用兒茶酚功能化的磁性納米顆粒、其制備和用圖
【專利摘要】描述了磁性納米顆粒，其表面用兒茶酚功能化；和構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含封裝在生物相容的聚合物基質(zhì)中的多個所述納米顆粒，其中具有治療作用的分子任選地被分散，所述聚合物基質(zhì)任選地轉(zhuǎn)而被進一步功能化；還描述了免疫系統(tǒng)的細胞，所述免疫系統(tǒng)的細胞并入所述聚合物構(gòu)建體以引起它們的工程化。
【專利說明】用兒茶酚功能化的磁性納米顆粒、其制備和用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及功能化的納米顆粒、其制備以及其用途的領(lǐng)域。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 已知磁鐵礦(magnetite)是具有鐵磁特性的礦物質(zhì)，其化學式是Fe3〇4(有時也寫作 FeO · Fe2〇3) 〇
[0003] 眾所周知，呈納米顆粒形式即具有范圍從幾納米到幾十納米的尺寸的磁鐵礦，如 果被浸沒在無線電波范圍內(nèi)的可變磁場中，與電磁場相互作用，且然后向其周圍的事物釋 放熱能，因此產(chǎn)生所謂的過熱作用或磁過熱療法。
[0004]在腫瘤學中，開發(fā)過熱療法以改進化學療法或放射療法的功效;事實上，將實體瘤 的溫度升高在41°C和45°C之間誘導(dǎo)了腫瘤細胞的凋亡;通常，這借助于用達到適當溫度并 且在受到腫瘤塊影響的部位附近循環(huán)的液體洗滌來應(yīng)用。
[0005] 近期，采用了天線，所述天線直接插入到腫瘤塊中，產(chǎn)生微波，并且因此與水的偶 極分子相互作用，產(chǎn)生過熱。
[0006] 這些治療通常是極具侵入性的并且具有差的功效(在第一種情況下），并且在第二 種情況下沒有避免可能的負面作用諸如轉(zhuǎn)移的風險、組織壞死等。
[0007] 使用到達緊鄰腫瘤組織處或優(yōu)選地滲透進入癌細胞的磁性納米顆粒，克服以上問 題并且實現(xiàn)高效的過熱作用是可能的，所述過熱作用以細胞水平被定位。
[0008] 將納米結(jié)構(gòu)特定地遞送到實體瘤的腫瘤細胞中、或病理組織上或諸如阿爾茨海默 病的淀粉樣斑塊的部位上、或多發(fā)性硬化的受損組織上，以有效的方式并且無副作用地傳 遞多個配合的治療諸如過熱療法和藥理學治療因此是可能的。
[0009] 在文獻中，存在雜化的無機聚合物或蛋白納米顆粒的許多實例，所述雜化的無機 聚合物或蛋白納米顆粒包含生物相容的納米顆粒磁鐵礦核心以及為聚合物或蛋白的包衣， 所述包衣可能裝載有藥物并且在表面上用合適的靶向劑功能化。
[0010] 這些納米顆粒是潛在的治療診斷劑，其中在電磁EM場的作用下產(chǎn)生熱的能力（過 熱作用）、藥物遞送(DD)的可能性以及在其與成像技術(shù)(MRI)作用期間被識別出的能力被協(xié) 同地組合。
[0011] 國際專利申請W0 2004/071386描述了由單層或雙層脂質(zhì)體微膠囊組成的化合物， 其含有磁性納米顆粒和生物活性分子，具有到達并治療肝臟腫瘤的主要目標。
[0012] 在歐洲專利EP 1 979 365中，
【申請人】已描述了由用雙功能分子功能化的納米級磁 性顆粒組成的構(gòu)建體，其中所述分子的一端與磁性顆粒的表面結(jié)合，而另一端是游離的并 且因此能夠與用于在制藥和診斷領(lǐng)域中使用的復(fù)合單元諸如生物聚合物、環(huán)糊精、抗體和 藥物反應(yīng)，允許獲得納米顆粒/粘合劑復(fù)合物，其中存在納米顆粒的完全且緊實的包衣而不 顯著改變依賴于其的特性(例如光學或磁性特性）。
[0013] 隨后的專利EP 2 117 600描述了構(gòu)建體，其中功能化的顆粒與在以上專利EP 1 979 365中描述的那些類似，用聚合物包覆，其中具有藥理特性的分子可能已被分散。
[0014] (姓名為同一
