用于癌癥免疫療法的新穎的靶向msln的dna疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種減毒沙門氏菌屬突變株，其包含編碼間皮素的重組DNA分子。具體地，本發(fā)明涉及所述減毒沙門氏菌屬突變株在癌癥免疫療法中的用途。
【專利說明】
用于癌癥免疫療法的新穎的靶向MSLN的DNA疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及減毒的沙門氏菌屬（Salmonella)突變株，其包含編碼間皮素的重組 DNA分子。具體地，本發(fā)明涉及所述減毒沙門氏菌屬突變株在癌癥免疫療法中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 間皮素是一種存在于多種人實體瘤的細胞表面上的糖基-磷脂酰肌醇錨定的糖蛋 白。用單克隆抗體(mAb)Kl首次鑒別出間皮素(Chang等人，1992)。間皮素(MSLN)基因編碼一 種71-kDa前體蛋白，其被加工成40-kDa糖基-磷脂酰肌醇錨定的蛋白（即mAB K1所結(jié)合的成 熟部分，被稱作間皮素)和NH2-端31-kDa片段(被稱作巨核細胞促進因子，其從細胞釋放）。 間皮素是一種以低水平存在于有限集合的正常成年組織(諸如間皮)上的腫瘤分化抗原，但 是在間皮瘤、卵巢和胰腺癌中異常地過表達(Hassan等人，2004)。因而，MSLN對于癌癥疫苗 的開發(fā)而言是一種有前途的候選物。
[0003] 間皮素(MSLN)已經(jīng)被描述為免疫療法的革E1抗原(Hassan等人，Clin Cancer Res, 2004)。幾種免疫治療方案已經(jīng)用于靶向過表達MSLN的腫瘤類型。Hassan等人(Clin Cancer Res，2004)公開了在成年裸鼠中表現(xiàn)出抗腫瘤活性的抗-間皮素免疫毒素 SSlP[SSl(dsFv) PE38]。近年來，已經(jīng)開始了幾個早期臨床試驗，它們基于通過快速推注或連續(xù)靜脈內(nèi)輸注 來施用抗-間皮素免疫毒素 SS1P或嵌合的抗-間皮素單克隆抗體M0RAb-009(綜合總結(jié)在 Kelly等人，Mol Cancer Ther 2012中）。目前在I/II期臨床試驗中試驗的另一個免疫治療 方案是基于抗-間皮素改造的淋巴細胞的施用（Cl inicalTrials . gov ; Identifyers %1'01355965和％1'01439152)。〇11即等人（(：1丨11〇311〇611^8,2012)公開了基于單核細胞增 生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的間皮素疫苗，其以靜脈內(nèi)方式施用。Yamasaki等 人(Int J Cancer，2013)公開了基于人腺病毒40的靜脈內(nèi)遺傳間皮素疫苗。
[0004] 腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)的減毒衍生物是用于將異種抗原遞送至哺 乳動物免疫系統(tǒng)的有吸引力的媒介物，因為腸道沙門氏菌(S.enterica)菌株可以潛在地通 過免疫接種的粘膜途徑（即口服地或經(jīng)鼻地)遞送，這會提供與胃腸外施用相比的簡單性和 安全性的優(yōu)點。此外，沙門氏菌屬菌株會在全身和粘膜隔室的水平引起強烈的體液和細胞 免疫應(yīng)答。批制備成本較低，并且活細菌疫苗的制劑是高度穩(wěn)定的。減毒可以通過刪除多個 基因（包括毒力基因、調(diào)芐基因和代謝基因）來完成。
[0005] 已經(jīng)證實幾種通過aro突變減毒的鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)菌 株是異種抗原在動物模型中的安全且有效的遞送媒介物。
[0006] 在W0 03/073995中描述了通過活的減毒鼠傷寒沙門氏菌菌株向小鼠靶細胞中遞 送DNA構(gòu)建體的方案，所述DNA構(gòu)建體編碼抗原、尤其是腫瘤間質(zhì)抗原VEGFRaNiethammer等 人（Nature Medicine 2002,8(12) ,1369)證實，攜帶編碼鼠血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR-2或FLK-1)(其是腫瘤血管生成所必需的）的表達載體的減毒的鼠傷寒沙門氏菌 (S. typhimurium)aroA菌株SL7207可作為癌癥疫苗起作用。
[0007] 但是，僅存在一種減毒的腸道沙門氏菌血清變型菌株，即腸道沙門氏菌傷寒血清 變型Ty21a(縮寫：S. typhi Ty21a)，其已經(jīng)被接受用于人類中，且以Viv.OtiflBerna Biotech Ltd·, a Crucell Company, Switzerland;日期為1996年 12 月16 日的銷售許可號 PL 15747/0001)的商品名稱進行分配。
[0008] 這種良好耐受的針對傷寒的活口服疫苗通過野生型毒性細菌分離物S.typhi Ty2 的化學(xué)誘變而衍生出，且攜帶galE基因中的功能缺失突變以及其它不太確定的突變。在它 在實地試驗中被證實有效和安全以后，它已經(jīng)在許多國家被許可作為傷寒疫苗。
[0009] W0 2013/091898公開了一種用于培養(yǎng)減毒突變的傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi)菌株的方法，所述菌株缺少半乳糖差向異構(gòu)酶活性且攜帶重組DNA分子。
[0010] MSLN對于癌癥疫苗的開發(fā)而言是一種有前途的腫瘤抗原。以前可得到的MSLN疫苗 的主要限制是經(jīng)由靜脈內(nèi)施用途徑的施用和有關(guān)的副作用。對基于靶向MSLN的改進癌癥治 療方案的巨大需求到目前為止尚未得到滿足。
[0011] 發(fā)明目的
[0012] 考慮到現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的一個目的是提供一種新穎的靶向MSLN的口服癌癥疫 苗。這樣的靶向MSLN的癌癥疫苗會為改善癌癥患者的治療選擇提供重大優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 在一個方面，本發(fā)明涉及減毒沙門氏菌屬突變株，其包含重組DNA分子的至少一個 拷貝，所述重組DNA分子包含編碼間皮素(MSLN)的表達盒。
[0014] 本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬菌株經(jīng)證實在健康小鼠中引起強烈的免疫應(yīng)答。據(jù)發(fā)明 人所知，該新穎的減毒沙門氏菌屬菌株是第一種靶向MSLN的口服癌癥疫苗。由于MSLN在間 皮瘤、卵巢癌、胰腺癌和多種其它腫瘤中過表達，本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬菌株作為用于治 療這些適應(yīng)癥的癌癥疫苗具有巨大潛力。
[0015] 在第一個研究中，已經(jīng)證實了根據(jù)本發(fā)明的疫苗(VXM04)會在健康小鼠中引起強 烈的MSLN-特異性的免疫應(yīng)答。這些結(jié)果指示，使用VXM04的疫苗接種可以導(dǎo)致免疫應(yīng)答和 針對過表達MSLN的腫瘤細胞的免疫記憶的發(fā)展。值得注意和驚人的是，新穎的疫苗VXM04在 相對較低的劑量是有效的。本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬突變株可以應(yīng)用在單一療法中或與第 二種減毒沙門氏菌屬突變株聯(lián)合應(yīng)用，所述第二種減毒沙門氏菌屬突變株包含編碼第二種 腫瘤抗原的DNA分子。此外，本發(fā)明的減毒突變株可以與化學(xué)療法、放射療法或生物學(xué)癌癥 治療聯(lián)合施用。如果患者已經(jīng)形成對化學(xué)療法的抗性(化療難治的患者），使用VXM04的治療 也可能是有效的。因此，本發(fā)明的新穎的減毒沙門氏菌屬菌株可能用在新穎的、巨大改進的 癌癥治療方案中。
