(xué)IV，化學(xué)修飾與肽合成， Kagaku-dojin Publishing Company, Inc.，日本，1981)。另外，可應(yīng)用多種市售的肽合成儀 根據(jù)常規(guī)技術(shù)來合成所述多肽。此外，可通過應(yīng)用已知的基因工程方法（Sambrook等， Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Bi〇l〇gy(1995)，J〇hn Wiley&Sons，等）制備編碼上述多肽的多核苷酸，將每一多核苷酸整 合至表達(dá)載體中并將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，由此允許該宿主細(xì)胞產(chǎn)生所述多肽，從而獲得目 標(biāo)多肽。通過此類方法，可獲得期望的多肽。
[0056]通過已知的基因工程技術(shù)或使用市售核酸合成儀的常規(guī)技術(shù)，可以容易地制備編 碼上述多肽的多核苷酸。例如，可以通過PCR，使用人染色體DNA或cDNA文庫(kù)作為模板和所設(shè) 計(jì)的能夠擴(kuò)增SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的引物對(duì)制備包含SEQ ID NO: 1所示核苷酸序 列的DNA。PCR條件可以適當(dāng)?shù)卮_定。例如，此類條件可包括進(jìn)行30次由以下組成的反應(yīng)步驟 (作為每一循環(huán))循環(huán):94°C，30秒(變性）；55°C，30秒至1分鐘(退火）；以及在72°C，2分鐘(延 伸），使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和含Mg2+的PCR緩沖液，隨后在完成30個(gè)循 環(huán)后在72°C反應(yīng)7分鐘。然而，本發(fā)明不限于上述示范性PCR條件。PCR技術(shù)和條件在例如 Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 1995,John Wiley&Sons(特別 是第15章）中得以描述。
[0057]另外，可以基于本文描述的序列表中SEQ ID NO: 1至30所示的核苷酸序列和氨基 酸序列的信息制備適當(dāng)?shù)奶结樅鸵铮⑶矣么祟愄结樅弦锖Y選人cDNA文庫(kù)等，從而可 分離目的DNA。此類cDNA文庫(kù)優(yōu)選地從表達(dá)偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID N0:2至30中任一所示蛋白質(zhì) 的細(xì)胞、器官或組織制備。細(xì)胞或組織的實(shí)例包括來自睪丸和癌或腫瘤，諸如白血病、乳腺 癌、淋巴瘤、腦腫瘤、肺癌和大腸癌的細(xì)胞或組織。上文所述的操作，諸如探針或引物的制 備、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、cDNA文庫(kù)的篩選和目的基因的克隆，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并 且它們例如可以根據(jù)Sambrook等人，Molecular Cloning,第2版，Current Protocols in Molecular Biology，（1989)，Ausubel等人（同上）中所述的方法實(shí)施。編碼人CAPRIN-1蛋白 及其部分肽的DNA可從由此獲得的DNA中獲得。
[0058]上述宿主細(xì)胞可以是任意細(xì)胞，只要它們可表達(dá)上述多肽。原核宿主細(xì)胞的實(shí)例 包括但不限于大腸桿菌。真核宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如猴腎細(xì)胞 (COS 1)、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CH0)、人胚腎細(xì)胞系(HEK293)和胎小鼠皮膚細(xì)胞系(NIH3T3); 酵母細(xì)胞，諸如出芽酵母細(xì)胞和分裂酵母細(xì)胞;家蠶細(xì)胞和爪蟾卵細(xì)胞。
[0059] 當(dāng)使用原核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，可使用具有可在原核細(xì)胞中復(fù)制的起點(diǎn)、啟動(dòng) 子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、終止子、耐藥基因和營(yíng)養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)基因等的表達(dá)載體。 大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例可以是pUC載體、pBluescriptIKpET表達(dá)系統(tǒng)、pGEX表達(dá)系統(tǒng)等。 可以將編碼上述多肽的DNA整合至這種表達(dá)載體，用此種載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞，并且然后 培養(yǎng)由此得到的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，因此，可以在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)由該DNA編碼的多肽。在 這種情況下，該多肽還可作為與另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白表達(dá)。
[0060] 當(dāng)使用真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞時(shí)，使用具有啟動(dòng)子、剪接區(qū)和聚腺苷酸添加位點(diǎn) 等的真核細(xì)胞表達(dá)載體。此類表達(dá)載體的實(shí)例包括口以1、？0^8、？5￥1(3、？156、？5￥1^?81(-CMV、pBK-RSV、EBV載體、pRS、pcDNA3和pYES2。通過與上述方法類似的方法，將編碼上述多肽 的DNA整合至這種表達(dá)載體，用該載體轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞，并且隨后培養(yǎng)由此獲得的經(jīng)轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞，由此，可以在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。當(dāng)使用pIND/V5-His、 pFLAG-CMV-2、pEGFP-Nl、pEGFP-Cl等作為表達(dá)載體時(shí)，可作為與標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)上述 多肽，所述標(biāo)簽諸如Hi s標(biāo)簽(例如，（Hi s) 6至(Hi s) 1Q)、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽或GFP。
[0061] 為將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞中，可使用公知的方法，諸如電穿孔法、磷酸鈣法、月旨 質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法、顯微注射法、病毒感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或與細(xì)胞膜透過性肽結(jié)合。 [0062]可通過聯(lián)合使用已知的分離技術(shù)從宿主細(xì)胞分離和純化目的多肽。此類已知技術(shù) 的實(shí)例包括但不限于用變性劑如脲或表面活性劑處理法、超聲破碎法、酶消化法、鹽析、溶 劑分級(jí)沉淀法、透析法、離心法、超濾法、凝膠過濾法、SDS-PAGE、等電點(diǎn)聚焦電泳、離子交換 層析法、疏水層析法、親和層析法和反相層析法。
[0063]〈抗體結(jié)構(gòu)〉
[0064] -般地，抗體是異多聚糖蛋白，其每一個(gè)包含至少兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈。同時(shí)，除 IgM之外的抗體均是每一個(gè)包含兩個(gè)相同輕(L)鏈和兩個(gè)相同重(Η)鏈的異四聚體糖蛋白 (約150kDa)。一般地，每一輕鏈通過單共價(jià)二硫鍵與重鏈相連。然而，重鏈之間的二硫鍵數(shù) 在不同的免疫球蛋白同種型之間是不同的。每一個(gè)重鏈和輕鏈還具有鏈內(nèi)二硫鍵。每一重 鏈在其一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VH區(qū)），一些恒定區(qū)與其順序地相連。每一輕鏈在其一端具有 可變結(jié)構(gòu)域(VL區(qū)），并且在其相反端具有單恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)對(duì) 齊，并且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈可變結(jié)構(gòu)域?qū)R?？贵w可變結(jié)構(gòu)域的稱為"互補(bǔ)決定區(qū) (CDR)"的特定區(qū)域展現(xiàn)出特定的變異性，由此賦予抗體的結(jié)合特異性?？勺儏^(qū)中相對(duì)保守 的部分稱為"構(gòu)架區(qū)(FR)"。完整的重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包含4個(gè)FR，它們通過3個(gè)CDR彼此 相連。此類⑶R以從重鏈N端開始的順序分別稱為"CDRH1"、"CDRH2"和"CDRH3"。類似地，對(duì)于 輕鏈，它們分別被稱為"CDRL1"、"CDRL2"和"CDRL3" <XDRH3對(duì)抗體-抗原結(jié)合特異性而言起 著最重要的作用。此外，每一鏈中的CDR通過FR區(qū)而保持它們彼此接近的狀態(tài)，并且它們與 相應(yīng)鏈的CDR-起形成抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn)。恒定區(qū)不直接對(duì)抗原-抗體結(jié)合起作用。然而， 它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)子作用，諸如與抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、通過結(jié)合 Fey受體的吞噬作用，通過新生兒Fc受體(FcRn)的半壽期/清除速率、以及通過補(bǔ)體級(jí)聯(lián)中 的Clq的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。
[0065]〈抗體制備〉
[0066]本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"抗-CAPRIN-1抗體"是指具有與全長(zhǎng)CAPRIN-1蛋白或其片段的 免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體。
[0067]本文所使用的術(shù)語(yǔ)"免疫學(xué)反應(yīng)性"表示抗體在體內(nèi)結(jié)合CAPRIN-1抗原的性質(zhì)。損 傷腫瘤的功能(例如，死亡、抑制或消退)可通過此類結(jié)合的結(jié)果而發(fā)揮出來。特別地，任意 類型的抗體均可用于本發(fā)明，只要該抗體可與CAPRIN-1蛋白結(jié)合從而損傷腫瘤或癌，諸如 白血病、淋巴瘤、乳腺癌、腦腫瘤、肺癌、食道癌、胃癌、腎癌或大腸癌。
[0068]此類抗體的實(shí)例包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、多特異性抗體、人抗體、 人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab和F(ab '）2)。此外，此類抗體任 意的免疫球蛋白類型的實(shí)例包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY，并且任意的免疫球蛋白亞類 的實(shí)例包括 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。
[0069] 除了糖基化之外，抗體還可通過乙?；⒓柞；?、酰胺化、磷酸化或聚乙二醇化 (PEG)而得以修飾。
[0070] 各種抗體的制備實(shí)例如下所述。
[0071] 在目標(biāo)抗體是單克隆抗體的情況下，將表達(dá)CAPRIN-1的乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞系等 施與小鼠用于免疫，隨后從該小鼠提取脾臟。從每一脾臟分離細(xì)胞，然后將其與小鼠骨髓瘤 細(xì)胞融合。從所得到的融合細(xì)胞(雜交瘤)篩選能夠產(chǎn)生具有癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的抗體的 克隆。分離和培養(yǎng)產(chǎn)生具有癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的單克隆抗體的雜交瘤。可通過一般的親 和純化方法從培養(yǎng)上清液中純化制備目標(biāo)抗體。
[0072]此外，還可例如通過以下描述的方式制備產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。首先，通過已 知方法用敏化抗原免疫動(dòng)物。在一般的方法中，通過腹膜內(nèi)或皮下注射敏化抗原至哺乳動(dòng) 物而實(shí)施免疫。具體地，將敏化抗原稀釋或懸浮于PBS(磷酸鹽緩沖鹽水）、生理鹽水等中至 合適的結(jié)果量。如需要的話，在其中混合合適量的常規(guī)佐劑(例如，弗氏完全佐劑）。發(fā)生乳 化后，每4至21天地將產(chǎn)物施與哺乳動(dòng)物數(shù)次。此外，可與敏化抗原一起使用足夠的載體用 于免疫。
[0073] 如上所述，免疫哺乳動(dòng)物并確定升高至期望的血清抗體水平之后，從該哺乳動(dòng)物 收集免疫細(xì)胞，并進(jìn)行融合。免疫細(xì)胞的特別優(yōu)選的實(shí)例是脾細(xì)胞。
[0074] 將哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞用作相關(guān)的親本細(xì)胞，進(jìn)行與上述免疫細(xì)胞的融合。對(duì)于 此類骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選使用已知細(xì)胞系的以下實(shí)例：P3U1 (P3-X63Ag8Ul )、P3 (P3x63Ag8·653)(J·Immunol·(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-l(Kohler.G.和Milstein, C.Eur.J.Immunol.(1976).6,511-519)、MPC-ll(Margulies.D.H.等，Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276,269-270)、F0(de St.Groth，S.F.等， J.Immunol.Methods(1980)35,1-21)^S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323)和R210(Galfre,G.等，Nature(1979)277,131-133)。
[0075] 基本上可根據(jù)已知的方法，諸如Kohler和Mil stein等（Kohler，G.和Mil stein, C.Methods Enzymol. (1981)73，3-46)的方法，進(jìn)行免疫細(xì)胞和上述骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融 合。
[0076] 更具體地，例如在含有常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)溶液中、在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下進(jìn) 行上述細(xì)胞融合。可使用的融合促進(jìn)劑的實(shí)例包括聚乙二醇(PEG)和仙臺(tái)病毒(HVJ:日本血 凝病毒）。如需要的話，可進(jìn)一步添加諸如二甲亞砜的佐劑，用于提高融合效率。
[0077] 可任意地確定所使用的免疫細(xì)胞和所使用的骨髓瘤細(xì)胞之間的比例。例如，免疫 細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的比例優(yōu)選為1:1至10 :1?？捎糜谏鲜黾?xì)胞融合的培養(yǎng)液的實(shí)例包括可 滿足上述骨髓瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的RPMI1640培養(yǎng)液和MEM培養(yǎng)液，以及用于這一細(xì)胞培養(yǎng)類型 的其他常規(guī)培養(yǎng)液。此外，可與其聯(lián)合使用血清替代物，諸如胎牛血清(FCS)。
[0078] 為進(jìn)行細(xì)胞融合，將上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以預(yù)定量在培養(yǎng)液中充分混合。 將之前加熱至約37°C的PEG溶液（例如，平均分子量：約1000至6000)以一般地30 %至60 % (w/v)的濃度加入其中，隨后混合。這使得形成了目標(biāo)雜交瘤。隨后，重復(fù)地進(jìn)行相繼地添加 合適的培養(yǎng)基和通過離心移除上清液的操作步驟，從而移除不適于雜交瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞融合 劑等。
