使用仙臺病毒作為載體的抗結(jié)核桿菌疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供表達結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原的重組仙臺病毒載體疫苗，可作為治療性和預(yù)防性抗結(jié)核疫苗使用。通過鼻內(nèi)免疫該疫苗，成功而有效地誘導(dǎo)針對結(jié)核菌的保護性免疫應(yīng)答，且未觀察到免疫接種引起的病理癥狀。將其作為預(yù)防性抗結(jié)核疫苗，鼻內(nèi)接種在小鼠模型中成功誘導(dǎo)明顯的抗原特異性細胞免疫應(yīng)答。結(jié)核菌的攻擊保護實驗發(fā)現(xiàn)，與對照動物相比被免疫小鼠的肺臟和脾臟中的結(jié)核桿菌明顯減少，其機制與在肺部誘導(dǎo)產(chǎn)生的強烈抗原特異性T細胞免疫應(yīng)答尤其是CD8+T細胞免疫反應(yīng)相關(guān)。作為治療性疫苗，獲得與利福平(RFP)相當?shù)寞熜?，二者?lián)用后能明顯提高抗結(jié)核效果。因此本發(fā)明的重組仙臺病毒載體疫苗是非常有前景的抗結(jié)核候選疫苗之一。CCTCC V20151820150419
【專利說明】使用仙臺病毒作為載體的抗結(jié)核桿菌疫苗 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及利用仙臺病毒作為載體的抗結(jié)核桿菌疫苗。本發(fā)明也涉及使用仙臺病 毒載體接種的方法，以及其在結(jié)核分枝桿菌感染的預(yù)防或治療中的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 結(jié)核病是影響人類健康的主要殺手之一。作為結(jié)核?。═B)的病原體，結(jié)核分枝桿 菌（Mycobacterium tuberculosis)是全世界細菌感染疾病中最主要的死亡原因--潛伏 性感染影響世界人口的三分之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的報告，2012年全球共有新發(fā)病 例860萬，死亡病例130萬。作為人類歷史上對抗傳染病最有效的方式之一，疫苗在諸多疾 病的預(yù)防控制中發(fā)揮了重要作用。卡介苗（Bacillus Calmette-Gu6rin，BCG)源自牛分枝 桿菌（Mycobacterium bovis)的減弱菌株，其迄今為止仍是針對TB的唯一經(jīng)過批準的疫 苗。然而，發(fā)現(xiàn)BCG對于成人的效果差異較大，特別是在不同種族中。BCG的有效性隨著年 齡的增長而下降，因此對于預(yù)防成人的疾病效果并不好，特別是在TB高發(fā)地區(qū)。BCG疫苗接 種已經(jīng)用于預(yù)防結(jié)核腦膜炎并幫助防止肺結(jié)核分枝桿菌向肺外部位擴散，但是不能預(yù)防感 染。BCG疫苗的另一局限是胃腸外投遞不能在肺粘膜中誘導(dǎo)有力的T細胞免疫，而這一點恰 是針對肺結(jié)核分枝桿菌進行保護關(guān)鍵性的。
[0004] 已提出幾種假說來解釋BCG對肺結(jié)核病的不佳的保護效果，其中一種認為BCG未 能誘導(dǎo)充分的⑶8+T細胞應(yīng)答（參見）。最近的研究顯示，除了 Thl型⑶4+T細胞免疫以 外，誘導(dǎo)CD8+T細胞應(yīng)答對于針對結(jié)核分枝桿菌感染的免疫是至關(guān)重要的。
[0005] BCG效果的局限性和TB的全球流行性促使各國研究人員致力于產(chǎn)生新的更有效 的抗結(jié)核疫苗。
[0006] 基于活病毒載體的疫苗具有誘導(dǎo)有效而持久的抗原表達的能力，是研究最廣泛的 疫苗載體之一（Cairns, J. S.和Sarver，N.，1998年，《人逆病毒的AIDS研究》）（AIDS Res. Hum. Retroviruses) 14 卷：第 1501-1508 頁；Hirsch, V. Μ·等人，1996 年，《病毒學雜志》70 卷：第3741-3752頁；Buge，S. L.等人，1997年，《病毒學雜志》71卷：第8531-8541頁）。其 中，痘病毒和腺病毒載體是研究最廣泛的載體，均已完成臨床試驗。但是，II a期臨床試驗 發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核痘病毒載體疫苗并不能夠誘導(dǎo)足夠的保護性抗結(jié)核免疫應(yīng)答。研究認為，病毒 載體引發(fā)有效的保護性免疫應(yīng)答取決于許多因素，如抗原表達的水平和持久性、載體病毒 復(fù)制的動力學，以及載體病毒的趨性和致病性等。目前可用的病毒載體都有各自的優(yōu)缺點。 因此，選擇最佳的基于病毒載體的免疫方案需要精確的評估和比較。
[0007] 基于病毒載體的疫苗免疫方案的一個致命缺點是它會誘導(dǎo)靶抗原以外的針對載 體病毒本身的強烈免疫應(yīng)答。這一問題可以利用兩個或兩個以上不同種類的載體疫苗分別 進行"初次免疫（priming)"和"加強免疫（boosting)"的方法來解決。其中，DNA載體初 次免疫（下文簡稱為初免）_病毒載體加強是研究最廣泛的免疫形式之一（Hanke，T.等人 1999年，《病毒學雜志》，73卷：第7524-7532頁；Robinson, H. L.等人，1999年，《自然學方 法》（Nat. Med)，第5卷：第526-534頁）。所以，仍然有必要開發(fā)病毒載體的新種類。
[0008] 由于結(jié)核分枝桿菌感染不斷增加的危險和全球流行性，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)有 效而安全的結(jié)核疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種含有編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的仙臺病毒載體及從該載體制備的疫 苗。具體地，本發(fā)明提供一種融合表達結(jié)核分枝桿菌蛋白Ag85的仙臺病毒載體及其疫苗。
[0010] 在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼的結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)為Ag85,其包含選自如下的蛋 白質(zhì)或片段的氨基酸序列：Ag85A、Ag85B、其片段或上述任一項的組合。在一個實施方案中， 所述結(jié)核桿菌蛋白包含Ag85A與Ag85B蛋白或其片段的氨基酸序列的嵌合體。在一個進一 步的實施方案中，所述結(jié)核桿菌蛋白包含Ag85A蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N〇:2)與Ag85B 的第125-282位氨基酸（SEQ ID No:5)的氨基酸序列的嵌合體（SEQ ID No:8)，所述編碼 Ag85B蛋白第125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在Ag85A基因的序列中，嵌合位點為 Ag85A基因的第245-250位限制性內(nèi)切酶Κρη I識別序列和/或第430-435位內(nèi)切酶Acc I識別序列。
[0011] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及將一種結(jié)核桿菌嵌合基因通過本領(lǐng)域公知的質(zhì)粒 構(gòu)建方法插入到仙臺病毒載體中，如上文所述的，該嵌合基因優(yōu)選包含Ag85A蛋白的編碼 序列（SEQ ID N〇:l)與編碼Ag85B的第125-282位氨基酸（SEQ ID N〇:5)的核苷酸序列的 嵌合體（SEQ ID No: 6或7)，嵌合位點優(yōu)選為Ag85A基因的第245-250位限制性內(nèi)切酶Κρη I識別序列和/或第430-435位內(nèi)切酶Acc I識別序列。本發(fā)明還涉及由該嵌合基因所編 碼的嵌合結(jié)核桿菌Ag85蛋白。
[0012] 在一個實施方案中，要插入編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的基因的所述仙臺病毒載體 (SeV)有F基因缺陷。具體地，所述仙臺病毒載體缺失F基因。在一個實施方案中，構(gòu)建得 到的重組仙臺病毒載體在LLC-MK2細胞中成功表達Ag85蛋白。
[0013] 本發(fā)明進一步涉及如上述的任一種重組仙臺病毒載體在制備預(yù)防和/或治療結(jié) 核桿菌感染或結(jié)核病的疫苗中的用途。另外，本發(fā)明還涉及一種預(yù)防和/或治療結(jié)核桿菌 感染或結(jié)核病的方法，包括對受試者施用如上文所述的重組仙臺病毒載體的疫苗。優(yōu)選地， 所述結(jié)核病為肺結(jié)核病。
[0014] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供如上述的任一種仙臺病毒載體的疫苗可作為抗結(jié) 核預(yù)防性疫苗使用。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供上述任一種仙臺病毒載體疫苗可作 為抗結(jié)核治療性疫苗使用。
[0015] 在一個方面，本發(fā)明的仙臺病毒載體的疫苗可以經(jīng)鼻腔內(nèi)給藥或肌肉內(nèi)注射的方 式一次或多次地施用給受試者。
[0016] 在一個實施方案中，本發(fā)明的仙臺病毒載體疫苗以多價疫苗接種的形式接種至少 一次。具體地，所述仙臺病毒載體疫苗與BCG疫苗聯(lián)合施用，BCG疫苗的施用可在所述仙臺 病毒載體疫苗的施用之前、同時或之后。優(yōu)選地，受試者先前已接受過BCG疫苗的初次免 疫，然后使用本發(fā)明的仙臺病毒載體疫苗進行加強免疫。本發(fā)明還提供一種包含上文所述 的重組仙臺病毒載體疫苗任選和至少一種另外的免疫學作用劑用于在受試者中預(yù)防結(jié)核 桿菌感染的用途，其中所述另外的免疫學作用劑可以是BCG疫苗或表達結(jié)核桿菌免疫優(yōu)勢 抗原的任何其他免疫制劑，如核酸疫苗或重組亞單位疫苗等。優(yōu)選地，本發(fā)明提供上述仙臺 病毒載體疫苗與BCG疫苗組合用于預(yù)防結(jié)核病。
[0017] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供編碼上述結(jié)核桿菌蛋白的仙臺病毒載體在制備治 療結(jié)核病的疫苗中的用途。本發(fā)明還提供一種包含上文所述的重組仙臺病毒載體疫苗用于 治療患有結(jié)核病的受試者的用途，任選地所述重組仙臺病毒載體疫苗與至少一種另外的結(jié) 核桿菌治療劑一起施用，其中所述另外的結(jié)核桿菌治療劑可以是利福平（RFP)或抑制結(jié)核 桿菌的任何其他藥劑。優(yōu)選地，本發(fā)明提供上述仙臺病毒載體疫苗與利福平組合用于治療 結(jié)核病。
[0018] 所述受試者可以是有感染結(jié)核桿菌風險或已患有結(jié)核病的動物，比如小鼠，或者 是人。
[0019] 在一個實施方案中，本發(fā)明還提供一種編碼結(jié)核桿菌蛋白的仙臺病毒載體用于誘 導(dǎo)特異性針對該結(jié)核桿菌蛋白的細胞免疫應(yīng)答。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種編 碼結(jié)核桿菌蛋白的仙臺病毒載體在制備誘導(dǎo)特異性針對該結(jié)核桿菌蛋白的細胞免疫應(yīng)答 的藥物中的用途。在一個實施方案中，本發(fā)明的重組仙臺病毒載體在肺臟和脾臟中均誘導(dǎo) 強烈的針對該結(jié)核桿菌蛋白的細胞免疫應(yīng)答。在又一個實施方案中，本發(fā)明的重組仙臺病 毒載體在肺臟中誘導(dǎo)更強的針對該結(jié)核桿菌蛋白的細胞免疫應(yīng)答。
[0020] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)特異性針對結(jié)核桿菌蛋白的細胞免疫 應(yīng)答的方法，包括：(a)將融合表達結(jié)核桿菌相關(guān)蛋白的仙臺病毒載體導(dǎo)入抗原遞呈細胞； (b)使抗原遞呈細胞與細胞毒性T淋巴細胞接觸。所述方法可以體外、離體或體內(nèi)進行。 具體地，編碼的結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)為Ag85,其包含選自如下的蛋白質(zhì)或片段的氨基酸序列： Ag85A、Ag85B、其片段或上述任一項的組合。在一個實施方案中，所述結(jié)核桿菌蛋白包含 Ag85A與Ag85B蛋白或其片段的氨基酸序列的嵌合體。在一個進一步的實施方案中，所述結(jié) 核桿菌蛋白包含Ag85A蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N〇:2)與Ag85B的第125-282位氨基酸 (SEQ ID No: 5)的氨基酸序列的嵌合體（SEQ ID No:8)，所述編碼Ag85B蛋白第125-282位 氨基酸序列片段的基因嵌合在Ag85A基因的序列中，嵌合位點為Ag85A基因的第245-250 位限制性內(nèi)切酶Κρη I識別序列和/或第430-435位內(nèi)切酶Acc I識別序列。
[0021] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種疫苗組合物，其包含如上述的任一種重組仙 臺病毒載體和至少一種藥學可接受的載體或媒介物。在一個實施方案中，所述藥學可接受 的載體為佐劑。優(yōu)選地，佐劑為左旋咪唑。
[0022] 在一個實施方案中，本發(fā)明涉及編碼結(jié)核桿菌蛋白Ag85AB的仙臺病毒載體，其已 被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，地址：武漢市武昌珞珈山，郵編：430072)，分 類：副粘病毒科/屬，保藏日期：2015年4月19日，保藏編號為CCTCC V201518。
[0023] 具體地，本發(fā)明涉及以下項：
[0024] 1. -種仙臺病毒載體的疫苗，其中所述載體表達結(jié)核分枝桿菌免疫抗原，優(yōu)選表 達結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Ag85。
[0025] 2.權(quán)利要求1的疫苗，其中所表達的結(jié)核分枝桿菌抗原包含Ag85A蛋白、和/或 Ag85B蛋白、和/或其一部分以及上述它們的嵌合體的氨基酸序列
[0026] 3.項1或2的疫苗，所使用的載體為F基因缺陷的仙臺病毒載體。
[0027] 4.項1-3中任一項的仙臺病毒載體疫苗作為抗結(jié)核預(yù)防性疫苗使用的用途。
[0028] 5.項4的用途，其中所述疫苗通過鼻內(nèi)接種的方式免疫。
[0029] 6.項4或5的用途，其中所述疫苗以多價疫苗的形式接種至少一次。
[0030] 7.項1-3中任一項的仙臺病毒載體疫苗作為抗結(jié)核治療性疫苗使用的用途。
[0031] 8. -種誘導(dǎo)特異性針對結(jié)核桿菌蛋白的細胞免疫應(yīng)答的方法，包括：(a)將融合 表達結(jié)核桿菌相關(guān)蛋白的仙臺病毒載體導(dǎo)入抗原遞呈細胞；(b)使抗原遞呈細胞與細胞毒 性T淋巴細胞接觸，其中所述結(jié)核桿菌的蛋白包括選自如下的蛋白：Ag85A，Ag85B，其片段， 或上述任一者的任何組合。
[0032] 9.權(quán)利要求8的方法，其在體外進行。
[0033] 10. -種編碼結(jié)核桿菌蛋白Ag85的仙臺病毒載體在制備誘導(dǎo)特異性針對該蛋 白的細胞免疫應(yīng)答的藥物中的用途，其中所述結(jié)核桿菌Ag85蛋白包括選自如下的蛋白： Ag85A，Ag85B，其片段，或上述任一者的任何組合。
[0034] 11. -種重組仙臺病毒載體，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC V201518。