[0016] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株屬于腸道沙門氏菌種。在特定實 施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株是傷寒沙門氏菌Ty21a。
[0017] 在特定實施方案中，所述表達盒是真核表達盒。
[0018] 在特定實施方案中，MSLN選自人MSLN和與其具有至少約80%序列同一性的蛋白。 [0019]在特定實施方案中，所述MSLN具有如在SEQ ID NO 1中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。
[0020]在特定實施方案中，所述重組DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMBlori和 在CMV啟動子控制下的真核表達盒，所述真核表達盒編碼人MSLN或與其具有至少80%序列 同一性的蛋白。在特定實施方案中，人MSLN具有如在SEQ ID N0 2中發(fā)現(xiàn)的核酸序列。
[0021 ]在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株用于用作藥物。
[0022]在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株用于用作疫苗。
[0023] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株用于用在癌癥免疫療法中。
[0024] 在特定實施方案中，癌癥免疫療法還包括施用一種或多種其它減毒沙門氏菌屬突 變株，其包含重組DNA分子的至少一個拷貝，所述重組DNA分子包含編碼腫瘤抗原和/或腫瘤 間質(zhì)抗原的表達盒。在特定實施方案中，所述一種或多種其它減毒沙門氏菌屬突變株是包 含真核表達盒的傷寒沙門氏菌Ty21a。在特定實施方案中，所述一種或多種其它沙門氏菌屬 菌株包括編碼腫瘤間質(zhì)抗原人VEGFR-2和/或腫瘤抗原人威爾曼瘤蛋白（WT1)的減毒沙門氏 菌屬突變株。
[0025] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株與所述一種或多種其它減毒沙門 氏菌屬突變株共同施用。
[0026] 在特定實施方案中，癌癥免疫療法伴有化學(xué)療法、放射療法或生物學(xué)癌癥治療。
[0027] 在特定實施方案中，在化學(xué)療法或放射療法治療周期中或在生物學(xué)癌癥治療過程 中施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。
[0028] 在特定實施方案中，在化學(xué)療法或放射療法治療周期之前或在生物學(xué)癌癥治療之 前施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。
[0029] 在特定實施方案中，在化學(xué)療法或放射療法治療周期之后或在生物學(xué)癌癥治療之 后施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。
[0030] 在其它實施方案中，在化學(xué)療法、放射療法治療周期和生物學(xué)癌癥治療中的至少 一個之前和過程中施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。在進行化學(xué)療法、放射療法和生物學(xué) 癌癥治療中的超過一種的情況下，可以在這些療法中的至少一種之前或過程中或者之前和 過程中、特別是在這些療法中的至少兩種的過程中施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。
[0031] 在特定實施方案中，口服地施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。
[0032] 在特定實施方案中，所述癌癥選自間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宮頸的鱗狀細胞癌、 頭頸癌、外陰癌、肺和食管癌、肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌、雙相性滑膜肉瘤、結(jié)締組織增生性小圓 細胞腫瘤和胃腺癌。
[0033] 在特定實施方案中，單次劑量是約105至約1011個、特別是約106至約10 1()個、更特別 是約106至約109個、更特別是約106至約10 8個、最特別是約106至約107個菌落形成單位 (CFU)〇
[0034] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株用在個體化的癌癥免疫療法中， 所述個體化的癌癥免疫療法包括評估患者的MSLN表達模式和/或針對MSLN的免疫前應(yīng)答的 步驟。
【具體實施方式】
[0035]通過參考以下發(fā)明詳述和其中包含的實施例，可以更容易地理解本發(fā)明。
[0036]在一個方面，本發(fā)明涉及一種減毒沙門氏菌屬突變株，其包含重組DNA分子的至少 一個拷貝，所述重組DNA分子包含編碼間皮素(MSLN)的表達盒。
[0037]根據(jù)本發(fā)明，所述減毒沙門氏菌屬菌株充當(dāng)包含編碼間皮素(MSLN)的表達盒的重 組DNA分子的細菌載體用于將所述重組DNA分子遞送進靶細胞中。
[0038] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"減毒的"表示這樣的細菌菌株:其具有與不攜帶減毒 突變的親本細菌菌株相比降低的毒力。減毒的細菌菌株已經(jīng)優(yōu)選地喪失它們的毒力，但是 保留它們的誘導(dǎo)保護性免疫的能力。減毒可以通過刪除多個基因（包括毒力基因、調(diào)芐基因 和代謝基因）來完成。減毒的細菌可以天然地存在，或它們可以在實驗室中人工地產(chǎn)生，例 如通過適應(yīng)新的培養(yǎng)基或細胞培養(yǎng)物，或它們通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。
[0039] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"突變株"表示在它的基因組中攜帶突變的細菌菌株。 在該背景下，術(shù)語"突變"表示核酸序列中的變化，包括點突變、插入、缺失、易位和倒位。
[0040] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"包含"或"包括"是指"包括、但不限于"。該術(shù)語意圖是 開放式的，以指定任何所述的特征、元件、整數(shù)、步驟或組分的存在，但是不排除一個或多個 其它特征、元件、整數(shù)、步驟、組分或其集合的存在或添加。術(shù)語"包含"因而包括更限制性的 術(shù)語"由……組成"和"基本上由……組成"。在一個實施方案中，貫穿本申請和尤其是在權(quán) 利要求書內(nèi)使用的術(shù)語"包含"可以用術(shù)語"由……組成"替代。
[0041] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"重組DNA分子"表示經(jīng)工程改造的DNA構(gòu)建體，優(yōu)選地 由不同起源的DNA片段組成。所述重組DNA分子可以是直鏈核酸，或優(yōu)選地，是通過將編碼 MSLN的開放讀碼框引入表達載體質(zhì)粒中而產(chǎn)生的環(huán)狀重組DNA質(zhì)粒。
