Cd44結(jié)合肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)，其結(jié)合至由人類CD44基因外顯子9(CD44ex9)編碼的區(qū)域，以融合蛋白質(zhì)并與所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)，尤其涉及偶聯(lián)到所述蛋白質(zhì)的納米顆粒。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)和相應(yīng)的偶聯(lián)納米顆粒的方法，以及本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)在治療和診斷癌癥方面的應(yīng)用。
【專利說明】
CD44結(jié)合肽
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)，其結(jié)合至由人類CD44基因外顯子9(CD44ex9)編碼的區(qū) 域，以融合蛋白質(zhì)并與所述蛋白質(zhì)偶聯(lián)，尤其涉及偶聯(lián)到所述蛋白質(zhì)的納米顆粒。本發(fā)明還 涉及一種生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)和相應(yīng)的偶聯(lián)納米顆粒的方法，涉及CD44V5衍生肽，以及本發(fā)明 所述的蛋白質(zhì)和肽在治療和診斷各種疾病方面的應(yīng)用，尤其是在治療和診斷癌癥方面的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥轉(zhuǎn)錄模式的大量研究已經(jīng)導(dǎo)致了分子靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)，以從良性腫瘤中區(qū)分出惡 性腫瘤，從那些不太具備侵略性的腫瘤中區(qū)分出最具侵略性的腫瘤。癌癥往往過度表達一 些蛋白質(zhì)，包括某些細胞表面抗原，例如，細胞表面受體。結(jié)合到這些過表達的細胞表面抗 原的抗體可促進此類癌癥的檢測和治療。目前已經(jīng)使用了許多方法來產(chǎn)生針對癌細胞表面 受體的抗體，所述癌細胞表面受體可用作潛在的診斷或療法。過度表達的細胞表面受體和 結(jié)合在其上的抗體的識別，為癌癥療法的發(fā)展提供了有效的途徑，尤其是對那些具有不良 預(yù)后且對傳統(tǒng)療法產(chǎn)生抵抗的癌癥亞型而言。⑶44，CA19-9和CEA均是這種過度表達的細胞 表面受體，它們均被認為與腫瘤惡化和惡性腫瘤相關(guān)。
[0003] CD44,是胞外基質(zhì)的一種主要的粘附分子，已廣泛涉及多種生理過程，包括：白細 胞歸位和激活，傷口愈合和細胞迀移，以及腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移(Gijnthert et al.， 1991;Nagano and Saya，2004;Ponta et al.,2003)〇
[0004] ⑶44是一種單鏈分子，包含一個保守的N-末端細胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，一個非保守的近膜 區(qū)，一個表達變體外顯子的各種組合的可變區(qū)，一個跨越區(qū)域的保守的跨膜區(qū)，以及一個保 守的胞質(zhì)尾。CD44基因組圖譜包括在5'末端的5個恒定的外顯子與在3'末端的5個恒定的外 顯子。小鼠⑶44基因還在分子指定的V1-V10的中間包括10個外顯子變體，導(dǎo)致共有20個外 顯子。人類⑶44基因僅包含這10個外顯子變體中的9個(V2-V10)，因而總共包含19個外顯 子。不同的選擇性剪接生成表達外顯子變體的各種組合的CD44的許多亞型（指定的外顯子 Vx中，x=l-10)，所述外顯子變體插在近膜區(qū)中，并構(gòu)成了該分子的可變區(qū)。這些分子被指 定為⑶44變體(⑶44v)。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了⑶44的20種亞型。
[0005] 然而，標(biāo)準(zhǔn)⑶44亞型（CD44s)主要表達于造血細胞和普通上皮細胞的亞群中，在 膜-近端胞外區(qū)插入的CD44變體被發(fā)現(xiàn)富含于多種人類腫瘤中，包括:結(jié)腸腫瘤，乳腺腫瘤， 胃腫瘤，膀胱腫瘤，前列腺腫瘤和各種造血腫瘤。其它報道提出CD44變體表達與腫瘤惡化尤 其是腫瘤細胞的淋巴擴散之間有著密切的聯(lián)系。
[0006] -并考慮這些觀察結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)它們指出了 CD44變體除了在細胞粘附和迀移中更 常規(guī)的功能外，還在腫瘤起始階段和癌細胞保持階段中具有重要功能。
[0007] 除了CD44在癌癥中的作用外，CD44也被建議作為自身免疫性疾病中的潛在靶標(biāo)。 據(jù)報道(Hale et al. ,1992)，⑶44蛋白質(zhì)或肽或衍生物的給藥可被用于治療各種自身免疫 疾病。
[0008] 基于已經(jīng)確立的⑶44在癌癥和自身免疫疾病中作用，直接針對⑶44的各種變種區(qū) 域的單克隆抗體也已經(jīng)得以生產(chǎn)，作為用于CD44相關(guān)病癥的診斷和治療的潛在試劑。
[0009] Seiter等人報道了直接針對大鼠腺癌的CD44表面蛋白質(zhì)的特定轉(zhuǎn)移變體的mAbs (Seiter et al.，1993)。這些抗體擬被用于生產(chǎn)用于免疫調(diào)節(jié)紊亂的治療性處理的免疫抑 制，所述免疫調(diào)節(jié)紊亂包括，例如，風(fēng)濕性類型的疾病。與CD44反應(yīng)的單克隆抗體，其抑制T 細胞增殖，也被提供用于治療各種自身免疫病。連接至含有外顯子v6肽的CD44形式的單克 隆抗體也被報道為適用于診斷炎癥性疾病(Jalkanen et al.，1986)。
[0010] W091/17248涉及抗-CD44V抗體在治療和診斷腫瘤中的應(yīng)用。W095/00851涉及直接 針對CD44的可變的外顯子的抗體在診斷腫瘤中的應(yīng)用。W095/04547公開了出于免疫治療和 免疫成像的目的的特別直接針對外顯子v5序列內(nèi)的表位的抗-CD44抗體的應(yīng)用。直接針對 外顯子v6的一種抗-CD44抗體被W0 95/33771所公開。進一步地，EP0538754教導(dǎo)了直接針對 CD44變體的抗體在免疫抑制方面的應(yīng)用。
[0011] 現(xiàn)有技術(shù)所述的抗-CD44抗體顯示出多個缺點。它們代表了龐大而復(fù)雜的分子，這 些分子不得不通過重組生產(chǎn)方法而被制備。因此，所述生產(chǎn)方法過于復(fù)雜、代價高昂且不得 不嚴格履行監(jiān)管要求。進一步地，降低免疫原性的潛力的必要性需要人類抗體或人源化抗 體的產(chǎn)生。
[0012] 因此，仍然需要CD44變體結(jié)合分子。因而本發(fā)明的目的是提供一種CD44變體結(jié)合 物質(zhì)，其克服了上述缺點中的至少一種。
[0013] 該問題通過依據(jù)權(quán)利要求1所述的一種CD44變體結(jié)合蛋白質(zhì)的提供，并通過所述 結(jié)合蛋白質(zhì)在診斷和治療中的應(yīng)用，特別是通過涂覆有所述蛋白質(zhì)的納米顆粒的使用，得 以解決。本發(fā)明所述的特定實施例為進一步的獨立權(quán)利要求或從屬權(quán)利要求的主題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合至由人類⑶44基因的外顯子9(⑶44ex9)編碼 的多肽的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含以下物質(zhì)或者由以下物質(zhì)組成：
[0015] a)根據(jù)SEQ ID NO: ID N0:卜5所示的氨基酸序列；或
[0016] b)與SEQ ID NO: ID N0:1-5所給出的氨基酸序列具有至少80% -致性的，優(yōu)選 85 % -致性的，更優(yōu)選90 % -致性的，且最優(yōu)選95 % -致性的氨基酸序列;或
[0017] c)與由以下序列所限定的⑶44結(jié)合基序具有至少90 % -致性的，優(yōu)選至少95 % - 致性的或100%-致性的氨基酸序列：
[0018] ''PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX1Q-14AIE"，如SEQ ID N0:ID N0:6-10所示，其中，X表 示任意的氨基酸;并且
[0019] 其中所述的蛋白質(zhì)具有100個氨基酸或更小的長度。
[0020] 通過實施酵母雙雜交篩選，發(fā)明人能夠借助于特異性結(jié)合到被CD44的外顯子9編 碼的多肽來識別五種不同的肽。所述氨基酸序列如圖3和下表中所示，并且指定為SEQ ID NO:ID NO:1-5。
[0021]
[0022] -個進一步的分析表明，一個共有序列可源自具有以下氨基酸序列的這些序列：
[0023] PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX1Q-14AIE。
[0024]這些共有序列被指定為SEQ ID N0:6-10,如下表所示，由此這五個序列在任意序 列x1Q-14的長度上不同;請注意，"X"被定義為任意氨基酸。
[00251
[0026]衍生出唯一的共有序列的能力進一步驗證了雙雜交篩選方法的結(jié)果，其中所述的 共有序列包括所有獨立分離的⑶44相互作用多肽。
[0027]在隨后的兩個獨立的親和力檢測中，SEQ ID N0:1-5的多肽被分析用于向被⑶44 的外顯子9編碼的多肽結(jié)合，并允許一個多肽親和力的排名，由此多肽命名如下：
[0028] 序列號1的肽:肽A
[0029] 序列號2的肽:肽C [0030]序列號3的肽:肽B [0031]序列號4的肽:肽D [0032]序列號5的肽:肽E
[0033] 這兩種親和力檢測，即偽樣品挑選檢測與基于熒光素-二-β-D-吡喃半乳糖苷 (FDG)的檢測揭示了同樣的排名順序：
[0034] B>A，C，D，E
[0035] C>A，D，E
[0036] D>A，E
[0037] E>A
[0038] A>
[0039] 總之，肽B(=序列號3的多肽)對⑶44的外顯子9編碼的多肽具有最高的親和力并 且應(yīng)當(dāng)被視為本發(fā)明中優(yōu)選的肽。為了此肽而實施表位定位，由此實施了缺失分析和丙氨 酸掃描。
[0040] 此外，肽A，C，D和E也在缺失檢測中進行了分析，確認共有序列的有效性。
[0041]基于這些分析，本發(fā)明在另一方面提供了一種結(jié)合至被人類⑶44基因的外顯子9 (CD44ex9)所編碼的多肽的蛋白質(zhì)，實施蛋白質(zhì)包含以下物質(zhì)或者由以下物質(zhì)組成：
[0042] a)根據(jù)SEQ ID NO:39-52所示的氨基酸序列；或
[0043] b)與SEQ ID N0:39-52所給出的氨基酸序列具有至少80% -致性的，優(yōu)選85% - 致性的，更優(yōu)選90 % -致性的，且最優(yōu)選95 % -致性的氨基酸序列;或 [0044] c)與由以下序列所限定的⑶44結(jié)合基序具有至少90% -致性的，優(yōu)選至少95% - 致性的或100%-致性的氨基酸序列：
[0045] 〃PGLQPSFAVQVX2s/aXQXiq-14AIE〃，如SEQ ID 勵:53-62所示，其中4表示任意的氨基 酸;并且
[0046] 其中所述的蛋白質(zhì)具有100個氨基酸或更小的長度。
[0047]
[0048] 基十所述肽的這柙表位定位，上_所討論的共有序列總體上得到/證買。然時，一 個更加優(yōu)選的共有序列可源自具有下列氨基酸序列的這些序列：
[0049] PGLQPSFAVQVX2s/aXQXiq-14AIE。
[0050] 這些共有序列所述被指定為如下表所示的SEQ ID N0:53-62,因而，這些序列在14 位的氨基酸(Ser-Ala)交換方面和所述任意序列X1Q- 14的長度方面存在不同。請注意，"X"被 定義為任意氨基酸。
[0051]
[0052] 必須強調(diào)的是，本發(fā)明所述的肽第一次表明，不僅大分子抗體能夠被生成以針對 ⑶44表位，而且具有32至66個氨基酸長度的小分子肽也能夠能夠被生成以針對⑶44表位， 其中所述小分子肽特異性地且選擇性地結(jié)合至臨床相關(guān)的CD44區(qū)域。
[0053]與現(xiàn)有技術(shù)所述的（單克隆的）CD44v5抗體形成對比的是，這些肽顯示出多個優(yōu) 點。
[0054]由于它們表示不需要形成復(fù)合物或分子內(nèi)二硫橋鍵的短肽，它們更容易被生產(chǎn)和 純化。
[0055]由于這些肽具有32至66個氨基酸的長度，所以甚至可能通過固相合成法合成它們 (根據(jù)Merrifield)?？紤]到與重組蛋白表達相關(guān)的嚴格的監(jiān)管要求，這種體外蛋白質(zhì)合成 具有特別的優(yōu)勢。
[0056] 另外，作為小分子肽，為了用于治療或診斷，它們可被有利地偶聯(lián)至或融合至不同 的蛋白質(zhì)，特定化合物甚至納米顆粒。
[0057] 作為小分子肽，它們能夠穿過血腦屏障和細胞膜以將化合物傳遞至不能被抗體所 處理的部位。
[0058]由于它們的小尺寸，本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)引發(fā)免疫應(yīng)答的風(fēng)險被顯著降低。必須 指出的是，抗體所固有的免疫原性風(fēng)險明顯阻礙了其臨床應(yīng)用。
[0059]必須強調(diào)的是，本發(fā)明所述⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)僅通過變體區(qū)域v5的干擾就使得 普通CD44的功能保持不變，并因而允許一個特定干預(yù)。
[0060] 總之，本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)為副作用風(fēng)險降低的治療和診斷癌癥的 新方法推開了大門。
【具體實施方式】
[0061] 在本發(fā)明的一個實施例中，本發(fā)明提供了一種結(jié)合至被人類⑶44基因的外顯子9 (CD44ex9)所編碼的多肽的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含以下物質(zhì)或者由以下物質(zhì)組成：與SEQ ID N0:1-5和SEQ ID N0:39-52所給出的氨基酸序列具有至少80% -致性的，優(yōu)選85%至少 一致性的，更優(yōu)選至少90 % -致性的，最優(yōu)選至少95 % -致性的且具體地至少97.5 % -致 性的氨基酸序列。
[0062]在一個進一步的實施例中，本發(fā)明提供了一種結(jié)合至被人類⑶44基因的外顯子9 (CD44ex9)所編碼的多肽的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含以下物質(zhì)或者由以下物質(zhì)組成：與由以 下序列所限定的⑶44結(jié)合基序具有至少90% -致性的，優(yōu)選至少95% -致性的，更優(yōu)選至 少97.5%-致性的并甚至更優(yōu)選至少100%-致性的氨基酸序列：
[0063] 如SEQ ID N0:6-10所示的〃PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQX1Q-14AIE〃和如SEQ ID N0: 53-62所示的〃PGLQPSFAVQVX2s/aXQXiq-i4AIE〃，其中，X表示任意的氨基酸。
[0064] 如本文所要求保護的蛋白質(zhì)具有300個氨基酸或更小的長度，優(yōu)選200個氨基酸或 更小的長度，更優(yōu)選100個氨基酸或更小的長度，并且甚至更優(yōu)選90，85，80，75，70或66個氨 基酸或更小的長度。
[0065]在本發(fā)明的一個進一步的實施例中，所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)對被外顯子9所編碼 的多肽具有高的親和力，具有小于1〇μΜ的ki值，優(yōu)選小于ΙμΜ，更優(yōu)選小于ΙΟΟηΜ，并且最 優(yōu)選小于1〇ηΜ。
[0066]在本發(fā)明的一個進一步的實施例中，所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合至被 外顯子9編碼的所述多肽，考慮到當(dāng)其結(jié)合至其它任意蛋白質(zhì)的時候，所述其它任意蛋白質(zhì) 具有比用于⑶44ex9結(jié)合的ki值至少小10倍的ki值，并且進一步優(yōu)選小100倍。
[0067]在一個實施例中，本發(fā)明所述的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)能夠結(jié)合至每種⑶44亞型，所 述⑶44亞型含有被外顯子9所編碼的區(qū)域，其也被指定為"變體5"（v5)。
[0068] 在一個優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合至選自以下名單 的CD44亞型，所述名單包括：CD44v5，CD44v5-v6，CD44v3-v6，CD44v3-v6，CD44v2-vlO， CD44v3-v 10，CD44V4-v7 以及 CD44v4-v 10。
[0069] 值得注意的是，本發(fā)明所述的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)還結(jié)合至既包含V5區(qū)域，也包含 其它變體區(qū)域的蛋白質(zhì)，所述其它變體，如vl， v2，v3，v4，v6，v7，v8，￥9和/或￥10。