[0079] 在常規(guī)的選擇培養(yǎng)液諸如HAT培養(yǎng)液(包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)液） 中培養(yǎng)如此獲得的雜交瘤，用于選擇。持續(xù)地進(jìn)行在諸如HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，持續(xù)足以使 目標(biāo)雜交瘤之外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞)死亡的時(shí)間（一般為數(shù)天至數(shù)周）。接下來，應(yīng)用常規(guī) 的有限稀釋方法篩選產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤，并得到單克隆。
[0080] 此外，還可能用以下方式獲得產(chǎn)生具期望活性（例如，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性）的人抗 體的雜交瘤，以及通過用抗原免疫非人動(dòng)物獲得上述雜交瘤。用蛋白質(zhì)、表達(dá)蛋白的細(xì)胞或 其溶胞產(chǎn)物在體外敏化人淋巴細(xì)胞(例如，用EB病毒感染的人淋巴細(xì)胞），并將敏化的淋巴 細(xì)胞與能永久分裂的人來源的骨髓瘤細(xì)胞(例如U266)(登錄號(hào)TIB196)融合。
[0081] 可在常規(guī)培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)如上產(chǎn)生的產(chǎn)單克隆抗體雜交瘤。此外，可將它們保 存于液氮中一段時(shí)間。
[0082] 特別地，根據(jù)常規(guī)免疫方法使用期望的抗原或表達(dá)期望抗原的細(xì)胞作為敏化抗原 進(jìn)行免疫。通過常規(guī)細(xì)胞融合方法將得到的免疫細(xì)胞與公知的親本細(xì)胞融合。然后，通過常 規(guī)篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞(雜交瘤）。因此，可進(jìn)行抗體制備。
[0083]可用于本發(fā)明的抗體的其他實(shí)例包括多克隆抗體。例如，可應(yīng)用如下描述的方法 獲得多克隆抗體。
[0084]通過用天然存在的CAPRIN-1蛋白、作為與GST等融合的蛋白在諸如大腸桿菌的微 生物中表達(dá)的重組CAPRIN-1蛋白、或其部分肽免疫諸如小鼠、產(chǎn)生人抗體的小鼠、或兔的小 動(dòng)物，從而獲得血清。通過硫酸銨沉淀、蛋白A/蛋白G柱層析、DEAE離子交換層析、親和柱層 析(使用偶聯(lián)了 CAPRIN-1蛋白或合成肽的柱子）、或用于制備多克隆抗體的類似技術(shù)，純化 血清。在以下描述的實(shí)施例中，制備了兔多克隆抗體，并確認(rèn)了其抗腫瘤效果，該抗體針對(duì) 在癌細(xì)胞表面表達(dá)的CAPRIN-1蛋白質(zhì)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域的部分肽(具有SEQ ID N0:37所 示序列）。
[0085] 本文所使用的已知產(chǎn)人抗體小鼠例如是KM小鼠 （Kirin Pharma/Medarex)或 XenoMouse(Amgen)(例如W002/43478和W002/092812)。當(dāng)用CAPRIN-1 蛋白或其片段免疫此 類小鼠時(shí)，可從血液中獲得完全的人多克隆抗體。此外，可通過將收集自經(jīng)免疫的小鼠的脾 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的方法制備人單克隆抗體。
[0086]可根據(jù)諸如應(yīng)用動(dòng)物細(xì)胞的方法（日本專利公開，特表2007-530068號(hào)）或應(yīng)用桿 狀病毒的方法(例如，W098/46777)的方法制備抗原。如果抗原的免疫原性低的話，將抗原與 具有免疫原性的大分子(諸如白蛋白）結(jié)合。然后，可將該抗原用于免疫。
[0087]此外，可使用基因重組抗體，所述重組抗體通過從雜交瘤克隆抗體基因，將該克隆 整合至適當(dāng)?shù)妮d體，將該載體引入宿主，并應(yīng)用基因重組技術(shù)制備。（例如，參見，Carl， A·K·Borrebaeck，James，W·Larrick，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，由MACMILLAN PUBLISHERS LTD在英國(guó)出版，1990)。具體地，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶從雜交瘤mRNA合成抗體的可變 區(qū)(V區(qū)）cDNA。獲得編碼目標(biāo)抗體V區(qū)的DNA后，將此類DNA與所期望的編碼抗體恒定區(qū)（C區(qū)） 的DNA連接。將得到的產(chǎn)物整合至表達(dá)載體。備選地，可將編碼抗體V區(qū)的DNA整合至包含抗 體C區(qū)DNA的表達(dá)載體中。將此類DNA整合至表達(dá)載體中，以使得其在諸如增強(qiáng)子或啟動(dòng)子的 表達(dá)控制區(qū)的控制下表達(dá)。之后，用此類表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，由此使得抗體表達(dá)。
[0088]本發(fā)明的抗-CAPRIN-1抗體優(yōu)選為單克隆抗體。然而，它們可以是多克隆抗體、基 因修飾的抗體(諸如嵌合抗體和人源化抗體)等。
[0089]單克隆抗體包括人單克隆抗體和非人動(dòng)物單克隆抗體(例如，小鼠單克隆抗體、大 鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體和雞單克隆抗體）?？赏ㄟ^培養(yǎng)雜交瘤獲得單克隆抗體，其中 通過骨髓瘤細(xì)胞和來自用CAPRIN-1蛋白免疫的非人哺乳動(dòng)物(例如，小鼠或產(chǎn)生人抗體的 小鼠）的脾細(xì)胞的融合獲得所述雜交瘤。在以下描述的實(shí)施例中，產(chǎn)生了小鼠單克隆抗體并 證實(shí)了其抗腫瘤作用。此類單克隆抗體包含具有SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:73、SEQ ID N0: 83、SEQIDN0:93、SEQIDN0:103、SEQIDN0:113或SEQIDN0:123所示氨基酸序列的重 鏈可變（VH)區(qū)，和具有SEQ ID N0:47、SEQ ID N0:53、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:68、SEQIDN0:77、SEQIDN0:87、SEQIDN0:97、SEQIDN0:107、SEQIDN0:117SSEQ IDN0 :127所示氨基酸序列的輕鏈可變(VL)區(qū)。此處，該VH區(qū)包含：由SEQIDN0:40、SEQID NO:70、SEQ ID NO:80、SEQID NO:90、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:120的氨 基酸序列表示的CDR1;由SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:71、SEQ ID N0:81、SEQ ID N0:91、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 121 的氨基酸序列表示的CDR2;以及由SEQ ID NO: 42、SEQIDN0:72、SEQIDN0:82、SEQIDN0:92、SEQIDN0:102、SEQIDN0:112SSEQID N0:122的氨基酸序列表示的CDR3。該VL區(qū)包含：由SEQIDN0:44、SEQIDN0:50、SEQID N0:55、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:65、SEQ ID N0:74、SEQ ID N0:84、SEQ ID N0:94、SEQ ID N0:104、SEQIDN0:114或SEQIDN0:124的氨基酸序列表示的CDR1;由SEQIDN0:45、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:75、SEQ ID N0:85、SEQ IDN0:95、SEQIDN0:105、SEQIDN0:115或SEQIDN0:125的氨基酸序列表示的CDR2;以 及由SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:57、SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:67、SEQ ID N0:76、SEQIDN0:86、SEQIDN0:96、SEQIDN0:106、SEQIDN0:116或SEQIDN0:126的 氨基酸序列表示的⑶R3。
[0090] 嵌合抗體是通過組合來自不同動(dòng)物的序列所產(chǎn)生的抗體。其實(shí)例是由小鼠抗體重 鏈和輕鏈可變區(qū)，以及人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)組成的抗體?？赏ㄟ^公知的方法制備此類 嵌合抗體。例如，可通過連接編碼抗體V區(qū)的DNA至編碼人抗體C區(qū)的DNA，將產(chǎn)物整合至表達(dá) 載體，并將該載體引入用于抗體制備的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生此類嵌合抗體。
[0091] 多克隆抗體包括通過用CAPRIN-1抗體免疫產(chǎn)生人抗體的動(dòng)物（例如小鼠）而獲得 的抗體。
[0092] 人源化抗體是經(jīng)修飾的抗體，其有時(shí)也稱為"重構(gòu)人抗體"。公知通過將來自免疫 動(dòng)物的抗體的CDR移植至人抗體互補(bǔ)決定區(qū)從而構(gòu)建人源化抗體。這種一般的基因重組技 術(shù)也是公知的。
[0093] 具體地，通過PCR方法合成被設(shè)計(jì)以允許小鼠抗體⑶R與人抗體構(gòu)架區(qū)(FR)連接的 DNA序列，其中所述的PCR使用了若干個(gè)如下方式制備的寡核苷酸，即該寡核苷酸具有在其 一端與彼此重疊的部分。可通過將上面得到的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接、將產(chǎn)物 整合至表達(dá)載體、并將該載體引入用于產(chǎn)生抗體的宿主細(xì)胞中，從而獲得人源化抗體(參見 EP-A-239400和W096/02576)。以下述假設(shè)選擇通過CDR彼此相連的人抗體FR，即互補(bǔ)決定區(qū) 能夠形成良好的抗原結(jié)合位點(diǎn)。如果需要的話，也可以以下述方式替換抗體可變區(qū)的構(gòu)架 區(qū)中的氨基酸，即，使得重構(gòu)人抗體中的互補(bǔ)決定區(qū)形成合適的抗原結(jié)合位點(diǎn)（Sato K.等， Cancer Researchl993,53:851-856)。此外，還可用來自不同人抗體的構(gòu)架區(qū)替換該構(gòu)架區(qū) (參見 W099/51743)。
[0094] 以下述假設(shè)選擇通過CDR彼此相連的人抗體構(gòu)架區(qū)，即互補(bǔ)決定區(qū)能夠形成良好 的抗原結(jié)合位點(diǎn)。如果需要的話，也可以以下述方式替換抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)中的氨基酸， 即，使得重構(gòu)人抗體中的互補(bǔ)決定區(qū)形成合適的抗原結(jié)合位點(diǎn)（Sato K .等，Cancer Research 1993,53:851-856)〇
[0095] 產(chǎn)生了嵌合抗體或人源化抗體后，可替換可變區(qū)（例如，F(xiàn)R)或恒定區(qū)中的氨基酸， 例如，用不同的氨基酸替換。
[0096] 本文中，所述的氨基酸替換是，例如，少于15、少于10、不超過8、不超過7、不超過6、 不超過5、不超過4、不超過3或不超過2個(gè)氨基酸，優(yōu)選1至5個(gè)氨基酸，以及更優(yōu)選1或2個(gè)氨 基酸的替換。經(jīng)替換的抗體應(yīng)當(dāng)在功能上與未替換的抗體等價(jià)。替換優(yōu)選是保守氨基酸替 換，即在電荷、側(cè)鏈、極性、芳香性等方面具有類似性質(zhì)的氨基酸之間的替換。例如，可將性 質(zhì)相似的氨基酸歸類為以下類型:堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸）；酸性氨基酸(天 冬氨酸和谷氨酸）；不帶電極性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、半胱 氨酸和酪氨酸）；非極性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨 酸和甲硫氨酸）；支鏈氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸）；以及芳香族氨基酸(苯丙氨酸、 酪氨酸、色氨酸和組氨酸）。
[0097]抗體修飾物的一個(gè)實(shí)例是與諸如聚乙二醇(PEG)的分子連接的抗體。就本發(fā)明的 抗體修飾物而言，與抗體結(jié)合的物質(zhì)不受限制?？赏ㄟ^化學(xué)修飾所獲得的抗體而得到此類 抗體修飾物。在本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中已建立起此類修飾的方法。
[0098]本文所使用的表達(dá)"功能上等價(jià)的"表示這樣的情況，即其中目標(biāo)抗體具有與本發(fā) 明抗體類似的生物學(xué)或生物化學(xué)活性。特別地，此類抗體具有損壞腫瘤的功能，并且當(dāng)施與 人類時(shí)基本上不會(huì)引起排斥反應(yīng)。此類活性的實(shí)例是細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性或結(jié)合活性。
[0099]本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的用于制備與給定的多肽功能上等價(jià)的多肽的公知方法是 包括將突變引入多肽的方法。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過定點(diǎn)誘變方法（Hashimoto-Gotoh，T.等，（1995)Gene 152,271-275;Zoller，MJ.，和Smith，Μ·(1983)Methods Enzymol·100,468-500;Kramer，W.等，（1984)Nucleic Acids Res.12,9441-9456;Kramer, W.和Fritz，HJ.，（ 1987)Methods Enzymol·154,350-367;Kunkel，TA.，（ 1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82,488-492;或Kunkel(1988)Methods Enzymol.85,2763-2766) 或類似方法將突變適當(dāng)?shù)匾氡景l(fā)明的抗體。由此可制得與本發(fā)明的抗體功能上等價(jià)的抗 體。
[0100] 前述能夠識(shí)別由抗-CAPRIN-1抗體識(shí)別的CAPRIN-1蛋白表位的抗體可通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的方法獲得。例如，其可通過以下方法獲得:包括通過一般的方法(例如，表位 作圖）確定由抗-CAPRIN-1抗體識(shí)別的CAPRIN-1蛋白表位，并應(yīng)用具有該表位所含氨基酸序 列的多肽作為免疫原產(chǎn)生抗體的方法;或包括確定通過一般的方法產(chǎn)生的抗體的表位，以 及篩選具有與抗-CAPRIN-1抗體同一的表位的抗體的方法。本文中，"表位"是指在哺乳動(dòng)物 尤其是人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段。其最小的單位由約7至12個(gè)氨基酸組成，優(yōu) 選由8至11個(gè)氨基酸組成。
[0101] 本發(fā)明抗體的親和常數(shù)如(1^/1^)優(yōu)選為至少1〇￥1、至少10%_1、至少5\10%_ 1、 至少 109M-\至少 5X109M-\至少 101QM-\至少 5X101QM-\至少 10nM-\至少 5X10nM-\至少 1012M-\或至少 1013M-、
[0102] 本發(fā)明的抗體可與抗腫瘤劑綴合。可通過間隔子實(shí)現(xiàn)抗體和抗腫瘤劑之間的結(jié) 合，其中所述的間隔子具有與氨基、羧莖、羥基、硫醇基等反應(yīng)的基團(tuán)（例如，亞胺基琥珀酸 酯基團(tuán)、甲酰基、2-吡啶基二硫基、馬來酰亞胺基、烷氧羰基或羥基）。