[0042] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"表達盒"表示至少包含MSLN基因的核酸單元，其在控 制它的表達的調(diào)節(jié)序列的控制下。在所述減毒沙門氏菌屬突變株中包含的表達盒可以優(yōu)選 地介導(dǎo)包含的編碼MSLN的開放讀碼框在靶細胞中的轉(zhuǎn)錄。表達盒典型地包含啟動子、至少 一個開放讀碼框和轉(zhuǎn)錄終止信號。
[0043] 間皮素是一種存在于正常間皮細胞上并在幾種人腫瘤(包括間皮瘤和卵巢和胰腺 腺癌）中過表達的40-kDa細胞表面糖蛋白。間皮素基因編碼一種71-kDa前體蛋白，其被加工 以產(chǎn)生31-kDa脫落蛋白（shed protein)(被稱作巨核細胞促進因子(MPF))和40-kDa細胞結(jié) 合片段間皮素。證實了間皮素在有白介素-3存在下表現(xiàn)出巨核細胞-集落形成活性。間皮素 是一種以低水平存在于有限集合的正常成年組織(諸如間皮)上的腫瘤分化抗原，但是在多 種人腫瘤中異常地過表達，所述人腫瘤包括間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宮頸的鱗狀細胞癌、 頭頸癌、外陰癌、肺和食管癌、肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌、雙相性滑膜肉瘤、結(jié)締組織增生性小圓 細胞腫瘤和胃腺癌。間皮素的正常生物學(xué)功能是未知的。在間皮素敲除的小鼠中的研究沒 有揭示可檢測的表型，并且雄性和雌性小鼠都產(chǎn)生健康的后代。在胰腺癌中的研究提示，間 皮素通過增加細胞增殖、迀移和S-期細胞群體而在腫瘤發(fā)生中起作用。此外，有證據(jù)表明， 間皮素是一種免疫原性蛋白。由于它的表達模式、它的致癌功能和它的免疫原性潛力，腫瘤 抗原間皮素對于癌癥疫苗的開發(fā)而言是一種有前途的候選物。
[0044] 間皮素是一種以低水平存在于有限集合的正常成年組織(諸如間皮)上的腫瘤分 化抗原，但是在間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌中異常地過表達(Hassan等人,2004)。因而，MSLN對 于癌癥疫苗的開發(fā)而言是一種有前途的候選物。
[0045] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株屬于腸道沙門氏菌種。在特定實 施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株是傷寒沙門氏菌Ty21a。所述減毒的S.typhi Ty21a 菌株是 TyphoralX^ 也被稱作 VivOtii'K 由Berna Biotech Ltd·, a Crucell Company, Switzerland制造）的活性組分。目前它是唯一被許可的針對傷寒的口服活疫苗。該疫苗已 經(jīng)經(jīng)過廣泛試驗并被證實關(guān)于患者毒性以及向第三方的傳播而言是安全的(Wahdan等人， J. Infectious Diseases 1982，145:292-295)。該疫苗在超過40個國家中被許可。Typhoral JL?的銷售許可號是日期為1996年12月16日的PL 15747/0001。一劑疫苗含有至少2xl09個 存活的S.typhi Ty21a菌落形成單位和至少5xl09個非存活的S.typhi Ty21a細胞。
[0046]傷寒沙門氏菌Ty21a細菌菌株的生化性能之一是它不能代謝半乳糖。所述減毒的 細菌菌株也不能將硫酸鹽還原成硫化物，這將它與野生型傷寒沙門氏菌Ty2菌株區(qū)分開。關(guān) 于它的血清學(xué)特征，傷寒沙門氏菌Ty21a菌株含有09-抗原(這是一種細菌外膜多糖)且缺乏 05-抗原(這又是鼠傷寒沙門氏菌的一種特征性組分）。該血清學(xué)特征支持在用于批次放行 的一組鑒別試驗中包括各個試驗的原理。
[0047]在特定實施方案中，所述表達盒是真核表達盒。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"真核 表達盒"表示允許開放讀碼框在真核細胞中表達的表達盒。已經(jīng)證實，誘導(dǎo)適當(dāng)免疫應(yīng)答所 需的異種抗原的量可能對于細菌而言是有毒的，并導(dǎo)致細胞死亡、異種抗原的表達的過度 減少或缺失。使用在細菌載體中不表達、但是僅在靶細胞中表達的真核表達盒可能克服該 毒性問題，并且表達的蛋白可能顯示真核糖基化模式。
[0048] 真核表達盒包含能夠控制開放讀碼框在真核細胞中的表達的調(diào)節(jié)序列，優(yōu)選啟動 子和多腺苷酸化信號。在本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬突變株所包含的重組DNA分子中所含的 啟動子和多腺苷酸化信號優(yōu)選地選擇成在要免疫的受試者的細胞內(nèi)起作用。合適的啟動子 (特別對于用于人類的DNA疫苗的生產(chǎn)而言）的例子包括、但不限于來自巨細胞病毒（CMV) (諸如強CMV立即早期啟動子）、猿猴病毒40 (SV40)、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷 病毒(HIV)(諸如HIV長末端重復(fù)序列(LTR)啟動子）、莫洛尼病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV) 和勞斯肉瘤病毒(RSV)的啟動子，以及來自人基因（諸如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋 白、人肌肉肌酸和人金屬硫蛋白）的啟動子。在一個特定實施方案中，所述真核表達盒含有 CMV啟動子。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"CMV啟動子"表示強立即早期巨細胞病毒啟動子。
[0049] 合適的多腺苷酸化信號(特別對于用于人類的DNA疫苗的生產(chǎn)而言）的例子包括、 但不限于牛生長激素(BGH)多腺苷酸化位點、SV40多腺苷酸化信號和LTR多腺苷酸化信號。 在一個特定實施方案中，在本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬突變株所包含的重組DNA分子中所含 的真核表達盒包含BGH多腺苷酸化位點。
[0050] 除了異源MSLN基因的表達所需的調(diào)節(jié)元件(如啟動子和多腺苷酸化信號）以外，在 重組DNA分子中還可以包括其它元件。這樣的另外的元件包括增強子。所述增強子可以是， 例如，人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸的增強子，和病毒增強子諸如來自 CMV、RSV和EBV的那些。
[0051] 調(diào)節(jié)序列和密碼子通常是物種依賴性的，所以為了使蛋白生產(chǎn)最大化，調(diào)節(jié)序列 和密碼子優(yōu)選地選擇成在要免疫的物種中是有效的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以生產(chǎn)在給定的受 試者物種中有功能的重組DNA分子。
[0052]在特定實施方案中，MSLN選自人MSLN和與其具有至少約80%序列同一性的蛋白。
[0053]在該背景下，術(shù)語"約"或"大約"是指，在給定的值或范圍的80%至120%內(nèi)，可替 換地在90%至110%內(nèi)，包括在95%至105%內(nèi)。
[0054]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"與人MSLN具有至少約80%序列同一性的蛋白"表示在 人MSLN的氨基酸序列和/或編碼人MSLN的氨基酸序列的核酸序列中存在差異的蛋白。所述 蛋白可以具有天然來源，例如不同物種的MSLN的同系物，或是經(jīng)工程改造的蛋白，例如經(jīng)工 程改造的MSLN衍生物。已知的是，密碼子的使用在物種之間是不同的。因而，當(dāng)在靶細胞中 表達異源蛋白時，使核酸序列適應(yīng)靶細胞的密碼子使用可能是必要的，或至少是有用的。用 于設(shè)計和構(gòu)建給定蛋白的衍生物的方法是本領(lǐng)域的任何普通技術(shù)人員眾所周知的。