[0070] 在本發(fā)明的一個進一步的實施例中，本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)偶聯(lián)或融 合至異源蛋白質(zhì)或多肽。此偶聯(lián)/融合可改變所述結(jié)合蛋白質(zhì)的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)特性， 或者其可用于減少潛在的副作用。
[0071] 它可進一步作為報告蛋白質(zhì)使用，促進結(jié)合蛋白的檢測，或者作為使蛋白純化的 肽或蛋白質(zhì)使用，并且其可用蛋白酶或化學(xué)試劑就切割位點進一步被改造，所述蛋白酶或 化學(xué)試劑使得兩段分離的蛋白質(zhì)得以釋放。
[0072] 通過融合一種GST蛋白質(zhì)、FLAG肽或一段6個組氨酸的肽(6x His-tag)，該技術(shù)通 常被用于識別和純化蛋白質(zhì)，所述6個組氨酸的肽可通過使用具有鎳或鈷樹脂的親和層析 而被分咼出來。
[0073] 所述結(jié)合蛋白質(zhì)優(yōu)選連接或融合至一種包含有選自以下物質(zhì)的蛋白質(zhì):抗體，毒 素，免疫調(diào)節(jié)肽和細胞因子。
[0074] 在一個優(yōu)選實施例中，所述偶聯(lián)/融合蛋白質(zhì)為一種酶，所述酶從前體分子催化細 胞毒素或細胞抑制劑的產(chǎn)生。合適酶的非窮舉名單包括:醛氧化酶，氨基酸氧化酶，細胞色 素 P450氧化酶，NAD (P )H:醌氧化還原酶，酪氨酸酶，胸苷酸合成酶，胸苷磷酸化酶，谷胱甘 肽-s-轉(zhuǎn)移酶，脫氧胞苷激酶，羧酸酯酶，堿性磷酸酶，β_葡萄糖醛酸酶，半胱氨酸偶聯(lián)_β裂 解酶以及硝基還原酶。
[0075] 本發(fā)明所述的結(jié)合蛋白質(zhì)還可偶聯(lián)或融合至一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)抑制、損害或 殺死癌細胞或者使得癌細胞對另外的細胞毒性化合物很敏感。所述蛋白質(zhì)的非限制性實施 例為:胞嘧啶脫氨酶，可溶性FMS樣酪氨酸激酶配體，單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)，細 胞色素 P450 2B1，視網(wǎng)膜母細胞瘤相關(guān)蛋白，pl6/cdkn2與MMAC1/PTEIMMAC1/PTEN作為磷 酰肌醇3 -激酶的負調(diào)節(jié)物。MMA C1代表多種晚期癌癥1中的突變。
[0076]在另一個方面，本發(fā)明提供了一種偶聯(lián)物，包含本發(fā)明所述的⑶44ex9結(jié)合蛋白 質(zhì)，其通過一個連接分子直接或間接地連接至一種化合物，所述化合物選自以下物質(zhì)所構(gòu) 成的組:碳水化合物，染料分子，放射性同位素，毒素，細胞抑制劑，細胞因子，免疫調(diào)節(jié)劑， 或它們的前藥。
[0077] 根據(jù)本發(fā)明所述的偶聯(lián)物，通?？杀贿B接至損害、抑制甚至殺死癌細胞的任何類 型的藥物。因此，特別優(yōu)選一種細胞毒素劑。細胞毒素劑的非限制性例子包括:替莫唑胺，卡 莫司汀，洛莫司汀，甲基芐肼，鏈脲霉素，伊立替康或者這些試劑中的兩種或多種的任意結(jié) 合。
[0078] 合適的癌癥抑制劑的進一步的例子包括：（-)-Ci-(Mpl，（-)-Ci_(Mp2，（-)-兒茶 素，（+ )-〇^4(1?丨2，（ + )-(：^(1?2，1〇-脫乙酰巴卡丁111，4-脫甲氧道諾霉素，5-氮胞苷/5-氮 雜-2 脫氧胞苷，5-氟尿嘧啶，5-亞氨基阿霉素鹽酸鹽，6-巰基嘌呤，阿柔比星，諾考達唑， 放線菌素 D，腺嘌呤的磷酸鹽，腺苷，阿得巴司，阿多來新;U-73,975,阿非替康，阿侖單抗，阿 利維A酸，阿洛司瓊鹽酸鹽，麥珠子酸，六甲蜜胺，阿螺旋霉素，雙硫脲脒腙，阿美蒽醌，氨磷 汀，氨魯米特，安吖啶鹽酸鹽，安拉羅汀，苦杏仁甙，阿那格雷，阿那曲唑，阿那昔酮，安西他 濱，annomontacin，刺果番蒸枝素 A，（C19/C20赤式），刺果番蒸枝素 B，（C10/C11，C19/C20赤 式），刺果番荔枝素 C，（所有這三種)刺果番荔枝素 E，番荔枝素，番荔枝素-10-1，番荔枝素-A-1, annonidin B , annonin VI, annosquamosin A , annosquamosin B，安曲霉素， apaziquone，精美司那，aristoforin，三氧化二砷，青蒿素，子囊霉素，門冬酰胺酶，阿托西 班，阿莫司汀，阿西替尼，鹽酸阿扎司瓊，阿扎替派，硫唑嘌呤，阿奇霉素，巴氟替尼，巴拉莫 德，匕&11(?&111：1'〇116，匕&七&13111;[11，巴馬司他，13131-34384，匕60&七60&1'；[11，貝洛替，貝那昔濱，苯達 莫司汀，芐替哌，berubicin，白樺脂醇，樺木酸，樺木醛，貝伐單抗，貝沙羅汀，比卡魯胺，胺 利血平，比立考達，蒽雙咪腙，bistramide A;bistratene A，比折來新，博來霉素，博來霉素 A2的硫酸鹽，平陽霉素，硫酸博來霉素，硼替佐米，波生坦，波舒替尼，布喹那鈉，布喹那，溴 匹立明，brostallicin，布朵替坦，布拉它辛，布舍瑞林，白消安，卡巴他賽，亞葉酸鈣，左亞 葉酸鈣，卡普睪酮，喜樹堿，卡奈替尼，莰佛，斑蝥素，卡培他濱，卡醋胺，卡貝替姆，卡鉑，卡 前列素(卡前列素氨丁三醇），卡波醌，卡非佐米，卡哥魯酸，卡莫氟，卡折來新，西地芬戈，西 馬多丁，西妥昔單抗，西維布林，苯丁酸氮芥，氮芥(二氯甲基二乙胺），氯堿他莫昔芬，氯烯 雌醚，塞奧羅奈，順鉑，克拉屈濱，克蘭氟脲，安妥明，氯法齊明，克羅米芬，蟲草素，科羅索 酸，克雷斯托，姜黃素，環(huán)胞苷，環(huán)磷酰胺，阿糖胞苷，胞苷，D-氨基乙酰丙酸，達卡巴嗪，二氫 豚草素，達尼喹酮，達魯舍替，達?自利奈，darinaparsin，達沙替尼，daunoblastina，柔紅霉 素，地西他濱，拉羅司，雷帕霉素，秋水仙胺，艾日布林，阿霉素，地塞米松尼古，右奧馬鉑，鳥 嘌呤，衛(wèi)康醇，二溴螺氯銨，諾孕素，二氟替康，dinal in，地舍莫來，多西他賽，多非喹達，甲 磺酸多拉司瓊，多韋替尼，去氧氟尿苷，阿霉素，屈他雄酮，達佐霉素，duocarmycin， (^]16111；[0；[11，羅氮芥，依達曲沙，6(10丨6031'；[11，6(101^601：1(16，依氟鳥氨酸，依克立達， elacy tarabine，伊利司莫，依利奈法德，厄洛替康，依沙，乙啼替氟，恩洛鉬，依諾他濱，恩普 氨酯，恩替卡韋，恩替諾特，恩曲他濱，enzastaurin，表阿霉素，依他前列素，艾日布林，厄洛 替尼，多柔比星，雌莫司汀，etalocib，依他硝唑，依托格魯，依托泊苷，依沙替康，依西美坦， 依昔舒林，法倔唑，法扎拉濱，地西他濱，氟尿苷，氟達拉濱，氟甲睪酮，氟胞嘧啶，氟他胺，福 美坦，咲略地辛，fosf luridine tidoxi 1，磷喹酮，福司曲星，福莫司汀，福曲他明，氟維司 群，煙曲霉素，加柔比星，加洛他濱，吉非替尼，吉西他濱，吉妥單抗，吉羅酚， gigantetronenin，gigantetroneninone，吉馬替康，吉莫斯特，格洛沙腙，葡磷酰胺， goniothalamicin，goniothalamin，戈舍瑞林，鹽酸格拉司瓊，胍立莫司，海沙瑞林，高三尖 杉酯羥基喜樹堿，羥基脲，羥基脲，金絲桃素，伊班膦酸鈉，伊班膦酸，伊達比星鹽酸鹽，脫氫 雌馬酚，異環(huán)磷酰胺，伊莫福新，伊馬替尼，甲磺酸伊馬替尼伊美克，英丙舒凡，因卡磷酸二 鈉，吲地布林，N-(3-氯-1Η-Π 引噪-7-基)-1,4-苯二磺酰胺，伊諾他酮，inproquone，（2R)-2-[4-[(7_溴喹啉-2-基)氧基]苯氧基]丙酸，碘芐胍，伊洛福芬，依索拉定，伊斯平斯，伊沙匹 隆，甲氨蝶呤，丙氨菌素，1 iquidar，拉帕替尼二甲苯磺酸酯，蘭瑞肽，larotaxel， ledoxantrone，來那度胺香燕多糖，來他替尼，來曲唑，醋酸亮丙瑞林，亮丙瑞林，馬沙骨化 醇，利阿唑洛鉑，洛那法尼，氯尼達明，米托蒽醌，Ly-83583,賴氨加壓素，馬磷酰胺甘露醇氮 芥，mannosulfan，馬立馬司他，marinomycin A，馬賽替尼，山楂酸馬丙考，氮芥，阿霉素，甲 地孕酮，美雄烷，巰美司鈉，甲氨蝶呤，甲基氨基乙酰丙酸，美托咪酯，氯苯氨啶，美妥替哌米 帕，米噪妥林，米伐木肽，mi lataxel，米普昔芬，米鉬，米索硝挫米丁度胺，米托拉酮，米托胍 腙，絲裂霉素，米托胍腙，米托喹酮，米托坦米托蒽醌，替莫唑胺，（-)-(S)-N-(5-氨基-2-甲 基-3-苯基-L，2-二氫吡啶并[3，4-B]吡嗪-7-基)氨基甲酸乙酯，咪唑立賓，莫法羅汀，莫哌 達醇，莫特塞尼莫特沙芬，木利替尼，muricapentocin，muricatacin，鹽酸氮芥，嗎替麥考酸 酯霉酸酸，奈達鉬，奈拉濱，奈莫柔比星，亞銅靈，neptamustine neratinib，尼日利亞，尼洛 替尼，尼魯米特，尼莫司汀，氨基胞，諾拉霉素洛拉曲克，斑蝥素，愈創(chuàng)木酸， nortopixantrone，novembichin obatoclax，奧曲肽，奧拉帕尼，齊墩果醛，高三尖杉酯堿， ombrabulin omtripolide，鹽酸昂丹司瓊，沃塔紫杉醇，奧替拉西，氧嗪酸鉀，奧沙利鉬，奧 昔舒侖氧芬胂，紫杉醇酯，帕利伐米，帕諾斯瓊，帕米膦酸二鈉帕米膦酸，帕尼單抗，帕比司 他，帕妥匹隆，泊澤尼普定，帕唑帕尼培門冬酶，peldesine，培利替尼，N-((5-(2-((6S)-2-氨基_1，4,5，6,7,8_六氫-4-氧代吡啶并[2,3-D]嘧啶-6-基）乙基)-4-甲基-2-噻吩）甲酰 基)-L-谷氨酸，培美曲塞二鈉，噴司他丁，peplomycin peretinoin，異環(huán)磷酰胺，哌立福新， pibrozelesin的氫溴酸鹽，P比鉬，P比萘非特哌泊舒凡，P比柔比星，P比非尼酮，P比曲克辛，P比羅 蒽醌，匹杉瓊，培美曲塞普卡，plitidepsin，普洛美坦，鬼臼毒素，泊馬度胺，卟菲爾鈉普拉 曲沙，普啉司他，鹽酸甲基芐肼，普羅帕脒，氯化丙啶，嘌嘧替派嘌呤霉素，吡唑霉素， quarfloxin，拉替拉韋，雷替曲塞，鹽酸雷莫司瓊，雷莫司汀瑞他霉素，retelliptine，利波 腺苷，利曲舒凡，利安昔單抗，羅氟司特，羅米地辛1-(2-脫氧-beta-咲喃核糖基)_5_碘-2-啼啶酮，羅喹美克，羅莎布林，盧比替康，sabarubicin，沙芬戈，salirasib sapacitabine， 塞卡替尼，sardomoz ide，賽特鉑，司鉑，細胞周期蛋白B激酶抑制劑，馬沙尼；SU-5416，洛莫 司汀，舍莫瑞林，司莫紫杉醇，辛曲秦，西他列汀，裂裥菌素 ，soblitodin sobuzoxane，苯丁 酸鈉，索拉非尼，斯帕磷酸，稀疏霉素，螺鉑角鯊胺，squamocin，鏈黑菌素，鏈霉素，異環(huán)磷酰 胺，軟化劑，舒尼替尼苦馬豆素，泰克地那林，他氟前列素，[(2R)-1-[(2S)-2-氨基-3-甲基 丁?；鵠吡略燒-2-基]硼酸，他利霉素，他莫司汀，talotrexin taltobulin，枸橡酸他莫昔 芬，凡德他尼，替拉替尼，N-[2-[[4-[2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氫-1H-異喹啉-2-基）乙基] 苯基]氨基甲?；鵠-4，5-二甲氧基苯基]喹啉-3-甲酰胺，tas idot in，他斯索蘭?；悄就?， 替加氟，替加氟-尿啼啶，telatinib，替洛蒽醌，替莫唑胺，teniposide tenuazonic酸， MES0-1，4-雙(3，4-二甲氧基苯基)二甲基丁烷，特立帕肽，tesetaxel，睪內(nèi)酯，扎西他濱，硝 咪硫鳥嘌呤，塞替派，胸腺生成素，噻唑呋林，噻氯咪索，替洛隆，timecoder，噻莫西酸硫鳥 噪呤，替拉扎明，todadesine，拓優(yōu)得，鹽酸拓撲替康，托瑞米芬tosedostat，托西莫， toxipantrone，曲妥珠單抗，三亞胺醌，維甲酸，曲西瑞賓，曲洛司坦三甲，triplatin四硝酸 酯，雷公藤，曲普瑞林，氯乙環(huán)磷酰胺，鹽酸托烷司瓊妥布氯唑，娃兒藤堿，1]-67786，1]_ 68415，U-71 184，1]-76074，1]-78057，烏苯美司卡莫司汀，烏瑞替派，氨基甲酸酯，尿苷，熊果 酸，烏蘇醛，2,5_己酮可可堿，戊柔比星伐司樸達，凡德他尼，伐普肽，伐他拉尼;PTK787,維 替泊芬，維格列汀，硫酸長春堿，長春新堿，長春地辛，長春匹定，長春氟寧，長春米特，長春 西汀，長春西醇，長春羅新，長春瑞濱[堿]，酒石酸長春瑞濱，長春曲醇，長春利定，伏立康 P坐，伏立諾他，伏氯唑，雷公藤內(nèi)酯A，黃黴素 A，扎西他濱，折尼鉬，zilascorb，zinostatin， 唑來膦酸，佐柔比星，唑喹達，或其類似物，或者包含上述癌癥抑制劑中的至少一種的結(jié)合。
[0079] 此外，抗血管新生藥也可被用于本發(fā)明所述的偶聯(lián)物。非限制性例子包括：貝伐單 抗，阿柏西普，西地尼布，索拉非尼，舒尼替尼，凡德他尼，帕唑帕尼，瓦他拉尼，伊馬替尼，西 侖吉肽，血管內(nèi)皮抑素，血小板因子4。特別地，所述抗血管新生藥可以所列例子中的兩種或 多種的任意組合使用。
[0080] 輻射增敏劑代表另一類用于所述偶聯(lián)物的藥物種類，包含根據(jù)本發(fā)明所述的 CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)。非限制性例子為卡鉑，西侖吉肽，CG841251，如MK-1775的星孢菌素衍 生物，4-苯基丁酸鈉鹽，一種包含如莫特沙芬釓化合物的釓，如紫杉醇或多西他賽的紫杉烷 衍生物，或者它們的結(jié)合。
[0081] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或根據(jù)本發(fā)明所述的 ⑶44v5肽的分離的核酸分子。
[0082]在另一方面，本發(fā)明涉及一種表達載體，含有所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)、所述 CD44v5肽或者它們的融合蛋白的核苷酸序列。
[0083]在進一步的另一方面，本發(fā)明提供了一種含有所述表達載體的宿主細胞，所述表 達載體含有所述CD44ex9蛋白質(zhì)、所述CD44v5肽或者它們的融合蛋白的核苷酸序列。
[0084]在一個進一步的實施例中，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)所述⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所 述CD44v5肽的方法，其中，所述方法包含以下步驟：
[0085] 1)采用表達構(gòu)建來轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述表達構(gòu)建包含編碼本發(fā)明所述蛋白質(zhì)或相 應(yīng)的融合蛋白的核酸分子;并且
[0086] 2)在適于生產(chǎn)所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述CD44v5肽的條件下培養(yǎng)所述宿主細 胞。
[0087]在本發(fā)明的一個實施例中，所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述CD44v5肽可被用于診 斷或治療以下疾?。鹤陨砻庖咝约膊。?胰島素依賴型糖尿病，多發(fā)性硬化癥，干燥綜合征 和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);皮膚病，如:牛皮癬或過敏性皮炎;慢性炎癥性疾病，如:類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎或炎癥性腸疾病;組織損傷;變應(yīng)性疾病和癌癥。
[0088]本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述CD44v5肽在診斷或治療炎癥中的應(yīng)用是 基于以下事實，CD44起到引導(dǎo)炎癥細胞達到感染或組織破壞的部位的作用。由此，在活化的 T淋巴細胞、單核細胞或活化內(nèi)皮細胞上的CD44結(jié)合細胞外基質(zhì)組分的透明質(zhì)酸，誘導(dǎo)如 CCR2的趨化因子，然后促進炎性細胞向炎癥部位的迀移(Johnson&Ruffell，2009)。由所述 CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)引起的CD44的阻塞或者由所述CD44v5肽引起的透明質(zhì)酸的封鎖會阻止 這一過程。
[0089]例如，⑶44表達已在具有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人中得到了廣泛的研究，從而，來自具 有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病人的滑液中的單核細胞上的⑶44表達水平已被證實明顯升高。⑶44表 達水平的升高，與炎癥中滑膜炎的程度呈正相關(guān)。進一步地，缺乏CD44的小鼠具有較低等級 的關(guān)節(jié)炎，并且抗-CD44處理被證明有效地降低了動物模型中的關(guān)節(jié)炎程度。因此，本發(fā)明 所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述的CD44v5肽可被用于診斷或治療炎癥。
[0090]在本發(fā)明的一個進一步的實施例中，所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述的CD44v5 肽可被用于生產(chǎn)免疫抑制劑，例如，通過抑制T細胞增殖以阻止移植排異反應(yīng)。
[0091]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述⑶44v5肽可被用 于診斷或治療癌癥。這一優(yōu)選應(yīng)用是基于以下事實，CD44變體包含在癌細胞中已經(jīng)描述了 的v5區(qū)域。
[0092]由于所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)向所述CD44蛋白質(zhì)的v5區(qū)域的特異性結(jié)合，事實結(jié) 合蛋白質(zhì)抑制CD44與各種胞外基質(zhì)蛋白的相互作用，并從而抑制腫瘤細胞的附著、迀移和 轉(zhuǎn)移，并且也可削弱腫瘤細胞的增殖率。