[0103] 抗腫瘤劑的實(shí)例包括以下在參考文獻(xiàn)中公知的抗腫瘤劑等:紫杉醇、阿霉素、柔紅 霉素、環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、硫替派、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、 卡波醌、美妥替哌、uredopa、六甲蜜胺、三亞乙基蜜胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰 胺（triethylenethiophosphoramide)、三輕甲蜜胺（trimethylolomelamine)、布拉他辛 (bullatacin)、布拉它辛酮（bullatacinone)、喜樹喊、苔蘚抑素、callystatin、 cryptophycin 1、cryptophycin 8、多拉司他汀、duocarmycin、eleutherobin、7K鬼蕉喊 (pancratistatin)、匍枝珊瑚醇（sarcodictyin)、海綿抑制素（spongistatin)、苯丁酸氮 芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、氫氯化氧氮芥、苯丙氨酸氮 芥、新氮芥、膽留醇對(duì)苯乙酸氮芥、松龍苯芥、氯乙環(huán)磷酰胺、尿嘧啶氮芥、亞硝脲氮芥、吡葡 亞硝脲、福替目丁、環(huán)己亞硝脲、啼啶亞硝脲、雷諾氮芥、calicheamicin、dynemicin、氯膦酸 鹽、esperamicin、阿克拉霉素、放線菌素、authramycin、重氮乙酰絲氨酸、爭(zhēng)光霉素、放線菌 素 C、carabicin、洋紅霉素、嗜癌菌素、色霉素、放線菌素、detorbicin、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲氧正定霉素、麻西羅霉素、絲裂霉素 C、霉酚酸、 諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑菌 素、鏈脲霉素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星、二甲葉酸、蝶羅呤、曲美沙特、氟 達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、2-氨基嘌呤-6-硫醇、環(huán)胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、 阿糖胞苷、雙脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、5-氟脫氧尿苷、雄激素諸如二甲睪酮、丙酸 甲雄燒酮、環(huán)硫雄醇、美雄燒、睪內(nèi)酯、氨基苯乙哌啶酮、米托坦、曲洛司坦、frolinic acid、 醋葡內(nèi)酯、醛磷酰胺苷、氨基硐戊酸、恩尿啼啶、安吖啶、bestrabuci 1、比山群、依達(dá)曲沙、 defof amine、脫羰秋水仙堿、亞胺醌氨酯、elforni thine、依利醋銨、環(huán)氧聚微管素、乙環(huán)氧 啶、蘑菇多糖、氯尼達(dá)明、美登素、安絲菌素 （ansami toe ine)、丙脒腙、米托蒽醌、 mopidanmol、nitraerine、噴司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基酰肼、 甲基芐肼、丙亞胺、根霉素、裂裥菌素、鍺螺胺、細(xì)格孢氮雜酸、三亞胺醌、桿孢菌素 A、蛇形菌 素(anguidine)、氨基甲酸乙酯、去乙酰長(zhǎng)春酰胺、氮烯唑胺、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴 衛(wèi)矛醇、哌泊溴烷、加環(huán)利定、紫杉萜、苯丁酸氮芥、吉西他濱、6-硫代鳥嘌呤、巰基嘌呤、順 氯氨鉑、奧克賽鉑、卡波鉑、長(zhǎng)春花堿、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、米托蒽醌、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞 濱、諾消靈、替尼泊苷、依達(dá)曲沙、道諾霉素、氨基蝶呤、希羅達(dá)、伊班膦酸鹽、依立替康、拓?fù)?異構(gòu)酶抑制劑、二氟甲基鳥氨酸(DMF0)、視黃酸、卡培他濱，及其可藥用鹽或衍生物。
[0104] 備選地，還可將放射性同位素與本發(fā)明的抗體相連接，所述的放射性同位素諸如 在參考文獻(xiàn)中已知的21^、 1311、1251、9<^、186此、188此、 1535!11、21啪、3￥、1751^或1761^等。期望此 類放射性同位素對(duì)腫瘤治療或診斷有效。
[0105] 本發(fā)明的抗體是具有與CAPRIN-1的免疫反應(yīng)性的抗體，或能夠特異性地識(shí)別 CAPRIN-1的抗體。此類抗體應(yīng)當(dāng)是具有這樣的結(jié)構(gòu)的抗體，即允許施與所述抗體的受試動(dòng) 物完全或幾乎完全避免排斥反應(yīng)。如果該受試動(dòng)物是人，上述抗體的實(shí)例包括人抗體、人源 化抗體、嵌合抗體(例如，人-小鼠嵌合抗體）、單鏈抗體以及雙特異性抗體。這樣的抗體是： 具有人抗體來源重鏈和輕鏈可變區(qū)的重組抗體、具有由非人動(dòng)物抗體來源互補(bǔ)決定區(qū) (⑶Rl、CDR2和⑶R3)和人抗體來源構(gòu)架區(qū)組成的重鏈和輕鏈可變區(qū)（每一個(gè)均如此)的重組 抗體、或具有非人動(dòng)物抗體來源重鏈和輕鏈可變區(qū)以及人抗體來源重鏈和輕鏈恒定區(qū)的重 組抗體。前兩種抗體是優(yōu)選的。
[0106] 可通過如下描述的方法產(chǎn)生上述重組抗體。從諸如雜交瘤的產(chǎn)抗體細(xì)胞中克隆編 碼抗人CAPRIN-1單克隆抗體(例如，人單克隆抗體、小鼠單克隆抗體、大鼠單克隆抗體、兔單 克隆抗體、或雞單克隆抗體）的DNA。應(yīng)用得到的克隆作為模板通過RT-PCR方法等產(chǎn)生編碼 該抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的DNA。然后，通過Kabat EU編碼系統(tǒng)（Kabat等， Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5片反.Public Health Service, National Institute of Health，Bethesda，Md. (1991))確定輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的 序列，或CDR1、CDR2以及CDR3的序列。
[0107] 進(jìn)一步地，通過基因重組技術(shù)（Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))或DNA合成儀產(chǎn)生編碼可變區(qū)的 DNA或編碼⑶R的DNA。在這里，上述產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤可通過用人CAPRIN-1免疫產(chǎn) 生人抗體的動(dòng)物(例如，小鼠），并使來自該動(dòng)物的脾的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而產(chǎn)生。除 上述之外，需要的話，通過基因重組技術(shù)或DNA合成儀產(chǎn)生編碼人抗體來源輕鏈或重鏈可變 區(qū)及恒定區(qū)的DNA。
[0108] 在人源化抗體的情況下，產(chǎn)生了這樣的DNA，即其中編碼人抗體來源輕鏈或重鏈可 變區(qū)的DNA中的CDR編碼序列已由非人動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠或雞)來源的抗體中相應(yīng)的CDR 編碼序列替換。將如上述那樣獲得的DNA與編碼人抗體來源輕鏈或重鏈恒定區(qū)的DNA連接。 由此，可產(chǎn)生編碼人源化抗體的DNA。
[0109] 在嵌合抗體的情況下，將編碼非人動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠或雞)來源抗體重鏈或輕 鏈可變區(qū)的DNA與編碼人抗體來源的輕鏈或重鏈恒定區(qū)的DNA連接。由此，可產(chǎn)生編碼嵌合 抗體的DNA。
[0110] 單鏈抗體是其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過接頭彼此線性連接的抗體?？赏ㄟ^ 結(jié)合編碼重鏈可變區(qū)的DNA、編碼接頭的DNA和編碼輕鏈可變區(qū)的DNA從而產(chǎn)生編碼單鏈抗 體的DNA。在這里，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)是來自人抗體的那些，或來自于人抗體的、其中 僅有CDR已由非人動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠或雞)來源的抗體CDR替換的那些。此外，該接頭由 12至19個(gè)氨基酸組成。它的實(shí)例是由15個(gè)氨基酸組成的（G4S) 3(G.B. Kim等，Protein Engineering Design and Selection 2007,20(9):425-432)〇
[0111] 雙特性抗體(diabody)是能特異性地結(jié)合兩種不同表位的抗體，其中，例如，編碼 重鏈可變區(qū)A的DNA、編碼輕鏈可變區(qū)B的DNA、編碼重鏈可變區(qū)B的DNA、以及編碼輕鏈可變區(qū) A的DNA以這樣的順序彼此相連(條件是編碼輕鏈可變區(qū)B的DNA和編碼重鏈可變區(qū)B的DNA通 過編碼上述接頭的DNA彼此連接）。由此可產(chǎn)生編碼雙特異性抗體的DNA。在這里，重鏈可變 區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩者均是來自人抗體的那些，或來自于人抗體、其中僅有CDR已由非人動(dòng)物 (例如，小鼠、大鼠或雞)來源的抗體CDR替換的那些。
[0112] 將如上產(chǎn)生的重組DNA整合至一個(gè)或多個(gè)合適的載體中。將每一此種載體引入宿 主細(xì)胞（例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞）用于（共）表達(dá)。由此可產(chǎn)生重組抗體 (P.J.Delves.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997WILEY，P.Sh印herd和 C.Dean..Monoclonal Antibodies .,20000XF0RD UNIVERSITY PRESS；J.ff. Coding , Monoclonal Antibodies:Principles and Practice.,1993ACADEMIC PRESS)〇
[0113] 通過上述方法產(chǎn)生的本發(fā)明抗體的實(shí)例包括以下抗體(a)至(k)。
[0114] (a)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO :44、45和46所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO :43的重鏈可變區(qū) 和SEQ ID N0:47的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0115] (b)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:50、51和52所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū) 和SEQ ID NO:53的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0116] (c)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:55、56和57所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū) 和SEQ ID NO:58的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0117] (d)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:60、61和62所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū) 和SEQ ID NO:63的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0118] (e)包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:65、66和67所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū) 和SEQ ID NO:68的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0119] (f)包含有包含SEQ ID N0:70、71和72所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:74、75和76所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID N0:73的重鏈可變區(qū) 和SEQ ID NO:77的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0120] (g)包含有包含SEQ ID N0:80、81和82所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:84、85和86所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID N0:83的重鏈可變區(qū) 和SEQ ID NO:87的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0121] (h)包含有包含SEQ ID N0:90、91和92所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:94、95和96所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID N0:93的重鏈可變區(qū) 和SEQ ID NO:97的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0122] (i)包含有包含SEQ ID N0:100、101和102所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 104、105和106所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO: 103的重 鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 107的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0123] (j)包含有包含SEQ ID N0:110、111和112所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID N0:114、115和116所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID N0:113的重 鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 117的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0124] (k)包含有包含SEQ ID N0:120、121和122所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 124、125和126所示序列的輕鏈可變區(qū)的抗體（以及優(yōu)選為包含SEQ ID NO: 123的重 鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 127的輕鏈可變區(qū)的抗體）。
[0125] 在這里，SEQ ID N0:40、41和42所示的氨基酸序列、SEQ ID N0:70、71和72所示的 氨基酸序列、SEQ ID N0:80、81和82所示的氨基酸序列、SEQ ID N0:90、91和92所示的氨基 酸序列、SEQIDN0:100、101和102所示的氨基酸序列、SEQIDN0 :110、111和112所示的氨 基酸序列、或SEQ ID N0:120、121和122所示的氨基酸序列分別相應(yīng)于小鼠抗體重鏈可變區(qū) 的CDRUCDR2和CDR3。此外，SEQ ID N0:44、45和46所示的氨基酸序列、SEQ ID N0:50、51 和 52所示的氨基酸序列、SEQ ID N0:55、56和57所示的氨基酸序列、SEQ ID N0:60、61和62所 示的氨基酸序列、SEQ ID N0:65、66和67所示的氨基酸序列、SEQ ID N0:74、75和76所示的 氨基酸序列、SEQ ID N0:84、85和86所示的氨基酸序列、SEQ ID N0:94、95和96所示的氨基 酸序列、SEQIDN0:104、105和106所示的氨基酸序列、SEQIDN0:114、115和116所示的氨 基酸序列、或SEQ ID N0:124、125和126所示的氨基酸序列分別相應(yīng)于小鼠抗體輕鏈可變區(qū) 的 CDRUCDR2 和 CDR3。
[0126] 此外，本發(fā)明的人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體例如是以下抗體 (i)或（ii)(以下描述了抗體(a)的實(shí)例）。
[0127] (i)包含以下的抗體:包含SEQ ID N0:40、41和42的氨基酸序列和人抗體來源構(gòu)架 區(qū)氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；以及包含SEQ ID N0:44、45和46的氨基酸序列和人抗體來源 構(gòu)架區(qū)氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)（以及優(yōu)選是在重鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0:43的氨基酸 序列、并且在輕鏈可變區(qū)中包含SEQ ID N0:47的氨基酸序列的抗體）。