[0035] 上文概述僅為例示性的，且不意圖以任何方式進行限制。除了上文描述的例示性 的方面、實施方案和特征以外，其它方面、實施方案和特征將通過下文詳細描述闡明。
[0036] 附圖簡述
[0037] 從下文描述和所附權(quán)利要求書，結(jié)合所附附圖，本公開的前述特征和其它特征將 變得更為明顯。應(yīng)理解這些附圖僅描繪了依照本公開的數(shù)個實施方案且不意圖視為限制其 范圍，將部分地，經(jīng)由所附圖的使用更特定并詳細地描述本公開。
[0038] 圖1表示pSeV85AB質(zhì)粒的構(gòu)建，其中構(gòu)建的Ag85A和Ag85B的嵌合體被插入F基 因缺陷性的SeV載體的Not I位點處。
[0039] 圖2表示對構(gòu)建的pSeV85AB質(zhì)粒表達SeV85AB的鑒定結(jié)果，其中在用不同感染復(fù) 數(shù)（Μ0Ι)的SeV85AB感染LLC-MK2細胞后，利用小鼠抗Ag85A抗體和與熒光素結(jié)合的山羊 抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)進行對細胞裂解物的Western影印分析。
[0040] 圖3和4分別是經(jīng)鼻腔免疫接種SeV85AB后，通過ELISP0T對小鼠肺臟或脾臟中 T淋巴細胞經(jīng)過體外刺激后分泌IFN-γ的水平的測定。
[0041] 圖5顯示對小鼠施用PBS、兩個劑量的SeV85AB和兩個劑量的SeV空白載體后小鼠 體重的變化。結(jié)果顯示，SeV85AB的滴鼻免疫不會造成小鼠體重的異常變化。
[0042] 圖6和7分別是肌肉內(nèi)免疫接種SeV85AB后，通過ELISP0T對小鼠肺臟或脾臟中 T淋巴細胞經(jīng)過體外刺激后分泌IFN-γ的水平的測定。
[0043] 圖8顯示對小鼠施用PBS、兩個劑量的SeV85AB和兩個劑量的SeV空白載體后小鼠 體重的變化。結(jié)果顯示，SeV85AB的肌肉內(nèi)免疫不會造成小鼠體重的異常變化。
[0044] 圖9和10顯示采用如實施例6中所述的8種初次免疫一加強免疫方案得到的小 鼠肺臟和脾臟細胞的T細胞應(yīng)答結(jié)果。
[0045] 圖11顯示對小鼠施用8種初次免疫一加強免疫方案后小鼠體重的變化。結(jié)果顯 示，采用BCG+SeV85AB免疫的小鼠與其它試驗組相比，沒有觀察到任何明顯的體重變化。
[0046] 圖12顯示使用SeV空白載體、BCG和不同劑量的SeV85AB來免疫小鼠后用結(jié)核桿 菌進行攻擊所測定到的免疫效果。圖13顯示使用PBS、BCG、BCG-SeV85AB和SeV85AB的不同 免疫方案來免疫小鼠后用結(jié)核桿菌進行攻擊所測定到的免疫效果。縱坐標為對數(shù)CFU(菌 落形成單位），左圖為在肺臟中的結(jié)果，右圖為在脾臟中的結(jié)果。結(jié)果顯示高濃度（l〇 7CIU) SeV85AB免疫小鼠即可誘導(dǎo)產(chǎn)生與BCG疫苗接種相當?shù)拿庖弑Ｗo效果，而加強BCG初免小鼠 后則能顯著提高降低其細菌荷菌量，說明SeV85AB載體疫苗有望作為BCG的候選加強疫苗 之一。
[0047] 圖14顯示用利福平或SeV85AB對已受結(jié)核桿菌攻擊的小鼠的治療效果。圖15顯 示用僅PBS、僅利福平（RFP)、利福平聯(lián)合SeV85AB對已受結(jié)核桿菌攻擊的小鼠的治療效果， 從中可見單獨利用SeV85AB進行免疫治療即可獲得與RFP藥物治療相當?shù)闹委熜Ч?，而?福平和SeV85AB的聯(lián)合治療則能顯著降低小鼠肺臟中的荷菌量，說明SeV85AB免疫治療與 抗癆藥物聯(lián)用可提高抗結(jié)核治療效果。
【具體實施方式】
[0048] 本發(fā)明提供了融合表達結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原的重組仙臺病毒載體疫苗。該 疫苗可作為治療性和預(yù)防性抗結(jié)核疫苗使用。通過鼻內(nèi)免疫該疫苗，本發(fā)明人成功而有效 地誘導(dǎo)了針對結(jié)核菌的保護性免疫應(yīng)答，且并沒有觀察到免疫引起的病理癥狀。將其作為 預(yù)防性抗結(jié)核疫苗，其鼻內(nèi)接種在小鼠模型中成功誘導(dǎo)了明顯的抗原特異性細胞免疫應(yīng) 答。結(jié)核菌的攻擊保護實驗發(fā)現(xiàn)，與對照動物相比，被免疫小鼠的肺臟和脾臟中的結(jié)核桿菌 明顯減少，其機制與在肺部誘導(dǎo)產(chǎn)生的強烈抗原特異性T細胞免疫應(yīng)答尤其是CD8+T細胞 免疫反應(yīng)相關(guān)。同時，將其作為治療性結(jié)核疫苗，結(jié)核分枝桿菌感染小鼠經(jīng)鼻內(nèi)免疫治療8 周后，肺、脾細菌數(shù)量與利福平（RFP)藥物治療組相當，與RFP聯(lián)合治療后則顯著提高了 RFP 的治療效果。
[0049] 本疫苗至少利用了一種結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，甚至在只表達Ag85抗原 時也能夠誘導(dǎo)有效的免疫誘導(dǎo)。另外，利用多個類型的蛋白質(zhì)作為抗原，可以得到更高的 免疫性。使用結(jié)核桿菌Ag85蛋白結(jié)核桿菌Ag85A與Ag85B抗原蛋白的1-125位氨基酸序 列二者彼此差異不大，而125-282位氨基酸序列之間有較大差異，約有40個左右氨基酸不 相同，此區(qū)段二者的編碼核酸序列中共有90多個堿基不同。在此區(qū)段中Ag85B存在有重 要的可誘導(dǎo)Thl型應(yīng)答反應(yīng)細胞因子IFN-γ和IL-2的表位（S. D'Souza，V. Rosseels，M. Romano, A et al ；Mapping of Murine ThlHelper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January 2003,71 (1):483-493)〇
[0050] 本
【發(fā)明人】通過計算機軟件服務(wù)公司Intenet-Based Applied Bioinformatics Company的Epitope Informatics軟件對結(jié)核桿菌結(jié)構(gòu)蛋白Ag85A基因的抗原表位進行 搜索，發(fā)現(xiàn)其抗原表位主要集中在Ag85A的氨基端和羧基端（S. D' Souza, V. Rosseels, M. Romano, A et al ；Mapping of Murine ThlHelper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January 2003, 71 (1):483-493)。在不含抗原表位的 Ag85A 母體基因中 間區(qū)段第245-250位含有Κρη I酶切位點(GGTACC)，第430-435位含有Acc I酶切位點 (GTCTAC)，故設(shè)計在此嵌合插入編碼Ag85B的125-282位氨基酸的核苷酸序列片段。
[0051] 本發(fā)明中，插入仙臺病毒載體的結(jié)核桿菌蛋白編碼基因可以是編碼Ag85A，Ag85B， 其片段，或上述任一者的任何組合的多核苷酸序列，還可以是該多核苷酸序列的衍生物或 變體。該衍生物或變體與編碼該Ag85A、Ag85B蛋白或其片段的多核苷酸序列具有至少 70 %同源性，優(yōu)選為具有至少75 %同源性，更優(yōu)選為具有至少80 %同源性，更優(yōu)選為具有 至少85 %同源性，優(yōu)選為具有至少90 %同源性，更優(yōu)選為具有至少95%同源性，更優(yōu)選為 具有至少96 %，97%，98 %，99%同源性，只要所述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)具有與Ag85A、 Ag85B蛋白或其片段或其任意組合相同的免疫原性。
[0052] 本
【發(fā)明人】先前已經(jīng)建立了一個利用重組型仙臺病毒（Sendai virus, SeV)的有效 的抗原表達系統(tǒng)（Kato, A.等人，1996年，基因細胞第1卷：第569-579頁）。1型小鼠副流 感病毒SeV是帶有非分節(jié)段型負鏈RNA基因組的包膜病毒，屬于副粘病毒屬（Nagai，Y. 1999 年，《醫(yī)學病毒學綜述》（Rev. Med. Virol.)第9卷：第83-99頁）。該病毒在小鼠中引起致 命的呼吸道系統(tǒng)疾病，但對非人靈長類動物和人是不致病的（Nagai，Y. 1999年《醫(yī)學病毒 學綜述》(Rev. Med. Virol.)，第9卷：第83-99頁；Hurwitz，J. L.等人，《疫苗》，第15卷：第 533-540 頁，1997 年）。
[0053] 因為仙臺病毒在細胞質(zhì)中復(fù)制，所以抗原蛋白可以利用重組仙臺病毒載體疫苗通 過不依賴細胞核的方式有效地表達。更重要的是，仙臺病毒載體的感染并不會造成細胞的 分裂，從而能夠高效持續(xù)地表達外源基因。例如，在培養(yǎng)上清中，重組仙臺病毒載體表達的 1型人免疫缺陷病毒（HIV-l)Env蛋白的gpl20量高達6微克/毫升（相當于每10 6個細胞 6微克），是目前用于哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的載體中最高的（Yu，D.等人1997年《基因 細胞》，第2卷：457-466頁）。
[0054] 因為SeV的復(fù)制需要修飾包被的蛋白酶，所以它復(fù)制的趨性限制于特定的組織如 呼吸道上皮細胞（Nagai，Y.，1993年，《微生物學趨勢》（Trends Microbiol.)，第1卷：第 81-87頁）。而且預(yù)期它不會傳播到呼吸道以外的其它組織中，這暗示了 SeV載體及其復(fù)制 活性形式也在安全方面有其優(yōu)點。
[0055] 本發(fā)明人利用F基因缺陷性SeV作為載體，構(gòu)建了表達結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗 原Ag85A和Ag85B片段的抗結(jié)核重組仙臺病毒載體疫苗，命名為SeV85AB。Western Blot 證實了該重組疫苗能夠有效地表達這兩種結(jié)核桿菌蛋白的嵌合蛋白。
[0056] -方面，我們將該疫苗用作抗結(jié)核桿菌的預(yù)防性疫苗：在小鼠模型中，評估其對于 結(jié)核桿菌感染的預(yù)防作用。具體的，在SPF實驗室中，使用10 7CIU劑量的SeV85AB通過鼻 內(nèi)接種或肌肉注射方式免疫Balb/c小鼠（雌性，6-8周齡）。以BCG免疫和PBS作為對照。 免疫四周后，一方面，處死小鼠，取其肺臟和脾臟器官，無菌研磨后消化為單細胞懸液。使用 抗原特異性的多肽和PH)進行體外刺激，利用ELISP0T和多色流式的方法評估這部分細胞 在特異性刺激后，分泌細胞因子的能力。另一方面，將免疫后的小鼠送至P3實驗室進行結(jié) 核分枝桿菌H37Rv毒株的氣霧攻擊，并于攻擊4周后，取其肺臟和脾臟組織組織勻漿后進 行CFU菌落計數(shù)以分析該疫苗的免疫對小鼠的保護效率。實驗結(jié)果證明，SeV85AB的免疫， 尤其是鼻內(nèi)接種，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強烈的抗原特異性免疫反應(yīng)，單劑免疫即可產(chǎn)生與BCG 疫苗免疫相當?shù)目菇Y(jié)核分枝桿菌攻擊的保護效力；如果采取BCG初次免疫-SeV85AB加強免 疫的策略，則可顯著提高感染小鼠對結(jié)核分枝桿菌攻擊后的保護效率。
[0057] 另一方面，我們將該疫苗用作抗結(jié)核桿菌治療性疫苗：在小鼠模型中，評估其對于 結(jié)核桿菌感染的治療作用。具體的，在P3實驗室中，使用結(jié)核分枝桿菌H37Rv毒株感染（氣 霧攻擊，100CFU)Balb/c小鼠（雌性，6-8周齡）。在感染后的第4周、第6周、第8周進行三 劑10 7CIU SeV85AB的滴鼻免疫治療，空白對照組滴鼻PBS，藥物對照組則從第4周起在小鼠 的飲用水中加入l〇mg/kg/天劑量的利福平（RFP)，分別在感染的第4、6、8、12周，每組分別 殺3-4只小鼠，分析SeV85AB的治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SeV85AB免疫治療8周后，小鼠的肺、 脾的細菌數(shù)量與RFP藥物治療組相當；在另一個獨立的試驗中，小鼠感染三周后，在小鼠飲 用水中加入RFP進行治療，或在RFP治療的同時鼻內(nèi)接種10 7CIU SeV85AB，隔周治療一次， 共三次。對照組僅接種PBS。治療結(jié)束后1周，取小鼠的肺臟組織，組織勻漿后進行CFU菌 落計數(shù)以分析其治療效果。實驗結(jié)果證明，較之RFP單獨治療組，RFP+SeV85AB的聯(lián)合治療 方案能夠顯著降低小鼠肺臟中的菌落數(shù)，證明該重組病毒作為抗結(jié)核疫苗有良好的免疫治 療效果，與抗癆藥物聯(lián)合應(yīng)用，其治療效果更佳。
[0058] 鼻內(nèi)接種具有可以誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答的優(yōu)點。咽后LN(retropharyngeal LN) 和下頌下LN(submandibular LN)是來自鼻腔的淋巴細胞最初流入的LN(Suen，J. Y.，和 Stern, S. J. 1996 年《在頭和頸癌》第三版，Ε· N. Myers 和 J. Y. Suen，編輯者，W. B. Saunders 公司，Philadelaphia，第462-484頁，頸的癌癥）。這些LN很可能參與了粘膜免疫應(yīng) 答。研究已經(jīng)表明，在小鼠中NALT(nasalassociated lymphoid tissue:與鼻相關(guān)的淋 巴組織）是粘膜免疫應(yīng)答的重要組成部分（Yangagita，Μ.等人，1999年，免疫學雜志162 卷3559-3565)。通過對小鼠 NALT的Waldeyer' s ring制備的細胞的分析，可以證實在該 組織中有SeV的表達和免疫應(yīng)答。但是，在檢測咽后LN(retropharyngeal LN)和下頌下 LN(submandibular LN)中的SeV的表達時，在兩種組織中都檢測到了顯著的RNA。由于在這 些LN中不存在SeV蛋白質(zhì)修飾所必需的蛋白酶（Nagai，Y. 1993年，微生物學趨勢第1卷： 81-87)，所以可以預(yù)測在LN中沒有SeV的復(fù)制。在這些LN中的mRNA是來自從鼻腔流出的 SeV感染的淋巴細胞。利用鼻內(nèi)SeV接種，不僅僅是在鼻粘膜，而且在局部LN也高效地表 達了抗原，表明了 SeV在誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答中的能力（Gallichan，W.S.，和Rosenthal，K. L. 1996年，實驗方法雜志第184卷，1879-90)。
[0059] 細胞免疫應(yīng)答是機體控制結(jié)核分枝桿菌感染和復(fù)制的重要組成部分（Nature Reviews Immunology l，20_30(0ctober 2001))。所以，誘導(dǎo)結(jié)核菌特異性的T細胞免疫應(yīng) 答對TB的感染保護至關(guān)重要。并且，考慮到結(jié)核菌主要通過呼吸道和肺臟部位入侵人體， 在肺臟粘膜部位誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)非常重要。本發(fā)明人已通過ELISP0T、細胞內(nèi)因 子染色和四聚體染色等方法證明，SeV85AB的免疫能夠在小鼠的肺臟中誘導(dǎo)較強的抗原特 異性T細胞免疫反應(yīng)。
