一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑及其制備方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。該制備方法包括提取IgG、消化及加溫變性、提取F(ab’)2、明礬吸附除雜質(zhì)、超濾、柱層析純化、原液配制及制劑的制備八大步驟。經(jīng)本發(fā)明工藝制備出的破傷風(fēng)抗毒素更新?lián)Q代產(chǎn)品——馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab’)2，規(guī)格1500IU/0.75ml/瓶，蛋白含量≤50g/L，制劑不含防腐劑。解決了制品去除防腐劑的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)——大幅降低制品蛋白含量，降低制品本身易受污染程度。經(jīng)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的不良反應(yīng)發(fā)生率由傳統(tǒng)破傷風(fēng)抗毒素的40～60%下降至10%以下，安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)破傷風(fēng)抗毒素。
【專利說(shuō)明】
一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白 制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 破傷風(fēng)是由破傷風(fēng)梭菌侵入人體傷口后，在厭氧環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生嗜神經(jīng)外 毒素而引起全身肌肉強(qiáng)直性痙攣為特點(diǎn)的急性傳染病。破傷風(fēng)由于發(fā)病率高，發(fā)病后不易 治療，死亡率達(dá)到20%~50%。世界衛(wèi)生組織及各國(guó)均提倡以預(yù)防為主的策略。因此，我國(guó)目前 對(duì)破傷風(fēng)的普及預(yù)防措施之一是兒童在6歲前計(jì)劃接種破傷風(fēng)疫苗;此外即為凡因各種原 因造成深部創(chuàng)傷的患者，均給予預(yù)防破傷風(fēng)的藥物。傳統(tǒng)預(yù)防破傷風(fēng)藥物為破傷風(fēng)抗毒素， 其工藝技術(shù)自上世紀(jì)50年代從國(guó)外引進(jìn)后，一直沒(méi)有改進(jìn)，制劑蛋白含量高。由于破傷風(fēng)抗 毒素為蛋白類制劑，蛋白含量高，如不添加防腐劑，受微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)極高，一旦微生物 污染在其中繁殖，產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素，注射進(jìn)人體后引起發(fā)熱，嚴(yán)重時(shí)危及患者生命。因此，我 國(guó)破傷風(fēng)抗毒素產(chǎn)品的制劑處方一直含防腐劑成分。我國(guó)藥典允許添加至破傷風(fēng)抗毒素制 劑中的防腐劑為硫柳汞和間甲酚。硫柳汞是一種含汞的有機(jī)化合物，有毒性。間甲酚是一種 有毒有機(jī)化合物，對(duì)皮膚、粘膜有強(qiáng)烈刺激和腐蝕作用。盡管在制劑中防腐劑濃度低，使用 較安全，但制劑中防腐劑的毒性問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議。防腐劑應(yīng)用于生物制品（疫苗、抗血清 制品）處方中已有60多年歷史。目前我國(guó)部分疫苗產(chǎn)品已禁止添加防腐劑。由于破傷風(fēng)抗毒 素蛋白含量高，去除防腐劑存在較高污染風(fēng)險(xiǎn)，因此，國(guó)內(nèi)的破傷風(fēng)抗毒素均含防腐劑。去 除防腐劑需要的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)包括:生產(chǎn)環(huán)境無(wú)菌操作、制劑包裝密封性、制品本身易受污 染程度等。其中生產(chǎn)環(huán)境無(wú)菌操作、制劑包裝密封性可通過(guò)廠房設(shè)施設(shè)備來(lái)達(dá)到要求，但制 品本身易受污染程度，如破傷風(fēng)抗毒素的蛋白含量，其含量越低，越不易受微生物污染。需 通過(guò)工藝技術(shù)創(chuàng)新達(dá)到降低破傷風(fēng)抗毒素蛋白含量要求。