[0055]與人MSLN具有至少約80 %序列同一性的蛋白可以含有一個或多個突變，所述突變 包括一個或多個氨基酸的添加、缺失和/或置換。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，所述缺失、添加和/或 置換的氨基酸可以是連續(xù)氨基酸，或可以散布在與人MSLN具有至少約80%序列同一性的蛋 白的氨基酸序列的長度上。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可以添加、缺失和/或置換任意數(shù)目的氨基 酸，只要與人MSLN的序列同一性是至少約80%即可。在特定實施方案中，與人MSLN的序列同 一 1性是至少約80%、至少約85%、至少約90%，或最特別地是至少約95%。用于確定序列同 一性的方法和算法(包括對比親本蛋白和它的與親本序列相比具有缺失、添加和/或置換的 衍生物)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員眾所周知的。在DNA水平，編碼與人MSLN具有至少約80% 序列同一性的蛋白的核酸序列可以由于遺傳密碼的簡并性而具有更大程度的差異。
[0056]在特定實施方案中，MSLN具有如在SEQ ID NO 1中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。
[0057]在特定實施方案中，所述重組DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMBlori和 在CMV啟動子控制下編碼人MSLN或與其具有至少80%序列同一性的蛋白的真核表達盒。在 特定實施方案中，人MSLN具有如在SEQ ID N0 2中發(fā)現(xiàn)的核酸序列。
[0058]在特定實施方案中，所述重組DNA分子源自商購可得的達質(zhì)粒 (Invitrogen，San Diego，California)。通過用pBR322的低拷貝pMBl復(fù)制起點替換高拷貝 PUC復(fù)制起點，改造該表達載體。進行所述低拷貝改造，以便減小代謝負擔(dān)和使得所述構(gòu)建 體更穩(wěn)定。產(chǎn)生的表達載體骨架被命名為PVAX10。通過Nhel/Xhol將具有在SEQ ID N0 2中 發(fā)現(xiàn)的核酸序列的人MSLN插入該表達載體骨架中，產(chǎn)生表達質(zhì)粒pVAXl 0. hMSLN。在圖3中示 意地描繪了表達質(zhì)粒PVAX10. hMSLN。
[0059] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株用于用作藥物。
[0060] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株用于用作疫苗。
[0061] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"疫苗"表示在施用后能夠在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的 試劑。疫苗優(yōu)選地可以預(yù)防、改善或治療疾病。根據(jù)本發(fā)明的疫苗包含減毒沙門氏菌屬突變 株，優(yōu)選s.typhi Ty21a。根據(jù)本發(fā)明的疫苗還包含重組DNA分子的至少一個拷貝，所述重組 DNA分子包含編碼MSLN的表達盒，優(yōu)選真核表達盒，所述MSLN優(yōu)選地選自人MSLN或與其具有 至少約80 %序列同一性的蛋白。
[0062]包含編碼MSLN的重組DNA分子的、根據(jù)本發(fā)明的活的減毒沙門氏菌屬突變株可以 用作用于口服遞送該重組DNA分子的媒介物。這樣的包含編碼異種抗原(諸如MSLN)的DNA分 子的遞送載體被稱作DNA疫苗。
[0063]基因免疫接種可能比常規(guī)疫苗接種有利。靶DNA可以在相當(dāng)長的時間段內(nèi)檢測到， 因而充當(dāng)抗原的儲庫。在某些質(zhì)粒中的序列基序(如GpC島）是免疫刺激性的，且可以充當(dāng)被 LPS和其它細菌組分引起的免疫刺激促進的佐劑。
[0064]活細菌載體在原位產(chǎn)生它們自己的免疫調(diào)節(jié)因子諸如脂多糖(LPS)，這可以構(gòu)成 勝過其它施用形式(諸如微囊化)的一個優(yōu)點。此外，天然進入途徑的應(yīng)用證實是有利的，因 為許多細菌（如沙門氏菌屬)通過派伊爾斑的Μ細胞從腸腔流出并最終迀移進淋巴結(jié)和脾 中，從而允許疫苗靶向免疫系統(tǒng)的誘發(fā)位點。迄今為止已經(jīng)證實傷寒沙門氏菌的疫苗菌株 Ty21a具有優(yōu)良的安全性。在通過Μ細胞從腸腔離開后，所述細菌被吞噬細胞(諸如巨噬細胞 和樹突細胞)攝入。這些細胞被病原體活化并開始分化，并且可能迀移進淋巴結(jié)和脾中。由 于它們的減毒突變，S.typhi Ty21菌株的細菌不能在這些吞噬細胞中持續(xù)，而是在該時間 點死亡。重組DNA分子被釋放并隨后通過特定運輸系統(tǒng)或通過胞內(nèi)體滲漏轉(zhuǎn)移進吞噬性免 疫細胞的胞質(zhì)溶膠中。最后，重組DNA分子進入細胞核中，在此處它們被轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致吞噬細胞 的胞質(zhì)溶膠中的MSLN表達?；罨目乖蔬f細胞會誘導(dǎo)針對MSLN的特異的細胞毒性的T細 胞。
[0065] 迄今為止還沒有可得到的數(shù)據(jù)指示，S.typhi Ty21a能夠全身地進入血流中?；畹?減毒的傷寒沙門氏菌Ty21a疫苗菌株因而允許免疫系統(tǒng)的特異性靶向，同時表現(xiàn)出優(yōu)良的 安全性。相反，基于腺病毒的DNA疫苗可能帶有不希望的病毒復(fù)制的固有風(fēng)險。
[0066]腸道沙門氏菌的減毒衍生物作為將異種抗原遞送至哺乳動物免疫系統(tǒng)的媒介物 是有吸引力的，因為腸道沙門氏菌菌株可以潛在地通過免疫接種的粘膜途徑（即口服地或 經(jīng)鼻地)遞送，這會提供與胃腸外施用相比的簡單性和安全性的優(yōu)點。此外，沙門氏菌屬菌 株會在全身和粘膜隔室的水平引起強烈的體液和細胞免疫應(yīng)答。
[0067] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株用于用在癌癥免疫療法中。
[0068] 在特定實施方案中，癌癥免疫療法還包括施用一種或多種其它減毒沙門氏菌屬突 變株，其包含重組DNA分子的至少一個拷貝，所述重組DNA分子包含編碼腫瘤抗原和/或腫瘤 間質(zhì)抗原的表達盒。在特定實施方案中，所述一種或多種其它沙門氏菌屬突變株是包含真 核表達盒的傷寒沙門氏菌Ty21a。在特定實施方案中，所述一種或多種其它沙門氏菌屬菌株 包括編碼人VEGFR-2和/或人威爾曼瘤蛋白（WT1)的減毒沙門氏菌屬突變株。
[0069] 將本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬突變株與包含編碼第二種腫瘤抗原的DNA分子的第二 種減毒突變株組合可能具有協(xié)同抗腫瘤作用。具體地，不同腫瘤抗原的同時靶向可能使腫 瘤逃逸的風(fēng)險最小化。將基于MSLN的癌癥免疫療法與基于VEGFR-2的免疫療法組合可以證 實是特別有效的，因為過表達MSLN的腫瘤細胞和腫瘤脈管系統(tǒng)同時受到攻擊。
[0070] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株與所述一種或多種其它減毒沙門 氏菌屬突變株共同施用。