[0128] (ii)包含以下的抗體:包含SEQ ID N0:40、41和42的氨基酸序列和人抗體來源構(gòu) 架區(qū)氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；包含人抗體來源氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)；包含SEQ ID N0:44、45和46的氨基酸序列和人抗體來源構(gòu)架區(qū)氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；以及包含人抗 體來源氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)（以及優(yōu)選是包含如下的抗體:包含SEQ ID N0:43的氨基 酸序列的重鏈可變區(qū)；包含人抗體來源氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)；包含SEQ ID NO:47的氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)；以及包含人抗體來源氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)）。
[0129] 此外，例如可從NCBI(U.S.A:GenBank，UniGene，等）中獲得人抗體重鏈和輕鏈恒定 區(qū)和可變區(qū)的序列。例如，以下序列可用作相應(yīng)區(qū)域的參考序列：用于人IgGl重鏈恒定區(qū)的 具有登錄號(hào)J00228的序列；用于人IgG2重鏈恒定區(qū)的具有登錄號(hào)J00230的序列；用于人 IgG3重鏈恒定區(qū)的具有登錄號(hào)X03604的序列；用于人IgG4重鏈恒定區(qū)的具有登錄號(hào)K01316 的序列；用于人輕鏈κ恒定區(qū)的具有登錄號(hào)V00557、X64135或X64133的序列；以及用于人輕 鏈λ恒定區(qū)的具有登錄號(hào)X64132或X64134的序列。
[0130] 上述抗體優(yōu)選具有細(xì)胞毒活性，由此展現(xiàn)出抗腫瘤活性。
[0131] 此外，上述抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)以及⑶R的特定序列僅僅是例證性地描述。本發(fā) 明顯而易見地不限于特定的序列。產(chǎn)生了能夠產(chǎn)生不同的抗人CAPRIN-1的人抗體或非人動(dòng) 物抗體（例如，小鼠抗體）的雜交瘤。收集產(chǎn)自該雜交瘤的單克隆抗體。然后，應(yīng)用就人 CAPRIN-1而言的免疫結(jié)合活性及細(xì)胞毒活性作為指示，確定獲得的抗體是否為目的抗體。 由此鑒定產(chǎn)生單克隆抗體的目的雜交瘤。此后，如上述那樣，從該雜交瘤產(chǎn)生編碼目的抗體 重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA，用于序列確定。將該DNA用于產(chǎn)生不同的抗體。
[0132] 此外，本發(fā)明的上述抗體可以是具有一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1或2)氨基酸替換、缺失或 添加(尤其是在構(gòu)架區(qū)序列和/或恒定區(qū)序列中）的上述抗體(i)至（iv)的任一個(gè)，只要其具 有特異性識(shí)別CAPRIN-1的特定性質(zhì)。在這里，術(shù)語(yǔ)"幾個(gè)氨基酸"表示2至5個(gè)，優(yōu)選2或3個(gè)氨 基酸。
[0133] 此外，根據(jù)本發(fā)明，還提供了編碼本發(fā)明的上述抗體的DNA、編碼該抗體重鏈或輕 鏈的DNA、或編碼該抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)的DNA。例如，在抗體(a)的情況下，此類DNA的 實(shí)例包括:包含編碼SEQ ID N0:40、41和42的氨基酸序列的核苷酸序列的重鏈可變區(qū)編碼 DNA;以及包含編碼SEQ ID N0:44、45和46的氨基酸序列的核苷酸序列的輕鏈可變區(qū)編碼 DNA〇
[0134] 由上述序列的DNA編碼的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)是確定抗體特異性的區(qū)域。因此，編碼 抗體中其他區(qū)域（即，恒定區(qū)和構(gòu)架區(qū)）的序列可以是來自不同抗體的序列。在這里，不同的 抗體包括來自非人生物的抗體。然而，考慮到減少副作用，優(yōu)選為人來源的抗體。也就是說， 在上述情況下，編碼重鏈和輕鏈構(gòu)架區(qū)及恒定區(qū)的DNA序列優(yōu)選包含編碼來自人抗體的相 關(guān)氨基酸序列的核苷酸序列。
[0135] 此外，編碼本發(fā)明抗體（諸如抗體（a))的DNA的不同實(shí)例包括：包含編碼SEQ ID N0:43的氨基酸序列的核苷酸序列的編碼重鏈可變區(qū)的DNA，以及其中編碼輕鏈可變區(qū)的區(qū) 域包含編碼SEQ ID N0:47的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。在這里，編碼SEQ ID N0:43的 氨基酸序列的核苷酸序列實(shí)例是SEQ ID NO:48的核苷酸序列。此外，編碼SEQ ID NO:47的 氨基酸序列的核苷酸序列實(shí)例是SEQ ID N0:49的核苷酸序列。此外，上述編碼重鏈和輕鏈 恒定區(qū)的DNA優(yōu)選包含編碼相應(yīng)的人抗體來源氨基酸序列的核苷酸序列。
[0136] 本發(fā)明的DNA可例如通過前述方法或以下方法獲得。首先，應(yīng)用可商購(gòu)的RNA提取 試劑盒從本發(fā)明抗體的雜交瘤中制備總RNA。然后，應(yīng)用隨機(jī)引物等通過逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA。接下來，應(yīng)用具有已知小鼠抗體重鏈和輕鏈基因可變區(qū)中保守序列的寡核苷酸作為 引物，通過PCR方法擴(kuò)增編碼抗體的cDNA。可通過PCR方法擴(kuò)增已知序列獲得編碼恒定區(qū)的 序列。可通過一般的方法確定該DNA的核苷酸序列，其中所述的方法例如包括整合至用于序 列確定的質(zhì)粒或噬菌體。
[0137] 我們認(rèn)為本發(fā)明使用的抗-CAPRIN-1抗體對(duì)表達(dá)CAPRIN-1的癌細(xì)胞的抗腫瘤活性 是通過如下描述的細(xì)胞毒性機(jī)制而得以顯示的。
[0138] 該細(xì)胞毒性是針對(duì)表達(dá)CAPRIN-1細(xì)胞的、效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性 (ADCC)，以及針對(duì)表達(dá)CAPRIN-1細(xì)胞的、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)。
[0139] 因此，可通過先體外后體內(nèi)（ex vivo)確定針對(duì)表達(dá)CAPRIN-1的癌細(xì)胞的ADCC活 性或CDC活性評(píng)估本發(fā)明使用的抗-CAPRIN-1抗體的活性，如在以下實(shí)施例中具體描述的那 樣。
[0140] 本發(fā)明使用的抗-CAPRIN-1抗體與癌細(xì)胞上的CAPRIN-1蛋白結(jié)合，并且基于上述 活性展示出抗腫瘤效果。因此，相信此類抗體可用于癌癥治療或預(yù)防。特別地，根據(jù)本發(fā)明， 提供了包含抗-CAPRIN-1抗體作為活性組成的用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物。當(dāng)將 抗-CAPRIN-1抗體用于施與抗體給人類的目的（抗體治療）時(shí)，優(yōu)選以人抗體或人源化抗體 的形式使用，以降低免疫原性。
[0141] 此外，抗-CAPRIN-1抗體與癌細(xì)胞表面的CAPRIN-1蛋白之間的結(jié)合親和力變得越 高，則抗-CAPRIN-1抗體可展示出越強(qiáng)的抗腫瘤活性。因此，如能獲得具有與CAPRIN-1蛋白 的高結(jié)合親和力的抗-CAPRIN-1抗體，可以預(yù)期能展示出更強(qiáng)的抗腫瘤活性。因此，應(yīng)用此 類抗體作為腫瘤治療和/或預(yù)防的藥物組合物就變得可能。如上所述，對(duì)于高結(jié)合親和力， 親和常數(shù)1^(1^八淑)優(yōu)選為至少1071-1、至少1081- 1、至少5\10%-1、至少1091-1、至少5\ 109M-\至少 101QM-\至少 5X101QM-\至少 10nM-\至少 5X10nM-\至少 1012M-\或至少 1013M -1 〇
[0142] 〈與表達(dá)抗原的細(xì)胞結(jié)合〉
[0143] 可通過應(yīng)用例如實(shí)施例中描述的ELISA、蛋白印跡方法、免疫熒光或流式細(xì)胞分析 的結(jié)合測(cè)試法確定抗體與CAPRIN-1結(jié)合的能力。
[0144] 〈免疫組織化學(xué)染色〉
[0145] 可應(yīng)用用多聚甲醛或丙酮固定的冰凍組織切片或用多聚甲醛固定的石蠟包埋組 織切片，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的免疫組織化學(xué)方法，根據(jù)與CAPRIN-1的反應(yīng)性測(cè)試識(shí) 別CAPRIN-1的抗體。此類切片在手術(shù)期間從患者獲得、或從攜帶有異種移植組織的動(dòng)物中 獲得的組織制備，其中所述的動(dòng)物接種有表達(dá)CAPRIN-1的天然細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。
[0146] 為了進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，可通過各種方法染色與CAPRIN-1反應(yīng)的抗體。例如， 可通過與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠抗體或山羊抗兔抗體反應(yīng)而顯現(xiàn)該抗體。
[0147] 〈藥物組合物〉
[0148] 本發(fā)明治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物的靶沒有特別的限制，只要該靶是表達(dá) CAPRIN-1基因的癌(細(xì)胞)即可。
[0149] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"腫瘤"和"癌"兩者均指惡性贅生物，并且因此它們可互換使用。
[0150] 在本發(fā)明中可作為靶的癌是表達(dá)編碼包含偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO:2至30的任一項(xiàng) 的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列的7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸組成的部分序列的多肽的 基因。其優(yōu)選實(shí)例包括乳腺癌、腦腫瘤、白血病、肺癌、淋巴瘤、肥大細(xì)胞瘤、食道癌和大腸 癌。
[0151] 這些特定腫瘤的實(shí)施例包括，但不限于，乳腺癌、復(fù)合型乳腺癌、乳腺惡性混合腫 瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、肺腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤（即，神經(jīng)上 皮組織腫瘤）、室管膜瘤、神經(jīng)細(xì)胞性腫瘤、胚胎性神經(jīng)外胚層瘤、神經(jīng)鞘瘤、纖維神經(jīng)瘤、腦 膜瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、淋巴瘤、胃腸道淋巴瘤、消化性淋巴瘤、小細(xì)胞至中細(xì)胞淋巴 瘤、盲腸癌、上行結(jié)腸癌、下行結(jié)腸癌、橫結(jié)腸癌、乙狀結(jié)腸癌以及直腸癌。
[0152] 此外，本發(fā)明的受試動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。其實(shí)例包括諸如靈長(zhǎng)類、寵物動(dòng)物、家畜以 及競(jìng)技動(dòng)物的哺乳動(dòng)物。特別優(yōu)選的是人、狗和貓。
[0153] 當(dāng)本發(fā)明中使用的抗體作為藥物組合物使用時(shí)，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方 法對(duì)其進(jìn)行配制。例如，其可作為腸胃外注射液的形式腸胃外使用:包含水或可藥用非水溶 液的無(wú)菌溶液;或懸浮液。例如，在一種可能情況中，可以通過適當(dāng)?shù)姆椒?lián)合使用可藥用 載體或介質(zhì)，具體為無(wú)菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸混劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、矯味 劑、賦形劑、載體(vehicle)、防腐劑、結(jié)合劑，通過以通常可接受的藥物組合物所需的單位 劑型混合從而進(jìn)行配制。確定制劑中的活性組分量以使得可達(dá)到在指示范圍內(nèi)的合適劑 量。
[0154] 用于注射的無(wú)菌組合物可應(yīng)用諸如注射用蒸餾水的載體根據(jù)一般的配制方法配 制。
[0155] 注射用水溶液的實(shí)例包括生理鹽水以及包含葡萄糖和其它佐劑的等滲溶液，其中 所述的其它佐劑諸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化鈉。此類溶液可與合適的溶解 助劑一起使用。此類溶解助劑的實(shí)例包括醇，諸如乙醇和多元醇、丙二醇、聚乙二醇，以及非 離子表面活性劑，諸如聚山梨酸酯80(?)和HC0-60。
[0156] 油性流體的實(shí)例包括芝麻油和大豆油。此類油性流體可與諸如苯甲酸芐酯或苯甲 醇的溶解助劑聯(lián)合使用。此外，其還可與緩沖劑(諸如磷酸鹽緩沖溶液、醋酸鹽緩沖溶液）、 無(wú)痛劑(諸如鹽酸普魯卡因）、穩(wěn)定劑(諸如苯甲醇、苯酚)或抗氧化劑混合。一般地，將配制 的注射溶液引入適當(dāng)?shù)陌碴持小?br>[0157] 上述藥物組合物經(jīng)口或腸胃外施與。優(yōu)選為腸胃外施與。劑型的特定實(shí)例包括可 注射劑、經(jīng)鼻施與劑、經(jīng)肺施與劑、以及經(jīng)皮施與劑。例如，可注射劑可通過靜脈內(nèi)注射、肌 肉內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或皮下注射全身性或局部施與。
[0158] 此外，可根據(jù)患者年齡、體重、性別和癥狀適當(dāng)?shù)卮_定施與方法。可在例如 0.000111^至100011^/1^體重的范圍內(nèi)選擇包含抗體或編碼抗體的多核苷酸的藥物組合物的 單劑量。備選地，可在例如每位患者0.001至lOOOOOmg的范圍內(nèi)選擇劑量，然而，其不必限于 此。劑量和施與方法依據(jù)患者年齡、體重、性別和癥狀而改變。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適 當(dāng)?shù)剡x擇劑量和方法。
[0159] 〈多肽和 DNA>
[0160] 根據(jù)本發(fā)明，還提供了上述抗體(a)至(k)的以下多肽和DNA。
[0161] (i)包含SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:73、SEQ ID N0:83、SEQ ID N0:93、SEQ ID N0: 103、SEQIDN0:113和SEQIDN0:123的氨基酸序列的多肽，以及編碼該多肽的DNA。
[0162] (ii)包含SEQ ID N0:47、SEQ ID N0:53、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:77、SEQ ID N0:87、SEQ ID N0:97、SEQ ID N0:107、SEQ ID N0:117和SEQ ID NO:127的氨基酸序列的多肽，以及編碼該多肽的DNA。
[0163] (iii)包含SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:78、SEQ ID N0:88、SEQ ID N0:98、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:128的核苷酸序列的DNA。
[0164] (iv)包含SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:54、SEQ ID N0:59、SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:69、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:119和SEQ ID NO: 129的核苷酸序列的DNA。
[0165] (v)包含選自SEQ ID N0:40、41和42的氨基酸序列；SEQ ID N0:70、71和72的氨基 酸序列；SEQ ID N0:80、81和82的氨基酸序列；SEQ ID N0:90、91和92的氨基酸序列；SEQ ID N0:100、101和102的氨基酸序列；SEQ ID N0:110、lll和112的氨基酸序列；以及SEQ ID NO: 120、121和122的氨基酸序列的重鏈⑶R多肽，以及編碼該多肽的DNA。
[0166] (vi)包含選自SEQ ID N0:44、45和46的氨基酸序列；SEQ ID N0:50、51和52的氨基 酸序列；SEQ ID N0:55、56和57的氨基酸序列；SEQ ID N0:60、61和62的氨基酸序列；SEQ ID N0:65、66和67的氨基酸序列；SEQIDN0:74、75和76的氨基酸序列；SEQIDN0:84、85和86 的氨基酸序列；SEQ ID NO:94、95和96的氨基酸序列；SEQ ID NO: 104、105和106的氨基酸序 列；SEQIDN0:114、115和116的氨基酸序列 ；SEQIDN0:124、125和126的氨基酸序列的輕 鏈CDR多肽；以及編碼該多肽的DNA。