[0093]在一個進一步優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述CD44v5 肽可被用于癌癥干細胞(CSC)的診斷和治療。一個新出現(xiàn)的概念表明，CSC最終確定癌癥治 療的成功與否，由于細胞代表了長期生存下來群體，隨后導(dǎo)致了復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移(Deonarain et al.，2009)。⑶44被顯示在CSC上表達，并為所述長期生存和相應(yīng)腫瘤的轉(zhuǎn)移傾向負責(zé)。作為 一個實施例，乳腺癌的CSC由CD44+/CD24 1?的表達而被表征，CD44+/CD241?論證了 CD44作為 一種有希望的抗CLC-革巴標(biāo)。
[0094]在本發(fā)明的另一個實施例中，本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述CD44v5肽 可被用于診斷或治療慢性淋巴細胞白血病(CLLhZhang等人(2013)的研究表明CLL細胞顯 示出⑶44的高表達，并且進一步地，抗⑶44抗體有效地殺死體外和體內(nèi)的白血病細胞，因 而，在一個移植瘤模型中，腫瘤完全從有機體中消失。
[0095]通過本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述CD44v5肽進行的乳腺癌診斷或治療 由以下事實得以支持，⑶44V5代表了乳腺癌中最豐富表達的⑶44變體（⑶44v5占56 %對 ⑶44v6占24%和⑶44v8占15%)。此外，0044￥5變體的表達與乳腺癌的生存期短有關(guān)：在 CD44v5癌癥病人中的五年存活時間占71%，這與在CD44v5陰性病人中的五年存活時間占 86%相對（Tempfer et al.1996)。
[0096]在一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明所述的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述⑶44v5肽可被用 于診斷或治療結(jié)直腸癌，因為已證明⑶44v5(和⑶44v6)與結(jié)直腸癌中的預(yù)后不良有關(guān)。因 此，在腫瘤樣品中具有較高CD44v5或CD44v6含量的病人有一個明顯縮短的無復(fù)發(fā)生存期 (Vizoso et al.2004)〇
[0097]在另一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明所述的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述⑶44v5肽可被 用于診斷或治療頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)，由于這些腫瘤顯示出CD44的高表達，具有CD44 高表達的亞群對放療和化療較不敏感(La Fleur et al，2012)。
[0098] 在另一個實施例中，本發(fā)明所述的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)并且尤其是所述⑶44v5肽 可被用于診斷或治療黑素瘤，由于體外和體內(nèi)的CD44衍生肽在黑素瘤腫瘤模型顯示出了療 效（Piotrowicz et al,.2011)。
[0099] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)被用于制備造影劑，用于 醫(yī)療用途。
[0100] 在一個進一步優(yōu)選的實施例中，所述造影劑能夠識別出癌細胞或原位癌細胞。
[0101] 在一個特定實施例中，結(jié)合蛋白質(zhì)或任意的衍生物、偶聯(lián)物、融合蛋白質(zhì)或者結(jié)合 到納米顆粒的蛋白，能夠識別選自以下名單中的癌細胞:腺癌細胞，胸腺上皮腫瘤細胞，宮 頸癌細胞，非霍奇金淋巴瘤細胞，肺細胞癌細胞，胰腺癌細胞以及癌癥干細胞。
[0102] 本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)可被結(jié)合至任何種類的納米顆?！，F(xiàn)有技術(shù)中 已知了多種納米顆粒，而本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體的治療或診斷的要求選擇合適類型的 納米顆粒。
[0103] 結(jié)合至所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的納米顆粒的例子為:量子點，貴金屬團簇，超順 磁性氧化鐵納米顆粒（IONPs )，嵌段共聚物膠束，納米細胞，樹枝狀聚合物，納米管，聚合物 囊泡，XPclad?i內(nèi)米顆粒，以及由被結(jié)晶發(fā)光磷酸鈣層包圍著的無定形二氧化硅組成的納 米顆粒(例如，ORMOBEADK.)。
[0104] 0RM0BEAD顆?？梢栽诒砻嫔嫌镁垡蚁﹣啺坊騎RIAM0得到的胺基或者6-氨基己酸 (AHA)或己二酸得到的羧基進行適當(dāng)修飾。這些基團可被偶聯(lián)至本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)。 0RM0BEAD技術(shù)是由Dembski等人(2013)所公開的，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制 備和使用所述納米顆粒的目的。
[0105] 在本發(fā)明的一個實施例中，Si〇2/Zn2Si〇4:Mn2+和 Si〇2/CaiQ(P〇4)6〇H:Eu3+核心-殼納 米顆粒具有小于l〇〇nm的直徑，被作為用于偶聯(lián)至本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)的納米顆粒使用。這 些顆粒由Dembski等人所公開，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用所述納米 顆粒的目的。
[0106] 在另一個實施例中，發(fā)光染料標(biāo)記的混合納米顆?？梢员皇褂?，這些納米顆粒包 含基于Si02的顆?；|(zhì)，具有共價連接的有機熒光物質(zhì)。它們將有機染料分子的光學(xué)特性 與無機顆粒基質(zhì)屬性結(jié)合。因此，它們展現(xiàn)出對光漂白增加的抗性以及降低的染料滲漏。相 應(yīng)的納米顆粒由Probst等人(2012)所公開，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和 使用所述納米顆粒的目的。
[0107] 在另一個實施例中，無鎘量子點可被使用。這些納米顆粒顯示出了在光譜的可見 光和近紅外區(qū)明亮的發(fā)光。相應(yīng)的納米顆粒由Nanoco Technologies Ltd. (Manchester, UK)所公開，并且在 W007/020416，W008/100276，W010/52455，W010/15824，W010/10329 和 W013/93631中被公開，在此對這些專利申請的全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用所 述納米顆粒的目的。
[0108] 在本發(fā)明的一個實施例中，（Π 族合金）i-m-vi族半導(dǎo)體量子點，m-v族量子點 或者如Evident Technologies (Troy，NY, USA)所研發(fā)出的微粉型半導(dǎo)體納米晶體復(fù)合物可 以被使用。這些納米顆粒在冊07/118118,1008/94292，1006/17125或冊05/110916中分別被 公開，在此對這些專利申請的全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用所述納米顆粒的目 的。
[0109] 在另一個實施例中，超順磁性氧化鐵納米顆粒（lONPs)，嵌段共聚物膠束，納米細 胞，樹枝狀聚合物，納米管，聚合物囊泡以及XPclad?納米顆?？梢员皇褂谩Ｏ鄳?yīng)的納米顆 粒被Singh和Li 1 lard (2009)以及Xie等人(2010)所公開，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于 公開制備和使用所述納米顆粒的目的。
[0110] 在本發(fā)明的另一個實施例中，可以使用無鎘納米顆粒，其包括一個被殼區(qū)覆蓋的 核心區(qū)，所述殼區(qū)代表該核心區(qū)的一個抗反射涂層。相應(yīng)的納米顆粒被US 2008/0286826 A1(飛利浦知識產(chǎn)權(quán)及標(biāo)準(zhǔn)部)所公開，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用 所述納米顆粒的目的。
[0111] 在本發(fā)明的另一個實施例中，磁性顆?？梢员皇褂?。所述磁性顆粒特別適用于靶 向藥物遞送。在一個優(yōu)選實施例中，所述磁性顆粒由超順磁性金屬氧化物和/或金屬組成， 并且被本發(fā)明所述的肽所涂覆，并且可選地被一種或多種額外的藥物所涂覆。相應(yīng)的磁性 顆粒被EP1267843 Bl(EUCRO)所公開，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用所 述磁性顆粒的目的。
[0112] 修改后的納米顆粒可優(yōu)選用作體內(nèi)的造影劑，用于檢測CRC細胞。W0 2007/057182 A3公開了有利的納米粒子，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用所述納米顆 粒的目的。所述納米顆粒尤其為那些流體動力學(xué)直徑不超過15納米且在生物系統(tǒng)中非惰性 的納米顆粒。
[0113] 本發(fā)明所述的納米顆?？蛇M一步被偶聯(lián)至至少一種腫瘤抗原結(jié)合物質(zhì)和/或細胞 毒素劑。
[0114] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述納米顆粒被進一步偶聯(lián)至腫瘤抗原結(jié)合物 質(zhì)，所述腫瘤抗原結(jié)合物質(zhì)選自：抗CEA抗體，抗CA-19-9抗體，以及一種粘附素，或者它們?nèi)?意的結(jié)合。
[0115] 在一個優(yōu)選的實施例中，偶聯(lián)至納米顆粒的粘附素在其自身的氨基酸序列中進行 了修飾，并且更優(yōu)選地根據(jù)W0 2009/106102 A1進行了修飾，其通過引用在此并入本文，以 便其公開成為本發(fā)明申請的一部分。
[0116] 本發(fā)明優(yōu)選的納米顆粒包括至少3種結(jié)構(gòu)，即：一種被包含咪唑成分的層涂覆的無 機核心，包含所述咪唑成分的層(在下文中也被稱為"鈍化層"）依次攜帶特異性配體，其中， 所述特異性配體也可為該層的一部分。所述配體導(dǎo)致所述納米顆粒特異性地結(jié)合至生物系 統(tǒng)的靶標(biāo)。
[0117] 在優(yōu)選的納米顆粒中，所述無機核心包括圍繞它的所述鈍化層，具有不超過15nm 的流體動力學(xué)直徑，如果可能，優(yōu)選不超過1 〇nm。特別優(yōu)選的是，流體動力學(xué)直徑不超過8nm 或不超過5nm。這尤其適用于球形納米顆粒。該尺寸的納米顆粒可以通過腎臟消除，因而不 會積累，或者至多在體內(nèi)以可耐受的量積累。這使得體內(nèi)應(yīng)用成為可能。這尤其適用于具有 不超過5nm的流體動力學(xué)直徑的納米顆粒。
[0118] 在一個替代性實施例中，所述納米顆粒也可以是桿狀的。在此實施例中，以下情況 是有利的：該桿的直徑不超過15nm的上述限制。同樣地，優(yōu)選的直徑為5,8或10nm的范圍內(nèi)， 以有助于從體內(nèi)消除。因此，例如，根據(jù)本發(fā)明所述的可使用的納米顆?？删哂?X15nm的 長度/寬度尺寸。
[0119]根據(jù)本發(fā)明所述的可使用的納米顆粒優(yōu)選具有在600至700納米之間波長的最大 發(fā)射光，例如620至660納米，尤其優(yōu)選約625納米或655納米。所述發(fā)射光是容易被人眼所見 的，因此，這種納米顆?？杀恢苯佑米髟煊皠糜卺t(yī)療干預(yù)。因此，在某些情況下可以省去 輔助光學(xué)儀器。
[0120] 在一個替代性實施例中，超出上述流體動力學(xué)直徑的納米顆?？筛鶕?jù)本發(fā)明而被 采用，只要所述顆粒確保在體內(nèi)是非惰性的。后者是所述顆粒為生物可降解的先決條件，因 此，最初被固定在其中的金屬(例如Cd)顆?？杀晦D(zhuǎn)換成離子形式。降解產(chǎn)物可通過腎臟消 除。
[0121] 具有包含咪唑成分的鈍化層的無機納米顆粒在體內(nèi)的確為非惰性的，由于先前已 經(jīng)證明，但是它們在這些條件下被降解。因此，所述納米顆粒符合生物降解性的標(biāo)準(zhǔn)以及降 解產(chǎn)物的腎通路的標(biāo)準(zhǔn)，這對于體內(nèi)應(yīng)用特別相關(guān)。這是一個令人驚喜的發(fā)現(xiàn)，這是因為， 鈍化層尤其還用于增加了納米顆粒的化學(xué)和/或物理穩(wěn)定性(本文中，見下面的附加注釋）。 于是，一方面良好的診斷所需的納米顆粒的穩(wěn)定性與另一方面"大"顆粒腎通路所需的生物 降解性的關(guān)系使得其適合用作體內(nèi)造影劑。
[0122] 鈍化層的主要風(fēng)險在于增加了熒光強度以及無機核心的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。被鈍 化層所涂覆的無機核心由至少10%的量子產(chǎn)率所表征，有利地為至少30%、50%甚至70 %。 此處所述的量子產(chǎn)率指的是由樣品發(fā)出的光的量與由樣品吸收的光的量的比率。有利的 是，所述鈍化層具有不超過lnm的厚度。在這種情況下，所述鈍化的核心的直徑增加不超過 2nm〇
[0123] 有利的是，在不同情況下，所述納米顆粒也提供有修飾劑，特別是用于改善與生物 環(huán)境的相容性。優(yōu)選地，由于使用修飾劑而增加的流體力學(xué)半徑不超過2nm。在特殊情況下， 鈍化層和修飾劑的厚度還取決于這兩個結(jié)構(gòu)彼此之間的與相對于無機核心的關(guān)系。
[0124] 本發(fā)明優(yōu)選使用的納米顆粒，如果如上所述限制其尺寸，特別適于用作活體病人 中的診斷試劑。于是，尺寸的減小增大了擴散和穿透入組織的深度的比率。這就允許納米顆 粒均勻、迅速地分布在生物環(huán)境里，并且在局部給藥后盡可能遠地穿透組織(例如一個腫瘤 組織）。類似地，本發(fā)明所述的納米顆粒允許全身給藥，這也可以通過注射的方式來進行。然 而，局部給藥，例如外用藥或腫瘤內(nèi)或周圍給藥以用于治療腫瘤，也是可能的。
[0125] 本發(fā)明特別優(yōu)選的實施例包括偶聯(lián)至本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的納米顆粒，其具有不超 過8nm的流體動力學(xué)直徑，優(yōu)選不超過4nm。此尺寸順序的納米顆?？赏ㄟ^腎臟排除，從而不 會積累，或者在體內(nèi)累積到一個明顯輕微的程度。其結(jié)果是，本發(fā)明所述的納米顆粒大大減 少了可能與已知的量子點關(guān)聯(lián)的長期毒性的問題。
[0126] 所述納米顆粒有利地發(fā)射的熒光光譜范圍為600-700nm，特別優(yōu)選最大發(fā)光光譜 為600-660nm，尤其優(yōu)選為620-660nm。所述發(fā)光光譜具有非常高的組織傳輸性的優(yōu)點，這是 因為，在一個生命系統(tǒng)中，通過血紅蛋白和其他吸光物質(zhì)(包括水)僅有低的吸收。這些波長 的光仍然可以通過人眼來感測并因此使得負責(zé)治療的醫(yī)生能識別被標(biāo)記的組織而無需任 何其他復(fù)雜的技術(shù)檢測裝置(例如，電荷耦合攝像機）。當(dāng)在手術(shù)介入期間使用本發(fā)明所述 的納米顆粒作為造影劑用于識別CD44，CEA-和/或CA19-9表達細胞的時候，尤其是用于鑒別 致癌和健康組織的時候，這是特別有利的。
[0127] 在一個實施例中，優(yōu)選可以使用的納米顆粒為已知的納米顆粒，具有例如碲化鎘、 硫化鎘或碲化鎘的核心，如US 2004/0247861所述，參照科學(xué)出版物。該印刷出版物還引用 了關(guān)于制備核心材料的文獻，例如引用了US 6,179,912。茲提述了這些文獻中關(guān)于這些已 知的納米顆粒的性質(zhì)及其制備方法的公開的全部內(nèi)容。一種制備納米顆粒的方法也在US 7，147,712B2中被公開，出于公開的目的，該專利也在此進行了引用。
[0128] 特別有利的是，納米顆粒的無機核心主要含有半導(dǎo)體。這些核心發(fā)出各種顏色的 光，取決于各自的大小和/或組成，但是它們在相同的光譜范圍內(nèi)的寬波段進行吸收（紫外 到可見光范圍）。由于高斯托克斯位移，激發(fā)和發(fā)射光譜相距甚遠，這實現(xiàn)了對各種納米顆 粒簡單地且同步地激發(fā)。它們具有窄而對稱的發(fā)射光譜，其稍有重疊或根本沒有重疊。非常 重要的其它有益特性，特別是用于提升濾過深度和體內(nèi)標(biāo)記，為高達80%的高量子產(chǎn)率和 尚耐光性。
[0129] 優(yōu)選的納米顆粒已經(jīng)被公開，例如在W0 2005/001889中。因此，它們包含一種由合 金制成的無機核心，所述合金具有均勻分布的至少兩種半導(dǎo)體，或者在每種情況下存在該 合金中的濃度梯度。關(guān)于所述納米顆粒的性質(zhì)和制備方法的公開，請參考上面所引用的W0 2005/001889。所述核心在尺寸上各自會有約5%的偏差。
[0130] 因此，所述納米顆粒的無機核心可包含至少兩種半導(dǎo)體的合金，其中，所述核心具 有一種均勻的組合物并且通過"頻帶隙能量"被表征，其對于這兩種半導(dǎo)體的摩爾比是非線 性的。
[0131] 可選地，所述核心可為不均勻的，其具有從核心中心到核心表面的濃度逐漸增加 的第一半導(dǎo)體，以及具有從核心中心到核心表面的濃度逐漸減少的第二半導(dǎo)體。