[0003] 傳統(tǒng)破傷風(fēng)抗毒素生產(chǎn)工藝包括消化及加溫變性、硫酸銨沉淀提取、明礬吸附、超 濾濃縮，由此工藝制備出的破傷風(fēng)抗毒素，規(guī)格1500IU/0.75ml/瓶，蛋白含量< 100g/L，制 劑中含防腐劑。因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng) 免疫球蛋白制劑及其制備方法，該制備方法簡(jiǎn)單可靠，制得的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F (ab '）2，規(guī)格15001U/0.75ml/瓶，蛋白含量彡50g/L，制劑不含防腐劑，解決了制品去除防腐 劑的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)一一大幅降低制品蛋白含量，降低制品本身易受污染程度。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的制備方法，包括如下步驟： 步驟（1)，提取IgG:常溫下操作，馬血漿V L，用2V~3V L的質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水 溶液稀釋馬血漿，得到馬血漿稀釋液;按馬血漿稀釋液的體積加入16~18%(m/v)的硫酸銨 固體粉末，攪拌至溶解后，靜置2~18h，過(guò)濾;取濾液，按濾液體積加入13~15%(m/v)硫酸銨 固體粉末，接著攪拌至溶解后，靜置2~18h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(2)，消化及加溫變性:用質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液溶解步驟(1)得到的沉淀 至體積為2V~3V L，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.9~3.3，加入0.06VL胃蛋白酶水溶液，30 ± 1°C保 溫1.5~2h;所述的胃蛋白酶水溶液濃度為100~170酶單位/ml; 之后按步驟（1)得到的沉淀用質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液溶解后的體積加入14~ 16%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.9~5.3，58 ± 1°C保溫 0.5h后降溫，待溫度降至40°C以下后，過(guò)濾，取濾液； 步驟(3)，提取F(ab'）2:用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(2)得到的濾液pH至7.0~7.4,然后按 濾液體積加入19~21%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，靜置2~18h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(4)，明礬吸附除雜質(zhì):將步驟(3)得到的沉淀用注射用水溶解成2V L，然后加入質(zhì) 量濃度為10%的明礬水溶液〇. 16V L，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.7~7.9，攪拌lh，過(guò)濾，取濾 液； 步驟(5)，超濾:將步驟(4)得到的濾液濃縮至0.4V~0.5V L后，利用截留分子大小為 50KD的超濾膜進(jìn)行超濾，超濾時(shí)加入緩沖液使超濾罐中液體體積一直維持在0.4V~0.5V L，至超濾罐中液體中硫酸銨含量< 1. Og/L時(shí)超濾結(jié)束，然后將超濾罐中的溶液濃縮至溶液 蛋白含量65~120g/L，即得到超濾濃縮液；所述的緩沖液中PB濃度為0.02M，NaCl濃度為 0·01Μ，ρΗ為6.8~7.2; 步驟(6)，柱層析純化：陰離子交換層析柱依次采用3個(gè)柱體積水、3個(gè)柱體積1Μ氫氧化 鈉溶液、3個(gè)柱體積水、8~12個(gè)柱體積步驟(5)所述的緩沖液進(jìn)行沖洗;將步驟(5)得到的超 濾濃縮液加載至經(jīng)上述步驟處理后的層析柱中，加載速度為1.0~2.Ocm/min，加載完畢用 步驟(5)所述的緩沖液沖洗層析柱，當(dāng)A 28Qnm紫外吸收值開(kāi)始快速上升時(shí)，收集該層析峰液 體，得到馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab '）2溶液； 步驟(7)，原液配制:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第一輔料水 溶液;將第一輔料水溶液和步驟(6)所得馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2溶液按照體積比為1: 10進(jìn)行混合，混合均勻后，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0~7.0,除菌過(guò)濾后為原液，原液于2~8°C 放置穩(wěn)定;所配制的原液中甘氨酸含量為8~12g/L、氯化鈉含量為3.5~6. Og/L; 步驟(8)，制劑的制備:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第二輔料 水溶液，然后采用第二輔料水溶液對(duì)步驟(7)穩(wěn)定后的原液進(jìn)行稀釋，使馬破傷風(fēng)免疫球蛋 白F(ab'）2的含量為2000000~2400000 IU/L、甘氨酸的濃度為8~12g/L、氯化鈉的濃度為 3.5~6.Og/L;除菌過(guò)濾后，分裝，得到無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑。
[0006] 本發(fā)明中第一輔料水溶液和第二輔料水溶液中甘氨酸、氯化鈉的濃度沒(méi)有具體要 求，只要求保持配制后的液體為上述濃度即可。