[0167] 這些多肽和DNA可通過上述基因重組技術(shù)產(chǎn)生。 實(shí)施例
[0168] 下文參考以下實(shí)施例來更詳細(xì)地描述本發(fā)明，不過本發(fā)明的范圍不限于此。
[0169] 實(shí)施例1:通過SEREX方法鑒定新的癌抗原蛋白
[0170] (l)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
[0171] 通過酸胍-酚-氯仿方法從健康犬的睪丸組織提取總RNA，并且使用Oligotex-(1丁3〇1111?嫩純化試劑盒(^1^〇^311112〇&3.，1^(1.)，根據(jù)其中包括的說明書純化口〇15^1?嫩。
[0172] 使用如此獲得的mRNA(5yg)合成犬睪丸cDNA噬菌體文庫(kù)。使用cDNA合成試劑盒、 ZAP-cDNA合成試劑盒和ZAP-cDNA Gigapacklll Gold Cloning試劑盒（STRATAGENE)，根據(jù) 各試劑盒中所包含的各份說明書構(gòu)建cDNA噬菌體文庫(kù)。由此構(gòu)建的cDNA噬菌體文庫(kù)的大小 是7.73X 105pfu/ml。
[0173] (2)使用血清篩選cDNA文庫(kù)
[0174]使用上述構(gòu)建的犬睪丸cDNA噬菌體文庫(kù)實(shí)施免疫篩選。具體地，在NZY瓊脂糖平板 (Φ90χ 15mm)上用噬菌體感染宿主大腸桿菌(XLl-Blue MRF'），由此獲得2210個(gè)克隆。在42 °C培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞3至4小時(shí)以形成噬斑。平板以IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浸透 的硝化纖維素膜(Hybond C Extra:GE Healthcare Bio-Science)在37°C覆蓋4小時(shí)，從而 誘導(dǎo)并表達(dá)蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到該膜上。隨后，將該膜回收，浸泡在含有0.5%粉末 脫脂乳的TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)中并在4°(：振搖過夜以抑制非特異性反 應(yīng)。使該濾膜與500倍稀釋的患病犬血清在室溫反應(yīng)2至3小時(shí)。
[0175] 就上述患病犬的血清而言，使用從患有乳腺癌的犬中收集的血清。這些血清貯藏 在-80°C并在即將使用前預(yù)處理。預(yù)處理血清樣品的方法如下。具體而言，宿主大腸桿菌 (XLl-BLue MRF'）用其中未插入外來基因的λΖΑΡ表達(dá)噬菌體感染，并且隨后在NZY平板培養(yǎng) 基上于37°(：培養(yǎng)過夜。隨后，添加含有0.51他(：1的緩沖液(0.21似!1〇) 3，？!18.3)至該平 板，使該平板在4 °C靜置15小時(shí)，然后收集上清液作為大腸桿菌/噬菌體提取物。隨后，使由 此收集的大腸桿菌/噬菌體提取物流經(jīng)NHS-柱(GE Healthcare Bio-Science)，因而將衍生 自大腸桿菌/噬菌體的蛋白質(zhì)固定在該柱上。使患病犬的血清流經(jīng)固定有蛋白質(zhì)的柱以與 其反應(yīng)，并且從血清中除去已經(jīng)吸附至大腸桿菌和噬菌體的抗體。將已經(jīng)流過該柱的血清 級(jí)分用含有0.5%粉末脫脂乳的TBS稀釋500倍。將所得物用作免疫篩選材料。
[0176] 膜上已經(jīng)印跡了經(jīng)處理的血清和上述融合蛋白的膜用TBS_T(0.05%吐溫20/TBS) 洗滌4次，然后使已經(jīng)用含有0.5%粉末脫脂乳的TBS稀釋5000倍作為第二抗體的山羊抗犬 IgG(山羊抗犬IgG-h+I HRP綴合的(BETHYL Laboratories))與該膜在室溫反應(yīng)1小時(shí)。檢測(cè) 通過使用NBT/BCIP反應(yīng)溶液(Roche)的酶顯色反應(yīng)實(shí)施。從NZY瓊脂糖平板（Φ 90x 15mm)收 集與顯色反應(yīng)陽(yáng)性的位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的菌落，并將其裂解于500ylSM緩沖液（100mM NaCl，10mM 1%(：13〇4,5〇11111^8-!1(：1，0.01%明膠，？!17.5)。以與上文所述相似的方法重復(fù)第二和第三 篩選，從而篩選30,940個(gè)與血清IgG反應(yīng)的噬菌體克隆，直至顯色反應(yīng)陽(yáng)性菌落單一化。由 此分離了 5個(gè)陽(yáng)性克隆。
[0177] (3)分離的抗原基因的同源性搜索
[0178] 為了對(duì)通過上述方法分離的5個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行核苷酸序列分析，實(shí)施將噬菌體載 體轉(zhuǎn)變成質(zhì)粒載體的操作。具體地，制備200μ1吸光度0D 6QQ為1.0的含宿主大腸桿菌(XL1-Blue MRF'）溶液。將其與250μ1純化的噬菌體溶液混合，并隨后和ΙμL ExAssist輔助噬菌體 (STRATAGENE)混合，隨后在37°C反應(yīng)15分鐘。添加3ml LB培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)2.5至3小時(shí)。 培養(yǎng)后，立即通過水浴將溶液溫度保持在70°C，持續(xù)20分鐘，4°C和1000 Xg離心15分鐘，并 且然后收集上清液作為噬菌粒溶液。隨后，制備200μ1吸光度OD600為1.0的含噬菌粒宿主大 腸桿菌(S0LR)溶液。將該溶液與10μ1純化的噬菌體溶液混合，隨后在37°C反應(yīng)15分鐘。將溶 液(50μ1)接種于含有氨芐青霉素(終濃度:50μg/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基，并且在37°C培養(yǎng)過 夜。收集轉(zhuǎn)化的S0LR單菌落并且在含有氨芐青霉素(終濃度:50μg/ml)的LB培養(yǎng)基中在37 °C 培養(yǎng)。應(yīng)用QIAGEN質(zhì)粒小量制備試劑盒(QIAGEN)純化含有目的插入物的質(zhì)粒DNA。
[0179] 使用SEQ ID N0: 31的T3引物和SEQ ID N0: 32的T7引物，通過引物步行法，對(duì)純化 的質(zhì)粒進(jìn)行插入物全長(zhǎng)序列的分析。通過序列分析，獲得SEQ ID N0:5、7、9、ll和13的基因 序列。使用所述基因的核苷酸序列以及相應(yīng)的氨基酸序列（SEQ ID N0:6、8、10、12和14)來 實(shí)施同源性搜索程序BLAST搜索(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/BLAST/)。作為這個(gè)用已 知基因進(jìn)行的同源性檢索的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)獲得的5個(gè)基因均編碼CAPRIN-1。就待翻譯為蛋白質(zhì) 的區(qū)域而言，這五個(gè)基因之間的序列同一性為100%的核苷酸序列同一性和99%的氨基酸 序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所述基因與編碼人同源物的基因的序列 同一性為:94%的核苷酸序列同一性和98%的氨基酸序列同一性。人同源物的核苷酸序列 顯示于SEQ ID NO: 1和3,并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:2和4。此外，就待翻譯為蛋白 質(zhì)的區(qū)域而言，由此獲得的犬基因與編碼牛同源物的基因的序列同一性為:94%的核苷酸 序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。牛同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID N0:15,并 且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 16。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物 的基因與編碼牛同源物的基因之間的序列同一性為:94%的核苷酸序列同一性，以及93% 至97%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼 馬同源物的基因的序列同一性為:93%的核苷酸序列同一性和97%的氨基酸序列同一性。 馬同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO: 17,并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID NO: 18。此 外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼馬同源物的基因之間的序 列同一性為:93%的核苷酸序列同一性和96%的氨基酸序列同一性。此外，就待翻譯為蛋白 質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼小鼠同源物的基因的序列同一性為:87%至89%的 核苷酸序列同一性和95%至97 %的氨基酸序列同一性。小鼠同源物的核苷酸序列如SEQ ID N0:19、21、23、25和27所示并且其氨基酸序列如SEQIDN0:20、22、24、26和28所示。此外，就 待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人同源物的基因與編碼小鼠同源物的基因之間的序列同 一性為:89 %至91 %的核苷酸序列同一性和95 %至96 %的氨基酸序列同一性。此外，就待翻 譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，所獲得的犬基因與編碼雞同源物的基因的序列同一性為:82%的 核苷酸序列同一性和87%的氨基酸序列同一性。雞同源物的核苷酸序列顯示于SEQ ID NO: 29,并且其氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:30。此外，就待翻譯為蛋白質(zhì)的區(qū)域而言，編碼人 同源物的基因與編碼雞同源物的基因之間的序列同一性為:81%至82%的核苷酸序列同一 性和86 %的氨基酸序列同一性。
[0180] (4)每一組織中的基因表達(dá)分析
[0181] 通過RT-PCR方法檢驗(yàn)通過上述方法在犬和人正常組織及多種細(xì)胞系中獲得的基 因的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄按照以下方式實(shí)施。具體地，使用TRIZ0L試劑（Invitrogen)，按照其中包 含的方案從每一組織(50mg至100mg)和各細(xì)胞株(5至10x 106個(gè)細(xì)胞）中提取總RNA。使用用 于RT-PCR的Superscript第一鏈合成系統(tǒng)（Invi trogen)按照其中包含的方案，利用提取的 總RNA合成cDNA。使用對(duì)所獲得基因特異的引物（SEQ ID N0: 33和34)，按照以下方式實(shí)施 PCR。具體地，使用通過添加諸試劑(0.25μ1通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備的樣品，上述引物(每種2μ M)，dNTP(每種0.2mM)和0.65U ExTaq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd·))和附帶的緩沖液以 調(diào)節(jié)至25μ1總體積的反應(yīng)溶液，以及Thermal Cycler(BI0 RAD)，進(jìn)行以下30個(gè)循環(huán)反應(yīng)： 94°C30秒，60°C30秒和72°C30秒。此外，上述基因特異性引物用來擴(kuò)增SEQ ID N0: 5的核苷 酸序列（犬CAPRIN-1基因）第206至632位核苷酸之間的區(qū)域和SEQ ID N0:1的核苷酸序列 (人CAPRIN-1基因）第698至1124位核苷酸的區(qū)域。作為比較對(duì)照，同時(shí)使用GATOH特異性引 物(SEQ ID N0:35和36)。作為結(jié)果，如圖1中顯示，在健康犬的睪丸組織中觀察到強(qiáng)表達(dá)，同 時(shí)在犬乳腺癌及腺癌組織中觀察到表達(dá)。此外，還證實(shí)了與所獲得基因同源的人同源物的 表達(dá)。作為結(jié)果，類似犬CAPRIN-1基因的情況那樣，在正常組織的情況下，僅在睪丸中證實(shí) 了其表達(dá)。然而，在癌細(xì)胞的情況下，在許多類型的癌細(xì)胞系諸如乳腺癌、腦腫瘤、白血病、 肺癌和食道癌細(xì)胞系中檢測(cè)到表達(dá)。尤其在許多乳腺癌細(xì)胞系中證實(shí)了其表達(dá)。基于這些 結(jié)果，證實(shí)了在除睪丸組織之外的正常組織中觀察不到CAPRIN-1表達(dá)，然而，CAPRIN-1在許 多癌細(xì)胞中并且尤其在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)。
[0182] 此外，在圖1中，縱軸上的參考編號(hào)1顯示上文所鑒定的每一基因的表達(dá)模式并且 相同軸上的參考編號(hào)2顯示用于比較對(duì)照的GAPDH基因的表達(dá)模式。
[0183] (5)制備抗CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗體
[0184] 為獲得與CAPRIN-1結(jié)合的抗體，合成了 CAPRIN-1衍生肽以找^811-1^11-6111-1^8-Lys-Lys-Gly-Lys-Leu-Asp-Asp-Tyr_Gln(SEQ ID N0:37))。將作為抗原的所述肽（lmg)和 與肽等量的不完全弗氏佐劑（IFA)溶液混合。每?jī)芍芤淮蔚貙⒃摶旌衔锲は率┡c兔4次。隨 后，收集血液，由此獲得含有多克隆抗體的抗血清。此外，應(yīng)用蛋白G支持物(GE Healthcare Bio-Sciences)純化該抗血清，并且獲得抗CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗體。此外，選定了以 上述相同的方式應(yīng)用蛋白G支持物純化沒有施與抗原的兔的血清獲得的抗體，作為對(duì)照抗 體。
[0185] (6)抗原蛋白在癌細(xì)胞上的表達(dá)分析
[0186] 接下來，檢查CAPRIN-1蛋白是否在7種類型的乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-157、T47D、 MRK-nu-l、MDA-MB-231V、BT20、SK-BR-3、和 MDA-MB-231T)的細(xì)胞表面表達(dá)，其中已強(qiáng)烈確認(rèn) CAPRIN-1基因在這些細(xì)胞系中表達(dá)。將如上所述那樣已確認(rèn)了基因在其中表達(dá)的每種人乳 腺癌細(xì)胞系（1〇6個(gè)細(xì)胞)在1.5ml微離心管中離心。向其中添加上述(5)中制備的抗CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗體(2yg)(5yl)。使產(chǎn)物再懸浮于含有0.1%胎牛血清(95以1)的?83中，然 后在冰上靜置1小時(shí)。用PBS洗滌后，使產(chǎn)物懸浮于含有FITC-標(biāo)記的山羊抗-兔IgG抗體 (Santa Cruz Biotechnology，Inc ·)(5μ1)和0.1% 胎牛血清（FBS) (95μ1)的PBS 中，并在冰 上靜置1小時(shí)。用PBS洗滌后，應(yīng)用FACSCalibur(Becton,Dickinson and Company)測(cè)定焚光 強(qiáng)度。同時(shí)，應(yīng)用（5)中制備的對(duì)照抗體替代抗CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗體，進(jìn)行上述類 似的步驟，由此制備對(duì)照。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在所有添加了抗人CAPRIN-1抗體的細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度 比對(duì)照細(xì)胞中的強(qiáng)度強(qiáng)至少3 0 %。具體地，證實(shí)了以下熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)：M D A - Μ B -15 7 : 184%、T47D:221 %、MRK-nu-1:115%、MDA-MB-231 V:82%、BT20:32%、SK-BR-3:279% 以及 MDA-MB-231T: 80%?；谏鲜鼋Y(jié)果，確認(rèn)了CAPRIN-1蛋白在上述人癌細(xì)胞系的細(xì)胞表面上 表達(dá)。此外，熒光強(qiáng)度的增加率由細(xì)胞中平均熒光強(qiáng)度(MFI值）的增加率來表示。其通過以 下等式計(jì)算。
[0187]平均熒光強(qiáng)度的增加率（熒光強(qiáng)度增加率）（％ ) = ((與抗人CAPRIN-1抗體反應(yīng)的 細(xì)胞的MFI值）一（對(duì)照MFI值））/(對(duì)照MFI值）X 100
[0188] (7)免疫組織化學(xué)染色
[0189] (7) -1:正常小鼠和犬組織中的CAPRIN-1表達(dá)