[0060] 在接種了 F基因缺失的仙臺病毒載體SeV或重組SeV85AB疫苗后，小鼠并沒有出 現(xiàn)病毒感染癥狀和死亡情況。對小鼠的體重監(jiān)測也證明，該病毒載體或重組疫苗的接種并 不會導(dǎo)致接種小鼠的體重異常變化，從而證明了該疫苗的安全性。
[0061] 具體地說，本發(fā)明首次公開了由重組SeV85AB介導(dǎo)的免疫而引起的小鼠抗結(jié)核分 枝桿菌的應(yīng)答。我們的結(jié)果表明，在所有鼻內(nèi)免疫的小鼠中都有效地誘導(dǎo)了特異于抗原的 細胞免疫應(yīng)答?？乖磉_方式是局部部位并且受到很好的控制。這些結(jié)果暗示SeV系統(tǒng)可 以作為有前途的結(jié)核疫苗的載體。
[0062] 本發(fā)明的目的是提供含有編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的仙臺病毒載體的疫苗。本發(fā)明的 疫苗可以很好地用于預(yù)防和治療結(jié)核病。本發(fā)明也包括該疫苗的接種方法。具體地說，本 發(fā)明涉及：
[0063] (1)含有編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的仙臺病毒載體的疫苗；
[0064] (2) (1)中的疫苗，其中重組的蛋白質(zhì)含有Ag85A、和/或Ag85B蛋白質(zhì)和/或它們 的一部分以及上述它們的嵌合體；
[0065] (3)⑴或⑵的疫苗，其中仙臺病毒載體是F基因缺失的；
[0066] (4)接種的方法，該方法包括接種含有編碼結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)的仙臺病毒載體的 疫苗；
[0067] (5)⑷的方法，其中通過鼻內(nèi)接種疫苗；
[0068] (6)⑷或（5)的方法，其中在多個疫苗的接種中本疫苗至少接種一次；
[0069] (7)誘導(dǎo)特異于結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)的細胞免疫應(yīng)答的方法，該方法包括步驟（a) 在抗原遞呈細胞中導(dǎo)入編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的仙臺病毒載體和（b)將抗原抗原遞呈細胞 與T輔助細胞和細胞毒性T細胞接觸。
[0070] 本發(fā)明所用的術(shù)語"疫苗"是指用于預(yù)防或治療感染疾病的組合物。疫苗含有抗 原或者可以表達抗原，所以，它可以誘導(dǎo)對抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的含有仙臺病毒載體的 疫苗，能夠以所需的形式用于病原微生物的感染，傳播和流行的預(yù)防或治療。
[0071] "接種"是指通過接種疫苗在生物體或培養(yǎng)系統(tǒng)中能動地產(chǎn)生免疫性（體液免疫 性，細胞免疫性，或兩者）。由此可以預(yù)防阻止病原體的感染，繁殖，傳播和/或流行。而且 也可以抑制感染了病原體后病癥的表現(xiàn)和/或發(fā)展。
[0072] "抗原"指含有一個或多個表位并且可以通過刺激宿主的免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)特異于抗 原的免疫應(yīng)答的蛋白。免疫應(yīng)答可以是體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫應(yīng)答。雖然3個到幾 個氨基酸可以構(gòu)成表位，在蛋白質(zhì)中，一個表位通常含有約7到15個氨基酸，例如8、9、10、 12或14個氨基酸。抗原又稱為免疫原。在本發(fā)明中，當用編碼抗原蛋白質(zhì)的聚核苷酸或載 體表達抗原時，該聚核苷酸或載體定義為抗原。這也可以用作疫苗的成分。
[0073] "免疫應(yīng)答"或"免疫學應(yīng)答"指針對抗原或疫苗的體液免疫應(yīng)答和/或細胞免疫 應(yīng)答。體液免疫應(yīng)答指抗體分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細胞免疫應(yīng)答指T淋巴細胞和/或其它 白細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。細胞免疫應(yīng)當包括諸如CTL的產(chǎn)生、輔助T細胞的產(chǎn)生或活化。細 胞免疫應(yīng)答可以通過檢測諸如CD8+T細胞等活化T細胞或其它白細胞產(chǎn)生的細胞因子或趨 化因子來測定。另外，還可以通過諸如已知的淋巴細胞增殖測試、CTL測試、特異于抗原的T 細胞測試來確定。
[0074] "重組"體指通過重組的聚核苷酸產(chǎn)生的化合物或組合物。重組聚核苷酸指與天然 一樣非結(jié)合的聚核苷酸。表達重組聚核苷酸可以得到重組蛋白質(zhì)。另外，"重組"病毒載體 的定義是通過基因工程由重組聚核苷酸或它的擴增產(chǎn)物構(gòu)建的病毒載體。
[0075] 本發(fā)明所用的術(shù)語"副粘病毒"定義為Paramyxoviridae科的病毒。副粘病毒 包括，但不限于此。例如，仙臺病毒（Sendai virus)、新城病病毒（New castle disease virus)、流行性聰腺炎病毒（Mumps virus)、麻疹病毒（measles virus)、呼吸多核（RS) 病毒（Respiratory syncytial virus)、牛傷寒病毒（rinderpest virus)、溫熱病毒 (distemper virus)、猴副流感病毒（SV5)，I型、II型和III型人副流感病毒等等。仙臺病 毒可以是野生型菌株、突變體菌株、實驗室傳代菌株，或者是人工構(gòu)建的菌株等等。DI顆粒 (病毒學雜志，1994年，68卷：8413-8417頁）等不完全病毒和合成的寡核苷酸等等可以用 作生產(chǎn)本發(fā)明的疫苗的物質(zhì)。
[0076] 編碼副粘病毒的蛋白質(zhì)的基因包括即、？、1^、圓，和1^基因。本文中，"即、？、1、 F、HN，和L基因"分別表示編碼核殼蛋白質(zhì)、磷蛋白、基質(zhì)蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、血凝素-神 經(jīng)氨酸酶和巨大蛋白質(zhì)。副粘病毒亞族的每個病毒的基因通常如下所述。通常，NP基因也 可以表示為"N基因"。
[0077]
[0078] 屬于副粘病毒（Paramyxoviridae)呼吸病毒（Respirovirus)的仙臺病毒的每 個基因的核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫登記號分別為，對于NP基因參照M29343、M30202、M30203、 M30204, M51331、M5565、M69046,和 X17218 ;對于 P 基因參照 M30202、M30203、M30204、 M55565、M69046、X00583、X17007,和 X17008 ;對于 Μ 基因參照 D11446、K02742、M30202、 M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、X53056 ;對于 F 基因參照 D00152、D11446、D17334、 D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152 和 X02131 ;對于 HN 基因參照 D26475、 M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、X56131 ;對于 L 基因參照 D00053、 M30202、M30203、M30204、M69040、X00587,和 X58886。
[0079] 本發(fā)明所用的術(shù)語"基因"定義為含有核酸如RNA、DNA等的遺傳物質(zhì)?；蚩梢?是天然得到或帶有人工設(shè)計的序列。本文利用的副粘病毒載體含有編碼結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì) 或其一部分的外源基因。該外源基因可以是天然的結(jié)核桿菌含有的基因或或其片段。外源 基因也可以包括例如編碼缺損的、突變的、失活的或與其他蛋白質(zhì)融合的天然結(jié)核桿菌蛋 白質(zhì)的核酸。另外，本文的"DNA"包括單鏈DNA和雙鏈DNA。
[0080] 本發(fā)明所用術(shù)語"結(jié)核分枝桿菌"是指引起結(jié)核病的病原菌。可侵犯全身各器官， 以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核分枝桿菌根據(jù)基因組和地區(qū)等的不同，可分為多種菌株。比如在中 國和東南亞普遍流行的是北京家族結(jié)核菌。本發(fā)明中所使用的菌株為結(jié)核菌的標準毒株， 即H37Rv株。
[0081] 本發(fā)明所用的術(shù)語"仙臺病毒載體"定義為來自仙臺病毒的并且用于將基因轉(zhuǎn)化 到宿主細胞的載體。仙臺病毒可以是核糖核蛋白（RNP)，也可以是具有感染性的病毒顆粒。 在此，"感染性"定義為重組仙臺病毒載體通過它的細胞吸附和膜融合能力將載體內(nèi)部的基 因轉(zhuǎn)化到載體所吸附的細胞中的能力。本發(fā)明的仙臺病毒載體以可表達的方式攜帶編碼可 成為抗原的結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的外源基因。仙臺病毒載體可以具有與野生型載體一樣的復(fù)制 能力，也可以因基因突變而減弱。另外，本發(fā)明的仙臺病毒載體還可以是沒有復(fù)制能力的缺 陷型載體。"復(fù)制能力"定義為病毒載體在感染細胞中復(fù)制并生產(chǎn)感染性病毒顆粒的能力。
[0082] 本發(fā)明提供了包含結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的基因或其一部分的仙臺病毒載體的疫苗。仙 臺病毒編碼的結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)沒有局限性，只要蛋白質(zhì)具有抗原性。結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)包 括結(jié)核桿菌的結(jié)構(gòu)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和修飾蛋白。這些蛋白質(zhì)或者它們的一部分多肽等可用 于疫苗的生產(chǎn)。本疫苗可以通過構(gòu)建表達上述的蛋白質(zhì)或其一部分的仙臺表達載體來生 產(chǎn)。這些蛋白質(zhì)可以是單獨的，也可以是復(fù)數(shù)的組合。在本發(fā)明中，特定優(yōu)選利用表達結(jié)核 桿菌的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的SeV。
[0083] 本發(fā)明人先前已發(fā)現(xiàn)，鼻內(nèi)接種彌猴的重組SeV載體的基因表達在接種后一星期 內(nèi)達到峰值，并且持續(xù)至少13天。另外，重復(fù)給藥可以使表達持久。這些特征在利用重組 SeV載體進行接種時，具有獲得快速和持續(xù)的治療效果的優(yōu)點。
[0084] 從安全性的角度來看，SeV載體也表現(xiàn)出適宜于人的臨床應(yīng)用的可能性。首先，在 許多載體中，外源基因表達要求轉(zhuǎn)染后的DNA必須進入核內(nèi)，這成為影響基因轉(zhuǎn)染成功率 的主要障礙。但是，在仙臺病毒的情況下，外源基因的表達是在細胞質(zhì)中由細胞微管蛋白和 其本身具有的RNA聚合酶（L蛋白質(zhì)）兩者來驅(qū)動的。這表明SeV不會與寄主細胞的基因組 相互作用，這避免了致瘤等安全性方面的問題。其次，已知SeV對嚙齒類動物是致病性的， 可以引起肺炎。但對人沒有病原性。鼻內(nèi)給藥野生型SeV沒有對非人靈長類產(chǎn)生嚴重的有 害作用的報告也證明了這一點（Burwitz J.L.等人《疫苗》，1997年，第15卷，第533-540 頁）。SeV的這些特征表明，SeV載體用于人時，是非常安全的，并且有望成為能夠表達抗原 蛋白質(zhì)的載體之一。事實上，在本發(fā)明中，在SeV接種后的小鼠本身沒有表現(xiàn)出任何明顯的 病理癥狀，也沒有觀察體重的明顯降低。本發(fā)明的疫苗特別優(yōu)選用于以結(jié)核桿菌為對象的 接種。用另一句話說，接種本發(fā)明的疫苗可以誘導(dǎo)對結(jié)核桿菌的免疫從而達到防止結(jié)核桿 菌的感染和/或繁殖。本發(fā)明的疫苗優(yōu)選用于沒有感染結(jié)核桿菌之前的預(yù)防和感染后的治 療。
[0085] 在本發(fā)明中用于接種的SeV載體沒有特別的限制。例如較理想的SeV載體可以是 具有復(fù)制能力并且能夠自我繁殖的載體。例如，通常野生型SeV的基因組緊接著短3'引導(dǎo) 區(qū)是編碼N(核殼）、P(磷）、M(基質(zhì)）、F(融合）、HN(血凝素-神經(jīng)氨酸酶）和L(大）蛋 白質(zhì)的6個基因，并且在另一末端具有短5'非轉(zhuǎn)錄尾區(qū)。通過設(shè)計具有與上面所述的載體 相似的結(jié)構(gòu)的基因組可以得到能夠自我復(fù)制的載體。另外，通過在基因組中插入外源基因 可以獲得表達外源基因的載體。SeV載體的病毒基因的排列可以與野生型不同。
[0086] 本發(fā)明的用于免疫的SeV載體可以缺損一部分野生型SeV中含有的基因。例如， 為了構(gòu)建SeV載體和表達基因，NP、P/C和L基因編碼的蛋白質(zhì)被認為是必需的，所以，編碼 這些蛋白質(zhì)的基因必需包含在SeV載體的基因組中。而其他基因，比如M、F和HN蛋白質(zhì)可 在構(gòu)建SeV載體時，通過反式方法（Trans:其他形式）供應(yīng)。可以將攜帶編碼這些蛋白質(zhì) 的基因的表達載體與編碼SeV載體基因組的表達載體共轉(zhuǎn)染于寄主細胞，來構(gòu)建SeV載體。 還可以將編碼病毒基因組的表達載體轉(zhuǎn)染于攜帶編碼這些蛋白質(zhì)的基因的寄主細胞，利用 寄主細胞提供的蛋白質(zhì)來再構(gòu)建SeV載體。只要在核酸轉(zhuǎn)化中具有和天然的蛋白質(zhì)具有相 當?shù)幕蚋叩幕钚?，這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以與病毒本身的序列不同，并且可以是突 變的或使用另一個病毒的同源基因。
[0087] 當以RNP的形式制備SeV載體時，可以不要被認為是SeV載體的細胞間傳播所必 需的M、F和HN基因編碼的蛋白質(zhì)。只要RNP中含有的基因組包含M、F和HN基因，當將其 導(dǎo)入宿主細胞時，可以產(chǎn)生這些基因的產(chǎn)物，并且產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒。產(chǎn)生感染性 病毒的RNP載體可以是含有編碼N、P、M、F、HN和L基因的基因組RNA和N、P和L蛋白質(zhì)的 RNP。當將這樣的RNP導(dǎo)入細胞時，通過N、P和L蛋白質(zhì)的作用，病毒基因組得到了表達和 復(fù)制，以致感染性病毒載體得到擴增。
[0088] RNP可以與脂轉(zhuǎn)染胺試劑、聚陽離子脂質(zhì)體等形成復(fù)合物導(dǎo)入細胞。具體地說，可 以利用各種轉(zhuǎn)染試劑，例如 DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、D0TAP、D0PE、 D0SPER(Boehringer#1811169)。可以加入氯喹以防止在核內(nèi)體內(nèi)的降解（Calos Μ. P.，美 國科學院年報，1983年，80卷，第3015頁）。在復(fù)制型病毒的情況下，可以將產(chǎn)生的病毒通 過再感染培養(yǎng)細胞、雞胚或生物個體（例如小鼠等哺乳動物）進行擴增或傳代。