[0007] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是步驟(5)超濾時(shí)加入緩沖液的總量為3V~5V L。
[0008]進(jìn)一步，優(yōu)選的是步驟(7)所述的穩(wěn)定為放置至少1個(gè)月。
[0009]本發(fā)明所述的馬血漿經(jīng)過(guò)以下步驟獲得:健康馬匹經(jīng)破傷風(fēng)類毒素基礎(chǔ)免疫，再 用破傷風(fēng)類毒素對(duì)基礎(chǔ)免疫后的馬匹進(jìn)行超免疫，試血效價(jià)達(dá)到2500IU/ml以上后，進(jìn)行馬 血漿采集。所得馬血漿平均效價(jià)為3000IU/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)1000IU/ml。
[0010] 本發(fā)明中表示體積時(shí)所用的"V"可以為任意數(shù)值的體積，沒(méi)有具體限制。
[0011] 本發(fā)明還提供一種上述制備方法制備得到的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑，其 成分為表1所不。
[0012]表1馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2制劑配方
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為： 1、經(jīng)本發(fā)明工藝制備出的破傷風(fēng)抗毒素更新?lián)Q代產(chǎn)品一一馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F (ab '）2，規(guī)格15001U/0.75ml/瓶，蛋白含量彡50g/L，制劑不含防腐劑。解決了制品去除防腐 劑的關(guān)鍵技術(shù)要點(diǎn)一一大幅降低制品蛋白含量，降低制品本身易受污染程度。
[0013] 2、本發(fā)明工藝經(jīng)中試規(guī)模生產(chǎn)，按本發(fā)明方法制備出三批制品，經(jīng)3年穩(wěn)定性研究 考察，制品無(wú)菌檢查均符合要求，本發(fā)明可行。三批制品穩(wěn)定性研究結(jié)果見(jiàn)下表2: 表2無(wú)防腐劑馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2穩(wěn)定性研究關(guān)鍵指標(biāo)結(jié)果
3、經(jīng)本發(fā)明工藝制備的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2蛋白含量低，考慮到蛋白含量低 會(huì)對(duì)制品穩(wěn)定性有影響，因此，在制劑處方中加入甘氨酸作為穩(wěn)定劑，穩(wěn)定制品，保證制品 質(zhì)量。本發(fā)明制劑處方中氯化鈉作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，控制滲透壓范圍在240~400 mOsmol/ kg，為人體接受的安全范圍。
[0014] 4、經(jīng)本發(fā)明制備的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）^_IJ，不含防腐劑，為國(guó)內(nèi)首個(gè)不 含防腐劑的抗血清制品，經(jīng)臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2不良反應(yīng) 發(fā)生率由傳統(tǒng)破傷風(fēng)抗毒素的40~60%下降至10%以下，安全性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)破傷風(fēng)抗毒 素。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是按實(shí)施例3方法制備的三批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）^lj劑穩(wěn)定性試驗(yàn)pH 檢測(cè)結(jié)果； 圖2是按實(shí)施例3方法制備的三批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）^lj劑穩(wěn)定性試驗(yàn)抗體效 價(jià)檢測(cè)結(jié)果； 圖3是按實(shí)施例3方法制備的三批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）^lj劑穩(wěn)定性試驗(yàn)蛋白含 量檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0017] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā) 明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件 或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)購(gòu)買獲得的 常規(guī)產(chǎn)品。