[0190] 小鼠（Balb/c，雌性)和犬(比格犬，雌性)在乙醚麻醉下和在氯胺酮/異氟烷麻醉下 放血。剖腹手術(shù)后，將器官（胃、肝、眼球、胸腺、肌肉、骨髓、子宮、小腸、食道、心臟、腎、唾液 腺、大腸(結(jié)腸）、乳腺、腦、肺、皮膚、腎上腺、卵巢、胰腺、脾臟和膀胱)分別轉(zhuǎn)移至盛有PBS的 10-cm平皿中。在roS中切開每一器官并用含有4%多聚甲醛(PFA)的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)回流固定過夜。棄去回流液，用PBS漂洗每一器官的組織表面，將含有10 %蔗糖的PBS溶 液加入50-ml微離心管。然后將每一組織置于每一管中，然后使用轉(zhuǎn)子在4°C振搖2小時(shí)。用 含有20 %蔗糖的PBS溶液更換每一溶液，然后使其在4°C靜置直至組織沉降。用含有30 %蔗 糖的PBS溶液更換每一溶液，并使其在4 °C靜置直至組織沉降。取出每一組織并使用手術(shù)刀 切下所需的區(qū)域。隨后，將0CT化合物(Tissue Tek)施加至每一組織表面并鋪展開，并隨后 將組織置于Cryomo 1 d上。將Cryomo Id置于干冰上以迅速冷凍。使用冷凍切片機(jī)(LEI CA)將組 織切成厚度1〇μπι至20μπι，并且用電吹風(fēng)對(duì)載玻片上的組織切片風(fēng)干30分鐘，由此制備其上 置有組織切片的載玻片。隨后，將每一載玻片置于充滿roS-T(含有0.05%吐溫20的生理鹽 水)的染色瓶，每隔5分鐘更換PBS-T，更換3次。使用Kimwipes紙巾擦掉每一樣品周圍的多余 水分，用DAKOPEN(DAKO)圈定切片。將MOM小鼠 Ig封閉試劑(VECTASTAIN)置于小鼠組織上作 為封閉液，并將含有10%胎牛血清的PBS-T溶液置于犬組織上作為封閉液。使這些產(chǎn)物置于 保濕室中在室溫靜置1小時(shí)。隨后，制備含有抗CAPRIN-1的單克隆抗體(單克隆抗體#6)的溶 液，其中所述的抗體是實(shí)施例4制備的具有SEQ ID N0:73的重鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:77的 輕鏈可變區(qū)，并與癌細(xì)胞表面反應(yīng)，將該抗體在封閉液中調(diào)節(jié)為l〇μg/ml的濃度。將該溶液 施加于每一載玻片，并且然后在保濕室中于4°C靜置過夜。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘 后，向每一載玻片中施加用封閉液稀釋250倍的MOM生物素標(biāo)記的抗IgG抗體(VECTASTAIN)， 隨后使之在保濕室中于室溫靜置1小時(shí)。用roS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片上施加 抗生物素蛋白-生物素 ABC試劑(VECTASTAIN)，并隨后使之在保濕室中于室溫靜置5分鐘。用 PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，向載玻片上施加 DAB染色溶液（10mg DAB+ΙΟμΙ 30%H2〇2/ 0.05M Tris-HCl，pH 7.6,50ml)，并隨后使之在保濕室中于室溫靜置30分鐘。載玻片用蒸餾 水淋洗，然后施加蘇木精試劑(DAK0)。使載玻片在保濕室中于室溫靜置1分鐘后，用蒸餾水 淋洗。載玻片依次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分鐘，并隨后使 其在二甲苯中靜置過夜。取出載玻片，用Glycergel封片介質(zhì)(DAK0)封片，并且隨后觀察。作 為結(jié)果，在所有唾液腺、腎、結(jié)腸和胃組織的細(xì)胞內(nèi)觀察到微弱程度的CAPRIN-1表達(dá);然而 在細(xì)胞的表面上沒有觀察到CAPRIN-1表達(dá)。此外，在來自其它器官的組織中完全沒有觀察 到表達(dá)。此外，當(dāng)使用具有SEQ ID NO: 103的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 107的輕鏈可變區(qū)的 抗CAPRIN-1單克隆抗體(單克隆抗體#9)時(shí)，也得到了類似的結(jié)果。
[0191] (7)-2:犬乳腺癌組織中的CAPRIN-1表達(dá)
[0192] 使用通過病理診斷法診斷為患有惡性乳腺癌的犬的108份冷凍犬乳腺癌組織樣 品，通過與上述類似的方法制備冷凍切片載玻片，并且用實(shí)施例4制備的單克隆抗體#6進(jìn)行 免疫組織化學(xué)染色。作為結(jié)果，在108份樣品的100份（92.5 % )中證實(shí)了CAPRIN-1表達(dá)。 CAPRIN-1在異型度高的癌細(xì)胞表面上是特別強(qiáng)烈地表達(dá)。此外，當(dāng)使用實(shí)施例4產(chǎn)生的單克 隆抗體#9時(shí)，也獲得了類似的結(jié)果。
[0193] (7)-3:人乳腺癌組織中的CAPRIN-1表達(dá)
[0194] 應(yīng)用石蠟包埋的人乳腺癌組織陣列(ΒΙ0ΜΑΧ)的188份乳腺癌組織樣品實(shí)施免疫組 織化學(xué)染色。在60°C處理3小時(shí)后，將該人乳腺癌組織陣列加入到充滿二甲苯的染色瓶中， 然后每5分鐘更換二甲苯，更換3次。隨后，使用乙醇和PBS-T替代二甲苯重復(fù)相似流程。將人 乳腺癌組織陣列加入到充滿含有0.05%吐溫20的10mM檸檬酸緩沖液(pH 6.0)的染色瓶中， 在125°C處理5分鐘，并且在室溫靜置40分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間。使用Kimwipes紙巾擦掉每一樣品 周圍的多余水分，用DAKOPEN圈定每一切片，并且向其逐滴添加足夠量的過氧化物酶阻斷劑 (DAK0)。使所得物在室溫靜置5分鐘后，然后加入到充滿roS-T的染色瓶。每5分鐘更換roS-T，更換3次。將含有10 %FBS的PBS-T溶液施加在該陣列上作為封閉液，并且使該陣列置于保 濕室中在室溫持續(xù)1小時(shí)。隨后，制備含有實(shí)施例4制備的、與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗 體#6的溶液，應(yīng)用含有5%FBS的roS-T溶液將該抗體調(diào)節(jié)為10μg/ml的濃度。施與該溶液，并 且然后在保濕室中于4 °C靜置過夜。在用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘后，逐滴添加合適量的 Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO)，并且隨后使載玻片在保濕室中于室溫 靜置30分鐘。在用roS-T洗滌3次，每次10分鐘后，施加 DAB染色液(DAK0)，并且在室溫靜置約 10分鐘。棄去DAB染色液，然后用PBS-T洗滌3次，每次10分鐘。用蒸餾水淋洗載玻片，然后依 次地浸在70%、80%、90%、95%和100%乙醇溶液中，每次1分鐘，并隨后使其在二甲苯中靜 置過夜。取出載玻片，用Glycergel封片介質(zhì)(DAKO)封片，并且隨后觀察。作為結(jié)果，在全部 188份乳腺癌組織樣品的138份(73%)中觀察到強(qiáng)烈的CAPRIN-1表達(dá)。此外，當(dāng)使用實(shí)施例4 制備的單克隆抗體#9時(shí)，也獲得了類似的結(jié)果。
[0195] (7)-4:人惡性腦腫瘤中的CAPRIN-1表達(dá)
[0196] 用實(shí)施例4中制備的單克隆抗體#6如上文(7)_3中類似的方式對(duì)石蠟包埋的人惡 性腦腫瘤組織陣列(ΒΙ0ΜΑΧ)的247份惡性腦腫瘤組織樣品實(shí)施免疫組織化學(xué)染色。作為結(jié) 果，在全部247份惡性腦腫瘤組織樣品的227份(92% )中觀察到強(qiáng)烈的CAPRIN-1表達(dá)。此外， 當(dāng)使用實(shí)施例4制備的單克隆抗體#9時(shí)，也獲得了類似的結(jié)果。
[0197] (7)-5:人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中的CAPRIN-1表達(dá)
[0198] 用實(shí)施例4中制備的單克隆抗體#6以如上文(7)_3中類似的方式對(duì)石蠟包埋的人 乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織陣列(ΒΙ0ΜΑΧ)的150份人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織樣品實(shí)施免疫 組織化學(xué)染色。作為結(jié)果，在全部150份人乳腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織樣品的136份(90%)中 觀察到強(qiáng)烈的CAPRIN-1表達(dá)。特別地，揭示了 CAPRIN-1在轉(zhuǎn)移自乳腺癌的癌組織中也強(qiáng)烈 地表達(dá)。此外，當(dāng)使用實(shí)施例4制備的單克隆抗體#9時(shí)，也獲得了類似的結(jié)果。
[0199] 實(shí)施例2:抗CAPRIN-1抗體對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果(ADCC活性）
[0200]接下來，我們檢查了抗CAPRIN-1抗體是否能夠損傷表達(dá)CAPRIN-1的腫瘤細(xì)胞。應(yīng) 用實(shí)施例1中制備的抗人CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗體實(shí)施評(píng)估。分別將已證實(shí)表達(dá) CAPRIN-1的兩類人乳腺癌細(xì)胞系(T47D和MDA-MB-157)(每種細(xì)胞106個(gè)細(xì)胞)收集至50ml離 心管中。往其中加入鉻51 (lOOyCi)，隨后在37°C溫育2小時(shí)。之后，用含有10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，并將細(xì)胞加入到96孔V-底培養(yǎng)板的孔中（每孔103個(gè)細(xì)胞）。 往其中加入上述抗人CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗體(每孔lyg)。之后，往其中加入從兔外周 血分離的淋巴細(xì)胞(每孔2X10 5個(gè)細(xì)胞），隨后在37°C和5%C02中培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，確定每 一培養(yǎng)上清液中從受損腫瘤細(xì)胞中釋放的鉻(Cr) 51的水平。然后，計(jì)算抗人CAPRIN-1衍生 肽的多克隆抗體對(duì)癌細(xì)胞的ADCC活性。結(jié)果，證實(shí)了針對(duì)T47D(15.4%)和MDA-MB-157 (17.3%)的ADCC活性(參見圖2和3)。同時(shí)，當(dāng)應(yīng)用從未用抗原免疫的兔外圍血中制備的對(duì) 照抗體(實(shí)施例1(5))實(shí)施上述類似的方法時(shí)，或沒有添加抗體時(shí)，基本上沒有觀察到活性 (參見圖2和3)。因此，這揭示了通過使用抗CAPRIN-1抗體誘導(dǎo)的ADCC活性可損傷表達(dá) CAPRIN-1的腫瘤細(xì)胞。
[0201]此外，對(duì)于細(xì)胞毒活性，將本發(fā)明使用的抗CAPRIN-1抗體、小鼠淋巴細(xì)胞和摻有鉻 51的103個(gè)來自白血病細(xì)胞系的細(xì)胞混合在一起，并培養(yǎng)4小時(shí)。之后，確定釋放至培養(yǎng)基的 鉻51水平。然后，通過以下等式*計(jì)算對(duì)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性。
[0202] *等式：細(xì)胞毒活性（％) = [(從向其中添加了抗CAPRIN-1抗體和小鼠淋巴瘤的 T47D或MDA-MB-157中釋放的鉻51水平)/ (從向其中添加了 1N鹽酸的靶細(xì)胞中釋放的鉻51水 平）]X100
[0203]實(shí)施例3:制備新的人癌抗原蛋白 [0204] (1)重組蛋白的制備
[0205] 基于實(shí)施例1中獲得的SEQ ID NO: 1的基因通過下述方法制備人同源物基因的重 組蛋白。使用Thermal Cycler(BIO RAD)，以及通過添加試劑及附帶的緩沖液（ΙμL cDNA(其 來自實(shí)施例1制備的衍生自各組織/細(xì)胞的cDNA，并通過RT-PCR觀察其表達(dá)）、含有SacI和 Xhol限制性酶切位點(diǎn)序列的兩種類型的引物(每種0.4yM，SEQ ID N0:38和39)、0.2mM dNTP 和1.25U PrimeSTAR HS聚合酶(Takara Shuzo))以調(diào)節(jié)至達(dá)到總體積50μ1的反應(yīng)溶液進(jìn)行 PCR，所述PCR進(jìn)行30個(gè)98°C/10秒和68°C/2.5分鐘的循環(huán)。使用上述兩種引物來擴(kuò)增編碼 SEQ ID NO: 2的全長(zhǎng)氨基酸序列的區(qū)域。在PCR后，將擴(kuò)增的DNA在1 %瓊脂糖凝膠上電泳，并 且使用QIAqui ck凝膠提取試劑盒(QIAGEN)純化約2.1 kbp的DNA片段。
[0206] 將純化的DNA片段連接入pCR-Blunt克隆載體(Invitrogen)。將所得物轉(zhuǎn)化到大腸 桿菌中，并回收質(zhì)粒?；跍y(cè)序證實(shí)擴(kuò)增的基因片段匹配目的序列。用SacI和Xhol限制性酶 處理匹配于目的序列的質(zhì)粒，然后用QIAquick凝膠提取試劑盒純化所得物。然后將目的基 因序列插入用SacI和Xhol限制性酶處理的大腸桿菌pET30b表達(dá)載體(Novagen)。使用這種 載體能夠產(chǎn)生融合有His標(biāo)簽的重組蛋白。將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中用于表 達(dá)，并且然后用ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，由此在大腸桿菌中表達(dá)靶蛋白。
[0207] (2)重組蛋白的純化
[0208]在含有30μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)每一種上文所獲得的表達(dá)SEQ ID NO: 1的重組大腸桿菌，直至在600nm的吸光度達(dá)到大約0.7。然后添加異丙基-β-D-1-硫 代吡喃半乳糖苷至終濃度ImM，隨后在37°C培養(yǎng)4小時(shí)。此后，通過以4800rpm離心10分鐘收 集細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，并以4800rpm離心10分鐘，以洗滌細(xì) 胞。
[0209] 將細(xì)胞懸浮在磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，然后在冰上超聲破碎。超聲破碎的大腸 桿菌的溶胞產(chǎn)物以6000rpm離心20分鐘。將由此得到的上清液用作可溶級(jí)分，并將由此獲得 的沉淀用作不溶級(jí)分。
[0210] 將可溶級(jí)分添加至根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備的鎳螯合柱(載體:Chelateing Sepharose (商標(biāo))Fast Flow(GE Health Care);柱體積:5ml;50mM鹽酸緩沖液(pH 8.0)作為平衡緩沖 液）。用約10倍柱體積的50mM鹽酸緩沖液(pH 8.0)和含有20mM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗去未吸附的級(jí)分。洗滌之后，立即用含有100mM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)洗 脫6個(gè)床。將含有100mM咪唑的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)的洗脫級(jí)分（已通過考馬斯染色 法證實(shí)了目的蛋白的洗脫)添加至強(qiáng)陰離子交換柱(載體:Q Sepharose(商標(biāo))Fast Flow (GE Health Care);柱體積:5ml ;20mM磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)作為平衡緩沖液）。用10倍柱 體積的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)和含有200mM氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗去 未吸附的級(jí)分。洗滌后，立即用含有400mM氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗脫5個(gè)床。 由此，獲得了各個(gè)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的純化級(jí)分。
[0211] 將200μ1通過上述方法獲得的每一純化制備物分散到lml的反應(yīng)緩沖液（20mM Tris-HCl，50mM NaCl，2mM CaCl2，pH 7.4)中，然后添加2μ1 腸激酶（Novagen)。使制備物在 室溫靜置過夜進(jìn)行反應(yīng)，切除His標(biāo)簽，并且然后使用腸激酶切割捕獲試劑盒(Novagen)根 據(jù)隨附的說明書進(jìn)行純化。隨后，使用超濾法NAN0SEP 10K OMEGA(PALL)，用生理磷酸鹽緩 沖液(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.)置換1.2ml由上述方法獲得的每一純化制備物。 通過0.22μηι HT Tuffryn Acrodisc(PALL)實(shí)施無(wú)菌過濾，并且所得物用于以下實(shí)驗(yàn)。
[0212] 實(shí)施例4:抗CAPRIN-1單克隆抗體的制備