[0089] 相反，M、F和/或HN基因缺陷的SeV載體也可用于本發(fā)明。可以通過從外源提供 缺損的基因產(chǎn)物來再構(gòu)建這些載體。這樣的載體和野生型病毒一樣仍然與宿主細胞吸附并 且誘導(dǎo)細胞融合。但是由于導(dǎo)入細胞的載體的基因組上缺乏上述的某一基因，因此不能形 成和最初一樣的有感染性的子病毒顆粒。所以，這些載體可以用于只有一次基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力 的非常安全的病毒載體?；蚪M中缺損的基因可以是F和/或HN基因。將編碼缺損F基 因的重組副粘病毒的基因組的表達質(zhì)粒，F(xiàn)蛋白質(zhì)的表達載體和NP、P/C和L蛋白質(zhì)的表達 載體共轉(zhuǎn)染于寄主細胞可以再構(gòu)建病毒載體（W000/70055和W000/70070)。還可以利用基 因組內(nèi)已整合了 F基因的寄主細胞來生產(chǎn)。從外源提供這些蛋白質(zhì)時，其氨基酸序列可與 野生型的不相同，并且只要它們提供與天然的蛋白質(zhì)相當?shù)幕蚋叩幕蜣D(zhuǎn)化活性，可以 是突變的或使用另外的病毒的同源蛋白質(zhì)。
[0090] 可以在病毒的包被蛋白中含有和來自病毒基因組的包被蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)。這 些蛋白質(zhì)不受任何限制?？梢园ㄆ渌《镜陌坏鞍踪|(zhì)，如水泡性口膜炎病毒（VSV)的 G蛋白質(zhì)（VSV-G)。所以，構(gòu)成本發(fā)明的疫苗的SeV載體包括包含來自和病毒基因組非同源 的病毒的包被蛋白質(zhì)的假型病毒載體。
[0091] 同時，用于本發(fā)明的疫苗的SeV載體在它的包被的表面可以具有一個靶向特定的 細胞的粘連分子、配體或受體等蛋白質(zhì)，或者可以是在胞外區(qū)域含有這些蛋白質(zhì)，而在胞內(nèi) 區(qū)域含有起源于病毒包被蛋白質(zhì)的多肽的嵌合蛋白質(zhì)。由此可以制作以特定組織為靶標的 載體。這些蛋白質(zhì)可以是病毒基因組編碼的，或在病毒的再構(gòu)建時，通過病毒基因組以外的 基因（例如，其他的表達載體或宿主細胞的染色體的基因）的表達來提供。
[0092] 為了減少針對SeV蛋白質(zhì)的抗原性，或者為了增強RNA的轉(zhuǎn)錄效率和復(fù)制效率，可 以改變用于本發(fā)明的疫苗的SeV載體中含有的病毒基因。具體地說，至少可以改變復(fù)制因 子基因 NP、P/C和L基因中的某一個基因來增強轉(zhuǎn)錄或者復(fù)制能力。此外，作為結(jié)構(gòu)蛋白 質(zhì)之一的HN蛋白質(zhì)具有血凝素（hemagglutinin)活性和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase)活 性，如果可以減弱前者的活性，可望增強血液中病毒的穩(wěn)定性。如可以改變后者的活性，則 可望可望調(diào)節(jié)感染性。同樣，改變與膜融合相關(guān)的F蛋白質(zhì)，可望調(diào)節(jié)與膜融合的脂質(zhì)體的 融合能力。另外，還可望通過分析在細胞表面的F蛋白質(zhì)和HN蛋白質(zhì)的可能的抗原分子的 表位，并利用它們來制作降低了抗原表達能力的SeV。
[0093] 另外，缺少修飾基因的SeV也可以用于本發(fā)明的疫苗。例如，當SeV的一個修飾基 因 V基因被去掉后，雖然不影響基因在培養(yǎng)細胞中的表達和復(fù)制，但SeV對小鼠的致病能力 大大降低（Kato, A等人，1997年《病毒學雜志》71卷：第7266-7272頁；Kato, A等人，1997 年《EMBO 》第 16 卷：第 578-587 頁；Curran, 等人，W001/04272, EP1067179)。這樣弱 毒化后的載體特別優(yōu)選作為構(gòu)成本發(fā)明的疫苗的載體。
[0094] 用于本發(fā)明的疫苗的病毒載體在其基因組RNA中編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)或該蛋白 質(zhì)的一部分。通過在上面提到的在SeV載體的基因組中插入外源基因可以得到表達外源基 因的重組的SeV載體。外源基因可以是編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)或該蛋白質(zhì)的一部分的基因片 段。這樣的基因片段可以是編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的天然存在的基因片段，也可以是編碼經(jīng) 過缺損、替代或者插入等由天然蛋白質(zhì)經(jīng)修飾而得到的基因，只要該基因編碼的蛋白質(zhì)至 少具有一部分與天然蛋白質(zhì)相當?shù)目乖浴?br>[0095] 結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)是指結(jié)核菌中包含的蛋白質(zhì)。已有研究證明，H37Rv株的免 疫優(yōu)勢抗原是Ag85A和Ag85B等。在本發(fā)明中，優(yōu)選利用的是表達這些蛋白質(zhì)的任何一個 或一部分，或它們的混合體的SeV載體。我們構(gòu)建了 SeV載體以表達任何這些蛋白質(zhì)（包 括加工的和未加工的蛋白質(zhì)）的全長或它們的一部分，或它們的組合。作為蛋白質(zhì)的一部 分，其長度和位點不受任何限制，只要這部分具有抗原的活性。例如，它可以包含一個或多 個表位的多肽。這樣的多肽通常至少含有結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的3到幾個鄰接 的氨基酸。優(yōu)選含有結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的約7到約15個氨基酸，例如，8、9、 10、12或14個氨基酸。
[0096] 本疫苗至少利用了一種結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，甚至在只表達Ag85抗原 時也能夠誘導(dǎo)有效的免疫誘導(dǎo)。另外，利用多個類型的蛋白質(zhì)作為抗原，可以得到更高的免 疫性。
[0097] 另外，疫苗可以使用來自結(jié)核桿菌的一個菌株的蛋白質(zhì)，但如果用從復(fù)數(shù)的菌株 得到的菌體蛋白質(zhì)作為抗原，可以獲得針對更寬范圍的菌株的結(jié)核桿菌的免疫能力。在利 用復(fù)數(shù)的菌株作為抗原的情況下，它們之間的組合不受任何限制。例如，可以利用從各種分 離菌株中得到的基因生產(chǎn)疫苗?？梢詫⒍鄠€結(jié)核桿菌基因分別整合進不同的SeV載體基因 組中構(gòu)建SeV后利用它們的組合，也可以將多個基因整合進同一 SeV載體的基因組來表達 這些基因。
[0098] 為了構(gòu)建表達結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)的SeV，例如，可以將編碼靶結(jié)核桿菌的蛋白的基 因插入編碼SeV基因組的DNA(SeV載體DNA)。在將外源基因插入SeV載體DNA中時，需 要在轉(zhuǎn)錄終止序列（E)和轉(zhuǎn)錄起始序列（S)之間插入含有是六的倍數(shù)個的核苷酸的序列 (Calain P.和Roux L.，《病毒學雜志》，1993年，67 (8)，第4822-4830頁）。外源基因可以 插入在各個SeV基因（即、？、14、圓和1^基因）的上游和/或下游。為了不干擾上下游的 基因的表達，可在外源基因的上游或下游插入E-I-S序列（轉(zhuǎn)錄終止序列-中介序列-轉(zhuǎn) 錄起始序列）或它的一部分，使得各個基因之間都有E-I-S序列。或者可以通過插入IRES 表達外源基因。
[0099] 插入的外來基因的表達水平可以由附隨于這些基因的上游的轉(zhuǎn)錄起始序列的類 型來進行調(diào)節(jié)。也可以由插入的位點和基因前后的序列來調(diào)節(jié)。例如，在SeV中，插入位點 越靠近病毒基因組的負鏈RNA的3'末端（越靠近野生型病毒基因組中的NP基因），插入 基因的表達水平就越高。為了達到外源基因的高表達，優(yōu)選將外源基因插入在負鏈基因組 的上游區(qū)如NP基因的上游（負鏈的3'側(cè)區(qū)）或插入在NP和P基因之間。與此相反，插入 位點越靠近負鏈RNA的5'末端（越靠近野生型病毒基因組的L基因），插入基因的表達水 平就越低。為了減少外源基因的表達，可以將它插入在負鏈的最5'端位置，即野生型病毒 基因組的L基因的下游（負鏈的L基因的5'側(cè)區(qū)）或L基因的上游（負鏈的L基因的3' 側(cè)區(qū)）。由此可知，為了得到所望的外源基因的表達水平，可以適當?shù)卣{(diào)節(jié)外源基因的插入 位置，或通過前后的編碼病毒蛋白質(zhì)的基因的組合來調(diào)整。例如，當投放高滴度的病毒載體 時，由于導(dǎo)入基因的高表達會出現(xiàn)毒性。在這種情況下，除了可以控制所投放的病毒的滴度 以外，還可以通過將外來基因的插入位點設(shè)計在靠近負鏈的5'末端區(qū)域，或使用低效的轉(zhuǎn) 錄起始序列來控制。
[0100] 通常，因為沒有細胞毒性，抗原蛋白質(zhì)的高表達在免疫性的獲得上是有利的，所 以，優(yōu)選將編碼抗原蛋白質(zhì)的基因與高效的轉(zhuǎn)錄起始序列連接，并且將該基因插入負鏈基 因組的3'末端附近。優(yōu)選的載體的例子包括結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)在副粘病毒載體的負鏈基 因組中位于任何副粘病毒的病毒蛋白質(zhì)的3'側(cè)的載體。例如，優(yōu)選抗原基因插入在N基因 的上游（負鏈的3'側(cè)）的載體?；蛘呖乖虿迦朐诰o接N基因的下游。
[0101] 為了使外源基因的插入容易些，可以在插入位置設(shè)計一個克隆位點。例如，克隆位 點可以是限制酶的識別序列?？梢詫⑼庠椿虿迦氩《据d體DNA的限制位點?？寺∥稽c還 可以是含有多個限制酶的識別序列的多克隆位點。用于本發(fā)明的疫苗的載體可以在上述插 入了結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)以外的位置中含有其它外源基因。這樣的外源基因不受任何限制， 它可以是與免疫誘導(dǎo)有關(guān)的細胞因子或趨化因子基因，也可以是其它的基因。
[0102] 含有外源基因的重組仙臺病毒載體可以根據(jù)Hasan，M.K.等人《遺傳病毒學雜志》 78卷：2813-2820頁，1997年；Yu D.等人，基因細胞，1997年，2,457-466的記載，按如下方 法構(gòu)筑。
[0103] 首先制備含有所需的外源基因的cDNA序列的DNA樣品。優(yōu)選濃度為25納克/毫 升或更高，并且通過電泳檢測為單個質(zhì)粒的DNA樣品。下面的描述是將外源基因插入病毒 基因組DNA的Notl位點的例子。如果要插入的cDNA序列中含有Notl位點，那么需要預(yù)先 通過定位誘變法在不改變所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的前提下改變核苷酸序列以來除 去這個位點。從DNA樣品進行PCR以擴增并回收需要的DNA片段。為了使擴增的片段在兩 端都具有Notl位點，并且在一個末端附加一個拷貝的仙臺病毒的轉(zhuǎn)錄終止序列（E)、中介 序列（I)和轉(zhuǎn)錄起始序列（S) (EIS序列），合成了含有Notl限制酶切位點及轉(zhuǎn)錄終止序列 (E)、中介序列⑴和轉(zhuǎn)錄起始序列⑶以及一部分目的基因的序列的正向引物（正向鏈） 和反向引物（反義鏈）的引物對。
[0104] 例如，正向的合成DNA序列在5'末端含有任意的兩個或更多核苷酸以保證Notl 消化成功（優(yōu)選不含有起源于Notl識別位點如GCG和GCC的4個核苷酸，更優(yōu)選ACTT)。 在此序列的3'末端加入Notl識別序列GCGGCCGC。另外，在3'末端加入任意的9個或9+6 的倍數(shù)個核苷酸作為間隔區(qū)。另外，在3'末端，再加上對應(yīng)于所需的cDNA的0RF的從起始 密碼ATG開頭的約25個核苷酸的序列。優(yōu)選合成的正向的低聚DNA的3'末端含有約25 個所需的cDNA的核苷酸序列并且使最后的核苷酸是G或C。
[0105] 反向的合成DNA序列在5'末端含有任意的兩個或更多核苷酸（優(yōu)選不含有起源 于Notl識別位點，如GCG和GCC的4個核苷酸；更優(yōu)選ACTT)。在此序列的3'末端加上 Notl識別序列GCGGCCGC。另外，在3'末端，加入一個間隔低聚DNA來調(diào)節(jié)引物的長度。如 下所述，將包括Notl識別序列GCGGCCGC、與cDNA互補的序列、來自仙臺病毒基因組的EIS 序列在內(nèi)的低聚DNA的長度設(shè)計成使它核苷酸的總數(shù)為6的倍數(shù)（所謂的"6的規(guī)則"； Kolakofski D.等人《病毒學雜志》，1998 年，72 卷，第 891-899 頁；Calain P.和 Roux L·， 《病毒學雜志》，1993年，67卷：4822-4830)。另外，在加上的序列的3'末端再加上與仙臺病 毒的S序列互補的序列，優(yōu)選5' -CTTTCACCCT-3'，與I序列互補的序列，優(yōu)選5' -AAG-3'，和 與E序列互補的序列，優(yōu)選5' -TTTTTCTTACTACGG-3'。最后，再在3'末端加上所需的cDNA 的從終止密碼子往上游數(shù)的約25個核苷酸的互補序列并使最后的核苷酸為G或C。這樣， 制備了反向合成低聚DNA的3'末端。
[0106] PCR通過普通的方法，例如利用ExTaq聚合酶（TaKaRa)進行。優(yōu)選利用Vent聚合 酶（NEB)，擴增的DNA片段用Notl消化后，插入質(zhì)粒載體pBluescript的Notl位點。用自 動DNA序列儀檢測得到的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列。選擇具有正確序列的質(zhì)粒。通過Notl 消化從質(zhì)粒中切出插入的片段，亞克隆進含有副粘病毒基因組cDNA的質(zhì)粒中的Notl位點。 也可以不通過pBluescript質(zhì)粒，直接將PCR產(chǎn)物克隆進后述的質(zhì)粒的Notl位點而得到重 組的仙臺病毒cDNA。
[0107] 例如，可以根據(jù)文獻（Yu，D.等人《基因細胞》2卷：457-466，1997年；Hasan Μ. K.等人，《遺傳病毒學雜志》1997年，78卷：2813-2820)記載的方法構(gòu)建重組仙臺病毒基 因組cDNA。例如，將含有Notl位點的18bp的間隔序列（5' _(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'） 插入克隆的仙臺病毒基因組cDNA(pSeV(+))的導(dǎo)前置序列和編碼N蛋白質(zhì)的序列的5'末 端之間的鄰近的基因座中，得到了含有來自丁型肝炎病毒反義鏈的可自我裂解的核酶位點 的質(zhì)粒pSeV18 + * b (+) (Hasan, Μ· K.等人，《遺傳病毒學雜志》1977年，78卷：2813-2820)。 將外源基因片段插入pSeVIS * b(+)的Notl位點，得到已經(jīng)插入所需的外源基因的重組仙 臺病毒cDNA。