[0132] 對于這兩種內(nèi)核，該半導(dǎo)體中的至少一種為Π -VI族半導(dǎo)體或者m-v族半導(dǎo)體 (此處所述族的定義對應(yīng)于元素周期表中族的定義）。例如，所述合金可以選擇以下物質(zhì)所 組成的組：CdSeTe，CdSSe，CdSTe，ZnSeTe，ZnCdTe，CdHgS，CdHgTe，InGaAs，InGaP，GaAIAs， InGaN。這些核心可進一步承載無機材料涂層，例如，如半導(dǎo)體(例如硫化鋅）。該附加層對于 本領(lǐng)域技術(shù)人員而言被稱為"壓蓋"或"殼"。
[0133] π-VI族半導(dǎo)體和m-V族半導(dǎo)體通常是已知的，例如包括:CdSi-xSe^CdSi-xTex， CdSei-xTex，ZnSei-xTex，Zm-xQlxTe，Qli-xHgxS，Qli-xHgxTe，lm-xGa xAs，Gai-xAlxAs 和 lm-xGaxP〇 優(yōu)選的是使用以下半導(dǎo)體：CdSei-xTe x，CdSi-xTex，ZnSei-xTe x，Zm-xCdxTe，CcU-xHgxS，CcU- xHgxTe，lm-xGaxAs，lm-xGaxP，其中，x = 0_l。
[0134] 半導(dǎo)體的摩爾比可為任意的摩爾比。然而，如果所述合金包含CdSSe，優(yōu)選為具有 CdSi-xSex分子式的合金。如果該合金包含(MSTe，優(yōu)選具有QlSi-xTex分子式的合金。如果該合 金包含ZnSeTe，優(yōu)選具有ZnS ei-xTex分子式的合金。如果該合金包含ZnCdTe，優(yōu)選僅具有 CdTe分子式的合金。在上述每種情況下，x = 〇-l。
[0135] 所述納米顆粒的這些優(yōu)選的無機核心，可通過使用如下步驟制備：（i)在形成納米 晶體的條件下制備第一溶液；（ii)在不形成納米晶體的條件下制備第二溶液，所述第二溶 液包含具有一定摩爾比的半導(dǎo)體前體；（iii)將所述第二溶液添加至所述第一溶液中，這使 得納米顆粒形成；以及(iv)更改條件，使得納米晶體的生長和形成均停止。制備核心的方法 如W0 2005/001889所述，該專利申請被引用，關(guān)于本發(fā)明所述的納米顆粒的無機核心的此 優(yōu)選實施例的制備的公開。
[0136] 在一個替代性實施例中，所述無機核心可主要包含貴金屬團簇，其優(yōu)選包括2和27 個貴金屬原子。在一個優(yōu)選實施例中，所述貴金屬選自：金，銀，銅，鉑，鈀，鋨，銥，釕和銠。該 團族可具有不同的電荷。
[0137] 這些核心具有以下優(yōu)點，通過使用弱汞燈激發(fā)，它們可以作為單獨的"納米點"而 很容易地被檢測到，由于它們的強大的吸收和發(fā)射。含有這些核心的本發(fā)明所述的納米顆 粒可有利地用作單獨分子熒光標(biāo)記和質(zhì)量標(biāo)記。
[0138] 術(shù)語"貴金屬"指的是選自金，銀和銅，和鉑族金屬(PGM)，鉑，鈀，鋨，銥，舒和銠的 一組元素。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述貴金屬選自：金、銀和銅。在一個特別優(yōu)選的實施 例中，所述貴金屬為銀或金。
[0139] 術(shù)語"團簇"是指金屬的2-27個原子的化合物。團簇尤其可從化學(xué)催化，陶瓷，半導(dǎo) 體技術(shù)，材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域中知曉。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知它們的制備方法。W0 2004/ 003558特別描述了貴金屬團簇的制備，并且另外含有關(guān)于這個問題的進一步廣泛引用。更 具體的是，它公開了與有機分子關(guān)聯(lián)的貴金屬納米團簇的制備。此處所述的術(shù)語"關(guān)聯(lián)"指 的是任何形式的結(jié)合，獨立的化學(xué)或物理性的結(jié)合（因此，例如，共價的，非共價的，靜電或 范德華力結(jié)合）。關(guān)于作為本發(fā)明所述的納米顆粒的核心納米團簇的制備，被引用在W0 2004/003558 中。
[0140] 根據(jù)本發(fā)明所述的優(yōu)選可使用的納米顆粒具有一鈍化層，其增加了熒光強度并且 改善了所述無機核心的化學(xué)和物理穩(wěn)定性。因此，該納米顆粒發(fā)光具有大于10%的量子產(chǎn) 率，優(yōu)選大于50 %。
[0141]優(yōu)選的所述納米顆粒在4°C的含水環(huán)境中具有至少12個月的儲存穩(wěn)定性，如果可 能，穩(wěn)定于pH值為5-10的pH環(huán)境中，優(yōu)選pH值為7-10,即就其特定的光譜特性而言它們表現(xiàn) 出小于50%的偏差，所述光譜特性如量子產(chǎn)率，最大發(fā)射的位置，發(fā)光光譜的半峰寬。就這 些特定的光譜特性而言，優(yōu)選的顆粒展現(xiàn)出小于10%的偏差。
[0142] 根據(jù)本發(fā)明的另一個實施例，還在生物條件（即生理條件）下或體內(nèi)，所述可用的 納米顆粒在一段至少三天時間內(nèi)基本上展現(xiàn)出所述核心的屬性的一個恒定性/穩(wěn)定性(包 括圍繞它的鈍化層）。優(yōu)選的顆粒在7-14天內(nèi)展現(xiàn)出此類恒定性/穩(wěn)定性，其中，通過穩(wěn)定性 的方法保留了屬性的至少50%的恒定性。此信息尤其是指所述納米顆粒在實際的靶器官中 的穩(wěn)定性。值得注意的是，主要有代謝功能的器官中的納米顆粒的穩(wěn)定性可能明顯不太穩(wěn) 定(例如在肝臟中）。這甚至可以是明確地期望的。
[0143] 雖然所述納米顆粒在上述情況下是穩(wěn)定的，但它們卻在活體內(nèi)發(fā)生根本降解，因 此它們是非惰性的。從這個意義上來說，"非惰性"的意思是，在12周以上或更多用藥后，至 少50%的納米顆粒已被分解。優(yōu)選的是，在8、6或4周后，至少50%的已發(fā)生的降解是可檢測 的。殘留在體內(nèi)的顆粒的檢測包括人體器官內(nèi)的檢測和為此目的的等離子體中的檢測。因 此，"惰性"的意思是，在給藥4周后，大于50%甚至多達近100%的顆粒仍然在病人體內(nèi)可檢 測到。納米顆粒的降解可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的分析方法進行檢測，即例如通過電 感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS)，如果樣品合適，該分析還可以通過熒光光譜法測量進行 補充。
[0144] 所述鈍化層包含至少一種咪唑成分。這種化合物能夠配位金屬原子或金屬離子， 例如鋅離子、鎘離子或汞離子。在一個優(yōu)選實施例中，咪唑基團基于分子的結(jié)構(gòu)而位于末端 位置。所述鈍化層可進一步具有交聯(lián)劑，或者環(huán)狀的或線性的咪唑成分也可以用作交聯(lián)劑。 所述交聯(lián)劑可以是堿性的。
[0145] 通過螯合、配合的方式或路易斯堿的電子供體特性，含有金屬原子或金屬離子的 配位化合物可功能性結(jié)合至熒光無機核心，并且具有相應(yīng)的偶聯(lián)部分/基團。所述分子可進 一步包含將潤濕性或溶解性給予在水溶液中的所述核心的部分，所述核心涂覆有這些分 子。
[0146] 所述咪唑成分適當(dāng)?shù)赜伸⒒衔锝宦?lián)，優(yōu)選為烷基膦化合物。
[0147] 術(shù)語"咪唑成分"指的是，為了本發(fā)明所述的目的，一種雜環(huán)基或雜芳基分子，其含 有至少一個咪唑基(包括咪唑衍生物），并且其可用于結(jié)合所述無機核心或所述鈍化層，具 有金屬如鎘，鋅，鎵，或金屬陽離子或者含有這種陽離子的基質(zhì)。在這種情況下，優(yōu)選的至少 一個咪唑基應(yīng)當(dāng)基于分子的結(jié)構(gòu)而位于末端位置。以其功能形式存在的所述咪唑成分通過 環(huán)進行結(jié)合至熒光納米晶體，所述環(huán)含有離域分子軌道。一般地，咪唑環(huán)的氮原子作為配合 的配體以功能性地結(jié)合金屬離子，如鎘或鋅。
[0148] 在一個實施例中，所述咪唑成分包含反應(yīng)性官能團，如一個或兩個氨基酸，例如組 氨酸，肌肽，鵝肌肽，巴萊納，高肌肽，組氨酸苯基丙氨酸，環(huán)組氨酰苯丙氨酸，4-氨基-5-咪 唑甲酰胺，組氨酰亮氨酸，2-巰基咪唑，B0C-組氨酸，酰肼，組氨酸，1-甲基組氨酸，3-甲基組 氨酸，咪唑烷，含咪唑的鳥氨酸(例如5-甲基咪唑），含咪唑的丙氨酸(例如，β- (2-咪唑基)- l-α丙氨酸），CarZinine，組胺。這些基于組氨酸的分子或包含咪唑的氨基酸可以通過一般 已知的方法合成。
[0149] 術(shù)語"膦"指的是，為了本發(fā)明所述的目的，一種具有至少一個膦基團（包括它們的 衍生物）的分子，用于結(jié)合或螯合非金屬，如Se，S或者其他非金屬或含有這些原子的基質(zhì)， 并且其提供了至少一個官能團（例如羥基，氨基，巰基，羧基，甲酰胺基等）用于與相鄰分子 發(fā)生反應(yīng)。
[0150] 在本發(fā)明所述的一個優(yōu)選實施例中，所述咪唑成分是一種肽，含有至少一個組氨 酸殘基，并且優(yōu)選為一種含有一個或多個組氨酸殘基的二肽。
[0151] 在一個進一步優(yōu)選的實施例中，所述咪唑成分是含組氨的不同二肽的混合物。優(yōu) 選地，基于分子的結(jié)構(gòu)，至少一個膦基團應(yīng)當(dāng)位于末端位置。膦部分作為配位配體，以其功 能形式結(jié)合熒光核心或來自屏蔽層的化合物、非金屬或離子，如Se或S。
[0152] 在一個優(yōu)選實施例中，所述包含膦的化合物包括一個、兩個或多個彼此偶聯(lián)的膦 基（例如以聚合形式），其可包括但不限于羥甲基膦化合物或其類似物。所述包含膦的化合 物可通過一般已知的方法合成。此外，含有烷基膦的混合物被已知還可能具有一個或多個 另外的官能團（例如羥基，氨基，巰基，羧基，甲酰胺基等）。衍生物的例子為羥甲基膦衍生 物、酰胺或酯，只要所述衍生與本文中所述的作為膦涂覆的功能相兼容。
[0153]特別優(yōu)選的是三(羥甲基)膦和3-[三(羥甲基)膦基]丙酸，用于涂覆本發(fā)明所述的 納米顆粒的熒光無機核心。交聯(lián)的含膦化合物是公知的另外能夠功能性地結(jié)合至金屬原子 和/或離子，如Zn或Cd。在這方面官能化的異氰酸酯或氰基丙烯酸烷基酯可進一步被作為交 聯(lián)劑，用于配體以及與熒光核心的加成物的形成。所述交聯(lián)劑也可以是堿性的。
[0154] 本發(fā)明所述的鈍化層存在的鈍化效應(yīng)是基于表面鎘或鋅原子或類似物的屏蔽作 用，通過與咪唑成分形成復(fù)合物的形成，并且基于反原子（Se或S)的屏蔽作用，通過與含膦 的化合物形成復(fù)合物的形成。
[0155] 本發(fā)明所述的納米顆粒的鈍化層已被US 2004/0247861 A1公開。該公開申請描述 了涂覆有鈍化層的無機核心的制備，例如量子點。出于公開本發(fā)明所述的采用的鈍化層及 涂覆著該鈍化層的無機核心的制備方法的目的，US 2004/0247861 A被引用了。
[0156] 所述鈍化層的分子可以進一步具有或承載為了結(jié)合并交聯(lián)目標(biāo)分子和細胞(特異 性配體）的化學(xué)基團。在適當(dāng)合適的試劑存在下，如ZnS0 4和Na2S，所述分子或化合物可形成 一種鈍化層，具有在所述熒光核心上的分子（"壓蓋"或"殼"）。
[0157] 這些試劑也可功能性地結(jié)合至所述熒光納米晶體表面的原子或離子，并因此，此 額外的鈍化層也可直接形成于所述核心的表面。
[0158] 在一個有利的實施方案中，本發(fā)明所述的納米顆?？闪硗饩哂行揎梽?，其包含有 機和/或無機部分。它們被用于提升所述納米顆粒在液體或懸浮介質(zhì)中，特別是在生理環(huán)境 中的相容性、功效和/或溶解性。表面修飾特別有利于實現(xiàn)非常低的非特異性吸附和增加的 生物系統(tǒng)中的兼容性，尤其是在人體中的兼容性。
[0159] 一種可能性為用聚乙二醇(PEG)修飾表面，聚乙二醇已被批準(zhǔn)用于特定醫(yī)療應(yīng)用， 特別是以低分子量形式用于所述納米顆粒，以保持整體尺寸較小。于是，所述納米顆粒的生 物相容性和血液循環(huán)時間以及進入細胞的攝取效率可被提升。將低分子量PEG層與如維生 素的其它物質(zhì)接合，例如葉酸，可以獲得所述納米顆粒向巨噬細胞中較低的攝取，這是因為 吸收于所述納米顆粒的由此減少了的蛋白質(zhì)，通過免疫系統(tǒng)使得所述納米顆粒的識別更加 困難。
[0160] 通過修飾劑進行的另一種可能有利的表面修飾是用單糖、二糖或三糖以低分子量 多糖的形式涂覆，所述低分子量多糖由單糖或不同的單糖組成。一個可能的發(fā)展類型為采 用多聚葡萄糖進行修飾，例如，其中可使用右旋糖苷，所述右旋糖苷已被醫(yī)學(xué)證明作為血液 代用品。其表現(xiàn)出良好的生物相容性/耐受性。另一個實施例是，為了抵消可能的降解而使 用糖類的立體異構(gòu)體形式(D型和L型）。
[0161] 另一個實施例為使用生物相容的親水性維生素作為修飾劑，例如硫胺素，核黃素， 煙酸，吡哆醇，鈷胺素，泛酸，抗壞血酸和葉酸。于是，例如葉酸可導(dǎo)致納米顆粒優(yōu)選地結(jié)合 至癌細胞。此維生素僅展現(xiàn)出低免疫原性，因此具有很高的生物相容性。結(jié)合到膜結(jié)合葉酸 受體有助于納米顆粒的內(nèi)化。
[0162] 表面修飾也可能采用親脂性維生素，如視黃醇，膽鈣化留醇，生育酚和葉綠醌。于 是，例如維生素 E能夠增加納米顆粒的細胞攝取。
[0163] 脂肪酸，例如1-十八烯或18-甲基二十烷酸及其衍生物，可增加膠體的溶解性和穩(wěn) 定性，并且具有一末端官能羧基，其可被用于隨后結(jié)合特異性配體。因此，可以采用脂肪酸 作為修飾劑。
[0164] 表面修飾的另一個實施例是具有多元醇的涂層，所述多元醇例如為二甘醇(DEG)， 其特別有利于減少非特異性蛋白質(zhì)吸收。這同樣適用于聚四氟乙烯(PTFE，鐵氟龍），尤其是 以其低分子量的形式，其可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)吸收的減少。聚四氟乙烯在心臟外科手術(shù)中得以 頻繁使用。
[0165] 表面修飾同樣可以通過使用一種或多種天然存在的氨基酸實施，所述氨基酸包括 蛋白原和非蛋白原氨基酸以及合成的氨基酸。兩種立體異構(gòu)體(D型和L型）都可在此處被使 用。上述氨基酸的二肽，三肽，四肽直至小的多肽幾乎不刺激免疫系統(tǒng)且因此同樣適合于薄 兼容層。它們可以是人造的氨基酸序列以及來自生物蛋白質(zhì)的氨基酸序列。天然蛋白質(zhì)的 肽衍生物，例如植物螯合肽，同樣可用于表面修飾。采用Tat肽與含有Tat肽的多肽的表面修 飾是使得納米顆粒適用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的另一種可能。所述Tat肽是一種有效分子，例 如，用于通過細胞膜遞送金納米顆粒并一路進入細胞核。
[0166] 可能的修飾劑的另一個實施例為磷酰膽堿涂層的形成。磷酰膽堿減少了可能的非 特異性蛋白質(zhì)吸收，例如在隱形眼鏡上。由于它的不形成血栓的性質(zhì)，一種磷酰膽堿修飾可 以容易地在生物系統(tǒng)中被實施，并且通過高儲存穩(wěn)定性而被區(qū)分。由于聚乳酸酯是生物相 容性的，這種物質(zhì)在多種醫(yī)療應(yīng)用中得以使用。更具體地，聚乳酸酯的低分子量形式構(gòu)成了 本發(fā)明所述的納米顆粒的表面修飾的另一種可能。為了減少可能的生物降解，這兩種立體 異構(gòu)體(D型和L型)都可在此處被使用。
[0167] 除了所述表面修飾以外，非特異性蛋白質(zhì)的向納米顆粒的蛋白水解剪切結(jié)合也是 可能的。這可增加生物相容性/兼容性。在目標(biāo)位置，大分子蛋白質(zhì)可用被釋放在組織中的 小納米顆粒去除。所述去除也可在適當(dāng)?shù)耐Ａ魰r間之后發(fā)生。適合于此的優(yōu)選為常用的蛋 白質(zhì)，除了降低非特異性吸收的其它蛋白質(zhì)以外，例如可以為轉(zhuǎn)鐵蛋白，乳鐵蛋白，血漿銅 藍蛋白，彈性蛋白和白蛋白。因此，由結(jié)合有彈性蛋白的多肽組成的表面涂層可阻止不想要 的血塊形成，并因此增加所述納米顆粒的生物相容性。
[0168] 主要的血清蛋白白蛋白可減少與質(zhì)膜的非特異性相互作用。此外，適當(dāng)修飾的納 米顆粒保留了與靶標(biāo)分子發(fā)生特異性相互作用的能力，其通過特異性配體同時結(jié)合到顆粒 表面。具有血清白蛋白的涂層可在靜脈注射后通過防止巨噬細胞快速吸收而引起一個基本 上更長的血液循環(huán)時間，所述血液循環(huán)時間比未涂覆的納米顆粒的情況下要長。導(dǎo)致擴散 率和所述灌注較高的降低的流體動力學(xué)直徑與上述屬性和改進以及高熒光強度、尤其是在 可見紅光范圍內(nèi)的熒光強度的一并結(jié)合致使本發(fā)明所述的納米顆粒成為一種簡單的診斷 試劑，其可以許多不同的方式被用于選擇性地和準(zhǔn)確地辨別體內(nèi)的組織形式。這些可能性， 與抗原特異性生物標(biāo)記物相結(jié)合，特別用于識別⑶44V5，CEA-和/或CA19-9表達細胞，尤其 是用于從正常組織中區(qū)分異常的（預(yù))致癌組織，在外科介入期間，為幫助更精確的腫瘤切 除術(shù)協(xié)助視覺評估。
[0169] 因此，本發(fā)明所采用的創(chuàng)造性的納米顆粒作為造影劑使用。這尤其適用于癌癥的 診斷和手術(shù)中。
[0170] 承載有本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的納米顆粒，可在活體內(nèi)采用或者離體 采用，亦或作為體內(nèi)診斷試劑，治療診斷劑和/或治療劑。出于此目的，它們可被局部給藥 (例如，瘤內(nèi)注射，肌肉注射，或者通過手術(shù)抵達組織/器官）或者也可以全身給藥(例如，通 過靜脈注射）。局部給藥或外部給藥可通過液體，噴霧溶液，泡沫，膏或有效貼劑而被提供。 這可以特別優(yōu)選用于空腔器官的治療/診斷，所述空腔器官如在腸癌的情況下。也可能采用 口服，例如，糖漿或以片劑或膠囊的形式。吸入劑(例如噴霧劑）同樣也是可能的。在一種變 體中，所述納米顆?？梢运幬飪Υ鎺斓男问蕉恢踩搿?br>[0171 ]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)可用于革E1向藥物遞送。在 本發(fā)明的文本中，靶向藥物遞送被定義為在所關(guān)注的組織中濃縮藥物的一種方法，同時降 低該藥物在剩余的組織中的相對濃度。出于此目的，所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)單獨或作為一 種融合蛋白或偶聯(lián)物(優(yōu)選偶聯(lián)至納米顆粒)被結(jié)合至藥物遞送媒介。存在本領(lǐng)域技術(shù)所知 的各種類型的藥物遞送媒介，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體的目的而進行選擇，例如高 分子膠束，脂質(zhì)體，基于脂蛋白的藥物載體，納米藥物載體，樹形載體等等。一種理想的藥物 遞送媒介必須是無毒的，生物相容的，非免疫原性的，可生物降解的，并且避免被宿主的防 御機制所識別。