[0018] 本發(fā)明中m/v為質(zhì)量體積比，為固體的質(zhì)量和液體的體積比，單位為g/ml。
[0019] 本發(fā)明百分號(hào)如無(wú)特殊說(shuō)明，則表示為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0020] 實(shí)施例1 一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的制備方法，包括如下步驟： 步驟（1)，提取IgG:常溫下操作，馬血漿V L，用2VL的質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液稀 釋馬血漿，得到馬血漿稀釋液;按馬血漿稀釋液的體積加入16%(m/v)的硫酸銨固體粉末，攪 拌至溶解后，靜置2h，過(guò)濾;取濾液，按濾液體積加入13%(m/v)硫酸銨固體粉末，接著攪拌至 溶解后，靜置2h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(2)，消化及加溫變性:用質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液溶解步驟(1)得到的沉淀 至體積為2V L，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.9，加入0.06VL胃蛋白酶水溶液，30 ± 1°C保溫1.5h;所 述的胃蛋白酶水溶液濃度為100酶單位/ml; 之后按2V L體積加入14%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至4.9，58 土 1°C保溫0.5h后降溫，待溫度降至40°C以下后，過(guò)濾，取濾液； 步驟(3)，提取F(ab'）2:用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(2)得到的濾液pH至7.0,然后按濾液體 積加入19%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，靜置2h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(4)，明礬吸附除雜質(zhì):將步驟(3)得到的沉淀用注射用水溶解成2V L，然后加入質(zhì) 量濃度為10%的明礬水溶液〇. 16V L，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.7，攪拌lh，過(guò)濾，取濾液； 步驟(5)，超濾:將步驟(4)得到的濾液濃縮至0.4V L后，利用截留分子大小為50KD的超 濾膜進(jìn)行超濾，超濾時(shí)加入緩沖液使超濾罐中液體體積一直維持在0.4V L，至超濾罐中液 體中硫酸銨含量< 1. 〇g/L時(shí)超濾結(jié)束，然后將超濾罐中的溶液濃縮至溶液蛋白含量65g/L， 即得到超濾濃縮液;所述的緩沖液中PB濃度為0.02M，NaCl濃度為0.01M，pH為6.8~7.2;超 濾時(shí)加入緩沖液的總量為3V L; 步驟(6)，柱層析純化：陰離子交換層析柱依次采用3個(gè)柱體積水、3個(gè)柱體積1M氫氧化 鈉溶液、3個(gè)柱體積水、8個(gè)柱體積步驟(5)所述的緩沖液進(jìn)行沖洗;然后將步驟(5)得到的超 濾濃縮液加載至經(jīng)上述步驟處理后的層析柱中，加載速度為l.Ocm/min，加載完畢用步驟 (5)所述的緩沖液沖洗層析柱，當(dāng)A 28Qnm紫外吸收值開(kāi)始快速上升時(shí)，收集該層析峰液體，得 到馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2溶液； 步驟(7)，原液配制:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第一輔料水 溶液;將第一輔料水溶液和步驟(6)所得馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2溶液按照體積比為1: 10進(jìn)行混合，混合均勻后，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0~7.0,除菌過(guò)濾后為原液，原液于2~8°C 放置穩(wěn)定;所述的穩(wěn)定為放置至少1個(gè)月；所配制的原液中甘氨酸含量為8~12g/L、氯化鈉 含量為3.5~6.0g/L; 步驟(8)，制劑的制備:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第二輔料 水溶液，然后采用第二輔料水溶液對(duì)步驟(7)穩(wěn)定后的原液進(jìn)行稀釋，使馬破傷風(fēng)免疫球蛋 白F(ab'）2的含量為2000000~2400000 IU/L、甘氨酸的濃度為8~12g/L、氯化鈉的濃度為 3.5~6.Og/L;除菌過(guò)濾后，分裝，得到無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑。