[0108] 在體外或細胞中轉(zhuǎn)錄如此制作的重組的副粘病毒載體DNA，在L、P和NP蛋白質(zhì)存 在的條件下再構(gòu)建RNP，可以產(chǎn)生含有RNP的病毒載體。本發(fā)明提供了生產(chǎn)含有編碼結(jié)核 桿菌的蛋白質(zhì)副粘病毒載體的疫苗的方法，這一方法包括轉(zhuǎn)錄病毒的基因組DNA的工序。 本發(fā)明還提供了由該DNA生成的，用于生產(chǎn)作為本發(fā)明的疫苗的成分的副粘病毒載體的 DNA。本發(fā)明涉及生產(chǎn)作為本發(fā)明的疫苗的成分的副粘病毒載體的，編碼本載體的基因組的 DNA的用途?？梢愿鶕?jù)已知的方法從病毒載體DNA再構(gòu)建病毒（W097/16539 ;W097/16538 ; Durbin A. P.等人，《病毒學》，1997年，235卷：第323-332頁；Whelan S.P.等人《美國自然 科學進程》1995年，92卷，第8388-8392頁；Schnell M. J.等人《ΕΜΒ0 J》1994年，13卷，第 4195-4203 頁；Radecke F.等人，《ΕΜΒ0 J.》1995 年，14卷，第 5773-5784 頁；Lawson N.D.等 人，《美國自然科學進程》，1995年，92卷，第4477-4481頁；Garcin D.等人，《ΕΜΒ0 J.》，1995 年，14卷，6087-6094 ;Kato A.等人，《基因細胞》1996年，1卷，第569-579頁；Baron M.D.和 Barrett T·，《病毒學雜志》，1997 年，71 卷，第 1265-1271 頁；Bridgen A.和 Elliott R.M·， 《美國科學院年報》1996年，93卷：第15400-15404頁）。根據(jù)這些方法能夠從DNA再構(gòu)建 包括副流感病毒、水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒和仙臺病毒等副粘 病毒載體。如果病毒載體DNA中缺少F、HN和/或Μ基因，光此不能形成有感染性的病毒顆 粒?？梢詫⑦@些缺少的基因或編碼來自其他病毒的包被蛋白質(zhì)的基因?qū)爰闹骷毎⑹怪?表達來生產(chǎn)感染性病毒顆粒。
[0109] 將載體DNA導(dǎo)入細胞的方法可以包括⑴形成可以摻入所需的細胞的DNA沉淀， (2)生成包含帶正電的DNA的復(fù)合物的方法，該復(fù)合物適于摻入所需的細胞，并且細胞毒性 低，和（3)利用電脈沖在所需的細胞膜上快速地打開一個能讓DNA通過的足夠大的孔。
[0110] 在⑵中，可以利用各種轉(zhuǎn)染試劑，例如DOTMA(Boehringer)、 Superfect(QIAGEN#301305)、D0TAP、D0PE 和 D0SPER(Boehringer#1811169)。對于方法（1)， 可以利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染。在這一方法中，已知摻入細胞中的DNA會被吸收進吞噬泡，但核中也 有足夠量的DNA(GrahmF·L·和vanDerEbJ·，《病毒學》，1973 年，52,456;WiglerM·和 Silverstein S·，《細胞》，1977年，11卷，223頁）。chen和Okayama對轉(zhuǎn)化技術(shù)進行了最 佳化研究，并報告：（1)細胞和沉淀的培養(yǎng)條件為2到4%的C0 2, 35°C，15到24小時，（2)環(huán) 狀DNA比線性DNA活性高，和⑶混合溶液中DNA濃度在20到30毫克/毫升之間時，可以 得到最佳的沉淀（Chen C.和Okayama H.，《細胞分子生物學》，1987年，7卷，第2745頁）。 方法（2)適用于瞬時轉(zhuǎn)染。更早的方法是將DEAE-dextran(Sigma#D-9885M.W.5X10 5)溶 液與DNA以所需的濃度比例混合后進行轉(zhuǎn)染。因為大多數(shù)復(fù)合物在核內(nèi)體中降解，可以加 入氯喹增強轉(zhuǎn)染的效率（Calos M.P.，《美國科學院年報》，1983年，第80卷，3015)。方法 (3)，稱為電穿孔法，由于它可以用于任何種類的細胞，因而和方法（1)和（2)相比用途更 廣。在最佳脈沖流的持續(xù)時間、脈沖的形式、電場的強度（電極之間的空隙和電壓）、緩沖液 的導(dǎo)電性、DNA濃度和細胞密度的條件下效率最大。
[0111] 在上述3個方法中，方法（2)由于其操作簡便，并且可以利用大量的細胞來測試 多數(shù)的樣品，比較適于在再構(gòu)建載體時往細胞中導(dǎo)入DNA。優(yōu)選利用Superfect轉(zhuǎn)染試劑 (QIAGEN，#301305)或 D0SPER 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Boeringer Mannheim#1811169)。
[0112] 從cDNA的再構(gòu)建可按以下步驟來具體進行：
[0113] 在24孔-6孔的塑料平板中，或在100毫米的培養(yǎng)皿中，在含有10%的胎牛血 清（FCS)和抗生素（100單位/毫升青霉素 G和100暈克/毫升鏈霉素）的極限必需培養(yǎng) 基（MEM)中培養(yǎng)從猴腎得到的細胞系LLC-MK2,直到70-80%融合。然后，用2pfu/細胞的 已經(jīng)在1毫克/毫升的補骨脂素存在下，用20分鐘的UV曝光失活的表達T7聚合酶的重 組牛痘病毒VTF7-3感染細胞（Fuerst T. R.等人《美國自然科學進程》，1986年，83卷：第 8122-8126頁；Kato. A.等人，《基因細胞》1996年，1卷，第569-579頁）。補骨脂素的量和 UV曝光的時間可以進行適宜調(diào)整。感染后1小時，例如通過Superfect (QIAGEN)將2到60 毫克，更優(yōu)選3到5毫克的重組仙臺病毒cDNA和生產(chǎn)全長的仙臺病毒基因組所必需的，以 反式起作用的病毒蛋白質(zhì)的表達質(zhì)粒（例如，24-0. 5毫克的pGEM-N，12-0. 25毫克pGEM-P， 和24-0. 5毫克pGEM-L，或更優(yōu)選地1毫克pGEM-N，0. 5毫克pGEM-P，和1毫克pGEM-L)脂 轉(zhuǎn)染細胞（Kato. A.等人，《基因細胞》，1996年，1卷，第569-579頁）。轉(zhuǎn)染的細胞在無血清 的，如果需要，可含有100毫克/毫升利福平（Sigma)，和阿糖胞苷（AraC) (Sigma)，更優(yōu)選 在只含40毫克/毫升的阿糖胞苷的MEM中培養(yǎng)?？筛鶕?jù)需要調(diào)節(jié)藥物的濃度到最佳，從而 使牛痘病毒的細胞毒性最小和病毒的回收率最大（Kato. A.等人，《基因細胞》，1996年，第1 卷：569-579)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細胞48到72小時，然后回收細胞，用三個凍融循環(huán)破碎細胞后， 將其轉(zhuǎn)染進LLC-MK2細胞。培養(yǎng)3-7天后，收集培養(yǎng)液。為了再構(gòu)建不能復(fù)制的缺乏編碼 包被蛋白質(zhì)的基因的病毒載體，可以將載體轉(zhuǎn)染進表達包被蛋白質(zhì)的LLC-MK2細胞、或與 包被蛋白質(zhì)的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。還可以將表達包被蛋白質(zhì)的LLC-MK2細胞鋪在轉(zhuǎn)染的細胞 上并施培養(yǎng)來繁殖缺損的病毒載體（W000/70055和W00070070)。培養(yǎng)液中的病毒滴度可以 通過測量血凝素活性（HA)來確定。而HA可以用"終點稀釋法"來確定（Kato. A.等人，《基 因細胞》，1996年，1卷，569-579 ;Yonemitsu Y.和Kaneda Y.，日本凝血病毒-脂質(zhì)體介導(dǎo) 的微管細胞的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，微管疾病的分子生物學，分子醫(yī)藥方法，Baker A.H.編輯，Humana 出版，1999年，295-306頁）?？赡芑烊耄埩簦┑膙TF7-3可以通過將得到的尿囊樣品適當 稀釋（例如1〇6倍），并在雞蛋中再擴增來除去。再擴增例可以重復(fù)3或更多次。得到的病 毒可以儲藏在-80 °C。
[0114] 用于病毒載體構(gòu)建的寄主細胞不限于任何特定的細胞類型，只要病毒載體可以在 該細胞中再構(gòu)建。寄主細胞可以包括LLC-MK2細胞、從猴腎得到的CV-1細胞、從倉鼠腎得 到的BHK細胞等培養(yǎng)的細胞系，也可使用人起源的細胞。為了獲得大量的仙臺病毒載體， 可以用從上面的寄主細胞得到的病毒載體感染已成胚胎的雞卵來擴增載體。用雞卵生產(chǎn) 病毒載體的方法是已確立的（神經(jīng)科學研究的先進技術(shù)方案III，神經(jīng)科學分子生理學， Nakanishi等人編輯，Kouseisha, Osaka, 1993年，第153-172頁）。具體地說，例如將受精 的雞卵在溫育器中，在37-38Γ培養(yǎng)9到12天直到長成胚胎。將病毒載體接種進尿囊腔， 繼續(xù)培養(yǎng)雞蛋幾天繁殖載體。培養(yǎng)的時間等條件可以根據(jù)所用的重組仙臺病毒的類型而變 化。然后，回收含有病毒的尿囊液。根據(jù)標準方法，從尿囊樣品中分離和純化仙臺病毒載體 (Tashiro M.，病毒實驗方案，Nagai和Ishihama編輯，醫(yī)藥觀察，1995年，第68-73頁）。
[0115] 例如，可以按如下方法構(gòu)建和制備缺陷F蛋白質(zhì)的仙臺病毒載體（W000/70055和 W000/70070)〇
[0116] (1)構(gòu)建缺陷F基因的仙臺病毒基因組cDNA和F的表達質(zhì)粒
[0117] 用SphI和ΚρηΙ消化全長的仙臺病毒（SeV)基因組cDNA^=jpSeV18(Hasan Μ K.等 人，《遺傳病毒學雜志》，1997年，78卷，2813-2820頁）（pSeV18+b(+)也稱為pSeV18(+))， 回收得到的片段（14673bp)，克隆進pUC18得到質(zhì)粒pUC18/KS。F缺陷區(qū)域利用pUC18/ KS來構(gòu)建。F基因的缺陷通過PCR-連接法來進行，最終除去F基因的0RF(1698bp)，用 序列5' -atgcatgccggcagatga連接構(gòu)筑缺陷F基因的SeV基因組cDNA (pSeV18+/ Λ F) 用 EcoT22I 消化并連接用引物（正向：5' -gttgagtactgcaagagc ;反向：5' -tttgccggc atgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc)得到的F基因上游的PCR產(chǎn)物和引物（正向： 5' -atgcatgccggcagatga ;反向：5' -tgggtgaatgagagaatcagc)得到的 F 基因下游的 PCR 產(chǎn) 物。然后用SacI和Sail消化得到的質(zhì)粒，回收含有F基因缺損部位的片段（4931bp)，克隆 進PUC18得到pUC18/dFSS。用Drain消化pUC18/dFSS，回收片段并取代pSeV18+的含有F 基因的Drain片段，連接得到pSeV18/ Λ F。在pUC18/dFSS的F基因缺損部位中的Nsil 或NgoMIV位點可以插入外源基因。為此，可以用以Nsil接尾的引物及NgoMIV接尾的引物 擴增含有外源基因的片段。
[0118] (2)制備誘導(dǎo)表達SeV-F蛋白質(zhì)的輔助細胞
[0119] 如下構(gòu)建表達仙臺病毒F基因（SeV-F)的Cre/loxP可誘導(dǎo)表達質(zhì)粒。通過PCR擴 增SeV-F基因，克隆進pCALNdLw質(zhì)粒的唯一的Swal位點（Arai等人，《病毒學雜志》，1998 年，第72卷，第1115-1121頁），這一質(zhì)粒被設(shè)計成可以通過Cre DNA重組酶的作用誘導(dǎo)基 因產(chǎn)物的表達，這樣得到了 pCALNdLw/F。
[0120] 為了從缺損F基因的基因組得到感染性病毒顆粒，建立了一個表達SeV-F蛋白質(zhì) 的輔助細胞系?？梢岳脧膹浐锬I得到的，通常用于SeV繁殖的LLC-MK2細胞。在37°C， 5%的C0 2條件下，用含有10%的熱失活的胎牛血清（FBS)、50單位/毫升的青霉素 G鈉和 50毫克/毫升的鏈霉素的MEM培養(yǎng)LLC-MK2細胞。由于SeV-F基因產(chǎn)物有細胞毒性，所以 將該基因克隆進pCALNdLw，在這一質(zhì)粒中，F(xiàn)基因可由Cre DNA重組酶誘導(dǎo)表達。根據(jù)標準 方法，通過磷酸媽方法（哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒（Stratagene))，將上面的pCALNdLw/F轉(zhuǎn)染于 LLC-MK2 細胞。
[0121] 用10毫克pCALNdLw/F轉(zhuǎn)染在10厘米的平板中培養(yǎng)至40%融合的LLC-MK2細胞 用10毫升含有10% FBS，在37°C和5%的C02下培養(yǎng)24小時。然后，剝離細胞，懸浮于10 毫升的培養(yǎng)基中后，鋪到5個10厘米的盤上，其中在一個盤鋪5毫升細胞懸浮液，2個鋪2 毫升，兩個鋪0. 2毫升。在10毫升含有10% FBS和1200毫克/毫升G418(GIBC0-BRL)的 MEM中培養(yǎng)14天，每兩天更換培養(yǎng)基，選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體。用克隆環(huán)回收的培養(yǎng)基上生長的 抗G418的細胞。繼續(xù)培養(yǎng)回收的每個菌落的細胞，直到它們在10厘米的盤中到100%融 合。
[0122] 為了誘導(dǎo)F蛋白質(zhì)的表達，在6厘米的盤中培養(yǎng)細胞到100%融合，根據(jù)Saito等 人的方法（Saito等人，《核酸綜述》，1995年，23卷，第3816-3821頁；Arai T.等人《病毒學 雜志》，1998年，72卷，第1115-1121頁），用moi = 3的AxCANCre腺病毒感染。
[0123] (3)缺損F基因的SeV病毒的再構(gòu)建與繁殖
[0124] 如下，將已經(jīng)插入外源基因的pSeV18+/AF轉(zhuǎn)染進LLC-MK2細胞。將5X106個 細胞/盤的LLC-MK2細胞鋪在100毫米的盤里，培養(yǎng)24小時后，用補骨脂素和20分鐘的長 UV(365nm)處理過的表達T7RNA聚合酶的重組牛痘病毒感染1小時（Furest T. R.等人，《美 國自然科學進程》，1986年，第83卷，第8122-8126頁）在室溫下感染1小時（moi = 2-3 ; 優(yōu)選用moi = 2)。牛痘病毒的紫外線照射采用裝備了 5個15瓦的燈泡的UV Stratakinker 2400 (目錄號 400676 (100V)，Stratagene，La Jolla, CA，USA)。洗滌細胞三次后，以 12 毫 克/盤，4毫克/盤，2毫克/盤，和4毫克/盤將質(zhì)粒pSeV18+/DF-GFP，pGEM/NP，pEGM/P， 和pGEM/L懸浮于OptiMEM(GIBCO) (Kato A.等人，《基因細胞》，1996年，1卷，第569-579 頁），并與SuperFect轉(zhuǎn)染試劑（1毫克DNA用5毫升SuperFect(QIAGEN))混合后，在室 溫下放置10分鐘，最后加入3毫升濃度為3%的FBS的OptiMEM，然后加到細胞中。在溫 育器中培養(yǎng)3小時后，用無血清的MEM洗滌細胞2次，繼續(xù)在含有40毫克/毫升阿糖胞苷 (AraC，Sigma)，和7. 5毫克/毫升的胰蛋白胨（GIBC0)的MEM中培養(yǎng)70小時。然后，收集 細胞，并以1〇7個細胞/毫升將細胞再懸浮于OptiMEM中。凍融細胞3次，然后與脂轉(zhuǎn)染試 劑D0SPER(Boehringer mannheim)混合（每25毫升D0SPER中106個細胞），在室溫下放置 15分鐘，轉(zhuǎn)染進上述選擇的一個表達F的輔助細胞系，例如LLC-MK2/F7細胞（10 6個細胞 /孔，12孔的平板），在含有40毫克/毫升的Arac和7. 5毫克/毫升的胰蛋白胨的無血清 MEM中培養(yǎng)，收集上清液。有可能混入的牛痘病毒可以采取重復(fù)稀釋得到的上清液并感染 LLC-MK2F7細胞的過程來除去。