[0172] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，包含脂質(zhì)衍生雙膦酸的脂質(zhì)體可被用于靶向給 藥，特別適用于向骨骼結(jié)構(gòu)給藥。各種脂質(zhì)衍生雙膦酸被W0 2005/070952 A2(MCS Micro Carrier Systems GmbH)所公開，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用所述雙 膦酸的目的。
[0173] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)可被作為離體 或體外診斷試劑使用。體外或離體診斷用途涉及到源自病人的樣品內(nèi)所述CD44v5蛋白質(zhì)的 檢測。待分析的樣品可以是任何類型的，包括組織，器官，以及由此所得的活組織切片或體 液，如:血液，血清，尿，唾液或腦液。
[0174] 為了診斷用途，所述⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)被標(biāo)記用于檢測。合適的標(biāo)記均是現(xiàn)有技 術(shù)中已知的，并且包括染料，如發(fā)光或熒光染料，放射性同位素，酶，蛋白質(zhì)標(biāo)簽，如:FLAG標(biāo) 簽，GST標(biāo)簽，MBP標(biāo)簽或組氨酸標(biāo)簽，或者納米顆粒。
[0175] 為了并入一種標(biāo)記，許多現(xiàn)有技術(shù)中的方法均是已知的，它們依賴于巰基，胺基， 或羧基的隨機修飾。可替代地，基因工程可用于引入或除去額外的活性基團，如半胱氨酸殘 基。
[0176] 作為一種替代性方法，短肽標(biāo)記可被粘附至用作標(biāo)記受體位點的蛋白質(zhì)。這樣，標(biāo) 記既通過該標(biāo)記的固有活性也通過反式提供的酶的活性而被粘附。所述活性相關(guān)的標(biāo)記的 例子包括位點特異性生物素酰化，如由生物素全酶合成酶BirA所媒介的那樣，其允許標(biāo)記 的蛋白質(zhì)與眾多抗生物素蛋白/鏈霉親和素試劑相結(jié)合。融合到LUMI0標(biāo)簽(含四半胱氨酸 基序的一種六肽)的蛋白質(zhì)可通過包含兩個砷原子的染料直接染色。
[0177] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，人類DNA修復(fù)酶06-烷基鳥嘌呤DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶 (AGT，也稱為SNAP標(biāo)簽）的工程改造的版本被融合到所述⑶44ex結(jié)合蛋白質(zhì)。含有06-芐基 鳥噪呤的基質(zhì)，以快速和高度特異性的自標(biāo)記反應(yīng)，通過穩(wěn)定的硫醚鍵被共價結(jié)合到所述 融合蛋白質(zhì)。所述標(biāo)記技術(shù)與其為了診斷目的的用途，被Kampmeier等人(2009)和Xie等人 (2010)公開，在此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用所述標(biāo)記的目的。
[0178] 在一個優(yōu)選實施例中，所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)被結(jié)合至納米顆粒。各種類型的納 米顆粒均是現(xiàn)有技術(shù)已知的，并且也在本申請中被公開。
[0179] 在一個進一步優(yōu)選的實施例中，所述標(biāo)記的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)，其被優(yōu)選結(jié)合至 納米顆粒，被包含在水浸泡浴中。通過將樣品浸漬入浸泡浴，所述標(biāo)記的CD44ex9結(jié)合蛋白 質(zhì)將特異性地標(biāo)記該樣品的CD44v5蛋白質(zhì)，其可直接由研究者進行目測評估。該方法特別 適用于外科手術(shù)，從而提取的組織可在手術(shù)期間分析腫瘤標(biāo)記物的存在。因此，外科醫(yī)生對 腫瘤切除的準(zhǔn)確性具有一個即時反饋。
[0180] 用在本發(fā)明中的術(shù)語"診斷試劑"是"造影劑"的同義詞，即它被用于生物系統(tǒng)中 的，尤其是活人的形態(tài)和功能結(jié)構(gòu)的可視化識別，以協(xié)助醫(yī)學(xué)介入。
[0181] 所述納米顆?？杀挥米髟\斷試劑，尤其是用在手術(shù)治療中。它們同樣可在微創(chuàng)方 法中使用(例如，內(nèi)窺鏡，腹腔鏡）。與影像學(xué)檢查方法的結(jié)合(如PET，MRT，CT等)是值得的。
[0182] 如上所述，根據(jù)本發(fā)明所述以局部給藥的形式進行的應(yīng)用是特別有利的。為此進 行局部給藥所采用的Cd的量最好不超過總攝入量的十分之一，所述總攝入量通常無論如何 都會在人生過程中積累于老齡的和異常生活方式的人的肝臟和腎臟。這些器官的總攝入量 約為18mg。因此，在局部給藥時限制納米顆粒的量是有利的，以便供應(yīng)的Cd的量至少基本上 不超過2mg。在一個特別優(yōu)選的實施例中，腫瘤可視化是可能的，即使使用造影劑的量不超 過0.6mg鎘總量，特別優(yōu)選0.2mg鎘總量。
[0183] "局部給藥"是指出于本發(fā)明的目的而進行的任何給藥，其中，造影劑增加的量或 劑量可在身體的不同區(qū)域被預(yù)知，這取決于給藥的方式。相應(yīng)地，如果給藥人員采取相應(yīng)的 措施，所述造影劑的血管給藥也是一種局部給藥，所述措施例如為將繃帶綁定至傳入或傳 出血管以阻止造影劑以基本上無阻礙的方式在身體的整個血液循環(huán)系統(tǒng)中傳播。
[0184] 因而，該實施例的特殊優(yōu)點為在活人中的醫(yī)用納米顆粒的應(yīng)用也是可能的，因為 不然一一即作為全身給藥一一這將被排除，由于與之相關(guān)的毒性。這是因為局部給藥減少 了足夠可視化所必須的納米顆粒的劑量。
[0185] 據(jù)報道，根據(jù)本發(fā)明所述的含Cd的造影劑被優(yōu)選用于，以對應(yīng)于每cm3腫瘤組織而 采用0.002-0.02mgCd的劑量，在活體內(nèi)可視化腫瘤。按照0.002-0.015mg Cd/cm3腫瘤組織 而采用的造影劑的劑量是特別有利的，特別是按照0.002-0.OlOmg Cd/cm3腫瘤組織。采用 該有利的劑量可能以多達150cm3的活體內(nèi)體積來可視化腫瘤，從而無需超過對人類而言的 暴露的正?？山邮艿纳舷?。特別優(yōu)選以多達50cm 3的體積實施腫瘤的可視化。
[0186] 調(diào)查可能涉及病人的所有可接觸的組織/器官，尤其是在皮膚中，中空器官中（例 如，胃腸，泌尿生殖器官，呼吸道)或者感覺器官的其它從外部接觸的區(qū)域以及心血管系統(tǒng)。
[0187] 作為一種體外診斷試劑使用也是可能的，例如，免疫組織化學(xué)或FACS和ELISA。體 內(nèi)和體外診斷(例如，活檢標(biāo)本)的結(jié)合是特別有利的。
[0188] 根據(jù)本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)可保持結(jié)合到所述納米顆粒，或者可以是 可拆卸的、或可檢測的、或可釋放的。
[0189] 在另一方面，本發(fā)明提供了下表所列出的⑶44v5肽，并且指定為SEQ ID N0:11-38。這些肽為12個重復(fù)單元，具有覆蓋人類⑶44基因的整個v5區(qū)域的重疊的序列。
[0190]

[0191] 在一個實施例中，本發(fā)明還涉及一種被指定為如SEQ ID NO: 11-38的肽，其在N-末 端和/或C-末端缺失一個、兩個或三個氨基酸。
[0192] 在另一個實施例中，本發(fā)明還涉及被指定為如SEQ ID N0:11-38的肽，其在N-末端 和/或C-末端延伸一個、兩個或三個氨基酸，從而，這些額外的氨基酸為那些相應(yīng)的⑶44v5 氨基酸序列。
[0193] 在一個優(yōu)選實施例中，所述肽可被用于阻斷本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)。由 于這種拮抗活性，這些肽可被用于驗證CD44在體外、離體或體內(nèi)標(biāo)記的特異性。
[0194] 此外，所述肽可被用作所述⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的治療用途的拮抗劑。在本文中， 肽可被用于調(diào)節(jié)、削弱或抵消CD44ex9相關(guān)治療的效果。
[0195] 在治療環(huán)境中，本發(fā)明所述的⑶44v5肽可直接連接至所述⑶44受體的內(nèi)源性配 體。這可導(dǎo)致這些配體的中和(使得它們不能被CD44受體所利用)并且也可導(dǎo)致被巨噬細胞 迅速清除。
[0196] 在本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施例中，為了刺激個體的免疫系統(tǒng)，根據(jù)SEQ ID NO: 11-38序列的這些肽中的一種或多種可被用作一種疫苗抵抗所述⑶44變體表達所述v5-區(qū)域。作為疫苗，所述肽可被用于預(yù)防癌癥或者用于癌癥的免疫療法。
[0197] 由于兩者雜交篩選的成果，導(dǎo)致了所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的識別，各個肽作為免 疫相關(guān)的表位而已經(jīng)得到了驗證。因此，它們適合于用作疫苗。
[0198] 本發(fā)明的另一方面還提供了一種疫苗組合物，包含一種根據(jù)SEQ ID N0:11-38序 列的分離的蛋白質(zhì)或其肽片段，或者一種編碼所述蛋白質(zhì)或所述肽片段的核酸，用作一種 預(yù)防或治療癌癥的藥劑。
[0199] 在另一方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，包含本發(fā)明所述的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì) 或⑶44v5肽，或者標(biāo)記的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或⑶44v5肽，其優(yōu)選連接至納米顆粒，以及一 種藥學(xué)上可接受的載體。
[0200] 由于本發(fā)明所述的肽是相對小的分子，其可在這種組合物中被要求結(jié)合所述肽和 各種物質(zhì)，如佐劑，以生產(chǎn)疫苗、免疫原性組合物等。廣義定義的佐劑是促進免疫應(yīng)答的物 質(zhì)。通常情況下，選擇的佐劑為弗氏完全佐劑或不完全佐劑，或者滅活的百日咳桿菌有機 體，例如與明鞏沉淀抗原聯(lián)合使用。助劑的一般性討論被Goding，Monoclonal Antibodies: Principles&Practice(第61-63頁，1986年第二版)所提供。根據(jù)Goding所述，當(dāng)目標(biāo)抗原為 低分子量的或免疫原性差的時候，推薦偶聯(lián)到免疫原性載體。這種載體分子的例子包括:匙 孔血藍蛋白，牛血清白蛋白，卵清蛋白和家禽免疫球蛋白。各種皂苷提取物也已被建議用作 免疫原性組合物中的佐劑。最近，W0 97/28816已經(jīng)提出使用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因 子(GM-CSF)，即一種公知的細胞因子作為助劑的建議。
[0201] 根據(jù)本發(fā)明所述的疫苗組合物優(yōu)選含有一種佐劑和/或一種載體。有用的佐劑和 載體的例子示例如下。
[0202] 于是，存在于所述組合物中的所述CD44v5肽或其肽片段可與例如為一種蛋白質(zhì)的 載體相關(guān)聯(lián)，或者與抗原呈遞細胞相關(guān)聯(lián)，所述抗原呈遞細胞例如為樹突狀細胞(DC)，能夠 將所述CD44v5肽或其片段遞送給T細胞。
[0203] 佐劑為其混合成疫苗組合物可提升或相反地修飾對本發(fā)明所述CD44v5蛋白質(zhì)的 免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。載體為支架結(jié)構(gòu)，例如，多肽或多糖，所述CD44v5肽或其片段能夠連 接至所述多肽或多糖上。
[0204] 例如，佐劑可選自以下物質(zhì)所構(gòu)成的組:AIK(S〇4)2，AINa(S〇4)2AINH4(S〇4)，二氧化 硅，明礬，AI (0H)3，Ca3(P〇4)2，高嶺土，碳，氫氧化鋁，胞壁酰二肽，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨 酰-D-異谷酰胺(thr-DMP)，N-乙?；?nornuramy 1-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(CGP 11687，也被 稱為nor-M0P)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺?；?L-丙氨酸-2-0-2'_二棕櫚酰 基-sn-丙三氧基-3-羥基苯磷酰)-乙基胺(CGP 19835Α，也被稱為ΜΤΡ-ΡΕ)，2%角鯊烯/吐溫 80-RTM-乳液中的RIBI (MPL+TDM+CWS)，脂多糖及其各種衍生物，包括脂質(zhì)A，弗氏完全佐劑 (FCA)，弗氏不完全佐劑，默克佐劑65，多核苷酸(例如，聚1C和聚AU酸），源自結(jié)核分枝桿菌 的蠟〇,肺結(jié)核，短小棒狀桿菌中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，百日咳桿菌，以及布魯氏菌屬成員，脂質(zhì)體或 其它脂質(zhì)乳劑，Titermax，ISC0MS，奎爾A，ALUN(參見US58767和5，554，372)，脂質(zhì)A衍生物， 霍亂毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基質(zhì)或GMDP，白細胞介素1，白細胞介素2， 的Montanide ISA-51以及QS-21。與本發(fā)明共同使用的優(yōu)選佐劑包括基于油/表面活性劑的 佐劑，如Montanide佐劑(來自Seppic，比利時），優(yōu)選為Montanide ISA-51。其它優(yōu)選的佐劑 為基于細菌DNA的佐劑，如包括CpG寡核苷酸序列的佐劑。其它優(yōu)選的佐劑是基于病毒dsRNA 的佐劑，如聚1:C咪唑喹啉是優(yōu)選佐劑的另一例子。此外，優(yōu)選的佐劑為脂質(zhì)體。最優(yōu)選的佐 劑為適于人類使用的佐劑。
[0205] Montanide佐劑（全來自 Seppic，比利時）可選自：Montanide ISA-51，Montanide ISA-50,Montanide ISA-70,Montanide ISA-206,Montanide ISA-25,Montanide ISA-720, Montanide ISA-708 ,Montanide ISA-763A,Montanide ISA-207 ,Montanide ISA-264, Montanide ISA-27，Montanide ISA-35，Montanide ISA 51F，Montanide ISA 0160和 Montanide IMS，優(yōu)選自：Montanide ISA_51，Montanide IMS和Montanide ISA-720,更優(yōu)選 自：Montanide ISAHMontanide ISA_51(Seppic公司）是基于油/表面活性劑的佐劑，其 中，不同的表面活性劑與一種不可代謝的礦物油、一種可代謝的油或二者的混合物相結(jié)合。 它們優(yōu)選被用作一種具有水溶液的乳液，包含所述CD44v5肽或其片段。所述表面活性劑為 二縮甘露醇油酸酯。〇S-21 (Antigenics ;Aquila Biopharmaceuticals，F(xiàn)ramingham，MA)是 一種高度純化的水溶性的皂素，作為水溶液處理。OS-21和Montanide ISA-51佐劑可以無菌 的單次使用的小瓶的形式被提供。
[0206] 根據(jù)本發(fā)明所述的疫苗組合物可包含多于一種的不同佐劑。此外，本發(fā)明涵蓋了 進一步包括任何佐劑物質(zhì)的治療性組合物，所述任何佐劑物質(zhì)包括上述任一種或它們的組 合。也可以預(yù)期的是，所述CD44v5或其片段，以及所述佐劑可以任何適當(dāng)?shù)捻樞騿为毥o藥。
[0207] 載體可以是獨立于佐劑存在的。例如，載體的功能可以是增加所述肽或其片段的 分子量，以便提高它們的活性或免疫原性，以賦予穩(wěn)定性，增加生物活性，或者增加血清半 衰期。另外，一種載體可有助于將CD44v5肽或其片段遞送至T細胞。所述載體可以是本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的任何合適的載體，例如蛋白質(zhì)或抗原呈遞細胞。一種載體蛋白質(zhì)可以是但 不限于:匙孔血藍蛋白，如轉(zhuǎn)鐵蛋白之類的血清蛋白，牛血清白蛋白，人血清白蛋白，甲狀腺 球蛋白或卵清蛋白，免疫球蛋白，或激素，如胰島素或棕櫚酸。為了人類的免疫，所述載體必 須是生理上可接受的載體，并且是人類可接受的且安全的。但是在本發(fā)明的一個實施例中， 破傷風(fēng)類毒素和/或白喉類毒素是合適的載體?？商鎿Q地，所述載體可以是右旋糖酐，例如 瓊脂糖凝膠。