[0071 ] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"共同施用（"co-administration"或"coadminister" ） 是指，在連續(xù) 3 天內(nèi) ，更特別地在連續(xù) 2 天內(nèi) ，更特別地在同一天，更特別地在 12小時內(nèi)，施用兩種不同的減毒沙門氏菌屬突變株。最特別地，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語 "共同施用"表示兩種不同的減毒沙門氏菌屬突變株的同時施用。
[0072] 在特定實施方案中，癌癥免疫療法伴有化學(xué)療法、放射療法或生物學(xué)癌癥治療。為 了治愈癌癥，癌癥干細胞的完全根除可能是必需的。為了最大效力，不同治療方案的組合可 能是有益的。
[0073] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"生物學(xué)癌癥治療"表示包括使用活生物體、從活生物 體衍生出的物質(zhì)、或這樣的物質(zhì)的實驗室生產(chǎn)的形式的癌癥治療。一些生物學(xué)癌癥療法目 標(biāo)在于刺激身體的免疫系統(tǒng)以針對癌細胞起作用(所謂的生物學(xué)癌癥免疫療法）。生物學(xué)癌 癥治療方案包括遞送腫瘤抗原、遞送作為藥物的治療性抗體、施用免疫刺激性的細胞因子 和施用免疫細胞。治療性抗體包括靶向腫瘤抗原或腫瘤間質(zhì)抗原的抗體以及充當(dāng)檢驗點抑 制劑的抗體，諸如抗-PD-1、抗-PD-L1和抗-CTLA4。
[0074]可以與本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬突變株聯(lián)合使用的化學(xué)治療劑可以是，例如：吉 西他濱、氨磷汀(阿密磷定）、卡巴他賽、順鉑、達卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、多西他賽、氮芥、 鏈佐星、環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素）、多柔比星脂質(zhì)體 (doxil)、亞葉酸、吉西他濱(健擇）、柔紅霉素、柔紅霉素脂質(zhì)體(daunoxome)、丙卡巴肼、酮 康唑、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶（5-FU)、長春堿、長春新堿、博 來霉素、紫杉醇(泰素）、多西他賽(泰索帝）、阿地白介素、天門冬酰胺酶、白消安、卡鉑、克拉 屈濱、喜樹喊、CPT-11、10-羥基_7_乙基-喜樹喊(SN38)、達卡巴嗪、氣尿苷、氣達拉濱、羥基 脲、異環(huán)磷酰胺、伊達比星、美司鈉、干擾素 α、干擾素 β、伊立替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙 瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、奧沙利鉑、普卡霉素、米托坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊 溴烷、普卡霉素、鏈佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睪內(nèi)酪、硫鳥嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、長春 瑞濱、苯丁酸氮芥和它們的組合。
[0075]與VXM04組合的根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選化學(xué)治療劑是卡巴他賽、卡鉑、奧沙利鉑、順 鉑、環(huán)磷酰胺、多西他賽、吉西他濱、多柔比星、紫杉醇(泰素）、伊立替康、長春新堿、長春堿、 長春瑞濱、亞葉酸、5-氟尿嘧啶和博來霉素，特別是吉西他濱。
[0076] 取決于可能副作用的發(fā)生，也可能有利的是，包括使用抗生素或抗炎劑的治療。
[0077] 如果發(fā)生類似于由組胺、白三烯或細胞因子介導(dǎo)的超敏反應(yīng)的不利事件，則對于 發(fā)熱、過敏反應(yīng)、血壓不穩(wěn)定性、支氣管痙攣和呼吸困難的治療選擇是可利用的。不希望的 Τ-細胞衍生的自身攻擊的情況下的治療選擇源自在干細胞移植以后在急性和慢性移植物 抗宿主病中應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。環(huán)孢菌素和糖皮質(zhì)激素被提議作為治療選擇。
[0078] 在不太可能的全身性傷寒沙門氏菌Ty21a型感染的情況下，推薦適當(dāng)?shù)目股丿?法，例如使用熒光喹諾酮類，包括環(huán)丙沙星或氧氟沙星。胃腸道的細菌感染應(yīng)當(dāng)用各種藥劑 治療，諸如利福昔明。
[0079]在特定實施方案中，在化學(xué)療法或放射療法治療周期中或在生物學(xué)癌癥治療過程 中施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。
[0080] 在特定實施方案中，在化學(xué)療法或放射療法治療周期之前或在生物學(xué)癌癥治療之 前施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。該方案可能具有可以在增強的癌癥免疫的條件下執(zhí)行 化學(xué)療法或放射療法的優(yōu)點。
[0081] 在特定實施方案中，在化學(xué)療法或放射療法治療周期之后或在生物學(xué)癌癥治療之 后施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。
[0082] 在特定實施方案中，口服地施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。口服施用比胃腸外 施用更簡單、更安全和更舒適。相反，Dung等人(Clin Cancer Res,2012)描述的活細菌疫苗 (諸如基于單核細胞增生李斯特菌的間皮素疫苗）的靜脈內(nèi)施用最初會造成與膿毒癥型的 安全性風(fēng)險有關(guān)的菌血癥。因而，活細菌疫苗的靜脈內(nèi)施用需要小心地觀察和監(jiān)測臨床征 狀諸如細胞因子釋放。本發(fā)明的減毒突變株的口服施用可以至少部分地克服所述的風(fēng)險。 但是，必須指出，本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬突變株也可以通過任意其它合適的途徑來施用。 優(yōu)選地，將治療有效劑量施用給受試者，并且該劑量取決于特定應(yīng)用、惡性腫瘤的類型、受 試者的重量、年齡、性別和健康狀態(tài)、施用方式和制劑等。根據(jù)需要，施用可以是單次或多 次。
[0083] 本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬突變株可以以溶液、混懸液、凍干粉劑或任意其它適合 形式的形式提供。它可以與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑聯(lián)合提供。還可以包 括用于調(diào)節(jié)pH值的試劑、緩沖劑、用于調(diào)節(jié)毒性的試劑等。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"藥學(xué) 上可接受的"表示當(dāng)施用給哺乳動物（例如，人)時生理學(xué)上可耐受的且通常不會產(chǎn)生不良 反應(yīng)的分子實體和藥物組合物的其它成分。術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"也可以是指被聯(lián)邦或州 政府的管理機構(gòu)批準(zhǔn)或在美國藥典或其它普遍公認的藥典中列出用于哺乳動物和更具體 地用于人類。
[0084] 在特定實施方案中，所述癌癥選自間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宮頸的鱗狀細胞癌、 頭頸癌、外陰癌、肺和食管癌、肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌、雙相性滑膜肉瘤、結(jié)締組織增生性小圓 細胞腫瘤和胃腺癌。