[0125] 在制備缺損的病毒載體時，可以將在病毒基因組上缺失不同包被基因的兩個不同 的病毒載體轉(zhuǎn)染進相同的細胞。在這種情況下，各自缺損的包被蛋白可以通過另一載體的 表達提供，這樣的相互補充可以導(dǎo)致感染性病毒顆粒的形成并使病毒復(fù)制鏈運轉(zhuǎn)從而復(fù)制 病毒載體。換句話說，可以同時接種兩個或更多的，包被蛋白互補的病毒載體的組合，從而 低價并大規(guī)模地生產(chǎn)各個缺失包被的病毒載體的混合物。因為這些病毒缺失包被基因，與 不缺損包被基因的病毒相比病毒的基因組更小，所以它們允許插入更長的外源基因。另外， 這些本身不具感染性的病毒，在細胞外稀釋后很難保持共感染狀態(tài)，由于其是不孕的，所以 在環(huán)境管理上是有利的。
[0126] 為了使回收的副粘病毒真正純凈，可以進行精制。可以采用已知的純化和分離方 法，包括過濾、離心、柱層析純化或這些方法的組合進行純化。"真正純凈"指分離到的物 質(zhì)，例如化合物、多肽、病毒等等其在作為物質(zhì)存在的樣品中的成分在樣品中占主要的比 例。典型地，樣品中存在的真正純凈的成分占了含有其它成分的整個樣品的50%或更多， 優(yōu)選70 %或更多，更優(yōu)選80 %或更多，更優(yōu)選90 %或更多?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的 方法，例如重量比重量的比例（W/V)計算這一比例。計算比例時必需除去溶劑、鹽、加入的 化合物等等。副粘病毒的精制方法，具體地說，例如有米用纖維素硫酸酯或交聯(lián)的多糖硫 酸酯的方法（日本專利申請公開號（JP-B) :Sho62-30752 JP-B Sho 62-33879 JP-B Sho 62-30753)。以及使之與含有硫酸的多糖和/或它的降解產(chǎn)物吸收（WO 97/32010)，等等方 法。
[0127] 可以將回收的SeV載體用作活的重組疫苗。本文中，活疫苗被定義為能夠在給藥 的個體的細胞中擴增載體基因組，表達抗原蛋白質(zhì)，和獲得免疫性的組合物。如實施例中所 示，SeV載體的接種在彌猴中較好地誘導(dǎo)了免疫性，并且沒有表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，所以 優(yōu)選地用于活疫苗。接種這樣的活疫苗的對象沒有限制，可以包括免疫缺陷病毒可以感染 的所有動物，例如人、猴、貓、狗、豬、馬、牛等等。另外，利用上面提到的缺乏傳播能力的SeV 載體，可以生產(chǎn)載體不傳播的活疫苗。
[0128] 另外，在表達蛋白質(zhì)慘入SeV顆粒的情況中，可以利用SeV載體作為失活的顆粒疫 苗?；蛘撸诒磉_蛋白質(zhì)摻入SeV顆粒的情況中，可以從SeV載體分離和純化表達的免疫缺 陷病毒蛋白質(zhì)用作疫苗。因為SeV載體含有的蛋白質(zhì)種類有限，與從整個細胞溶菌物分離 用表達載體在細胞中表達的免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)相比要容易得多。已知的分離技術(shù)可以用 于蛋白質(zhì)的純化，例如利用針對免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)的抗體，通過免疫親和柱層析來純化。 可以期望，與活疫苗和失活疫苗相比，用純化的蛋白質(zhì)作為疫苗可以抑制接種后發(fā)生的發(fā) 燒和局部反應(yīng)的頻率。
[0129] 如果需要，含有SeV載體的疫苗可以與所需要的藥物學可接受的載體或者媒介物 結(jié)合或者可以包含所需要的藥物學可接受的載體或者媒介物。在本文中，"藥物學可接受載 體"定義為可以與載體一起給藥，但沒有明顯抑制載體的基因轉(zhuǎn)化的那些物質(zhì)。例如，可以 用生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水（PBS)等等適當?shù)叵♂孲eV載體制成組合物。如果在雞蛋中 繁殖SeV載體，組合物可以含有尿囊液。同樣，含有SeV載體的疫苗組合物可以含有如去離 子水或5%的葡聚糖水溶液這樣的媒體。它還可以進一步含有植物油、懸浮劑、表面活性劑、 穩(wěn)定劑、抗生素等等。另外，可以加入保存劑和其它添加劑。為了提高免疫原性，可以加入細 胞因子、霍亂毒素、傷寒毒素等等免疫催速劑。另外還可以將礬、不完全佛氏佐劑、MF59(油 乳劑）、MTP-PE (從分枝桿菌細胞壁得到的胞壁酰三肽）和QS-21 (從soapbark樹Quilaja saponaria得到）與疫苗組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，將SeV載體與佐劑左旋咪唑組合 配制為疫苗組合物。
[0130] 利用本發(fā)明的疫苗接種可以預(yù)防結(jié)核桿菌感染和/或在感染后除去結(jié)核桿菌或 抑制結(jié)核桿菌的繁殖。另外，它可以用于預(yù)防結(jié)核的發(fā)作，或在發(fā)作后進行治療。它也可以 在結(jié)核桿菌感染模型中用于預(yù)防及/或治療的方法的開發(fā)或評估。
[0131] 本發(fā)明的疫苗可以用足夠劑量給藥，使有效量的載體轉(zhuǎn)化到靶組織的細胞中。本 文中，"有限量"定義為能夠?qū)⒒驅(qū)氚薪M織的細胞以致至少產(chǎn)生部分所需的免疫應(yīng)答的 劑量。給藥有效量的含有所需基因的SeV載體能夠在轉(zhuǎn)染細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。優(yōu)選給藥 含有所需基因的有效量的SeV使轉(zhuǎn)染基因在給藥組織或血液中呈明顯的表達水平。"明顯 水平"定義為由SeV載體轉(zhuǎn)染的基因的表達（轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物的量）可被檢測。但是， 轉(zhuǎn)染的基因的表達水平必需考慮它的有效水平和毒性水平而決定。
[0132] 通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員周知的測試方法可以測定轉(zhuǎn)染進細胞的基因的表達水平。 可以用Northern雜交、RT-PCR、RNA防護測試等等檢測和定量轉(zhuǎn)錄物。還可以在原位進行 Northern雜交、RT-PCR等檢測。為了檢測翻譯產(chǎn)物，可以利用采用抗體的Western影印、免 疫沉淀、RIA，ELISA，pull down測試方法等等。為了容易地檢測轉(zhuǎn)染的基因的表達，可以在 待表達的蛋白質(zhì)上附加尾標，或在載體中包含一個報告基因。報告基因可以是編碼β-半 乳糖苷酶、CAT、堿性磷酸酶，或GFP的基因，但不局限于這些。
[0133] 可以通過檢測抗體或免疫細胞來檢測免疫應(yīng)答。例如，可以通過各種周知的測試 方法，如通過測試與各種病原蛋白質(zhì)的結(jié)合（ELISA測試、Western影印，等等）、對合胞體的 形成的抑制、互補固定、依賴抗體的細胞介導(dǎo)的細胞毒性（ADCC)能力、對感染或細胞融合 的中和能力、等等，來測試針對結(jié)核桿菌的體液性免疫應(yīng)答。
[0134] 可以通過例如測試特異于抗原的CTL活性、CTL的產(chǎn)生、或者輔助性T細胞的產(chǎn)生 和活性等等來檢測細胞的免疫應(yīng)答。另外，通過檢測激活的T細胞，如CD8+T細胞，或其它 的由白細胞產(chǎn)生的細胞因子或趨化因子同樣可以檢測細胞的免疫應(yīng)答。還有，可以通過周 知的淋巴細胞增殖測試、CTL測試、特異于抗原的T細胞測試等等進行檢測。
[0135] 用于給藥的載體的劑量可以根據(jù)疾病、患者的體重、年齡、性別、癥狀、給藥的目 的、疫苗的形式和給藥方法等等而變化，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員適當?shù)卮_定。疫苗中包含 的載體的劑量優(yōu)選在約l〇 5pfu/毫升到10npfu/毫升的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約107pfu/毫升到 l〇9pfu/毫升，但最優(yōu)選的是在約1 X 10spfu/毫升到5 X 10spfu/毫升內(nèi)，與藥物學可接受載 體一起給藥。疫苗可以在皮內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、跨支氣管、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或口服接種。例如，可 以通過往上呼吸道的附近的疫苗接種，即接種到鼻內(nèi)粘膜和上呼吸道來誘導(dǎo)粘膜免疫性。 因此，將SeV疫苗通過鼻內(nèi)噴灑等等接種于氣管是非常有效的。也可以鼻內(nèi)給藥，例如用導(dǎo) 管介導(dǎo)給藥。另外，可以將已經(jīng)導(dǎo)入SeV的細胞作為疫苗接種。例如，用SeV感染從待接種 疫苗的個體得到的細胞，然后，通過來自體內(nèi)的給藥進行接種。
[0136] 另外，不僅僅單次接種，例如通過兩次或多次的接種也可以有效地誘導(dǎo)足夠的免 疫性。在人的情況中，多次接種的間隔通常是2到4星期。
[0137] 在多次接種時，可以多次接種含有SeV的本發(fā)明的疫苗，但利用SeV疫苗和其它疫 苗的組合也是優(yōu)選的。如上所述，基于病毒載體的疫苗方案的一個缺點是最終誘導(dǎo)了針對 載體病毒起源的抗原而不是靶抗原的強烈的免疫應(yīng)答。這個問題可以利用在引導(dǎo)和加強時 分別使用兩個或更多不同種類的病毒載體來解決這一問題。所以，如上所述，在基于DNA疫 苗的引導(dǎo)之后使用基于病毒載體進行加強也是可選之策。另外，再接種相同的重組病毒對 于加強特異于抗原的應(yīng)答可能會不夠。所以，用SeV載體引導(dǎo)并用不同的病毒載體或DNA 疫苗進行加強也是有效的。除此之外，用重組SeV載體表達多個抗原可以提高防御效率。
[0138] 所以，在利用不同種類的疫苗進行引導(dǎo)-加強的方案中，與SeV疫苗組合的疫苗不 受限制，可以利用所需的疫苗。例子包括重組的亞單位疫苗、基于SeV以外的病毒或微生物 的活重組疫苗、BCG、多肽疫苗、DNA疫苗，等等，但不局限于這些。亞單位疫苗定義為不具有 靶結(jié)核桿菌的所有抗原、只含有一個或復(fù)數(shù)個選定的蛋白質(zhì)抗原的疫苗。這樣的疫苗至少 是從結(jié)核桿菌的其它成分或感染細胞得到的成分中部分地分離的。而亞單位疫苗可以通過 至少部分地純化結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)來制備。另外，也可以利用重組或通過合成生產(chǎn)亞單位疫 苗。用作活重組疫苗的基本成分的微生物的例子包括痘病毒、腺病毒、傷寒病毒、脊髓灰質(zhì) 炎病毒、分枝桿菌、流感病毒、以及Semliki森林病毒，等等，但不局限于這些。在SeV疫苗 和其它疫苗的接種順序上是不限制的。可以在接種SeV疫苗后，接種其它疫苗，相反，也可 以在接種其它疫苗后，接種SeV疫苗。
[0139] 例如，在用DNA疫苗引導(dǎo)后，再用SeV疫苗加強。這樣的接種是一個包括以下步驟 的方法：(a)給藥DNA疫苗，然后（b)給藥編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的副粘病毒。DNA疫苗可以 利用編碼例如結(jié)核桿菌基因組的DNA?？梢岳缤ㄟ^肌肉內(nèi)給藥和/或基因槍給藥接種DNA 疫苗。在接種DNA疫苗幾次后，例如接種基于本發(fā)明的SeV的疫苗。接種的間隔通常是幾 天到幾星期。
[0140] 可以接種疫苗的動物可以是具有免疫系統(tǒng)并且可以用結(jié)核桿菌感染的所有寄主， 包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、羊、豬、牛、馬、鳥等所有的哺乳動物。本發(fā)明的疫苗接種的動物 優(yōu)選靈長類。除了人以外，可以進行本發(fā)明的疫苗的接種的靈長類的例子（非人靈長類） 包括狐猴、loris及tarsier等原猴；廣鼻猴和狹鼻猴等真猴；類人猿如gibbbon、猩猩、 gorilla、黑猩猩、bonobo等等。狹鼻類中特別是彌猴，具體地，包括日本彌猴、食蟹彌猴、恒 河彌猴、bonnet猴、豬尾彌猴、棕粧尾彌猴、阿薩姆猴等等。對非人靈長類接種疫苗特別適 用于為了對人臨床應(yīng)用的結(jié)核疫苗的開發(fā)和評估。
[0141] 含有編碼結(jié)核桿菌的蛋白質(zhì)的SeV載體的疫苗可以局部地或全身性地誘導(dǎo)寄主 的免疫反應(yīng)。特別是導(dǎo)入本載體后的細胞作為特異于抗原的免疫反應(yīng)的刺激細胞起作用并 誘導(dǎo)細胞的免疫反應(yīng)。本發(fā)明提供了誘導(dǎo)特異于結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的細胞性免疫反應(yīng)的方 法，該方法包括步驟：(a)在抗原遞呈細胞中導(dǎo)入編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的仙臺病毒載體和 (b)將抗原遞呈細胞與T輔助細胞和細胞毒性T細胞接觸的過程。本文中，使細胞"接觸" 也包括允許細胞相互接觸。用其它話說，這包括，例如，將載體導(dǎo)入的細胞注入血液中（能 夠接觸體內(nèi)的T輔助細胞和細胞毒性T細胞）；在同一種培養(yǎng)基中將載體導(dǎo)入的細胞與T輔 助細胞和細胞毒性細胞進行共培養(yǎng)；等等。另外，特異于抗原的"細胞性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)" 指至少誘導(dǎo)了該細胞性免疫反應(yīng)的一部分。例如，特異于抗原的CTL的刺激，該CTL的頻率 和活性（例如，細胞毒性）上升，等等。
[0142] 抗原遞呈細胞指I類主要組織相容復(fù)合物（MHC)或II類MHC被提呈的細胞，并且 具有將抗原蛋白質(zhì)的肽結(jié)合到每個分子上的能力的細胞。抗原遞呈細胞的例子有樹突細胞 (DC)。I類MHC分子是結(jié)合抗原肽并且將它提呈于細胞毒性T細胞（⑶8+)的分子。II類 MHC分子是結(jié)合抗原肽并且將它提呈于細胞毒性T細胞（CD4+)上的分子。T輔助細胞是指 T細胞家族的一群細胞，它識別II類MHC分子提呈的抗原并整合一連串的免疫反應(yīng)的信號 傳遞的細胞。細胞毒性T細胞也指T細胞家族的一群細胞，它識別I類MHC分子提呈的抗 原，殺死如感染結(jié)核桿菌的細胞、癌細胞、以及移植片的細胞等等的細胞（Xu Μ等人，《生物 技術(shù)趨勢》18 (4) : 167-72, 2000)。
[0143] 例如，在外周血液單核細胞（PBMC)等等中轉(zhuǎn)導(dǎo)編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的SeV載體 后，通過在體外與PBMC的共培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)IFM-γ的產(chǎn)生及特異于結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的CTL 的增殖等細胞性免疫應(yīng)答。另外，體內(nèi)給藥能夠在寄主中誘導(dǎo)特異于抗原的細胞性免疫應(yīng) 答。
[0144] 通過測試IFN- γ的量和測量⑶8+IFN- γ +T細胞的頻度可以確認細胞免疫應(yīng)答。 另外，以表達結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的細胞為靶細胞并通過測量靶細胞的溶解也可以測量CTL的 活性?？梢酝ㄟ^轉(zhuǎn)導(dǎo)上面提到的SeV載體制備這樣的祀細胞。例如，在自身Herpesvirus papio無限增殖的B淋巴細胞系（BLC)中導(dǎo)入表達結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的SeV，然后與預(yù)期含有 CTL的樣品一起溫育，利用51Cr釋放等等作為指標可以測量BLC的溶解程度。另外，無限增 殖的細胞系H9 (來自人T細胞）等等也可以作為例證。