[0208] 相應(yīng)地，本發(fā)明涵蓋了一種治療性組合物，進一步包括一種佐劑物質(zhì)，所述佐劑物 質(zhì)包括上述任一種或它們的組合。可以預(yù)計的是，抗原，即本發(fā)明所述的肽和佐劑可以任何 適當(dāng)?shù)捻樞蛲瑫r或單獨給藥。
[0209] 根據(jù)本發(fā)明所制備的所述藥物組合物包含所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或連同藥學(xué)上 可接受的載體的CD44v5肽。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"包括不妨礙CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或 CD44v5肽的生物活性的有效性的任何載體，并且這些載體對于其所給藥的宿主是沒有毒性 的。
[0210] 作為本發(fā)明的一種實施方式，所述組合物通過使用具有穩(wěn)定的人血清白蛋白的 CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或⑶44v5肽而被制得。為此，CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或⑶44v5肽的制備方 法為與人血清白蛋白一起凍干在小瓶中。
[0211] 在某些實施例中，所述藥物組合物還包含一種或多種作為毒素，細胞因子，細胞生 長抑制劑，或免疫調(diào)節(jié)劑的其它藥物。
[0212] 如本文所述的，詞匯"藥學(xué)上可接受的載體"旨在包括任何和所有的溶劑，增溶劑， 填充劑，穩(wěn)定劑，粘合劑，吸收劑，堿，緩沖劑，潤滑劑，控釋賦形劑，稀釋劑，乳化劑，保濕劑， 潤滑劑，分散介質(zhì)，包衣，抗菌或抗真菌劑，等滲劑和吸收延遲劑等等與藥物施用相容的載 體。用于藥學(xué)活性物質(zhì)的此類介質(zhì)和試劑是本領(lǐng)域所已知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑是 與活性化合物不相容的，它們在組合物中使用是可預(yù)期的。補充試劑也可被并入所述組合 物。
[0213] 本發(fā)明所述的一種藥物組合物被配制成與其預(yù)期的給藥途徑相容。給藥途徑的例 子包括不經(jīng)腸道的給藥，例如:靜脈內(nèi)給藥，皮內(nèi)給藥，皮下給藥，口服給藥(例如吸入），經(jīng) 皮給藥(外用），透黏膜給藥，以及直腸給藥。用于腸胃外，皮內(nèi)或皮下施用的溶液或懸浮液 可包括以下組分:無菌稀釋劑，如注射用水，鹽水溶液，不揮發(fā)油或其它合成溶劑;抗菌劑， 如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯;抗氧化劑，如抗壞血酸或硫酸氫鈉;螯合劑，如EDTA;緩沖劑如 乙酸鹽，硝酸鹽或磷酸鹽，以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉和右旋糖。pH值可用酸或堿 調(diào)節(jié)，如鹽酸和氫氧化鈉。腸胃外制劑可以封裝在安瓿，一次性注射器或由玻璃或塑料制成 的多劑量小瓶中。
[0214] 適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液或分散液以及用于臨時配制無菌可 注射液或分散液的無菌粉末。為了靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水，抑菌水，聚氧乙 烯蓖麻油(845?丄11(1?丨8此 &&11，81^)或者磷酸鹽緩沖鹽水(？85)。在所有情況下，可注射的 組合物應(yīng)當(dāng)是無菌的并且應(yīng)當(dāng)是容易注射性存在的流體程度。它必須在生產(chǎn)和存儲條件下 是穩(wěn)定的，并且必需能防止微生物的污染作用，所述微生物如細菌和真菌。所述載體可以是 溶劑或分散介質(zhì)，例如包含水、乙醇等等，以及它們合適的混合物。例如，適當(dāng)?shù)牧鲃有钥梢?通過使用一種涂層而被保持，所述涂層如卵磷脂，在分散液的情況下以及通過使用表面活 性劑時，通過維持所需顆粒大小。
[0215] 微生物作用的預(yù)防可通過各種抗菌劑和抗真菌劑實現(xiàn)，所述抗菌劑和抗真菌劑， 如:對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗壞血酸，硫柳汞等。在許多情況下，優(yōu)選在該組合物中 包括等滲劑，例如糖，如甘露糖醇、山梨糖醇的多元醇，以及氯化鈉。注射組合物的延遲吸收 可通過在該組合物中包括一種延緩吸收的試劑而引起，所述延緩吸收的試劑例如為單硬脂 酉支錯。
[0216] 無菌可注射溶液可通過將活性化合物（例如，所述⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或⑶44v5 肽）以所需的量并入到合適溶劑中，并與以上列舉的一種成分或它們的組合相結(jié)合而制備， 根據(jù)需要，隨后過濾滅菌。一般地，分散液是通過將活性化合物并入至無菌媒介而制備的， 所述無菌媒介含有堿性分散介質(zhì)和以上列舉的所需的其它成分。在無菌粉末用于制備無菌 注射溶液的例子中，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)出活性成分加上來自先 前無菌過濾的溶液的任何另外所需成分的粉末。
[0217] 口服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用的載體。它們可被封裝在明膠膠囊中或 者被壓制成片劑。出于口服治療給藥的目的，所述活性化合物可與賦形劑結(jié)合并以片劑、錠 劑或膠囊形式被使用?？诜M合物也可通過使用流體載體制備，所述流體載體用作漱口水， 其中在所述流體載體里的所述化合物被置于口中漱口，然后吐出或吞咽。藥學(xué)上相容的粘 合劑和/或佐劑材料可被作為該組合物的一部分。片劑，丸劑，膠囊，錠劑等可包含任何以下 成分或具有類似性質(zhì)的化合物:粘合劑，如微晶纖維素;賦形劑，如淀粉或乳糖；崩解劑，如 藻酸，羥基乙酸淀粉鈉(例如，Primogel?)，或玉米淀粉;潤滑劑，如硬脂酸鎂;助流劑，如膠 體二氧化硅;甜味劑，如蔗糖或糖精;調(diào)味劑，如薄荷，水楊酸甲酯，或橙味劑。
[0218] 為了吸入給藥，所述化合物從加壓容器或分配器中以氣溶膠噴霧形式遞送，所述 加壓容器或分配器含有合適的推進劑，例如為一種氣體，如二氧化碳或噴霧劑。
[0219] 全身給藥還可通過粘膜或透皮實施。為了經(jīng)粘膜或透皮給藥，適于待滲透屏障的 滲透劑在制劑中使用。這些滲透劑一般都是本領(lǐng)域已知的，并包括，例如：用于經(jīng)粘膜給藥 的洗滌劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。粘膜給藥可通過使用鼻腔噴霧劑或栓劑來實現(xiàn)。為了 透皮給藥，生物活性化合物被配制成一般為本領(lǐng)域已知的油膏，軟膏或乳膏。
[0220] 所述組合物也可以栓劑(例如，采用常規(guī)的栓劑基質(zhì)，如可可脂和其它甘油酯)或 用于直腸給藥的保留灌腸劑的形式被制備。
[0221] 在一個實施例中，可包含所述⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或⑶44v5肽的治療性部分，采用 會防止從體內(nèi)迅速消除該化合物的載體制備，如控釋制劑，包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)。 用于制備這種制劑的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。該材料也可商購獲得， 例如購買自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals Incorporation。脂質(zhì)體懸浮液 (包括靶向癌細胞的具有針對腫瘤抗原的抗體的脂質(zhì)體)也可被用作藥學(xué)上可接受的載體。 這些可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制得。
[0222] 特別有利的是，以劑量單元形式配制口服或腸胃外組合物，以方便給藥且均勻劑 量。此處所使用的劑量單元形式包括物理上離散的單元，適合作為單一劑量用于接受治療 的主體;每個單元含有經(jīng)計算能產(chǎn)生期望的治療效果的預(yù)定量的活性蛋白質(zhì)，與所需的藥 物載體相聯(lián)合。本發(fā)明所述的劑量單元形式的規(guī)格由所掌控且直接取決于活性蛋白質(zhì)的獨 有特點待實現(xiàn)的特定治療效果，以及在本領(lǐng)域中組合這種活性蛋白用于治療個體所固有的 局限性。
[0223] 本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的毒性和療效可以通過細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏械臉?biāo)準(zhǔn)制藥程 序來確定，例如，用于確定LD5Q(半數(shù)致死劑量)與ED 5Q(半數(shù)有效劑量）。毒性和治療效果的 劑量比為治療指數(shù)并且其可被表達為LD5Q/ED 5Q比率。表現(xiàn)出大的治療指數(shù)的蛋白質(zhì)為優(yōu)選 的。當(dāng)表現(xiàn)出毒副作用的蛋白質(zhì)可被使用的時候，應(yīng)注意設(shè)計遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)將這 種蛋白質(zhì)靶向輸送至受影響的組織位點，以便盡量減少非癌癥細胞的潛在損害，從而減少 副作用。
[0224] 從細胞培養(yǎng)試驗和動物研究中獲得的數(shù)據(jù)可被用于配制用于人類的劑量范圍。這 種化合物的劑量優(yōu)選出于循環(huán)濃度范圍內(nèi)，所述濃度包括的m) 5Q具有很少毒性或沒有毒性。 所述劑量可在此范圍內(nèi)根據(jù)所用的劑型以及所利用的給藥途徑而變化。對于在本發(fā)明所述 方法中所使用的化合物，治療有效劑量可從細胞培養(yǎng)分析進行初步估計。劑量可在動物模 型中配制，以獲得包括如在細胞培養(yǎng)中測定的IC 5Q(即測試化合物達到了癥狀的半數(shù)最大抑 制量的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。此類信息可用于更準(zhǔn)確地確定人類中的有用劑量。血漿 中的水平例如可通過高效液相色譜被測量。
[0225] 所述藥物組合物可被包括在一個容器、包裝或一并具有給藥指令的分配器內(nèi)。
[0226] 另一方面，本發(fā)明提供了一種藥劑/劑量計組合套裝，包括:a)被單獨給藥的一種 藥劑，和b)用于患者特異性的診斷指標(biāo)體系，所述患者特異性與待施用給病人的藥物的作 用、副作用、相互作用、代謝、吸收、分布、代謝、消除有關(guān)，其中，所述患者特異性選自：內(nèi)源 性物質(zhì)，調(diào)節(jié)機制，基因或指示系統(tǒng)。在上述組合套裝中，藥劑或診斷指示劑系統(tǒng)可為分離 的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或任何融合蛋白質(zhì)或與它的偶聯(lián)物。出于以上目的，本發(fā)明所述的 ⑶44v5肽也可被用作藥劑或診斷指示劑系統(tǒng)。
[0227] 合適的組合套裝被EP1542644 B1(MCS Micro Carrier Systems GmbH)所公開，在 此對其全部內(nèi)容進行引用，出于公開制備和使用所述藥劑/劑量計組合的目的。
[0228] 本發(fā)明的另一方面包括制備藥物組合物的方法，用于調(diào)節(jié)表達或本發(fā)明所述蛋白 質(zhì)的活性。這種方法包含配制一種藥學(xué)上可接受的載體以及一種調(diào)節(jié)表達或本發(fā)明所述蛋 白質(zhì)的活性的試劑。這種組合物可進一步包括額外的活性劑。于是，本發(fā)明還包括通過配制 藥學(xué)上可接受的載體和調(diào)節(jié)表達或本發(fā)明所述蛋白質(zhì)的活性的試劑以及一種或多種額外 的生物活性劑以制備藥物組合物的方法。
[0229] 定義
[0230] 在本發(fā)明文本中，術(shù)語"⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)"是指被用于具有300個氨基酸長度或 更短的的蛋白質(zhì)，其結(jié)合至被人類CD44基因外顯子9編碼的多肽。在本發(fā)明的說明書中，它 也被稱為"結(jié)合蛋白質(zhì)"或"活性化合物"。
[0231] 本發(fā)明文本中的一種蛋白質(zhì)被定義為一種由氨基酸構(gòu)成的分子。因此，術(shù)語蛋白 質(zhì)包括:二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽，更長的寡肽和氨基酸鏈。所述氨基酸鏈可 以是直鏈或支鏈的形式。
[0232] 本發(fā)明所述的氨基酸為有機化合物，含有至少一個氨基和至少一個羧基，它們在 蛋白質(zhì)中形成酰胺鍵。
[0233] 所述氨基酸為所述蛋白質(zhì)的一部分，可以從20個標(biāo)準(zhǔn)的α_氨基酸或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸 中選取，如：硒代半胱氨酸，吡咯賴氨酸，羊毛硫氨酸，羥脯氨酸，羧基谷氨酸，2-氨基異丁 酸，脫氫丙氨酸。此外，β氨基酸(例如β丙氨酸），γ氨基酸甚至更高等的氨基酸等其它氨基 酸都可為所述蛋白質(zhì)的一部分。
[0234] 對于某些氨基酸，可選擇不同的對映或立體異構(gòu)體形式，例如對于存在兩種對映 體形式的α氨基酸，可與選擇D型和L型。
[0235] 所述蛋白質(zhì)可以合成制成(通過無細胞系統(tǒng)中的有機合成方式，所述無細胞系統(tǒng) 利用核糖體系統(tǒng)，可以是人造的或非人造的）或者它可由可被或不可被被基因操縱的細胞 自然制備，或者被單細胞生物體(例如通過細菌或酵母細胞)或多細胞生物體自然制備。
[0236] 所述蛋白質(zhì)可以許多方式進行修飾。典型的修飾為翻譯后修飾，其包括脂質(zhì)，乙酸 酯基團，磷酸基團，或碳水化合物。所述蛋白質(zhì)也可采用例如生物素群進行化學(xué)修飾。
[0237] 所述蛋白質(zhì)可以是多聚體，包含相同的亞基(單體)或由共價鍵或非共價相互作用 保持在一起的不同的蛋白質(zhì)(異聚體）。
[0238]本文所使用的術(shù)語"結(jié)合親和力"是指CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)與CD44v5區(qū)域之間的親 和力的強度，并且由解離常數(shù)Kd描述。用于CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)與CD44v5區(qū)域之間的結(jié)合親 和力的KD的值由例如平衡法(例如，酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析法(RIA))或 動力學(xué)研究(例如BIAC0RE?分析)所確定。
[0239] "Kd"是指所述⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)與所述⑶44v5區(qū)域之間的相對結(jié)合親和力。高Kd 值表示低的結(jié)合親和力。
[0240] 術(shù)語"治療"或"處理"指的是用于預(yù)防，減少，緩解或治愈哺乳動物中的尤其是人 類的生理疾病所需的任何醫(yī)療措施。根據(jù)本發(fā)明所述的治療也可涵蓋靶向藥物遞送。
[0241] "治療有效量"被定義為減少與神經(jīng)和的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的癥狀，如中風(fēng)，的 活性成分的量。"治療上有效的"也指在疾病嚴重程度上或事故發(fā)生頻率上與沒有治療相比 所得到的任何改善。術(shù)語"治療"涵蓋了治愈或愈合以及減輕、緩解或預(yù)防的意思。
[0242] 術(shù)語"表達載體"是指具有能力并入外源細胞并在外源細胞中表達異源DNA片段的 載體。許多原核和真核表達載體是已知的和/或商購可得的。合適表達載體的選擇是本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知的知識。
[0243] 在本發(fā)明的文本中，術(shù)語"納米顆粒"是指尺寸小于1微米并優(yōu)選在1-100納米的顆 粒。因而，術(shù)語"納米顆粒"包括由半導(dǎo)體材料制成的納米晶體(所謂量子點），以及包括貴金 屬團簇的納米顆粒，基于稀土的無機發(fā)光納米顆粒，超順磁性氧化鐵納米顆粒（IONPs )，嵌 段共聚物膠束，納米細胞，樹枝狀聚合物，納米管，聚合物囊泡，XPclad?納米顆粒，以及由 被結(jié)晶發(fā)光磷酸鈣層包圍著的無定形二氧化硅組成的納米顆粒(例如，GRMOBE為D? )。
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【附圖說明】
[0267]圖1:⑶44的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)區(qū)域。
[0268]圖2: (A)酵母雙雜交篩選方法原理示意圖；（B)用于所述Y2H-篩選的載體。
[0269]圖3:陽性⑶44相互作用克隆體與衍生于它的共有序列的氨基酸序列。
[0270] 圖4:采用納米顆粒偶聯(lián)物Q_CA19-9-3標(biāo)記HT29細胞。
[0271] 圖5:采用納米顆粒偶聯(lián)物Q_CA19-9-5標(biāo)記HT29細胞的陰性對照。
[0272] 圖6:采用納米顆粒偶聯(lián)物Q_CA19-9-3或者所述陰性對照MBP-納米顆粒標(biāo)記HT29 細胞的定量分析。
[0273] 圖7:通過遞增量地添加無靶標(biāo)CA19-9使納米顆粒偶聯(lián)物Q_CA19-9-3與標(biāo)記HT29 細胞的競爭。