[0021] 實(shí)施例2 一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的制備方法，包括如下步驟： 步驟（1)，提取IgG:常溫下操作，馬血漿V L，用3V L的質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液 稀釋馬血漿，得到馬血漿稀釋液;按馬血漿稀釋液的體積加入18%(m/v)的硫酸銨固體粉末， 攪拌至溶解后，靜置18小時(shí)，過(guò)濾;取濾液，按濾液體積加入15%(m/v)硫酸銨固體粉末，接著 攪拌至溶解后，靜置18小時(shí)，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(2)，消化及加溫變性:用質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液溶解步驟(1)得到的沉淀 至體積為3V L，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至3.3，加入0.06VL胃蛋白酶水溶液，30 ± 1°C保溫2h;所述 的胃蛋白酶水溶液濃度為170酶單位/ml; 之后按3V L體積加入16%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至5.3，58 土 1°C保溫0.5h后降溫，待溫度降至40°C以下后，過(guò)濾，取濾液； 步驟(3)，提取F(ab'）2:用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(2)得到的濾液pH至7.4,然后按濾液體 積加入21%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，靜置18h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(4)，明礬吸附除雜質(zhì):將步驟(3)得到的沉淀用注射用水溶解成2V L，然后加入質(zhì) 量濃度為10%的明礬水溶液〇. 16V L，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.9，攪拌lh，過(guò)濾，取濾液； 步驟(5)，超濾:將步驟(4)得到的濾液濃縮至0.5V L后，利用截留分子大小為50KD的超 濾膜進(jìn)行超濾，超濾時(shí)加入緩沖液使超濾罐中液體體積一直維持在0.5V L，至超濾罐中液 體中硫酸銨含量< 1. 〇g/L時(shí)超濾結(jié)束，然后將超濾罐中的溶液濃縮至溶液蛋白含量120g/ L，即得到超濾濃縮液;所述的緩沖液中1?濃度為0.02M，NaCl濃度為0.01M，pH為6.8~7.2; 超濾時(shí)加入緩沖液的總量為5V L; 步驟(6)，柱層析純化：陰離子交換層析柱依次采用3個(gè)柱體積水、3個(gè)柱體積1M氫氧化 鈉溶液、3個(gè)柱體積水、12個(gè)柱體積步驟(5)所述的緩沖液進(jìn)行沖洗;然后將步驟(5)得到的 超濾濃縮液加載至經(jīng)上述步驟處理后的層析柱中，加載速度為2. Ocm/min，加載完畢用步驟 (5)所述的緩沖液沖洗層析柱，當(dāng)A28Qnm紫外吸收值開(kāi)始快速上升時(shí)，收集該層析峰液體，得 到馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'） 2溶液； 步驟(7)，原液配制:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第一輔料水 溶液;將第一輔料水溶液和步驟(6)所得馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2溶液按照體積比為1: 10進(jìn)行混合，混合均勻后，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0~7.0,除菌過(guò)濾后為原液，原液于2~8°C 放置穩(wěn)定;所述的穩(wěn)定為放置至少1個(gè)月； 步驟(8)，制劑的制備:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第二輔料 水溶液，然后采用第二輔料水溶液對(duì)步驟(7)穩(wěn)定后的原液進(jìn)行稀釋，使馬破傷風(fēng)免疫球蛋 白F(ab'）2的含量為2000000~2400000 IU/L、甘氨酸的濃度為8~12g/L、氯化鈉的濃度為 3.5~6.Og/L;除菌過(guò)濾后，分裝，得到無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑。
[0022] 實(shí)施例3 一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的制備方法，包括如下步驟： 步驟（1)，提取IgG:常溫下操作，馬血漿V L，用2.5V L的質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶 液稀釋馬血漿，得到馬血漿稀釋液;按馬血漿稀釋液的體積加入17%(m/v)的硫酸銨固體粉 末，攪拌至溶解后，靜置8h，過(guò)濾;取濾液，按濾液體積加入14%(m/v)硫酸銨固體粉末，接著 攪拌至溶解后，靜置12h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(2)，消化及加溫變性:用質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液溶解步驟(1)得到的沉淀 