[0145] 本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)或檢測特異于結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的細胞性免疫反應(yīng)的，編碼結(jié) 核桿菌蛋白質(zhì)的SeV載體或本載體導(dǎo)入的細胞的使用。另外，本發(fā)明還涉及包含導(dǎo)入了編 碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的SeV載體的細胞在內(nèi)的，特異于結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的細胞性免疫應(yīng)答的 刺激細胞。本發(fā)明涉及包含導(dǎo)入了編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的SeV載體的細胞在內(nèi)的，特異于 結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的細胞免疫應(yīng)答的靶細胞。另外，本發(fā)明還涉及在上述刺激細胞或靶細胞 中表達結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的，編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的SeV載體的使用。
[0146] SeV載體編碼的結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)不受限制。如上所示，它們可以是結(jié)核桿菌結(jié)構(gòu)蛋 白質(zhì)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、修飾蛋白質(zhì)等等。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的例子包括Ag85A、Ag85B,等等。例如，利 用編碼結(jié)核桿菌的Ag85A蛋白質(zhì)的SeV，可以誘導(dǎo)特異于Ag85A的細胞性免疫應(yīng)答。
[0147] 實施例
[0148] 下面，用實施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于這些實施例。在本說明書中 引用的參考文獻的內(nèi)容均通過提述組入本說明書。
[0149] [實施例l]Ag85AB嵌合基因的分離、擴增和構(gòu)建
[0150] 通過PCR從結(jié)核分枝桿菌基因組擴增Ag85A基因，PCR擴增后通過Nhel/ BamHI雙酶切后連接至pVAXl載體中，使用的引物為針對該序列5'端的上游引物P1序 列和 3' 端的下游引物 P2 序列（5,-ΑΤΑ GCT AGC ATG GTT TCC CGG CCG GGC TTG 03' 和 5' -ΤΑΑ GGA TCC CTA GGC GCC CTG GGG CGC-3'）；然后選擇在 Ag85A 基因中可插 入外源DNA片段的第245-250位Κρη I酶切位點，或第430-435位Acc I酶切位點， 分別用內(nèi)切酶Κρη I或內(nèi)切酶Acc I消化Ag85A基因，并用堿性磷酸酶去磷酸化。接 著，分別用帶有內(nèi)切酶Κρη I識別序列的引物對，或帶有內(nèi)切酶Acc I識別序列的引 物對，通過聚合酶鏈反應(yīng)從結(jié)核分枝桿菌基因組擴增編碼Ag85B蛋白125-282位氨基 酸序列的DNA片段。本
【發(fā)明人】設(shè)計了針對該序列5'端的上游引物P3序列和3'端
者均帶有Κρη I酶切位點（GGTACC)，分別用內(nèi)切酶Κρη I或內(nèi)切酶Acc I消化Ag85A基因， 并用堿性磷酸酶去磷酸化。
[0151] 然后將經(jīng)消化的Ag85A基因與Ag85B片段用T4DNA連接酶連接起來，將所得質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在卡那霉素抗性培養(yǎng)基平皿上培養(yǎng)生長出菌落。挑選單個菌落分別小試管 培養(yǎng)后，分別抽提質(zhì)粒作電泳鑒定，再作酶切和電泳鑒定，初步選出正確者經(jīng)測序確認，重 組的Ag85AB嵌合型基因構(gòu)建成功。
[0152] [實施例2]SeV85AB重組仙臺病毒載體的構(gòu)建
[0153] F基因缺失的SeV載體（SEQ ID N〇:9)由日本生物載體公司構(gòu)筑提供（H. Li.等 人，2000年，《病毒學雜志》，74卷：第6564-6569頁）。利用該載體構(gòu)建表達結(jié)核分枝桿菌 Ag85AB蛋白的重組SeV載體疫苗，即SeV85AB，下文簡稱SeV85AB。具體的，前期實驗已證 明，通過重組技術(shù)敲除SeV融合蛋白F基因并不會影響該載體病毒在培養(yǎng)細胞中的復(fù)制和 基因表達，且感染細胞不會產(chǎn)生和釋放感染性病毒顆粒。因此，F(xiàn)基因的敲除在保證了病毒 感染和復(fù)制效力的同時，增強了該載體的安全性。如上述論文中記載的（H. Li.等人，見上 文），本發(fā)明人已對含有全長的F基因缺失的減毒SeV基因組cDNA質(zhì)粒pSeV (+) 18/dF進行 了描述。
[0154] 通過PCR擴增制備編碼Ag85AB (以Acc I為嵌合位點）的基因片段，并將它克隆到 pSeV(+) 18/dF 中，得到 pSeV(+) 18dF/Ag85AB。用于 PCR 的引物 P7 和 P8 序列是 5' -ATT GCG GCC GCG ACA TGG TTT CCC GGC CGG GCT TG-3' ；5'-ATT GAT GAA CTT TCA CCC TAA GTT TTT CTT ACT ACG GCT AGG CGC CCT GGG GCG CGG GCC CGG TGT TGG GCG TG-3,。首先，我 們通過[實施例1]分離并利用上述引物擴增了結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢基因 Ag85AB，然后， 將其通過N端編碼區(qū)上游的Not I位點插入至pSeV(+) 18/dF載體中（圖1)。在T7RNA聚合 酶的作用下，這一質(zhì)粒pSeV(+) 18dF/Ag85AB可以產(chǎn)生全長的SeV85AB的反基因組RNA。接 著將質(zhì)粒pSeV (+) 18dF/Ag85AB轉(zhuǎn)染到LLC-MK細胞并回收重組的SeV,即SeV85AB (Kato, A. 等人，1996年，《基因細胞》1卷：第569-579頁）。具體地說，用表達T7RNA聚合酶的重組牛 痘病毒（VV)，vTF7-3(Fuerst，T. R.等人，1986年《美國科學院年報》，83卷：8122-8126)感 染 LLC-MK2 細胞，然后將 pSeV (+) 18dF/Ag85AB 與 pGEM-N、pGEM-P、和 pGEM-L (Garcin, D.等 人，1995年，《EMBO J.》14卷：6087-6094)共轉(zhuǎn)染該細胞。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時后， 去除細胞培養(yǎng)上清，用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞2次，繼續(xù)在含有40毫克/毫升的阿 糖胞苷（AraC，Sigma)和7. 5毫克/毫升的胰蛋白胨（GIBC0)的DMEM中培養(yǎng)70小時。然 后，收集細胞，并以1〇7個細胞/毫升的比例將細胞重懸于培養(yǎng)基中。反復(fù)凍融細胞3次， 然后與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑DOSPER(Boehringer mannheim)混合（每25毫升D0SPER中106個 細胞），在室溫下放置15分鐘，轉(zhuǎn)染至一個表達F基因的輔助細胞系，例如LLC-MK2/F7細胞 (10 6個細胞/孔，12孔板），在含有40暈克/毫升的Arac和7. 5暈克/毫升的胰蛋白胨的 無血清DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，收集上清。
[0155] 我們利用同樣的方法制備空白SeV作為SeV85AB的對照。利用LLC-MK2細胞和抗 SeV抗體進行免疫染色來篩選和鑒定重組SeV載體疫苗，滴度（CIU [細胞感染單位]/毫升） 的檢測則如文獻（Kiyotani，K.等人，1990年《病毒學》177:第65-74頁）所述。
[0156] 本實施例中得到的SeV85AB重組仙臺病毒載體已被保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心（CCTCC，地址：武漢市武昌珞珈山，郵編：430072)，分類：副粘病毒科/屬，保藏日期： 2015年4月19日，保藏編號為CCTCC V201518。
[0157] [實施例3]表達Ag85AB的SeV85AB重組病毒的鑒定
[0158] 用SeV85AB感染細胞，并對其表達的蛋白質(zhì)進行分析。具體的，在六孔板中，以每 孔4X 105個細胞的密度過夜培養(yǎng)LLC-MK2細胞，然后以感染復(fù)數(shù)m. o. i.為1、3、10、30、100 的SeV或SeV85AB感染該細胞。2天后，回收細胞，并用1XSDS sample buffer溶解細胞。 經(jīng)100°C熱處理后，在各個電泳道中加入10微升的細胞溶解物進行SDS-PAGE電泳。利用 抗Ag85A小鼠單克隆抗體作為一抗，與熒光素結(jié)合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G (IgG)二抗對 細胞裂解物進行Western Blot分析。數(shù)據(jù)證實了 SeV85AB感染的LLC-MK2細胞中表達了 Ag85AB，而SeV空白載體對照為陰性結(jié)果（圖2)。
[0159] [實施例4]對小鼠鼻腔免疫SeV85AB能夠誘導(dǎo)抗原特異性T細胞免疫應(yīng)答
[0160] 無特定病原體（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周齡）購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.，Ltd.(中國上海）。利用該小鼠來驗證經(jīng)鼻腔免疫SeV85AB能否 誘導(dǎo)Ag85AB特異性免疫反應(yīng)。用2X10 6CIU/動物和107CIU/動物的SeV85AB(20ul，于PBS 中）經(jīng)鼻腔免疫小鼠，而將接種空白病毒（未表達結(jié)核抗原的SeV載體）和PBS的小鼠作 為對照。免疫兩周后，殺死小鼠，從小鼠中摘取肺臟（包括氣管組織）和睥臟。
[0161] 如下制備肺淋巴細胞和脾細胞的單細胞懸液：將脾臟機械破碎，并經(jīng)紗網(wǎng)（mesh gauze)過濾單個的脾細胞。將紅血球細胞（RBC)用RBC裂解緩沖液（BD Biosciences)裂 解。同時，無菌取出肺并用剪刀切成碎片，在37°C與10ml R10培養(yǎng)基（含有10% FBS[胎牛 血清]和1%青霉素加鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基）中的lmg/ml膠原酶IVdnvitrogen) 和10U DNase I (Thermo)溫育30min。為了將組織解離成單細胞，將經(jīng)膠原酶處理的肺碎片 經(jīng)由70 μπι細胞過濾器（Fisher Scientific)溫和過濾并通過注射器栓塞擠壓。然后，將 細胞懸液離心并進行RBC裂解。清洗后，將單個肺淋巴細胞重懸于R10培養(yǎng)基，計數(shù)用于進 一步分析。
[0162] 利用ELISP0T法檢測在Ag85AB多肽或蛋白質(zhì)（5 μ g/ml)和PPD (結(jié)核菌素純蛋白 衍生物，購自丹麥血清研究所Statens Serum Institute，SSI，10μg/ml)的刺激下，特異 性分泌IFN- γ的⑶4+T和⑶8+T細胞數(shù)量。用于刺激的Ag85AB多肽或蛋白質(zhì)信息如下： Ag85A-CD4 肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白 Ag85A(LTSELPGWLQANRHVKPTGS，II 類 MHC 特異性肽）， 卩1]熟1(03!11目錄號[4熟]62425)、48854-〇)8肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白48854-〇)8(]\0^660551'， I類MHC特異性肽），F(xiàn)UNAK0SHI目錄號[ASI]62424)、Ag85B-CD4肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白 Ag85B (240-254) (FQDAYNAAGGHNAVF，能引發(fā) CD4+T 輔助細胞（Th) 1)，Sigma-Aldrich，目錄 號[ANA]65391)、rAg85A(重組Ag85A蛋白，實驗室純化，序列如SEQIDNo :10所示）。
[0163] 數(shù)據(jù)證明，SeV85AB的鼻腔免疫能夠在小鼠肺臟和脾臟中誘導(dǎo)較強的抗原特異性 T細胞免疫反應(yīng)，而空白載體和PBS作為陰性對照并不能誘導(dǎo)相應(yīng)的免疫應(yīng)答。圖3是肺 臟淋巴細胞的檢測結(jié)果。該結(jié)果確認Ag85A-⑶4多肽、rAg85A蛋白和PPD的刺激能夠誘導(dǎo) 被免疫小鼠的淋巴細胞分泌IFN-γ。在脾臟內(nèi)也得到同樣結(jié)果（圖4)。從劑量看，10 7CIU 高劑量免疫組比2 X 106CIU低劑量免疫組誘導(dǎo)抗原特異性T細胞的效果更好（圖3-4)。從 這些結(jié)果可知，相比于用空白Sev載體和PBS，SeV85AB疫苗經(jīng)鼻腔免疫后，可顯著誘導(dǎo)產(chǎn) 生對結(jié)核抗原Ag85A的局部（肺）以及系統(tǒng)性（脾臟）免疫反應(yīng)。此外，在10 7CIU免疫組 和2X106CIU免疫組，無論有無表達結(jié)核抗原，均未觀察到體重的明顯減輕等毒性反應(yīng)（圖 5) 〇
[0164] [實施例5]對小鼠肌肉內(nèi)免疫SeV85AB能夠抗原特異性T細胞免疫應(yīng)答
[0165] 無特定病原體（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周齡）購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.，Ltd.(中國上海）。利用該小鼠檢測通過肌肉內(nèi)注射接種 SeV85AB是否能誘導(dǎo)Ag85AB特異性的免疫反應(yīng)。用2X106CIU/動物和107CIU/動物的 SeV85AB(20ul，于PBS中）經(jīng)鼻內(nèi)接種小鼠。使用接種空白病毒（未表達結(jié)核抗原的SeV載 體）和PBS的小鼠作為對照。免疫兩周后，殺死小鼠，從小鼠中摘取肺臟（包括氣管組織） 和睥臟并如實施例4所述的制備肺淋巴細胞和脾細胞的單細胞懸液。