[0274] 圖8:米用納米顆粒偶聯(lián)物Q_CA19-9-3標(biāo)記Colo29細胞。
[0275] 圖9:采用納米顆粒偶聯(lián)物Q_CA19-9_5標(biāo)記Colo29細胞的陰性對照。
[0276] 圖10:采用納米顆粒偶聯(lián)物Q_CA19-9_3標(biāo)記SW116細胞。
[0277] 圖11:采用納米顆粒偶聯(lián)物Q_CA19-9_5標(biāo)記SW116細胞的陰性對照。
[0278] 圖12:采用偶聯(lián)至抗CEA抗體和抗CA-19-9抗體的雙特異性納米顆粒Q_CEA/CA19-9_12標(biāo)記黏液腺癌組織(樣品號35)。在四個象限中，按以下條件進行分析：
[0279] 左上象限：用 Q_CEA/CA19_9_12 標(biāo)記
[0280] 右上象限:通過添加無靶標(biāo)MBP-CEA(25微米)用CEA CA19-9_12標(biāo)記
[0281] 左下象限:通過添加無靶標(biāo)唾液酸化路易斯a(250微米)用〇」^4/0419-9_12標(biāo)記
[0282] 右下象限：通過添加無靶標(biāo)MBP-CEA(25微米)和唾液酸化路易斯a(250微米）用〇_ CEA/CA19-9_12 標(biāo)記
[0283] 圖13:依據(jù)偽樣品挑選檢測I的結(jié)果進行的肽A-E的親和力的排名實驗。
[0284]圖14:依據(jù)FDG檢測I的結(jié)果進行的肽A-E的親和力的排名實驗。
[0285]圖15:依據(jù)偽樣品挑選檢測Π 的結(jié)果進行的肽A-E的親和力的排名實驗。
[0286]圖16:依據(jù)FDG檢測Π 的結(jié)果進行的肽A-E的親和力的排名實驗。
[0287] 圖17:肽A-E的親和力排名實驗的全面評價。
[0288] 圖18:圖中顯示了對于肽A、C、D和E的缺失型突變體。
[0289] 圖19:圖中顯示了對于肽B(左側(cè)）的缺失型突變體以及FDG檢測中它們的親和力分 析的結(jié)果(右側(cè)）。
[0290]圖20:圖中顯示了對于肽B的丙氨酸掃描變體以及PHP和H)G檢測中它們的親和力 分析的結(jié)果，在這兩種檢測方法中各進行了兩次。
[0291]圖21:圖中顯示了替代性的⑶44結(jié)構(gòu)，其被生成用于結(jié)合分析。
[0292] 圖22:圖中給出了體外生物化學(xué)實驗的概覽，所述體外生物化學(xué)實驗采用偶聯(lián)至 熒光納米顆粒的⑶44v5結(jié)合肽A，B或C實施。
[0293] 實施例
[0294] 實施例1:⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的分離
[0295] 為了分離結(jié)合至⑶44基因的v5區(qū)域的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，根據(jù)EP 1721 974 A1 所公開的方法實施了一種競爭性雙雜交篩選。作為誘餌，v5片段被融合至所述GAL4結(jié)合區(qū) 域。各自的ORF被克隆到質(zhì)粒載體并被指定為pGBKT7 (見圖2)。具有融合至GAL4激活區(qū)域的 片段的一種人類cDNA信息庫被用作被捕食者(見圖2,載體pGADT7-RecAB)。
[0296] 所述篩選在嚴格的篩選條件下進行，并導(dǎo)致了39個陽性克隆體的識別。誘餌和被 捕食者質(zhì)粒的選擇性共轉(zhuǎn)化之后，39個克隆體中的21個仍然為陽性。這21個克隆體進行測 序并通過BLAST研究進行分析。因此，這21個序列可被減少至12個不同的序列，由于四個序 列進行了雙重識別并且一條序列存在于4個克隆體中。
[0297] 進一步地，序列的比較表明這五個序列家族顯示出了大量的序列同源性，允許共 有序列的形成(見圖3)。
[0298] 實施例2:抗原表達的腫瘤細胞的離體檢測
[0299] 2.1背景和目的
[0300] 為了展示該蛋白質(zhì)-量子點偶聯(lián)物的能力，以特異性檢測抗原表達的腫瘤細胞，月中 瘤標(biāo)本或離體培養(yǎng)的腫瘤細胞通過熒光法被分析，并同時通過免疫組織化學(xué)用于分析各抗 原的表達。作為第一抗原，癌胚抗原(CEA)被分析了。CEA是一種參與細胞粘附的糖蛋白。作 為檢測配體，所述抗CEA抗體被偶聯(lián)至量子點QDBP-655(電荷#773780)。進一步地，所述癌癥 抗原19-9(CA19-9)被分析了。CA19-9是一種唾液酸化路易斯(a)抗原并代表一種腫瘤標(biāo)記 物，其主要被用于胰腺癌的管理。
[0301] 2.2樣品
[0302] 2.2.1細胞培養(yǎng)樣品
[0303] 在第一組實驗中，使用了離體培養(yǎng)的人類癌細胞株HT29，Colo25和HT29，SW116。 HT29是一種附著的結(jié)直腸腺癌細胞株，Co 1〇25是一種人結(jié)腸癌細胞株而SW116是一種結(jié)腸 直腸癌細胞株。
[0304] 2.2.2腫瘤樣品
[0305]在獨立的一組實驗中，使用了來自人類腫瘤的樣品。腫瘤樣品No.35在2011年被從 盲腸切除，并且被診斷為粘液腺癌。根據(jù)^#分類標(biāo)準(zhǔn)，它被歸類為pT4No(0/18)G3Ro。不以 其他方式預(yù)處理的樣品按照下文進行制備和固定。
[0306] 組織切片的制備和固定
[0307]通過使用 HM560MV 低溫恒溫器（Thermo Scientific，Walldorf，德國），在-70°C 儲 存的被切除的腫瘤樣品被用于制備5微米的冰凍切片。所述切片于室溫下干燥60至120分鐘 并用冷丙酮(_20°C)培育10分鐘。在進一步于室溫下干燥10分鐘的步驟之后，所述切片在-70 °C下被冷凍過夜。
[0308]將所述切片在封閉盒中于室溫下解凍30分鐘。通過在溶液中進行培育而實施固 定，所述溶液含有20mg/ml二甲基辛二亞酰胺化物(DMS)以及pH8.0的250mM的Tris-鹽酸緩 沖液中的20mM CaCl2。之后，將所述切片在D-roS-T緩沖液中洗滌5分鐘，所述D-roS-T緩沖 液含有13〇1^恥(：1，71111恥2冊〇4,3111]\11012?〇4和0.1%了￥661120，通過在緩沖液中持續(xù)20分 鐘的淬滅步驟，所述緩沖液含有：13〇禮NaCl，7mM Na2HP〇4,3mM KH2P〇4和200mM甘油。在最 后一步中，所述切片被置于D-PBS-T緩沖液中洗滌5分鐘。
[0309]組織切片的復(fù)染
[0310] 通過使用根據(jù)以下協(xié)議所述的Dako自動染色升級（DAKO Deutschland GmbH, Hamburg，Germany)來實施復(fù)染：
[0311] --用D-TBS-T緩沖液漂洗
[0312] --用l%BSA/5%山羊血清在D-PBS緩沖液中封閉60分鐘
[0313] --吹凈
[0314] --采用2 X 100μΙ的偶聯(lián)物（20nM，在D-PBS緩沖液中的1 %BSA/5 %山羊血清中） 孵育60分鐘
[0315] --采用D-PBS-T漂洗三次
[0316] --吹凈
[0317] --采用2Χ100μ1的一級抗體(20nM，在含有l(wèi)%BSA/5%山羊血清的D-PBS緩沖液 中）孵育60分鐘
[0318] --采用D-PBS-T漂洗三次
[0319] --吹凈
[0320] --采用2Χ100μ1的二級抗體(20nM，在含有l(wèi)%BSA/5%山羊血清的D-PBS緩沖液 中）孵育60分鐘
[0321] --采用D-PBS-T漂洗三次
[0322] --吹凈
[0323] --采用3Χ200μ1的Hoechst熒光染料33342(在D-PBS緩沖液中濃度為2μg/ml)孵 育10分鐘
[0324] --采用D-PBS-T漂洗三次
[0325] --用Mowiol/三乙烯二胺(DABC0)封片
[0326] 微觀評估
[0327] 如上所制得的切片被采用反向顯微鏡Axiovert200進行評價，所述反向顯微鏡 Axiovert200具有Axiocam HrM和Axiocam Hrc (XD攝像系統(tǒng)，HXP 120C照明裝置。通過使用 Axiovision軟件(4.8版，Carl Zeiss，0berkochen，Germany)對圖像進行分析。
[0328] 2.3蛋白質(zhì)-量子點偶聯(lián)物
[0329]為了抗原檢測，如下表所列出的量子點被制備：
[0330]
[0331] 偶聯(lián)物Q561是一種所述量子點QDBP-655(批號#773780)和所述配體SI6166之間的 偶聯(lián)物。QDBP-655具有的流體動力學(xué)直徑為6nm并且擁有一個Ni-NTA配體。所述配體SI6166 是一種CEA結(jié)合蛋白質(zhì)，具有2. lnm的流體動力學(xué)直徑，并且最終的偶聯(lián)物顯示出10. lnm的 流體動力學(xué)直徑。所述抗CEA蛋白質(zhì)被偶聯(lián)至所述量子點。
[0332] 所述量子點Q_CA19-9-x為所述量子點QDBP-655(批號#773780)和所述抗CA 19-9 抗體"MBP-NS-19-9-scFv-His6"之間的偶聯(lián)物。此抗-CA 19-9抗體是一種重組的抗體模擬， 包含重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)可被描述為"可變區(qū)的單鏈片段" scFv。此scFv片段被融 合至組胺-標(biāo)簽，其被用于偶聯(lián)至所述量子點。所述抗CA 19-9抗體"MBP-NS-19-9-scFv-His6"還被命名為SI6950。
[0333] 所述量子點Q_CEA CA19-9_x為雙特異性偶聯(lián)物，其中，攜帶所述抗CEA抗體SI6166 的所述量子點Q561進一步與所述抗CA抗體SI6950偶聯(lián)。
[0334] 所述偶聯(lián)物Q_CEA/CA19_9_x的不同批次以不同的量子點比配體的比率被制備(參 見商標(biāo)的最后一列）。
[0335] 3.CA19-9偶聯(lián)的納米顆粒的結(jié)果
[0336] 3.1 HT29 細胞
[0337] 如圖4左上象限所示，所述偶聯(lián)物Q_CA19-9_3標(biāo)記了HT29細胞的細胞膜。具有抗 CA19-9抗體的所述細胞的染色，通過Alexa Fluor 488焚光法檢測出來(見右上象限），顯示 出顯示著偶聯(lián)結(jié)合特異性的信號的完美共定位。在右下象限中，將細胞通過差示干涉差顯 微鏡術(shù)(DIC)進行顯示。
[0338] 在陰性對照中，偶聯(lián)至MBP(MBP-His/QDP655)的量子點被使用了。如圖5的左上象 限所示，未能檢測到任何標(biāo)記。所述CA19-9抗原的存在，通過采用抗CA19-9抗體對細胞染色 來驗證，所述抗CA19-9抗體由Alexa Fluor 488焚光法所檢測到(右上象限）。
[0339] 所述CA19-9抗原的特異性標(biāo)記通過滴定實驗被示出。如圖6所示，所述偶聯(lián)物Q_ CA19-9_3的增加量導(dǎo)致所述HT29細胞標(biāo)記增加，這是通過增加相對熒光法得以證實的。與 此不同，所述陰性對照MBP_His/QDP655僅造成一個稀疏熒光標(biāo)記，在較高濃度的偶聯(lián)物中 也沒有表現(xiàn)出重大增長。
[0340]所述CA19-9的標(biāo)記特異性通過競爭性實驗進一步得到驗證，如圖7所示：向所述標(biāo) 記混合物中添加的游離CA 19-9抗原的增加量導(dǎo)致CA 19-9標(biāo)記下降。
[0341] 3.2 Colo29細胞
[0342] 如圖8的左上象限所示，所述偶聯(lián)物Q_CA19-9-3標(biāo)記了 Colo29細胞的細胞膜。具有 抗CA19-9抗體的所述細胞的染色，通過Alexa Fluor 488焚光法檢測出來(見右上象限），顯 示出顯示著偶聯(lián)結(jié)合特異性的信號的完美共定位。在右下象限中，將細胞通過差示干涉差 顯微鏡術(shù)(DIC)進行顯示。
[0343] 在陰性對照中，偶聯(lián)至MBP(MBP-His/QDP655)的量子點被使用了。如圖9的左上象 限所示，未能檢測到任何標(biāo)記。所述CA19-9抗原的存在，通過采用抗CA19-9抗體對細胞染色 來驗證，所述抗CA19-9抗體由Alexa Fluor 488焚光法所檢測到(右上象限）。
[0344] 3.3 SW116細胞
[0345] 如圖10的左上象限所示，所述偶聯(lián)物Q_CA19-9_3標(biāo)記了 C〇l〇29細胞的細胞膜。具 有抗CA19-9抗體的所述細胞的染色，通過Alexa Fluor 488熒光法檢測出來(見右上象限）， 顯示出顯示著偶聯(lián)結(jié)合特異性的信號的完美共定位。在右下象限中，將細胞通過差示干涉 差顯微鏡術(shù)(DIC)進行顯示。
[0346] 在陰性對照中，偶聯(lián)至MBP(MBP-HiS/QDP655)的量子點被使用了。如圖11的左上象 限所示，未能檢測到任何標(biāo)記。所述CA19-9抗原的存在，通過采用抗CA19-9抗體對細胞染色 來驗證，所述抗CA19-9抗體由Alexa Fluor 488焚光法所檢測到(右上象限）。
[0347] 4.雙特異性偶聯(lián)納米顆粒的結(jié)果
[0348] 為了檢測雙特異性偶聯(lián)納米顆粒與給定靶標(biāo)的抗原相互作用的能力，進行了一系 列實驗。出于此目的，與所述抗CA19-9抗體和所述抗CEA抗體偶聯(lián)的納米顆粒被用于檢測上 述樣品N0.35的腫瘤細胞上的相應(yīng)的抗原。所述特異性通過采用無祀標(biāo)MBP-CEA與19-9進行 抑制而被證實。
[0349] 如圖12的左上象限所示，所述雙特異性納米顆粒標(biāo)記了所述腫瘤組織的細胞膜。 采用抗CA19-9抗體或抗CEA抗體對腫瘤組織的染色，在每種情況下，都顯示出了結(jié)合著所述 納米顆粒的完整標(biāo)記信息的部分共定位。
[0350]當(dāng)所述雙特異性納米顆粒與游離靶標(biāo)MBP-CEA結(jié)合使用時，可以觀察到標(biāo)記，其顯 示出與染色的所述抗CA-19-9抗體(見圖12的右上象限）的完美共定位。于是，游離靶標(biāo)抑制 了與所述細胞綁定CEA的相互作用，卻仍然允許所述CA 19-9的標(biāo)記。
[0351] 如圖12的左下象限所示，游離靶標(biāo)Sialyl-LewiSa的添加抑制了與所述細胞CA 19-9抗原的相互作用，卻仍然保留了 CEA標(biāo)記。
[0352] 在最后的實驗中，所述雙特異性納米顆粒與游離靶標(biāo)、MBP-CEA和Sialyl_Lewisa 相結(jié)合(見圖12的右下象限）。因此，標(biāo)記被完全抑制住(見左上象限）。所有抗原的共定位表 達均通過與各個抗CEA和CA19-9抗體染色來驗證。
[0353 ]實施例3:通過親和力排名進行的⑶44e x9結(jié)合蛋白質(zhì)的表征
[0354] 介紹：
[0355] 如在的實施例1的競爭性雙雜交篩選中所識別的所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)，通過兩 種不同的親和力分析法被進一步分析，以建立親和力的排名。
[0356] 方法：
[0357] 作為第一種分析法，采用了偽樣品挑選檢測，其按照如下所述進行:為了比較兩種 不同肽的親和力，菌落分別表達該第一肽或第二肽，涂布于瓊脂板的第一或第二半。用于定 義一個菌落作為"命中"的閾值隨后被確定，預(yù)先定義的第一肽的菌落百分比，在該板的基 準(zhǔn)區(qū)域被選為"命中"。在同樣的實驗中，第二肽的菌落被掃描和拾起。第二肽的菌落數(shù)隨后 被與第一肽的菌落數(shù)相比較，并且以百分比表示。基于此百分比，可以推導(dǎo)出相對作用強度 (即對所述CD44肽的親和力）。
[0358] FDG檢測是基于兩個雜交掃描系統(tǒng)的報告系統(tǒng)。從而，具有⑶44v5肽的所述GAL4結(jié) 合區(qū)域與融合至GAL4活化2區(qū)域的相應(yīng)的肽相互作用。經(jīng)過復(fù)雜的形成，兩個獨立的報告基 因被激活，第一個編碼熒光蛋白，第二個報告基因編碼所述β-半乳糖苷酶，其酶活性可通過 使用熒光基質(zhì)熒光素二-β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)確定。
[0359] 在偽樣品挑選檢測中，所有報道系統(tǒng)都將被認為是:開始，子葉報告基因的熒光， 并且在采用熒光基質(zhì)培育之后，第二種酶的活性編碼報告基因。于是，兩種不同報告基因的 結(jié)果可在一個實驗中被確定。
[0360]如圖13-16所示，SEQ ID Ν0:1-5這5個肽中的2個的十種不同的組合在偽樣品挑選 檢測中進行了比較，并且平行實施了 FDG檢測。于是，兩個獨立的實驗被實施，如圖13-20所 不。
[0361] 結(jié)果：
[0362] 所有實驗表明，肽B(SEQ ID N0:3)具有對所述⑶44V5肽最高的親和力，隨后是肽C 和肽D。圖17給出了親和力排名分析的概覽。
[0363] 實施例4:通過缺失⑶44ex9結(jié)合大蛋白質(zhì)的表征 [0364]介紹：
[0365] 對于5個肽，實施了基于缺失表位映射，以便識別并表征這些肽的結(jié)合位點。該結(jié) 果表明了一個重要的信息，其能夠有助于與CD44v5關(guān)聯(lián)的治療和診斷的發(fā)展。
[0366] 方法：
[0367] 對于所有的5個肽A-E，缺失突變體在PHP和H)G分析中被生成并檢測。對于肽A、C、D 和E，N-或C-末端缺失片段生成并命名為肽A1、C1、D1和El。用于A、C、D和E的缺失突變體的序 列如圖18所示。
[0368]對于所述肽B，以及一共四個缺失突變體，即肽B1-B4如圖19所示的那樣被生成。 [0369]所述肽在PHP和FDG檢測中進行了比較測試。
[0370]對于肽B，18個氨基酸的N末端缺失(肽B1)導(dǎo)致了一種活性稍微下降的肽(將圖19， 右側(cè)）。因而，此N末端區(qū)域并非對所述CD44v5肽相互作用的關(guān)鍵所在，并因此肽B1代表了一 段核心序列，用于與⑶44v5肽相互作用。
[0371]如圖19所示，具有N末端和C末端缺失的肽(肽M)，僅僅具有C末端缺失(肽B2)并且 具有核心序列"QLSFEVQWETS"（肽B3)的缺失，完全喪失結(jié)合至⑶44v5的能力。這一結(jié)果與肽 B1展示出的至少核心序列C末端部分一起是CD44v5結(jié)合所需的屬性完全一致。