[0085] 本發(fā)明的疫苗在相對較低的劑量是驚人地有效的。在特定實施方案中，所述單次 劑量是約1〇5至約10 11個、特別是約1〇6至約1〇1()個、更特別是約1〇6至約1〇 9個、更特別是約1〇6 至約1〇8個、最特別是約1〇6至約1〇7個菌落形成單位(CFU)。低劑量的該活細菌疫苗的施用會 使排泄的風(fēng)險和因而向第三方傳播的風(fēng)險最小化。
[0086] 在該背景下，術(shù)語"約"或"大約"是指，在給定值或范圍的3倍內(nèi)，可替換地在2倍 內(nèi)，包括在1.5倍內(nèi)。
[0087] 在特定實施方案中，所述減毒沙門氏菌屬突變株用在個體化的癌癥免疫療法中， 所述癌癥免疫療法包括評估患者的MSLN表達模式和/或針對MSLN的免疫前應(yīng)答的步驟。 [0088] VXM04可以單獨地或者與其它包含真核表達系統(tǒng)的基于傷寒沙門氏菌Ty21a的癌 癥疫苗聯(lián)合地用于治療多種癌癥類型。在特定實施方案中，VXM04可以用于個體化的患者特 異性的癌癥治療。對于該目的，可以在第一步中評估患者的腫瘤和/或間質(zhì)抗原表達模式 和/或患者針對腫瘤和/或間質(zhì)抗原的免疫前應(yīng)答，例如通過靶向患者的特定腫瘤和/或間 質(zhì)抗原模式的伴隨診斷。取決于患者的腫瘤和/或間質(zhì)抗原表達模式或患者針對腫瘤和/或 間質(zhì)抗原的免疫前應(yīng)答，VMX04可以單獨地或者與一種或多種合適的其它包含真核表達系 統(tǒng)的基于傷寒沙門氏菌Ty21a的癌癥疫苗聯(lián)合地施用。但是，VXM04與一種或多種其它基于 傷寒沙門氏菌Ty21a的癌癥疫苗的組合也可以作為固定組合來施用。這些組合兩種或更多 種基于傷寒沙門氏菌Ty21a的癌癥疫苗的混合物可以由單獨的現(xiàn)成的產(chǎn)品組成。所述固定 的或個體化的組合可以含有VXM01(W0 2013/091898)作為抗血管生成的基本療法。
[0089] 圖和表的簡單描述
[0090] 圖1:在質(zhì)粒pVAXlO.hMSLN中包含的MSLN cDNA編碼的人MSLN的氨基酸序列
[0091] 圖2:pVAX10.hMSLN 的核酸序列
[0092] 圖3:pVAX10.hMSLN 的質(zhì)粒圖譜
[0093] 厘土通過MSLN-GSL-Penta檢測到的來自健康C57B1/6小鼠的脾中的間皮素-特異 性的⑶8+細胞的百分比。顯示了與用VXM-04m治療的小鼠整體對比的用VXM-04m-空治療的 小鼠整體的各個百分比。
[0094] 里互:通過MSLN-GSL-Penta檢測到的來自健康C57B1/6小鼠的脾中的間皮素-特異 性的⑶8+細胞的百分比。顯示了根據(jù)治療組分配的各個百分比。
[0095] 通過MSLN-GSL-Penta檢測到的來自健康C57B1/6小鼠的脾中的間皮素-特異 性的⑶8+細胞的百分比。顯示了根據(jù)治療組分配的各個百分比。
[0096] 里I:通過MSLN-IQL-Penta檢測到的來自健康C57B1/6小鼠的脾中的間皮素-特異 性的⑶8+細胞的百分比。顯示了與用VXM-04m治療的小鼠整體對比的用VXM-04m-空治療的 小鼠整體的各個百分比。
[0097]圖8:通過MSLN-IQL-Penta檢測到的來自健康C57B1/6小鼠的脾中的間皮素-特異 性的⑶8+細胞的百分比。顯示了根據(jù)治療組分配的各個百分比。
[0098] 里互:通過MSLN-IQL-Penta檢測到的來自健康C57B1/6小鼠的脾中的間皮素-特異 性的⑶8+細胞的百分比。顯示了根據(jù)治療組分配的各個百分比。
[0099] 表1:在Pentamer分析中使用的 Ρπ)51;>重組MHC Pentamer。
[0100] 實施例
[0101] 實施例1:重組質(zhì)粒pVAXlO .mMSLN和pVAXlO. hMSLN的制備
[0102] 將人 MSLN(1893bp，根據(jù) NCBI 參照序列 NM_013404.4的 MSLN 序列）和鼠 MSLN (1878bp，根據(jù) NCBI 參照序列 NM_018857.1 的 MSLN 序列）克隆進 pVAX10.VR2-l 衍生的 pVAXlO 骨架中。通過雙鏈基因合成產(chǎn)生MSLN DNA片段，其中使用熱穩(wěn)定的連接酶將寡核苷酸連接 在一起。將得到的連接產(chǎn)物通過PCR擴增。擴增后，通過Nhel/Xhol將體外合成的人和鼠 MSLN 的DNA片段克隆進pVAXlO骨架中（用人或鼠 MSLN替換重組質(zhì)粒pVAXlO. VR2-1的VEGFR-2編碼 區(qū)）。對于質(zhì)量控制，將整個質(zhì)粒測序并在轉(zhuǎn)化進大腸桿菌(E. coli)中以后與各個參照序列 比對。兩個序列都被證實沒有錯誤。得到的質(zhì)粒被命名為pVAXl 0. mMSLN和pVAXl 0. hMSLN。
[0103] 實施例2:用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌屬菌株:
[0104] 用質(zhì)粒pVAXIO.hMSLN轉(zhuǎn)化S.typhi Ty 21a。用質(zhì)粒pVAXIO.mMSLN轉(zhuǎn)化鼠傷寒沙門 氏菌SL7207(ar〇Aj。通過電穿孔執(zhí)行所述轉(zhuǎn)化。
[0105] 感受態(tài)沙門氏菌屬細胞的制備:
[0106]將S.typhi Ty21a和鼠傷寒沙門氏菌SL7207的甘油培養(yǎng)物接種在LB平板(無動物 組分的[ACF]大豆蛋白胨)上。將平板在37°C溫育過夜。將各一個菌落用于過夜-液體-預(yù)培 養(yǎng)。將接種了各一個菌落的3ml LB培養(yǎng)基(ACF大豆蛋白胨)在37°C和180rpm溫育過夜。為了 制備感受態(tài)細胞，給2x 300ml LB培養(yǎng)基(ACF大豆蛋白胨)接種3ml過夜培養(yǎng)物并在37°C和 180rpm溫育直到約0.5的OD6〇〇。然后將培養(yǎng)物放在冰上10分鐘。隨后，將細菌在3000xg在4°C 離心10分鐘，并將每種沉淀物再懸浮于500mL冰冷的H2〇d(3St中。一個新的離心步驟以后，將細 菌沉淀物在10%冰冷的甘油中洗滌2次。將兩個托盤一起放在2ml 10%甘油中，并最后在干 冰上在50yL的等分試樣中冷凍。使用的甘油不含有任何動物成分(Sigma Aldrich，G5150)。 [0則感受態(tài)沙門氏菌屬細胞的轉(zhuǎn)化:
[0108]對于每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將感受態(tài)細胞的50μ1等分試樣在冰上融化10分鐘。加入3-5yL 質(zhì)粒DNA(對于感受態(tài)S.typhi Ty21a細胞而言為pVAXlO.hMSLN，和對于感受態(tài)鼠傷寒沙門 氏菌SL7207細胞而言為pVAXlO .mMSLN)以后，將混合物在冰上溫育5分鐘。隨后，將混合物轉(zhuǎn) 移至預(yù)冷卻的比色皿（1mm厚度）。在12.5kV/cm進行電脈沖。此后立即將lml LB培養(yǎng)基(ACF 大豆蛋白胨)加給細胞，并將細胞轉(zhuǎn)移進2ml Eppendorf試管和在37°C搖動1小時。在臺式離 心機上的短離心步驟（16600rCf，20s)以后，將細菌沉淀物再懸浮于200μ1不含抗生素的LB (ACF大豆蛋白胨)培養(yǎng)基中。用Drigalski刮勺將混合物涂布于含有卡那霉素(濃度= 25yg/ ml或50μg/ml)的LB平板(ACF大豆蛋白胨）。將平板在37°C溫育過夜。
[0109] 重組沙門氏菌屬克隆的質(zhì)粒制備:
[0110]將每種重組沙門氏菌屬菌株的3個克隆在3ml含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)基 (ACF大豆蛋白胨）中在37°C溫育過夜。然后將細菌培養(yǎng)物通過離心（16600rCf，30s)進行沉 淀。使用來自Macherey-Nagel的NucleoSpin Plasmid Kit執(zhí)行質(zhì)粒分離。用50μ1水從硅膠 柱洗脫質(zhì)粒DNA。將5μ1洗脫液用在瓊脂糖凝膠電泳中進行對照。
[0111] 為了長期貯存，生產(chǎn)了陽性克隆的lml甘油培養(yǎng)物。為此目的，將172μ1甘油(無動 物成分)加入對數(shù)生長的3ml培養(yǎng)物在1低ml螺口微管中的828μ1培養(yǎng)基中。將樣品在-70°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0112] 從沙門氏菌屬分離的重組質(zhì)粒DNA的全測序:
[0113] 給3 m 1液體L B - K a η培養(yǎng)基（A C F大豆蛋白胨）接種重組沙門氏菌屬（攜帶 pVAXlO·hMSLN的S·typhi Ty21a和攜帶pVAXlO.mMSLN的鼠傷寒沙門氏菌SL7207)的一個菌 落并在37°C和180rpm溫育過夜。將過夜培養(yǎng)物通過在臺式離心機(Biofuge pico，Heraeus) 上在1300rpm離心30s進行沉淀。使用來自Macherey-Nagel的NucleoSpin Plasmid Kit執(zhí)行 質(zhì)粒分離。在高分子量基因組DNA和細胞組分的堿性裂解和沉淀以后，將質(zhì)粒DNA加載到具 有硅膠(silica)膜的柱上。一個洗滌步驟以后，將質(zhì)粒用50μ1無菌水從柱洗脫并測序。然后 通過克隆特異性的比對將序列與各個參照序列進行對比，即將每個沙門氏菌屬克隆的質(zhì)粒 序列逐個與參照序列比對。所有序列與各個參照序列一致。將重組沙門氏菌屬菌株命名為 VXM04(攜帶質(zhì)粒pVAXIO.hMSLN的S.typhi Ty21a)和VXM04m(攜帶質(zhì)粒pVAXIO.mMSLN的鼠傷 寒沙門氏菌SL7207)。
[0114] 實施例3:在健康的C57B1/6小鼠中評估VXM04m的免疫動力學(xué)
[0115] 通過Pentamer分析和ELISpot評價健康C57B1/6小鼠中針對鼠間皮素的特異性免 疫活化的動力學(xué)。作為陰性對照，在研究方案中包括載體對照組(接受VXM04m-空=不含有 表達質(zhì)粒的鼠傷寒沙門氏菌）以將期望的免疫學(xué)效應(yīng)與由沙門氏菌屬空載體造成的任何非 特異性的背景刺激區(qū)分開。在使用VXM04m和VXM04m-空(各10 1()CFU/劑)的4倍每2天疫苗接種 以后，在疫苗接種后05、07、010、014和021進行免疫監(jiān)測。
[0116] 1.動物維持
[0117] 從JANVIER(Le Genest St 1816^瓜1?^)得到52只健康雌性05781/6小鼠（在接收 時6周齡），并在無特定病原體(SPF)的動物監(jiān)護單元中觀察7天，然后開始程序。在溫度(23 ± 2 °C)、濕度(45 ± 10 % )、光周期（12h亮/12h暗)和空氣交換的受控條件下將動物維持在房 間中。將動物維持在SPF條件中。連續(xù)地監(jiān)測室溫和濕度。將空氣處理系統(tǒng)程序化為14次換 氣/小時，沒有再循環(huán)。使新鮮室外空氣穿過一系列過濾器，然后均勻地擴散進每個房間。在 實驗室中維持正壓（20 ± 4Pa)以防止污染或嚙齒動物群體內(nèi)的病原體的傳播。將動物圈養(yǎng) 在聚碳酸酯籠子(Techniplast，Limonest，法國）中，所述籠子配有提供食品和水的裝置。使 用的標(biāo)準(zhǔn)面積籠子是800cm 2,每個籠子最多10只小鼠（來自相同組）。動物的墊層是無菌玉 米軸墊層（參考:LAB COB 12，SERLAB，Cergy-Pontoise，法國），每周更換2次。動物木購自 DIETEX(Saint-Gratien,法國）。福照過的RM1用作無菌控制顆粒。從配有橡膠塞和snipper 管的水瓶隨意提供食品。將水瓶通過無菌過濾進行滅菌并每周更換2次。在D0,使用Vivo manager"'軟件(Biosystemes，Couternon,法國）根據(jù)它們各自的體重將52只小鼠中的50只 分成2組各25只小鼠。兩組的平均體重沒有統(tǒng)計不同（方差分析）。
[0118] 2.治療計劃
[0119] 來自組1 -5的小鼠接受VXM04m-空的施用，來自組6-10的動物接受VXM04m的施用。 將VXM04m-空和VXM04m融化并在30min內(nèi)施用，使用后拋棄工作溶液。VXM04m-空和VXM04m的 治療劑量是在每次施用的1〇〇μ1中的l〇1()CFU。以0. lml的體積通過經(jīng)口管飼法（口服，P0)用 插管施用VXM04m-空和VXM04m。不論動物組，在給藥之前每只動物接受給藥前應(yīng)用緩沖液以 中和胃中的酸（1 ΟΟμΙ/動物/應(yīng)用）。因而緩沖液由溶解在100ml飲用水中的2.6g碳酸氫鈉、 1.7g L-抗壞血酸、0.2g乳糖一水合物組成，并在應(yīng)用VXM04m-空和VXM04m之前30min內(nèi)應(yīng) 用。治療計劃如下：
[0120]來自組1-5的小鼠接受101QCFU的VXM04m-空的每天口服施用，每2天1次連續(xù)4次 (Q2Dx4)〇
[0121] 來自組6-10的小鼠接受101QCFU的VXM04m的每天口服施用，每2天1次連續(xù)4次 (Q2Dx4)〇
[0122] 3.動物監(jiān)測和處死
[0123] 每天記錄動物的生存力和行為，每周2次地測量體重。
[0124] 不論施用的沙門氏菌屬疫苗，在疫苗接種階段(每個動物組和時間點5只小鼠）以 后5天(組1和6)、7天(組2和7)、10天(組3和8)、14天(組4和9)和21天(組5和10)將小鼠處死。 在處死之前使用異氟烷(Baxter，法國）麻醉動物。通過頸椎脫位將動物處死。對所有處死的 動物執(zhí)行尸體剖檢（心臟、肺、肝、脾、腎和胃腸道的肉眼檢查）。在小鼠處死時，將脾收集并 逐個放入單個ID標(biāo)記的各自含有冷PBS(2-8°C)的試管中，并在2-8°C儲存過夜。將新鮮分離 的和純化的脾細胞用于Pentamer分析。將新鮮制備的⑶8+細胞用于ELISpot分析。
[0125] 4.脾細胞制備
[0126] 如下執(zhí)行脾細胞制備:在洗滌步驟中，拋棄PBS的一部分，并用新鮮PBS替換。將100 Mi尼龍Cell Strainer(BD Falcon)懸掛在含有5ml lx PBS的50ml Falcon的開口中。將脾 用解剖刀切割，然后用5ml注射器的柱塞推動穿過Cell Strainer。每個脾使用一個 Strainer，總是將Strainer在間隙之間用無菌lx PBS沖洗。將細胞在2-8°C在1，500rpm(大 約450g)離心10min，并拋棄上清液。每個脾加入lml ACK-Ery-Lysis緩沖液(8.3g/l冊4、 lg/lKHC03、0.037g/lEDTA;pH7.2-7.4)以裂解紅血細胞。將溶液在室溫溫育30秒。加入 10ml PBS，并將細胞在2-8°C在l，500rpm再次離心10min，拋棄上清液。將沉淀物再懸浮于 10ml DMEM培養(yǎng)基中。用錐蟲藍執(zhí)行活/死細胞染色，并計數(shù)細胞數(shù)目。將細胞混懸液分份用 于隨后分析。將約1 /3用于Pen tamer分析，將剩余用于EL I Spo t分析。
[0127] 5 · Pentamer 分析
[0128] Pentamer分析包括生存力染色和Pentamer染色。對于生存力染色，在除去帽子之 前，使1瓶熒光反應(yīng)性染料(Pacific Orange-組分A)和1瓶無水DMS0(組分B)達到室溫。將50 μL DMS0(組分B)加入反應(yīng)性染料(組分A)的瓶中。隨后，將孔混合，并用肉眼證實所有染料 已經(jīng)溶解。將反應(yīng)性染料的溶液在重構(gòu)的幾小時內(nèi)沒有遲延地使用。將含有至少lx 1〇6個 細胞的細胞混懸液離心并拋棄上清液。將細胞用lml PBS洗滌1次并再懸浮于lml PBS中。將 細胞計數(shù)，并將密度用PBS調(diào)至在lml體積中的lx 106個細胞。將ΙμL重構(gòu)的熒光反應(yīng)性染料 加入lml細胞混懸液中。然后將混懸液徹底混合并在室溫避光溫育30min。將細胞用lml含有 1 %胎牛血清(FCS)的PBS洗滌1次，并再懸浮于lml含有1 %FCS的PBS中。