[0166] 利用ELISP0T法檢測在Ag85AB多肽或蛋白質(zhì)（5 μ g/ml)和PPD (結(jié)核菌素純蛋白 衍生物，購自丹麥血清研究所Statens Serum Institute，SSI，10μg/ml)的刺激下，特異 性分泌IFN- γ的⑶4+T和⑶8+T細胞數(shù)量。用于刺激的Ag85AB多肽或蛋白質(zhì)信息如下： Ag85A-CD4 肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白 Ag85A(LTSELPGWLQANRHVKPTGS，II 類 MHC 特異性肽）， 卩1]熟1(03!11目錄號[4熟]62425)、48854-〇)8肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白48854-〇)8(]\0^660551'， I類MHC特異性肽），F(xiàn)UNAK0SHI目錄號[ASI]62424)、Ag85B-CD4肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白 Ag85B (240-254) (FQDAYNAAGGHNAVF，能引發(fā) CD4+T 輔助細胞（Th) 1)，Sigma-Aldrich，目錄 號[ANA]65391)、rAg85A(重組Ag85A蛋白，實驗室純化，序列如SEQIDNo :10所示）。
[0167] 數(shù)據(jù)顯示，肌肉內(nèi)免疫pSeV85AB能夠在小鼠的肺臟及脾臟誘導(dǎo)抗原特異性T細 胞免疫應(yīng)答，而免疫空白載體以及PBS的對照組沒有檢測到相應(yīng)的免疫反應(yīng)。圖6是從肺 臟淋巴細胞的檢測結(jié)果。該結(jié)果確認Ag85A-⑶4多肽、rAg85A蛋白和PH)能夠誘導(dǎo)肺臟淋 巴細胞特異性分泌IFN-γ。在脾臟內(nèi)也得到同樣結(jié)果（圖7)。從這些結(jié)果可知，相比于用 空白Sev載體和PBS，SeV85AB疫苗經(jīng)肌肉內(nèi)免疫時，可誘導(dǎo)產(chǎn)生對結(jié)核抗原Ag85A的局部 (肺）以及系統(tǒng)性（脾臟）免疫反應(yīng)。此外，在10 7CIU免疫組和2X 106CIU免疫組，無論有 表達無結(jié)核抗原，均未觀察到體重的明顯減輕等毒性反應(yīng)（圖8)。
[0168] [實施例6] SeV85AB與BCG疫苗作為多價疫苗聯(lián)合免疫時的加強效應(yīng)
[0169] 如上文所述，無特定病原體（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周齡）購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中國上海）。利用該小鼠評估SeV85AB對BCG疫苗 (BCG Danish株，來源于中生集團上海生物制品有限公司）的加強免疫效果。將小鼠隨機分 為8組，每組先用BCG或作為對照的PBS初免，8周后，再用PBS、BCG、SeV/對照或SeV85AB 進行加強免疫。檢測能否誘導(dǎo)結(jié)核抗原Ag85AB特異性的細胞免疫反應(yīng)。試驗具體設(shè)計如 下：
[0170]
[0171] 用PBS初免時，將100 μ 1注射于右后肢腹股溝皮下部位（內(nèi)外側(cè)各50 μ 1)。用 BCG初免時，將106菌落形成單位（CFU)/100 μ 1/動物注射于右后肢腹股溝皮下部位（內(nèi)外 側(cè)各50 μ 1)。
[0172] 初免8周后采用經(jīng)鼻腔免疫的方式施行加強免疫。PBS加強免疫的劑量為20 μ 1/ 動物，BCG的劑量為106CFU/20 μ 1/動物，空白SeV載體的劑量為107CIU/20 μ 1/動物， SeV85AB載體的劑量為107CIU/20 μ 1/動物。加強免疫后2周，從小鼠中摘取肺臟（包括氣 管組織）和睥臟并如實施例4所述的制備肺淋巴細胞和脾細胞的單細胞懸液。
[0173] 利用ELISP0T法檢測在Ag85AB多肽或蛋白質(zhì)（5 μ g/ml)和PPD (結(jié)核菌素純蛋白 衍生物，購自丹麥血清研究所Statens Serum Institute，SSI，10μg/ml)的刺激下，特異 性分泌IFN- γ的⑶4+T和⑶8+T細胞數(shù)量。用于刺激的Ag85AB多肽或蛋白質(zhì)信息如下： Ag85A-CD4 肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白 Ag85A(LTSELPGWLQANRHVKPTGS，II 類 MHC 特異性肽）， 卩1]熟1(03!11目錄號[4熟]62425)、48854-〇)8肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白48854-〇)8(]\0^660551'， I類MHC特異性肽），F(xiàn)UNAK0SHI目錄號[ASI]62424)、Ag85B-CD4肽（結(jié)核分枝桿菌蛋白 Ag85B (240-254) (FQDAYNAAGGHNAVF，能引發(fā) CD4+T 輔助細胞（Th) 1)，Sigma-Aldrich，目錄 號[ANA]65391)、rAg85A(重組Ag85A蛋白，實驗室純化，序列如SEQIDNo :10所示）。
[0174] 肺臟淋巴細胞的ELISP0T實驗結(jié)果如圖9所示。接受BCG初免一SeV85AB加強免 疫的小鼠與BCG加強免疫相比，能夠更好的誘導(dǎo)分泌IFN-γ的淋巴細胞。脾臟的實驗結(jié)果 如圖10所示。接受BCG初免一SeV85AB加強免疫的小鼠與BCG加強免疫時相比，同樣能夠 誘導(dǎo)顯著更多的分泌IFN-γ的淋巴細胞。亦即，接受第8組免疫方案的小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了遠 優(yōu)于其余7組的針對結(jié)核抗原Ag85A的局部（肺）以及系統(tǒng)性（脾臟）免疫反應(yīng)。同時， SeV85AB免疫的小鼠與其它試驗組相比，沒有觀察到任何明顯的體重變化（圖11)。
[0175] [實施例7]與BCG相比SeV85AB對結(jié)核分枝桿菌感染的預(yù)防作用
[0176] 如上文所述，無特定病原體（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周齡）購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中國上海）。利用該小鼠來檢測SeV85AB對結(jié)核桿菌 感染的預(yù)防作用。
[0177] 將該小鼠分為4組，分別用空白SeV載體、BCG疫苗（皮下注射接種106CFU -次）、 低劑量（2父106(：11])36￥8548和高劑量36￥8548(107(：11])免疫一次。4周后，在？3實驗室對 其進行結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的氣霧攻擊（100-200CFU)。接著，5周后，殺死小鼠并取小鼠 的肺臟和脾臟組織，研磨成勻漿物后涂布于Middlebrook 7H11瓊脂板上，該瓊脂板補充有 10% 0ADC富集和預(yù)防污染性微生物生長的四抗生素混合物（40U/ml多鏈絲霉素 B、4 μ g/ml 兩性霉素、50 μ g/ml羧芐青霉素、2 μ g/ml甲氧芐氨嘧啶）。在37°C培養(yǎng)三周后，對CFU菌 落計數(shù)，評估疫苗的保護效力。使用student's t檢驗比較任意兩組之間的顯著性，并在圖 12中表示為*(若p〈0. 05)和(若p〈0. 01)。如圖12所示，低劑量SeV85AB的單次經(jīng)鼻 免疫至少能夠誘導(dǎo)與BCG相當?shù)拿庖弑Ｗo效力，而高劑量SeV85AB的效果甚至比BCG更好。
[0178] [實施例8]不同免疫方案下SeV85AB對結(jié)核分枝桿菌感染的預(yù)防作用
[0179] 如上文所述，無特定病原體（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周齡）購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中國上海）。利用該小鼠來檢測SeV85AB對結(jié)核桿菌 感染的預(yù)防作用。
[0180] 首先將該小鼠分為4組，第1-3組分別用PBS (20 μ 1)、BCG (皮下注射接種106CFU 一次）、和BCG(皮下注射接種106CFU-次）處理，4周后，第3組鼻內(nèi)加強接種107CIU SeV85AB -次（加強免疫），第4組使用107CIU SeV85AB經(jīng)鼻腔接種一次。再4周后，在P3 實驗室對其進行結(jié)核分枝桿菌H37Rv株的氣霧攻擊（100-200CFU)。接著，5周后，殺死小鼠 并取小鼠的肺臟和脾臟組織，研磨成勻漿物后涂布于Middlebrook 7H11瓊脂板上，該瓊脂 板補充有10% OADC富集和預(yù)防污染性微生物生長的四抗生素混合物（40U/ml多鏈絲霉素 Β、4 μ g/ml兩性霉素、50 μ g/ml羧芐青霉素、2 μ g/ml甲氧芐氨嘧啶）。在37°C培養(yǎng)三周后， 對CFU菌落計數(shù)，評估疫苗的保護效力。使用student' s t檢驗比較任意兩組之間的顯著 性，并在圖13中表示為*(若p〈0.05)和***(若p〈0.01)。如圖13所示，在肺中，僅使用 SeV85AB的單次經(jīng)鼻免疫能夠誘導(dǎo)與僅使用BCG相當?shù)拿庖弑Ｗo效力，而若將SeV85AB作為 BCG的加強疫苗，則會顯著提高保護效力（圖13右圖）；而在脾中，僅使用SeV85AB的單次 經(jīng)鼻免疫能夠誘導(dǎo)與僅使用BCG相當?shù)拿庖弑Ｗo效力，而若將SeV85AB作為BCG的加強疫 苗，其效果也明顯優(yōu)于僅使用BCG或SeV85AB(圖13左圖）。
[0181] [實施例9]與利福平相比SeV85AB對感染結(jié)核桿菌小鼠體內(nèi)結(jié)核桿菌的抑制作用
[0182] 如上文所述，無特定病原體（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周齡）購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中國上海）。利用該小鼠來檢測SeV85AB對體內(nèi)結(jié)核 桿菌的抑制作用。
[0183] 首先，該小鼠經(jīng)氣霧攻擊100-200CFU H37Rv MTB毒株，感染4周后，將小鼠分為3 組，每組20只。第1組在小鼠飲用水中加入利福平（RFP)進行治療（劑量為10mg/kg/d);第 2組鼻內(nèi)接種10 7CIU SeV85AB，隔周治療一次，共治療三次；對照組僅滴鼻接種PBS(20 μ 1)。 在感染后第1天和感染后4、6、8、12周時，在每個時間節(jié)點分別從每組取3-4只小鼠，殺死 小鼠，并取小鼠的肺臟和脾臟，研磨成勻漿物后涂布于Middlebrook 7Η11瓊脂板上，該瓊 脂板補充有10% 0ADC富集和預(yù)防污染性微生物生長的四抗生素混合物（40U/ml多鏈絲霉 素 Β、4 μ g/ml兩性霉素、50 μ g/ml羧芐青霉素、2 μ g/ml甲氧芐氨嘧啶）。在37°C培養(yǎng)三周 后，進行CFU菌落計數(shù)以分析其治療效果。結(jié)果證明，使用SeV85AB治療4周后較之PBS組 細菌數(shù)量明顯下降，治療8周后的治療效果與RFP組相當（圖14)。
[0184] [實施例10] SeV85AB與利福平聯(lián)合施用對感染結(jié)核桿菌小鼠體內(nèi)結(jié)核桿菌的抑 制作用
[0185] 如上文所述，無特定病原體（SPF)的雌性BALB/c小鼠（6-8周齡）購自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co·, Ltd.(中國上海）。利用該小鼠來檢測SeV85AB對體內(nèi)結(jié)核 桿菌的抑制作用。
[0186] 首先，該小鼠經(jīng)氣霧攻擊100-200CFU H37Rv MTB毒株，感染3周后，將小鼠分為3 組。第1組在小鼠飲用水中加入利福平（RFP)進行治療（劑量為10mg/kg/d)，第2組在施 用利福平治療的同時鼻內(nèi)接種l〇 7CIU SeV85AB，每周治療一次，共治療三次；對照組僅滴鼻 接種PBS (20 μ 1)。感染6周后，殺死小鼠，并取小鼠的肺臟和脾臟，研磨成勻漿物后涂布于 Middlebrook 7Η11瓊脂板上，該瓊脂板補充有10% 0ADC富集和預(yù)防污染性微生物生長的 四抗生素混合物（40U/ml多鏈絲霉素 Β、4 μ g/ml兩性霉素、50 μ g/ml羧節(jié)青霉素、2 μ g/ml 甲氧芐氨嘧啶）。在37°C培養(yǎng)三周后，進行CFU菌落計數(shù)以分析其治療效果。如圖15中顯 示的，在肺中的結(jié)果表明，相比于PBS對照和僅使用利福平，采用利福平和SeV85AB的聯(lián)合 治療能夠顯著降低小鼠肺臟中的荷菌量（圖15)。
[0187] 工業(yè)應(yīng)用
[0188] 本發(fā)明提供了含有編碼結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)的仙臺病毒載體的疫苗。仙臺病毒的毒性 低并且可以用培養(yǎng)細胞大量生產(chǎn)，因此可望能夠安全而容易地生產(chǎn)活的重組疫苗。本發(fā)明 的疫苗還提供了有前途的阻遏結(jié)核桿菌的感染和/或結(jié)核病的發(fā)病和進展的疫苗的方案。
[0189] 保藏：
[0190] 重組SeV85AB載體，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，地址：武漢市武昌 珞珈山，郵編：430072)，分類：副粘病毒科/屬，保藏日期：2015年4月19日，保藏編號為 CCTCC V201518。
【主權(quán)項】
1. 一種仙臺病毒載體的疫苗，其中所述載體表達結(jié)核分枝桿菌免疫抗原，優(yōu)選表達結(jié) 核分枝桿菌分泌蛋白Ag85。2. 權(quán)利要求1的疫苗，其中所表達的結(jié)核分枝桿菌抗原包含Ag85A蛋白、和/或Ag85B 蛋白、和/或其片段以及上述它們的嵌合體的氨基酸序列。3. 權(quán)利要求1或2的疫苗，所使用的載體為F基因缺陷的仙臺病毒載體。4. 權(quán)利要求1-3中任一項的仙臺病毒載體疫苗作為抗結(jié)核預(yù)防性疫苗使用的用途。5. 權(quán)利要求4的用途，其中所述疫苗通過鼻內(nèi)接種的方式免疫。6. 權(quán)利要求4或5的用途，其中所述疫苗以多價疫苗的形式接種至少一次。7. 權(quán)利要求1-3中任一項的仙臺病毒載體疫苗作為抗結(jié)核治療性疫苗使用的用途。8. -種體外誘導(dǎo)特異性針對結(jié)核桿菌蛋白的細胞免疫應(yīng)答的方法，包括：(a)將融合 表達結(jié)核桿菌相關(guān)蛋白的仙臺病毒載體導(dǎo)入抗原遞呈細胞；(b)使抗原遞呈細胞與細胞毒 性T淋巴細胞接觸，其中所述結(jié)核桿菌的蛋白包括選自如下的蛋白：Ag85A，Ag85B，其片段， 或上述任一者的任何組合。9. 一種編碼結(jié)核桿菌蛋白Ag85的仙臺病毒載體在制備誘導(dǎo)特異性針對該蛋白的細胞 免疫應(yīng)答的藥物中的用途，其中所述結(jié)核桿菌Ag85蛋白包括選自如下的蛋白的氨基酸序 列：Ag85A，Ag85B，其片段，或上述任一者的任何組合。10. -種重組仙臺病毒載體，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC V201518。
【文檔編號】C12N15/86GK106063932SQ201510187738
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2015年4月20日 公開號201510187738.8, CN 106063932 A, CN 106063932A, CN 201510187738, CN-A-106063932, CN106063932 A, CN106063932A, CN201510187738, CN201510187738.8
【發(fā)明人】范小勇, 朱亞峰, 胡志東, 羅道良
【申請人】上海市公共衛(wèi)生臨床中心, 株式會社愛迪藥業(yè)