[0372]肽A1和C1與其親本肽A與C的區(qū)別在于在C末端缺乏3個或8個氨基酸長度的序列， 包括所述共有序列的"AIE〃基序。在這兩種情況下，結(jié)合至⑶44v5幾乎完全被阻斷，表現(xiàn)出 所述共有序列的這部分的相關(guān)性。
[0373] 肽D 1和E 1與其親本肽D與E的區(qū)別在于在N末端缺乏包括所述核心序列的 "PYYGKXLXX"基序的序列。在這兩種情況下，結(jié)合至⑶44v5并不會削弱。然而，肽D1具有類似 的親和力，與親本肽E相比，所述肽E1甚至表現(xiàn)出朝向CD44v5的更強的結(jié)合。
[0374] 這些結(jié)果與上述肽B的結(jié)果完美一致。所述N末端區(qū)域并不是⑶44v5結(jié)合所必須 的，一條縮短的肽及其作為核心序列的各共有序列代表優(yōu)選的肽基序，用于與CD44v5相關(guān) 聯(lián)的診斷和治療。
[0375] 實施例5:通過丙氨酸掃描而進行的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的表征
[0376] 介紹：
[0377] 對于大多數(shù)仿射肽B而言，其核心序列的丙氨酸被掃描以識別對于CD44v5結(jié)合至 關(guān)重要的那些氨基酸。如由突變的肽B3所示，所述核心序列"QLSFEVQWETS"的存在對于 ⑶44v5結(jié)合是必須的。
[0378] 方法：
[0379] 所述肽B被用于生產(chǎn)共11種變體，由此，所述核心序列"QLSFEVQWETS"的每個氨基 酸獨立地被氨基酸丙氨酸取代（見圖20)。這些變體與所述肽B進行比較而以PHP及H)G分析 方法被檢測。對于全部5個肽A-D，缺失變體被產(chǎn)生，并以PHP及FDG分析方法進行檢測。
[0380]結(jié)果：
[0381]如圖20所示，所述核心序列的第一氨基酸的取代并不會造成朝向CD44v5的親和力 發(fā)生顯著變化。但是，帶下劃線的核心序列的第11個氨基酸絲氨酸用丙氨酸進行更換，導(dǎo)致 具有更尚未和力的妝。
[0382] 于是，在所述核心序列里，沒有任何單一的氨基酸對于⑶44v5結(jié)合而言是至關(guān)重 要的，然而必須被假定為，這些氨基酸以協(xié)調(diào)的方式結(jié)合至所述靶標(biāo)。
[0383] 然而，基于結(jié)果，甚至改進的肽B和在第11氨基酸位置具有Ser-Ala交換的改進的 共有序列被識別出來(見SEQ ID N0:No.58-62的共有序列）。
[0384] 實施例5:⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)向不同⑶44變體的結(jié)合分析
[0385] 如圖21所示，共有四種不同的CD44變體被生成，其含有與不同區(qū)域相結(jié)合的v5區(qū) 域。如PHP分析法和H)G分析法所揭示的那樣，本發(fā)明所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)也能夠結(jié)合 這些⑶44變體。作為陰性對照，CD44變體pGKT7_CD44被用于僅編碼區(qū)域1 -5以及15，16 (此處 未示出）。正如所預(yù)期的，所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)沒有表現(xiàn)出向此CD44蛋白質(zhì)的任何結(jié)合。
[0386] 實施例5:偶聯(lián)著CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的納米顆粒向體外培養(yǎng)的表達CD44v5的腫瘤 細胞的結(jié)合分析
[0387] 為了強調(diào)所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的診斷和治療功效，肽A、B和C被表達為MBP融合 蛋白，含有組氨酸-標(biāo)簽，偶聯(lián)至量子點并被用于表達CD44的腫瘤細胞的免疫細胞化學(xué)分 析。
[0388] 方法：
[0389] 所述肽被表達為大腸桿菌中的MBP-(YTH_v5_A B/C)-His6融合蛋白，使用Ni-NTA 親和層析進行純化，并且通過His6-標(biāo)簽偶聯(lián)至所述QDBP-655量子點。這些量子點具有CdSe 核心，ZnS殼以及含有咪唑化合物的鈍化層。
[0390] 本文所述的QDBP-655納米顆粒的特性可總結(jié)如下：
[0391] 所述納米顆粒具有硒化鎘(CdSe)核心和硫化鋅(ZnS)殼。所述殼被二肽涂層所圍 繞，所述二肽涂層包含甘氨酸-組氨酸，組氨酸-亮氨酸，肌肽，以及氨基-PEG(聚乙二醇），通 過氨基二苯甲酮與3-[三(羥甲基)膦]丙酸酯(THPP)被交聯(lián)。所述二肽涂層通過其咪唑環(huán)配 位結(jié)合至所述殼結(jié)構(gòu)的鋅離子。無伯氨基在二肽涂層中可以被用于偶聯(lián)反應(yīng)。關(guān)于所述二 肽涂層的附加信息被公開于美國專利申請US2003/0059635 A1中。
[0392] QDBP-655由Life Technologies Corporation(Eugene,Oregon,USA)所出售。其以 呈紅色的膠體懸浮液而在緩沖液中被遞送。所述納米顆粒展示出以下產(chǎn)品特點：
[0393] 外觀:紅透明液體
[0394] 流體力學(xué)半徑：<6.5nm(通過尺寸排阻色譜法測定）
[0395] 分子量：1000kDa
[0396] 最大發(fā)射波長：655nm±4nm [0397]偶聯(lián)：
[0398] 被表達的和被親和純化的肽A、B或C以pH = 8.3的50mM硼酸鈉溶液被透析2小時 (Slide-A-Lyzer Mini Dialysis Uni-10 KDa(Thermo Fisher，Rockford，IL，USA))〇之后， 該蛋白質(zhì)濃度被確定并且將溶液稀釋到所需濃度。QDBP-655量子點和蛋白質(zhì)被一起混合至 0.3yM(QDBP-655)的結(jié)束濃度，在無菌硼硅酸鹽樣品瓶中，QDBP-655/配體的比率為1:12.5， 1:25,1:50,1:75和1:100,如下表中總結(jié)所示：
[0399]
[0400]成功的偶聯(lián)通過SDS-瓊脂糖凝膠電泳顯示，由此，1:50或更高的比率導(dǎo)致分子量 的顯著增大，從而顯示了成功的偶聯(lián)反應(yīng)。
[0401] 免疫細胞化學(xué)分析
[0402] 腫瘤細胞的免疫細胞化學(xué)分析按如下所述進行：
[0403] ?將每種5 X 105腫瘤細胞置于涂層鏡片上
[0404] ?在37°C，5%C02條件下培育48小時
[0405] ?采用lmL的D-PBS洗滌細胞3 X 1分鐘
[0406] ?采用lmL的二甲亞胺(DMS)溶液（在250 ml三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中的20mg/ ml DMS，20mM CaCl2，pH8.0)固定20分鐘
[0407] ?采用lmL的D-PBS洗滌細胞1 X 1分鐘
[0408] ?在含0.2%的甘氨酸的在D-PBS中培育20分鐘而進行淬滅
[0409] ?在含l%BSA/5%山羊血清的D-PBS中封閉60分鐘
[0410] ?在室溫下采用50μ1預(yù)培養(yǎng)的Qdot肽偶聯(lián)物（ΙΟΟηΜ)進行孵育
[0411] ?采用lmL的D-PBS洗滌細胞3 X 5分鐘
[0412] ?采用 50μ1-級抗體(抗 CD44v5:VFF-7，l:25)進行孵育
[0413] ?采用lmL的D-PBS洗滌細胞3X5分鐘
[0414] ?采用 50μ1 二級抗體進行孵育(GAM-A488，1:100)
[0415] ?采用lmL的D-PBS洗滌細胞3X5分鐘
[0416] ?采用300μ1 的Hoechst 33342(D-PBS中濃度為200ng/ml)復(fù)染 10分鐘
[0417] ?采用lmL的D-PBS洗滌細胞3 X 5分鐘
[0418] ?用Mowiol 4_88(Sigma Aldrich,St·Louis，M1，USA)封片
[0419] 結(jié)果：
[0420] 偶聯(lián)至肽A、B和C的納米顆粒采用人結(jié)腸癌細胞株HCT-1 16進行檢測(見圖22)。當(dāng) 使用所述肽偶聯(lián)的納米顆粒時，可以觀察到腫瘤細胞的標(biāo)記，作為陽性對照，其與所述抗 ⑶44v5抗體所產(chǎn)生標(biāo)記共定位。
【主權(quán)項】
1. 一種結(jié)合至被人類CD44基因外顯子9(CD44ex9)所編碼的多肽的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì) 包含以下物質(zhì)或者由以下物質(zhì)組成： (i) 根據(jù)SEQ ID NO: 1-5和SEQ ID NO:39-52所示的氨基酸序列；或 (ii) 與SEQIDN0:l-5和SEQIDN0:39-52所給出的氨基酸序列具有至少80%-致性 的，優(yōu)選85 % -致性的，更優(yōu)選90 % -致性的，且最優(yōu)選95 % -致性的氨基酸序列;或 (iii) 與由以下序列所限定的CD44結(jié)合模體具有至少90% -致性的，優(yōu)選至少95% - 致性的或100%-致性的氨基酸序列： 如SEQIDN0:6-10所示的〃PYYGKXLX3YLQPSFAVQVX2SXQXl()-l4AIE〃，或者由如SEQIDN0 : 53-62所示的"PGLQPSFAVQVXZ/aXQXkj-wAIE"所定義的序列，其中，X表示任意的氨基酸;并且 其中所述的蛋白質(zhì)具有100個氨基酸或更小的長度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)，其特征在于，其結(jié)合至一種⑶44亞型，所 述⑶44亞型包含外顯子9所編碼的區(qū)域。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)，其特征在于，所述CD44亞型選自以下名 單，該名單包括： a) CD44v5, b) CD44v5-v6, c) CD44v3-v6, d) CD44v3-v6, e) CD44v2-vlO, f) CD44v3-vlO, g) CD44v4-v7, h) CD44v4_vlO〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)，其特征在于，其被偶聯(lián)或融合至異源 蛋白質(zhì)或多肽，所述異源蛋白質(zhì)或多肽優(yōu)選為一種酶，所述酶從前體分子催化細胞毒素劑 或細胞抑制劑的產(chǎn)生或催化標(biāo)記粘附至所述蛋白質(zhì)。5. -種偶聯(lián)物，包含： a) 根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)； b) -種化合物，選自以下物質(zhì)所構(gòu)成的組:碳水化合物，染料分子，放射性同位素，毒 素，細胞抑制劑，細胞因子，免疫調(diào)節(jié)劑，或它們的前藥； 其中，所述化合物直接連接至所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或者通過連接分子連接至所述 ⑶44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)。6. -種分離的核酸分子，用于編碼根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)。7. -種表達載體，其包含有根據(jù)權(quán)利要求6所述的核苷酸序列。8. -種宿主細胞，其包含有根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達載體。9. 一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括： a) 采用表達構(gòu)建來轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述表達構(gòu)建包含編碼權(quán)利要求1-4所述蛋白質(zhì)的 核酸分子;并且 b) 在適于生產(chǎn)所述CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或各種融合蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述宿主細 胞。10. -種納米顆粒，其特征在于，其偶聯(lián)至根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的CD44ex9結(jié)合蛋白 質(zhì)。11. 一種納米顆粒，其特征在于，其偶聯(lián)至根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的偶聯(lián)物或融合蛋白 質(zhì)。12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的納米顆粒，其特征在于，進一步偶聯(lián)到至少一種腫瘤抗 原結(jié)合物質(zhì)和/或細胞毒素劑。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的納米顆粒，其特征在于，所述腫瘤抗原結(jié)合物質(zhì)選自以下名 單，該名單包括:抗CEA抗體，抗CA-19-9抗體，以及一種優(yōu)選被修飾的粘附素，或者它們?nèi)我?的結(jié)合。14. 根據(jù)權(quán)利要求10-13所述的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒選自以下物質(zhì)所 構(gòu)成的組:量子點，貴金屬團簇，超順磁性氧化鐵納米顆粒（IONPs)，嵌段共聚物膠束，納米 細胞，樹枝狀聚合物，納米管，聚合物囊泡，XPciad3iD納米顆粒，以及由被結(jié)晶發(fā)光磷酸鈣層 包圍著的無定形二氧化娃組成的納米顆粒，具有小于l〇〇nm的直徑的Si〇2/Zn2Si〇4:Mn 2+和 Si02/Ca1Q(P〇4)6OH:Eu3+核心-殼納米顆粒，以及熒光染料標(biāo)記的混合的納米顆粒。15. 根據(jù)權(quán)利要求10-13所述的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒具有無機核心和 包含咪唑成分的涂覆層，包括所述涂覆層的所述無機核心具有的最小直徑為不超過15nm。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的納米顆粒，其特征在于，所述咪唑成分為一種包含至少一個 組氨酸殘基的肽，并且優(yōu)選為二肽。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的納米顆粒，其特征在于，所述咪唑成分為含組氨酸的不同二 肽的混合物。18. 根據(jù)權(quán)利要求10-17中任一項所述的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒是非惰 性的。19. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或者根據(jù)權(quán)利要求10-18中 任一項所述的納米顆粒在診斷或治療以下疾病中的應(yīng)用：自身免疫性疾病，如:胰島素依賴 型糖尿病，多發(fā)性硬化癥，干燥綜合征或系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);皮膚病，如：牛皮癬或過敏 性皮炎;慢性炎癥性疾病，如:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或炎癥性腸疾病;組織損傷;變應(yīng)性疾病和癌 癥。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述的納米顆粒在制備造影劑中的 應(yīng)用。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述的納米顆粒，其特征在于，所述 造影劑被用于識別癌細胞或原位癌細胞。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì)或所述的納米顆粒，其特征在于，被識 別的所述癌細胞選自： a) 腺癌細胞； b) 胸腺上皮腫瘤細胞； c) 宮頸癌細胞； d) 非霍奇金淋巴瘤細胞； e) 肺細胞癌細胞； f) 胰腺癌細胞；以及 g)癌癥干細胞。23. -種藥物組合物，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的⑶44ex9結(jié)合 蛋白質(zhì)或者根據(jù)權(quán)利要求10-18中任一項所述的納米顆粒以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。24. -種藥物/放射量測定器組合套裝，包括： a) -種被單獨給藥的藥物，和 b) -種針對特定病人屬性的診斷指示系統(tǒng)，所述屬性與施用給病人的藥劑的效應(yīng)，gij 作用，相互作用，新陳代謝，吸收，分布，代謝以及消除有關(guān)； 其中，所述特定病人屬性選自內(nèi)源性物質(zhì)，調(diào)節(jié)機制，基因或指標(biāo)體系，并且 其中，所述藥物或所述診斷指示系統(tǒng)包含根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的CD44ex9結(jié)合蛋白質(zhì) 或根據(jù)權(quán)利要求10-18中任一項所述的納米顆粒。
【文檔編號】A61P35/00GK106061496SQ201480069981
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月22日
【發(fā)明人】克勞迪婭·阿恩茨, 沃爾夫?qū)じ窭撞?
【申請人】交換成像技術(shù)股份有限公司