[0129] 對于Pentamer染色，使用用于生存力門控的Pacific Orange預(yù)標(biāo)記的脾細胞。使 用的Pr〇5K'重組MHC Pentamer列出在下表丄中：
[0130]
[υι j i j 尸entamer仕YT1 歡星罔n兒T仕丄4，uuuxg罔m-iUOUT以七^^子仕丁搭*· 中的任何蛋白聚集體收集在瓶底，以便避免非特異性的染色。將上清液用于Pentamer染色。 將所有試劑避光維持在冰上直到需要。每種染色條件分配lxl06個脾細胞。將細胞用2ml洗 滌緩沖液(含有1%FCS的PBS)洗滌并離心(500x g 5分鐘），拋棄上清液，并將細胞再懸浮于 殘余體積(~50μ1)中。將試管保持在冰上冷藏用于所有后續(xù)步驟，除非另有指示。將一個試 驗(2μ1)的未標(biāo)記的Pentamer加給細胞，并將溶液通過移液管上下吹吸進行混合，并在室溫 (22°C)避光溫育lOmin。然后將細胞用2ml洗滌緩沖液洗滌并再懸浮于殘余液體（~50μ1) 中。將ProS^Fluorotag R-PE在冷微量離心機中在14,000x g離心3分鐘以除去否則會促進 非特異性結(jié)合的蛋白聚集體。將試劑避光維持在冰上直到需要。將上清液用于Pentamer染 色。加入8μ1 pr05 "Fluorotag和 ΙμL 抗-CD8FITC和 0 · 5μ1 抗-CD3APC/Cy-7 抗體，并將溶液通 過移液管上下吹吸進行混合。將樣品避光在冰上溫育20分鐘。將細胞用2ml洗滌緩沖液洗滌 2次并將每個試管混合。加入200μ1固定溶液（1 % FCS，2.5 %甲醛在PBS中的溶液），并將試管 渦旋。徹底渦旋對于避免細胞團集來說是重要的。在準(zhǔn)備好數(shù)據(jù)采集之前，將試管在冰箱中 在暗處保存。在任何情況下，由于固定以后形態(tài)學(xué)變化，在著手數(shù)據(jù)采集之前將樣品放置3 小時。
[0132] 研究了各自與Pentamer (由Proimmune制造)的特異性結(jié)合。在選擇適當(dāng)?shù)拈T以后， 計數(shù)m間皮素特異性的CD8+T細胞?；谂cPentamer的結(jié)合親和力，計算m間皮素特異性的 CD8+T細胞的比率。在VXM04m和VXM04m-空對照組之間和在組內(nèi)隨時間對比所述比率。使用 Viv〇managerK軟件(Biosystems，Dijon,法國）執(zhí)行所有統(tǒng)計分析。認為p值〈0.05的是顯著 的。間皮素-特異性的⑶8+細胞的各個百分比呈現(xiàn)在圖4-9中。圖4-6代表通過MSLN-GSL-Penta檢測到的間皮素-特異性的CD8+細胞；圖7-9代表通過MSLN-IQL-Penta檢測到的間皮 素-特異性的CD8+細胞。免疫動力學(xué)（平均值）在疫苗接種后10天達到峰值。不論使用的 Pentamer，間皮素-特異性的⑶8+細胞在第10天的百分比與對照組相比顯著增加。
【主權(quán)項】
1. 減毒沙門氏菌屬突變株，其包含重組DNA分子的至少一個拷貝，所述重組DNA分子包 含編碼間皮素(MSLN)的表達盒。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中所述減毒沙門氏菌屬突變株屬 于腸道沙門氏菌種，特別地其中所述減毒沙門氏菌屬突變株是傷寒沙門氏菌Ty21a。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中所述表達盒是真核表達盒。4. 根據(jù)權(quán)利要求1 _3中的任一項所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中MSLN選自人MSLN 和與其具有至少80%序列同一性的蛋白，特別地其中MSLN具有如在SEQ ID NO 1中發(fā)現(xiàn)的 氨基酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中所述重組DNA分子包含卡那 霉素抗生素抗性基因 、pMBl ori和在CMV啟動子控制下的、編碼人MSLN或與其具有至少80% 序列同一性的蛋白的真核表達盒，特別地其中人MSLN具有如在SEQ ID NO 2中發(fā)現(xiàn)的核酸 序列。6. 用作藥物的根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任一項所述的減毒沙門氏菌屬突變株。7. 用作疫苗的根據(jù)權(quán)利要求6所述的減毒沙門氏菌屬突變株。8. 用在癌癥免疫療法中的根據(jù)權(quán)利要求7所述的減毒沙門氏菌屬突變株。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中癌癥免疫療法還包括施用一種 或多種其它減毒沙門氏菌屬突變株，其包含重組DNA分子的至少一個拷貝，所述重組DNA分 子包含編碼腫瘤抗原和/或腫瘤間質(zhì)抗原的表達盒，特別地其中所述一種或多種其它減毒 沙門氏菌屬突變株是包含真核表達盒的傷寒沙門氏菌Ty21a，更特別地其中所述一種或多 種其它減毒沙門氏菌屬突變株包含編碼人VEGFR-2和/或人威爾曼瘤蛋白（WT1)的減毒沙門 氏菌屬突變株。10. 前述權(quán)利要求中的任一項、特別是根據(jù)權(quán)利要求9所述的減毒沙門氏菌屬突變株， 其中所述減毒沙門氏菌屬突變株與所述一種或多種其它減毒沙門氏菌屬突變株共同施用。11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10中的任一項所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中癌癥免疫療法 伴有化學(xué)療法、放射療法或生物學(xué)癌癥治療，特別地其中在化學(xué)療法或放射療法治療周期 之前或過程中、或在生物學(xué)癌癥治療之前或過程中、或在化學(xué)療法或放射療法治療周期或 生物學(xué)癌癥治療之前和過程中施用所述減毒沙門氏菌屬突變株。12. 根據(jù)權(quán)利要求6-11中的任一項所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中口服地施用所 述減毒沙門氏菌屬突變株。13. 根據(jù)權(quán)利要求8-12中的任一項所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中所述癌癥選自 間皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、子宮頸的鱗狀細胞癌、頭頸癌、外陰癌、肺和食管癌、肺腺癌、子宮 內(nèi)膜癌、雙相性滑膜肉瘤、結(jié)締組織增生性小圓細胞腫瘤和胃腺癌。14. 根據(jù)權(quán)利要求6-13中的任一項所述的減毒沙門氏菌屬突變株，其中單次劑量包含 約105至約1011個、特別地約10 6至約101()個、更特別是約106至約109個、更特別是約10 6至約 1〇8個、最特別是約1〇6至約1〇7個菌落形成單位(CFU)。15. 用在個體化的癌癥免疫療法中的、根據(jù)權(quán)利要求8-14中的任一項所述的減毒沙門 氏菌屬突變株，所述癌癥免疫療法包括評估患者的MSLN表達模式和/或針對MSLN的免疫前 應(yīng)答的步驟。
【文檔編號】A61K39/00GK106061500SQ201480069996
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月17日
【發(fā)明人】馬爾科·施普林格, 海因茨·盧本奧
【申請人】萬科斯蒙股份有限公司