至體積為2.5V L，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，加入0.06VL胃蛋白酶水溶液，30 ± 1°C保溫1.8h;所 述的胃蛋白酶水溶液濃度為140酶單位/ml; 之后按2.5V L體積加入15%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH至5，58± 1 C保溫0.5h后降溫，待溫度降至40 C以下后，過(guò)濾，取濾液； 步驟(3)，提取F(ab'）2:用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(2)得到的濾液pH至7.2,然后按濾液體 積加入20%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，靜置10h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(4)，明礬吸附除雜質(zhì):將步驟(3)得到的沉淀用注射用水溶解成2V L，然后加入質(zhì) 量濃度為10%的明礬水溶液〇. 16V L，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.8，攪拌lh，過(guò)濾，取濾液； 步驟(5)，超濾:將步驟(4)得到的濾液濃縮至0.45V L后，利用截留分子大小為50KD的 超濾膜進(jìn)行超濾，超濾時(shí)加入緩沖液使超濾罐中液體體積一直維持在〇.45V L，至超濾罐中 液體中硫酸銨含量< 1. 〇g/L時(shí)超濾結(jié)束，然后將超濾罐中的溶液濃縮至溶液蛋白含量 100g/L，即得到超濾濃縮液;所述的緩沖液中1?濃度為0 · 02M，NaCl濃度為0 · 01M，pH為6 · 8~ 7.2;即緩沖液是0.021?8+0.0謂恥(：1，？?jī)?cè).8~7.2;超濾時(shí)加入緩沖液的總量為4￥^ 步驟(6)，柱層析純化：陰離子交換層析柱(DEAE Sepharose Fast Flow)依次采用3個(gè) 柱體積水、3個(gè)柱體積1M氫氧化鈉溶液、3個(gè)柱體積水、10個(gè)柱體積步驟(5 )所述的緩沖液進(jìn) 行沖洗;然后將步驟(5)得到的超濾濃縮液加載至經(jīng)上述步驟處理后的層析柱中，加載速度 為1.5cm/min，加載完畢用步驟(5)所述的緩沖液沖洗層析柱，當(dāng)A28tom紫外吸收值開(kāi)始快速 上升時(shí)，收集該層析峰液體，得到馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab '）2溶液； 步驟(7)，原液配制:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第一輔料水 溶液;將第一輔料水溶液和步驟(6)所得馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2溶液按照體積比為1: 10進(jìn)行混合，混合均勻后，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0~7.0,除菌過(guò)濾后為原液，原液于2~8°C 放置穩(wěn)定;所述的穩(wěn)定為放置至少1個(gè)月； 步驟(8)，制劑的制備:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第二輔料 水溶液，然后采用第二輔料水溶液對(duì)步驟(7)穩(wěn)定后的原液進(jìn)行稀釋，使馬破傷風(fēng)免疫球蛋 白F(ab'）2的含量為2000000~2400000 IU/L、甘氨酸的濃度為8~12g/L、氯化鈉的濃度為 3.5~6.0g/L;除菌過(guò)濾后，分裝，得到無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑。
[0023]按實(shí)施例3方法制備的三批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）^_lj檢定結(jié)果見(jiàn)表3及圖 1-圖3所示。
[0024]表3三批馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）^lj劑檢定結(jié)果
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員 應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明 的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和 改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效 物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的制備方法，其特征在于，包括如 下步驟： 步驟（1)，提取IgG:常溫下操作，馬血漿V L，用2V~3V L的質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水 