[0213] 將實(shí)施例3中制備的SEQ ID N0:2所示抗原蛋白（人CAPRIN-l)(100yg)與等量的 MPL+TDM佐劑(S i gma)混合。將該混合物用作每只小鼠的抗原溶液。將該抗原液腹膜內(nèi)地施 用至6周齡的Balb/c小鼠 （Japan SLC Inc.)，并且以每周為間隔再施用該溶液3次或24次， 以完成免疫。最后免疫3日后取出脾臟，然后將其在兩片無(wú)菌的載玻片之間研磨。用PBS(-) (Nissui)洗滌每一所得物，然后以1500rpm離心10分鐘，并因此重復(fù)3次移除上清液的程序。 由此，獲得脾臟細(xì)胞。將由此獲得的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 (購(gòu)自ATCC)以10:1的 比例混合。添加 PEG溶液至細(xì)胞，其中所述的PEG溶液通過使在37 °C加熱的200μ1含有10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基與800μ1 PEG1500(Boehringer)混合而制得。使溶液靜置5分鐘以進(jìn) 行細(xì)胞融合。所得物以1700rpm離心5分鐘，以移除上清液。將細(xì)胞懸浮于150ml已經(jīng)添加2% 等價(jià)HAT溶液(Gibco)的含有15%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(HAT選擇培養(yǎng)基）中，并且以每孔 1〇〇μ1鋪種于15塊96孔平板(Nunc)中。在37°C和5%⑶ 2的條件下培養(yǎng)細(xì)胞7天，由此獲得因 脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合而產(chǎn)生的雜交瘤。
[0214]使用由這樣制備的雜交瘤產(chǎn)生的抗體對(duì)CAPRIN-1蛋白的結(jié)合親和力作為指標(biāo)，選 擇雜交瘤。將實(shí)施例3中制備的CAPRIN-1蛋白溶液（lμg/ml)以每孔100μΙ的量添加至96孔平 板，并使該平板在4°C靜置18小時(shí)。各孔用roS-T洗滌3次，以每孔400μ1的量添加0.5 %牛血 清白蛋白（BSA)溶液(Sigma)，并且然后使該平板在室溫靜置3小時(shí)。移除該溶液，用400μ1的 PBS-T洗滌各孔3次。以每孔100μ1的量添加上文獲得的每個(gè)雜交瘤的培養(yǎng)上清液，并且使該 平板在室溫靜置2小時(shí)。用roS-T洗滌各孔3次，以每孔100μ1的量添加用roS稀釋5000倍的 HRP標(biāo)記的抗小鼠 IgG(H+L)抗體（Invitrogen)，并且在室溫靜置1小時(shí)。用roS-T洗滌各孔3 次，以每孔1〇〇μ1的量添加 TMB底物溶液(Thermo)，并且靜置15至30分鐘，由此進(jìn)行顯色反 應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔1〇〇μ1的量添加1N硫酸以終止該反應(yīng)。使用吸光度計(jì)測(cè)定在450nm 的吸光度和在595nm的吸光度。結(jié)果，選出了具有高吸光度值的產(chǎn)生抗體的多株雜交瘤。
[0215] 將由此選出的雜交瘤以每孔0.5個(gè)雜交瘤細(xì)胞的量添加至96孔平板并培養(yǎng)。1周 后，觀察到在孔中形成單個(gè)集落雜交瘤。進(jìn)一步培養(yǎng)這些孔中的細(xì)胞。使用（從克隆的雜交 瘤產(chǎn)生的抗體)對(duì)CAPRIN-1蛋白的結(jié)合親和力作為指標(biāo)，選擇雜交瘤。將實(shí)施例3中制備的 CAPRIN-1蛋白溶液（lμg/ml)以每孔100μ1的量添加至96孔平板，并使該平板在4°C靜置18小 時(shí)。各孔用TOS-T洗滌3次，以每孔400μ1的量添加0.5%BSA溶液，并且然后使該平板在室溫 靜置3小時(shí)。移除該溶液，用400μ1的roS-T洗滌各孔3次。以每孔100μ1的量添加上文獲得的 每個(gè)雜交瘤的培養(yǎng)上清液，并且使該平板在室溫靜置2小時(shí)。用PBS-T洗滌各孔3次，以每孔 1〇〇μ1的量添加用roS稀釋5000倍的HRP標(biāo)記的抗小鼠 IgG(H+L)抗體（Invitrogen)，并且在 室溫靜置1小時(shí)。用roS-T洗滌各孔3次，以每孔100μ1的量添加 TMB底物溶液(Thermo)，并且 靜置15至30分鐘，由此進(jìn)行顯色反應(yīng)。在顏色顯現(xiàn)后，以每孔100μ1的量添加1N硫酸以終止 該反應(yīng)。使用吸光度計(jì)測(cè)定在450nm的吸光度和在595nm的吸光度。結(jié)果，獲得了150個(gè)雜交 瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系產(chǎn)生顯示出與CAPRIN-1蛋白的反應(yīng)性的單克隆抗體。
[0216] 接下來，在這些單克隆抗體當(dāng)中選出顯示了與表達(dá)CAPRIN-1的乳腺癌細(xì)胞的表面 的反應(yīng)性的單克隆抗體。具體地，在1.5ml微量離心管中離心10 6個(gè)MDA-MB-231V人乳腺癌細(xì) 胞系細(xì)胞。添加上文制備的每一雜交瘤上清液（1〇〇μ1)，并且在冰上靜置1小時(shí)。在用PBS洗 滌后，添加用含有0 . 1 %FBS的PBS稀釋500倍的FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG抗體 (Invitrogen)，并在冰上靜置 1 小時(shí)。在用PBS洗滌后，使用FACSCalibur(Becton,Dickinson and Company)測(cè)量熒光強(qiáng)度。同時(shí)，應(yīng)用用雜交瘤培養(yǎng)基稀釋500倍的未受處理的6周齡 Balb/c小鼠血清代替抗體實(shí)施類似程序，由此制備對(duì)照。結(jié)果，選出了 11個(gè)(#1至#11)具有 比對(duì)照更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度的單克隆抗體;即，選出了與乳腺癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體 [0217]實(shí)施例5:所選擇的抗體的表征 [0 218] ⑴抗CAPRIN-1單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆
[0219] 從產(chǎn)生實(shí)施例4所選擇的11個(gè)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系中提取mRNA。應(yīng)用對(duì)衍 生自小鼠 FR1的序列和衍生自小鼠 FR4的序列特異的引物，通過RT-PCR獲得每一抗CAPRIN-1 單克隆抗體的重鏈可變(VH)區(qū)基因和輕鏈可變(VL)區(qū)基因。為了測(cè)序，將這些基因分別克 隆至pCR2 · 1 載體（Invitrogen)。
[0220] (l)-lRT-PCR
[0221] 應(yīng)用mRNA微量純化試劑盒(GE Healthcare)從每一雜交瘤細(xì)胞系（106個(gè)細(xì)胞）制 備mRNA。應(yīng)用5卯6巧〇1^口1:11第一鏈合成試劑盒（111￥；[1：1'08611)對(duì)每一獲得的1111?嫩進(jìn)行逆轉(zhuǎn) 錄，用于cDNA合成。根據(jù)該試劑盒所附方案進(jìn)行上述程序。
[0222] 對(duì)每一獲得的cDNA通過PCR進(jìn)行抗體基因擴(kuò)增。
[0223] 為獲得VH區(qū)基因，應(yīng)用了對(duì)小鼠重鏈FR1序列特異的引物（SEQ ID N0:130)和對(duì)小 鼠重鏈FR4序列特異的引物（SEQ ID NO: 131)。此外，為獲得VL區(qū)基因，應(yīng)用了對(duì)小鼠輕鏈 FR1序列特異的引物(SEQIDN0:132)和對(duì)小鼠輕鏈FR4序列特異的引物(SEQIDN0:133)。 參照J(rèn)ones，S.T.和Bending,M.M.Bio/Technology 9,88-89( 1991)設(shè)計(jì)這些引物。為了進(jìn)行 PCR，使用了Ex_taq(Takara Bio Inc·)。將每一cDNA樣本與 10x EX Taq緩沖液（5yl)、dNTP 混合物（2.5禮）（4以1)、引物（1.(^1〇(每種2以1#陽(yáng)1了&9(51]/^1)(0.25以1)混合。應(yīng)用無(wú)菌水 將總體積調(diào)節(jié)至50μ1。在包括以下條件的條件下進(jìn)行PCR:在94°C處理2分鐘后，進(jìn)行30個(gè)以 下循環(huán):94 °C變性1分鐘、58 °C退火30秒、以及在72 °C延伸1分鐘。
[0224] (1)-2 克隆
[0225] 將上述獲得的每一 PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，隨后切取VH區(qū)和VL區(qū)的DNA帶。 應(yīng)用QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN)根據(jù)該試劑盒所附說明書純化DNA。應(yīng)用TA克隆試 劑盒(Invitrogen)將每一純化的DNA克隆至pCR2.1載體中。將每一DNA連接的載體根據(jù)常規(guī) 方法轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞(Τ0Υ0Β0)中。在37°C在培養(yǎng)基（100μg/ml氨芐青霉素）中培養(yǎng)每 一轉(zhuǎn)化子(10個(gè)克隆)過夜。應(yīng)用Qiaspin小量制備試劑盒(QIAGEN)純化所獲得的質(zhì)粒DNA。
[0226] (1)-3 測(cè)序
[0227] 應(yīng)用熒光測(cè)序儀(ABI;DNA測(cè)序儀3130XL)和BigDye終止子Ver.3.1循環(huán)測(cè)序試劑 盒(ABI)，根據(jù)試劑盒所附說明，應(yīng)用M13正向引物(SEQIDN0:134)和M13反向引物(SEQID N0:135)對(duì)上述獲得的每一質(zhì)粒的VH區(qū)和VL區(qū)進(jìn)行基因序列分析。結(jié)果，確定了每一基因序 列(在10個(gè)克隆中是同一的）。
[0228] 所得到的單克隆抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:43、SEQ ID N0: 73、SEQIDN0:83、SEQIDN0:93、SEQIDN0:103、SEQIDN0:113和SEQIDN0:123;所得 到的單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:47、SEQ ID N0:53、SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:77、SEQ ID N0:87、SEQ ID N0:97、SEQ ID N0:107、SEQIDN0:117和SEQIDN0:127。
[0229] 具體地，單克隆抗體#1包含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:47的輕鏈可 變區(qū)。單克隆抗體#2包含SEQ ID NO: 43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 53的輕鏈可變區(qū)。單克 隆抗體#3包含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:58的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#4包 含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:63的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#5包含SEQ ID N0:43的重鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:68的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#6包含SEQ ID N0:73的重 鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:77的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#7包含SEQ ID N0:83的重鏈可變區(qū)和 SEQ ID N0:87的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#8包含SEQ ID N0:93的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 97的輕鏈可變區(qū)。單克隆抗體#9包含SEQ ID NO: 103的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 107的輕鏈 可變區(qū)。單克隆抗體#10包含SEQ ID N0:113的重鏈可變區(qū)和SEQ ID N0:117的輕鏈可變區(qū)。 單克隆抗體#11包含SEQ ID NO: 123的重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO: 127的輕鏈可變區(qū)。
[0230] (2)應(yīng)用所獲得的單克隆抗體的CAPRIN-1在不同細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表達(dá)
[0231] 接下來，我們檢查了 CAPRIN-1蛋白是否在7種已證實(shí)在其中表達(dá)CAPRIN-1基因的 乳腺癌細(xì)胞系（]\0^-1?-157、了470、]\?1(-1111-1、]\?^-]\?-231￥、8了20、51(-81?-3和0厶-]\?-2311')、3 種其他乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231C、MCF-7和ZR75-1)、6種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(T98G、SNB19、 U251和U87G)、3種腎癌細(xì)胞系(Caki-1、Caki2和A498)、1種胃癌細(xì)胞系(MKN45)、1種大腸癌 細(xì)胞系(Caco2)、3種肺癌細(xì)胞系(A549、QG56和PC8)、以及3種白血病細(xì)胞系(Namalwa、BDCM 和RPI1788)的細(xì)胞表面表達(dá)。在1.5ml微離心管中離心每一細(xì)胞系（106個(gè)細(xì)胞）。分別將實(shí) 施例4中制備的與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的含有抗CAPRIN-1單克隆抗體#1至#10的雜交瘤上清液 (每一種100μ1)添加至其中，并在冰上靜置1小時(shí)。在用PBS洗滌后，將每一所得物懸浮于用 含有0. 1 %FBS的PBS稀釋500倍的FITC-標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG抗體（Invitrogen Corporation)中，然后在冰上靜置1小時(shí)。在用PBS洗滌后，應(yīng)用FACSCalibur(Becton， Dickinson and Company)測(cè)量焚光強(qiáng)度。同時(shí)，應(yīng)用上述(5)中制備的對(duì)照抗體作為對(duì)照代 替含有抗CAPRIN-1的單克隆抗體#1至#11的雜交瘤上清液，實(shí)施與上述相同的程序，由此制 得對(duì)照。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)加入了單克隆抗體#1至#11的所有細(xì)胞均比對(duì)照細(xì)胞的熒光強(qiáng)度強(qiáng)至少 30 %。具體地，例如當(dāng)使用單克隆抗體#9時(shí)，證實(shí)了熒光強(qiáng)度的以下增強(qiáng)：MDA-MB-157 : 211%;T47D:145%;MRK-nu-l:123%;MDA-MB-231V:251%;BT20:168% 以及 MDA-MB-231T: 94%?；诖耍C實(shí)了CAPRIN-1蛋白在上述人癌細(xì)胞系的細(xì)胞表面表達(dá)。此外，熒光強(qiáng)度的 增強(qiáng)率由細(xì)胞中平均熒光強(qiáng)度(MFI值)的增強(qiáng)率來表示。其通過以下等式計(jì)算。
[0232]平均熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)率（熒光強(qiáng)度增強(qiáng)率）（％ ) = ((與抗人CAPRIN-1抗體反應(yīng)的 細(xì)胞的MFI值)-(對(duì)照MFI值））/(對(duì)照MFI值）X 100
[0233] (3)抗CAPRIN-1抗體對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果(ADCC活性）
[0234]根據(jù)對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(ADCC活性)評(píng)估了上面選擇的抗CAPRIN-1單克隆抗 體#1至#11。應(yīng)用雜交瘤SFM培養(yǎng)基（Invitrogen)培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體#1至#11的雜交瘤。應(yīng) 用把廿&?蛋白4瓊脂糖?？(6冊(cè)冊(cè)1也(^代)純化每一獲得的上清液，隨后用?83(-)置換，并用 0.22-μπι濾器(Millipore)純化。將每一所得物用作活性確定的抗體。將人乳腺癌MDA-MB-157細(xì)胞系（10 6個(gè)細(xì)胞)收集至50ml離心管中。往其中加入鉻51(100yCi)，隨后在37°C溫育2 小時(shí)。之后，用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次。將細(xì)胞加入到96孔V-底培養(yǎng)板 的孔中（每孔1〇 3個(gè)細(xì)胞）。這樣制得靶細(xì)胞。往其中加入上述純化的抗體(每孔lyg)。之后， 往其中加入從小鼠脾臟中分離的小鼠淋巴細(xì)胞(每孔2X10 5個(gè)細(xì)胞），隨后在37°C和5%C02 中培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)后，確定每一培養(yǎng)上清液中從受損腫瘤細(xì)胞中釋放的鉻(Cr) 51的水平。 然后，計(jì)算每一抗人CAPRIN-1衍生肽的多克隆抗體對(duì)癌細(xì)胞的ADCC活性。結(jié)果，所有單克隆 抗體# 1至# 11顯示出針對(duì)MDA-MB-157的ADCC活性(20 %或更多）。具體地，例如，得到了以下 細(xì)胞毒活性:22.1 % ;#2:29.1 % ;#6:30.2%;和#9:32.4% (參見圖4)。同時(shí)，當(dāng)應(yīng)用實(shí)施 例4中制備的與CAPRIN-1蛋白質(zhì)本身反應(yīng)但不與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體實(shí)施上述類 似的方法時(shí)，證實(shí)了沒有細(xì)胞毒活性(參見圖4)。上述結(jié)果顯示了所獲得的抗CAPRIN-1單克 隆抗體(#1至#11)通過展示出ADCC活性損傷表達(dá)CAPRIN-1的癌細(xì)胞。