溶液稀釋馬血漿，得到馬血漿稀釋液;按馬血漿稀釋液的體積加入16~18%(m/v)的硫酸銨 固體粉末，攪拌至溶解后，靜置2~18h，過(guò)濾;取濾液，按濾液體積加入13~15%(m/v)硫酸銨 固體粉末，接著攪拌至溶解后，靜置2~18h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(2)，消化及加溫變性:用質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液溶解步驟（1)得到的沉淀 至體積為2V~3V L，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.9~3.3，加入0.06VL胃蛋白酶水溶液，30 ± 1°C保 溫1.5~2h;所述的胃蛋白酶水溶液濃度為100~170酶單位/ml; 之后按步驟（1)得到的沉淀用質(zhì)量濃度為0.85%氯化鈉水溶液溶解后的體積加入14~ 16%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至4.9~5.3，58 ± 1°C保溫 0.5h后降溫，待溫度降至40°C以下后，過(guò)濾，取濾液； 步驟(3)，提取F(ab'）2:用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)步驟(2)得到的濾液pH至7.0~7.4,然后按濾 液體積加入19~21%(m/v)硫酸銨固體粉末，攪拌至溶解后，靜置2~18h，過(guò)濾，取沉淀； 步驟(4)，明礬吸附除雜質(zhì):將步驟(3)得到的沉淀用注射用水溶解成2V L，然后加入質(zhì) 量濃度為10%的明礬水溶液〇. 16V L，用2M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.7~7.9，攪拌lh，過(guò)濾，取濾 液； 步驟(5)，超濾：將步驟(4)得到的濾液濃縮至0.4V~0.5V L后，利用截留分子大小為 50KD的超濾膜進(jìn)行超濾，超濾時(shí)加入緩沖液使超濾罐中液體體積一直維持在0.4V~0.5V L，至超濾罐中液體中硫酸銨含量< 1. Og/L時(shí)超濾結(jié)束，然后將超濾罐中的溶液濃縮至溶液 蛋白含量65~120g/L，即得到超濾濃縮液；所述的緩沖液中PB濃度為0.02M，NaCl濃度為 0·01Μ，ρΗ為6.8~7.2; 步驟(6)，柱層析純化：陰離子交換層析柱依次采用3個(gè)柱體積水、3個(gè)柱體積1Μ氫氧化 鈉溶液、3個(gè)柱體積水、8~12個(gè)柱體積步驟(5)所述的緩沖液進(jìn)行沖洗;然后將步驟(5)得到 的超濾濃縮液加載至經(jīng)上述步驟處理后的層析柱中，加載速度為1.0~2. Ocm/min，加載完 畢用步驟(5)所述的緩沖液沖洗層析柱，當(dāng)A28Qr?紫外吸收值開(kāi)始快速上升時(shí)，收集該層析峰 液體，得到馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab '）2溶液； 步驟(7)，原液配制：將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第一輔料水 溶液;將第一輔料水溶液和步驟(6)所得馬破傷風(fēng)免疫球蛋白F(ab'）2溶液按照體積比為1: 10進(jìn)行混合，混合均勻后，用2M鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.0~7.0,除菌過(guò)濾后為原液，原液于2~8°C 放置穩(wěn)定;所配制的原液中甘氨酸含量為8~12g/L、氯化鈉含量為3.5~6. Og/L; 步驟(8)，制劑的制備:將甘氨酸和氯化鈉一起加入到注射用水中溶解，得到第二輔料 水溶液，然后采用第二輔料水溶液對(duì)步驟(7)穩(wěn)定后的原液進(jìn)行稀釋，使馬破傷風(fēng)免疫球蛋 白F(ab'）2的含量為2000000~2400000 IU/L、甘氨酸的濃度為8~12g/L、氯化鈉的濃度為 3.5~6.Og/L;除菌過(guò)濾后，分裝，得到無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的制備方法，其 特征在于，步驟(5)超濾時(shí)加入緩沖液的總量為3V~5V L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的制備方法，其 特征在于，步驟(7)所述的穩(wěn)定為放置至少1個(gè)月。4.權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的無(wú)防腐劑的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑的制備方 法制備得到的注射用馬破傷風(fēng)免疫球蛋白制劑。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK106039308SQ201610492044
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月29日
【發(fā)明人】李景玉, 陳孝婷, 石碧珠
【申請(qǐng)人】玉溪九洲生物技術(shù)有限責(zé)任公司