[0235] (4)抗CAPRIN-1抗體對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤效果(⑶C活性）
[0236]根據(jù)對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(CDC活性)評(píng)估了上面選擇的抗CAPRIN-1單克隆抗 體#1至#11。將通過血液采樣從兔中收集的血液加入到Eppendorf管中，在室溫下靜置60分 鐘，隨后以3000rpm離心5分鐘。由此，制得用于CDC活性確定的血清。將人乳腺癌MDA-MB-231V細(xì)胞系（10 5個(gè)細(xì)胞)收集至50ml離心管中。往其中加入鉻51(100yCi)，隨后在37°C溫育 2小時(shí)。之后，用含有10%FBS的RPMI培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，然后將其懸浮于含有50 %上述制 備的兔血清的RPMI中。將細(xì)胞加入到96孔V-底培養(yǎng)板的孔中（每孔103個(gè)細(xì)胞）。分別將上面 (3)中獲得的抗體# 1至# 11加入到孔中（每孔lyg)，隨后在37°C和5 % C02中培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng) 后，確定每一培養(yǎng)上清液中從受損腫瘤細(xì)胞中釋放的鉻(Cr)51的水平。然后，計(jì)算每一雜交 瘤上清液中抗CAPRIN-1單克隆抗體展示出的針對(duì)MDA-MB-231V的CDC活性。結(jié)果，所有單克 隆抗體#1至#11展示出CDC活性(30%或更多）。同時(shí)，當(dāng)應(yīng)用實(shí)施例4中制備的與CAPRIN-1蛋 白質(zhì)本身反應(yīng)但不與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的單克隆抗體實(shí)施上述類似的方法時(shí)，證實(shí)了沒有細(xì) 胞毒活性(參見圖4)。因此，揭示了抗CAPRIN-1單克隆抗體(#1至#11)還可通過展示出⑶C活 性損傷表達(dá)CAPRIN-1的癌細(xì)胞。
[0237] 實(shí)施例6:抗CAPRIN-1單克隆抗體對(duì)小鼠的體內(nèi)抗腫瘤效果
[0238] 接下來，評(píng)估了所得抗CAPRIN-1單克隆抗體#1至#11對(duì)帶瘤小鼠的體內(nèi)抗腫瘤效 果。通過以上述方法對(duì)每一雜交瘤上清液進(jìn)行柱純化得到這一實(shí)施例中使用的抗體。
[0239] 應(yīng)用帶瘤小鼠檢查抗CAPRIN-1單克隆抗體#1至#11的抗腫瘤效果，其中向所述帶 瘤小鼠中移植了表達(dá)CAPRIN-1的衍生自小鼠的癌細(xì)胞系。將CT26細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)皮下移植 至70只Balb/c小鼠 （Japan SLC，Inc.)的背部(每只小鼠106個(gè)細(xì)胞）。使每一腫瘤生長(zhǎng)，直至 其直徑變?yōu)榧s7mm。對(duì)該帶瘤小鼠（70只中的60只）腹膜內(nèi)施與抗CAPRIN-1單克隆抗體#1至# 11，以及實(shí)施例4中制備的一類單克隆抗體(與CAPRIN-1蛋白質(zhì)本身反應(yīng)，但不與癌細(xì)胞表 面反應(yīng)）（每種抗體5只小鼠），劑量為每只小鼠300yg(300yl)。之后，在總共2天期間以相同 的劑量腹膜內(nèi)施與每一抗體至相關(guān)帶瘤小鼠3次。每天測(cè)量腫瘤尺寸，用于觀察抗腫瘤效 果。給10只剩余的帶瘤小鼠施與PBS(-)代替抗體。這組小鼠設(shè)計(jì)作為對(duì)照組。作為抗腫瘤效 果的觀察結(jié)果，在施與了抗CAPRIN-1單克隆抗體#1至#11的測(cè)試組的情況下，所發(fā)生的腫瘤 消退達(dá)到了這樣的程度，即開始施與抗體時(shí)的腫瘤體積(100 %)在第4天下降至50 %，第6天 下降至約10%，并且在第8天為百分之幾。在第11至14天發(fā)生了基本上完全的腫瘤消退(見 圖5)。另一方面，在對(duì)照組中，在第4、6、8和11天，腫瘤體積分別增長(zhǎng)至原始體積的260%、 350%、550%和800% (參見圖5)。另外在施與了單克隆抗體(與CAPRIN-1蛋白質(zhì)本身反應(yīng)， 但不與癌細(xì)胞表面反應(yīng))的小鼠組中，沒有展現(xiàn)出抗腫瘤效果，并且如對(duì)照組那樣發(fā)生腫瘤 生長(zhǎng)。該結(jié)果表明所獲得的抗CAPRIN-1單克隆抗體#1至#11展示出強(qiáng)烈的針對(duì)表達(dá)CAPRIN-1的癌細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤效果。此外，通過以下公式計(jì)算腫瘤體積從而獲得腫瘤尺寸:長(zhǎng)直 徑X短直徑X短直徑X 0.5。
[0240] 此外，以上述相同的方式將抗CAPRIN-1單克隆抗體#1至#11施與帶瘤小鼠（Balb/ c)，其中向該小鼠移植了小鼠 N1E癌細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)。這導(dǎo)致在施與抗體后第15天腫瘤完全 消退。另一方面，在對(duì)照組中，腫瘤體積升高至高達(dá)原始體積的約950% (參見圖6)。
[0241] 實(shí)施例7:鑒定CAPRIN-1蛋白中的肽，其中與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-1抗體結(jié) 合所述肽
[0242] 應(yīng)用與癌細(xì)胞表面反應(yīng)的抗CAPRIN-1單克隆抗體#1至#11(上面獲得），鑒定了由 這些單克隆抗體識(shí)別的CAPRIN-1蛋白中的部分序列。
[0243] 首先，通過將重組CAPRIN-1蛋白用PBS溶解為lyg/μL濃度制備溶液，將DTT(Fluka) 添加到1〇〇μ1該溶液中至10mM終濃度，隨后在95°C反應(yīng)5分鐘，由此使CAPRIN-1蛋白內(nèi)的二 硫鍵還原。接下來，以20mM的終濃度加入碘乙酰胺（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)，然后在遮光條件下在37°C對(duì)硫醇基進(jìn)行烷基化反應(yīng)30分鐘。將50yg每一種抗 CAPRIN-1單克隆抗體#1至#11加入到40yg如此獲得的還原的烷基化的CAPRIN-1蛋白中，將 混合物體積調(diào)節(jié)至lmL 20mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)，然后在攪拌混合每一混合物的同時(shí) 使該混合物在4 °C反應(yīng)過夜。
[0244] 然后，添加胰蛋白酶(Promega)至〇 · 2yg的終濃度。在37 °C反應(yīng)1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí) 和12小時(shí)后，將所得物與在ImM碳酸鈣及NP-40緩沖液（20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)、5mM EDTA、150mM NaCl和1 %NP-40)中的蛋白A-玻璃珠(GE)混合，然后反應(yīng)30分鐘，其中所述的 蛋白A-玻璃珠在此之前用含l%BSA(Sigma)的PBS進(jìn)行封閉并然后用PBS洗滌。
[0245] 用25mM碳酸銨緩沖液(pH 8.0)洗滌每一反應(yīng)混合物，然后用100μ10.1%甲酸洗脫 抗原-抗體復(fù)合物。應(yīng)用Q-T0F Premier(Waters-MicroMass)根據(jù)該儀器所附說明對(duì)洗脫物 進(jìn)行LC-MS分析。
[0246] 結(jié)果，鑒定出了SEQ ID N0:136的多肽作為CAPRIN-1的部分序列，其被所有抗 CAPRIN-1單克隆抗體#1至#11識(shí)別。此外，鑒定了SEQ ID N0:137的肽，其作為上述SEQ ID NO: 136多肽中的部分序列，被單克隆抗體#2至#5、#6至#8和#10識(shí)別。還揭示了單克隆抗體# 2至#5識(shí)別SEQ ID N0:138的肽，其為SEQ ID N0:137肽中的部分序列肽。
[0247] 工業(yè)實(shí)用性
[0248] 本發(fā)明的抗體可用于治療和/或預(yù)防癌。
[0249] 本說明書包括日本專利申請(qǐng)?zhí)?009-087285的說明書和/或附圖的全部或部分公 開內(nèi)容，其中本申請(qǐng)對(duì)所述的日本專利申請(qǐng)?zhí)栆髢?yōu)先權(quán)。此外，本文中引用的全部出版 物、專利和專利申請(qǐng)也通過引用的方式完整并入本文中。
[0250] 序列表獨(dú)立文本
[0251] 引物：SEQ ID N0:31 至39及 130至 135
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的具有與CAPRIN-1蛋 白、或與包含7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的CAPRIN-1蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片 段，其中所述的CAPRIN-1蛋白具有偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO: 2-30任一項(xiàng)所示的氨基酸序列， 或與所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其包含作為活性成分的具有與CAPRIN-1蛋白片段的 免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片段，其中所述的CAPRIN-1蛋白片段是由除了SEQ ID N0:6和18 之外的偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID NO: 2-30任一項(xiàng)所示氨基酸序列中的氨基酸殘基編號(hào)50-98或氨 基酸殘基編號(hào)233-305區(qū)域內(nèi)的7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸組成的多肽，或包含所述多肽作為 部分序列的多肽。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其包含作為活性成分的具有與CAPRIN-1的部分多肽、 或與包含7個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸的所述部分多肽的片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片 段，其中所述的CAPRIN-1部分多肽具有SEQ ID NO:37或SEQ ID NO: 136所示的氨基酸序列， 或與所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述癌癥是乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋 巴癌、肺癌、食道癌或大腸癌。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述抗體是人抗體、人源化抗體、嵌合 抗體、單鏈抗體或雙特異性抗體。7. 具有與下述多肽的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體，其中所述的多肽具有SEQ ID N0:37或SEQ ID NO: 136所示的氨基酸序列、或與所述氨基酸序列具有80%或更多序列同一性的氨基酸 序列。8. 抗體，其包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 44、45和46所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。9. 抗體，其包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 50、51和52所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。10. 抗體，其包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 55、56和57所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。11. 抗體，其包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 60、61和62所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。12. 抗體，其包含有包含SEQ ID N0:40、41和42所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 65、66和67所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。13. 抗體，其包含有包含SEQ ID N0:70、71和72所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 74、75和76所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。14. 抗體，其包含有包含SEQ ID N0:80、81和82所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 84、85和86所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。15. 抗體，其包含有包含SEQ ID N0:90、91和92所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含SEQ ID NO: 94、95和96所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng)性。16. 抗體，其包含有包含SEQ ID NO: 100、101和102所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含 SEQ ID NO: 104、105和106所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng) 性。17. 抗體，其包含有包含SEQ ID NO: 110、111和112所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含 SEQ ID NO: 114、115和116所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng) 性。18. 抗體，其包含有包含SEQ ID NO: 120、121和122所示序列的重鏈可變區(qū)，以及包含 SEQ ID NO: 124、125和126所示序列的輕鏈可變區(qū)，并且具有與CAPRIN-1蛋白的免疫學(xué)反應(yīng) 性。19. 根據(jù)權(quán)利要求7至18任一項(xiàng)的抗體，其是人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體 或雙特異性抗體。20. 用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物組合物，其包含作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求7-19 任一項(xiàng)的抗體或其片段。21. 用于治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其應(yīng)用具有與CAPRIN-1蛋白、或與包含7個(gè)或更多 個(gè)連續(xù)氨基酸的CAPRIN-1蛋白片段的免疫學(xué)反應(yīng)性的抗體或其片段，其中所述的CAPRIN-1 蛋白具有偶數(shù)編號(hào)的SEQ ID N0:2-30任一項(xiàng)所示的氨基酸序列，或與所述氨基酸序列具有 80 %或更多序列同一性的氨基酸序列。22. 用于治療和/或預(yù)防癌癥的方法，其特征在于應(yīng)用根據(jù)權(quán)利要求7-19任一項(xiàng)的抗體 或其片段。
【文檔編號(hào)】C07K16/30GK106039307SQ201610373466
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2009年8月5日
【發(fā)明人】岡野文義, 井戶隆喜, 齋藤孝則, 小林真, 小林真一
【申請(qǐng)人】東麗株式會(huì)社