【申請人】的）歐洲專利申請2 512 992還描述了多元醇合成方法，其允 許容易地獲得具有均勻且受控制的尺寸的磁鐵礦納米顆粒(其因此具有高的過熱療法功 效)。
[0015] 因此，如可以看出的，在文獻中已經(jīng)提出許多解決方案用于解決在體內(nèi)選擇性地 指導(dǎo)顆粒的問題，所述顆粒能夠通過單獨地或與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合地應(yīng)用過熱療法而執(zhí)行治療 作用;但是，已知的產(chǎn)品由于多種尚未克服的問題而未完全滿足用納米結(jié)構(gòu)實現(xiàn)腫瘤和其 他疾病的有效治療的應(yīng)用需求。
[0016] 第一個問題是納米結(jié)構(gòu)的特異性，事實上，從文獻已知，雜化的無機聚合物/蛋白 顆粒當被全身施用時從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)快速消除（網(wǎng)狀細胞、巨噬細胞、枯否氏細胞(Kupffer cell)) 〇
[0017] 因此，納米結(jié)構(gòu)的清除是以全身水平的納米治療診斷治療的無效的原因；已經(jīng)進 行多種嘗試來克服該困難，包括用遞送單元諸如單克隆抗體、肽和活性分子(諸如糖等等） 使納米顆粒聚合物/蛋白表面功能化，但是還是在這種情況下，大多數(shù)顆粒被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng) 消除，且僅少量到達有關(guān)部位:腫瘤組織和癌細胞。
[0018] 第一個問題的結(jié)果，第二個問題是到達腫瘤或病理組織的磁性顆粒的量可以證明 不足以進行有效的過熱作用。
[0019] 最后，目前的納米治療診斷系統(tǒng)在生物流體中具有差的穩(wěn)定性，并因此趨向于形 成不可能滲透至腫瘤塊中或逾越完整的血腦屏障的大的聚集體(高至超過500-1000nm)，這 使靶細胞中這些系統(tǒng)的特定靶向性變得更差，進一步限制了治療的效率。
[0020] 從文獻已知的是，免疫系統(tǒng)內(nèi)的T淋巴細胞是抗腫瘤應(yīng)答的主要角色。
[0021] T淋巴細胞由于它們的被稱為TCR的特異性受體而能夠選擇性地識別腫瘤細胞。只 有抗原通過由單核細胞、巨細胞、樹突細胞、朗格漢斯細胞(Langerhans cell)、小神經(jīng)膠 質(zhì)細胞或還有B淋巴細胞代表的細胞來呈遞時，才可以發(fā)生T淋巴細胞通過各自的腫瘤抗原 肽的活化。
[0022] 對于有效的T淋巴細胞活化而言，除了抗原之外，還需要膜信號和可溶性信號。在 可溶性信號中，最強有力的活化因子是白細胞介素2(IL_2)，而在膜信號中，最強有力的是 分子B7〇
[0023] 腫瘤被識別后，其通過多種機制被淋巴細胞破壞，在這些機制中，主要的機制是： 與穿孔素關(guān)聯(lián)的細胞毒性機制(cytotoxic machinery)和與Fas配體關(guān)聯(lián)的細胞毒性機制。 [0024]黑素瘤是與由T淋巴細胞介導(dǎo)的強烈的局部免疫應(yīng)答相關(guān)的第一腫瘤之一，并且 這些年來，證明強烈的τ-淋巴細胞應(yīng)答與較好的預(yù)后相關(guān)已成為可能。
[0025] 通過納米顆粒的使用，開發(fā)一種新的定制的抗癌策略是可能的，該抗癌策略基于 專門殺傷腫瘤的裝備有納米顆粒的T淋巴細胞的使用，所述T淋巴細胞在通過激光/電磁場 活化后易于擊中腫瘤。
[0026] 此外，文獻廣泛地描述了在神經(jīng)系統(tǒng)的疾病諸如多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病中由 免疫系統(tǒng)、并且特別地由淋巴細胞和炎性細胞發(fā)揮的作用。
[0027]多發(fā)性硬化確實是自體免疫性疾病的原型，在其發(fā)病機理中，由T淋巴細胞發(fā)揮關(guān) 鍵作用（Elliot M.Frohman，M.D.，Michael K.Racke，M.D·，和Cedric S.Raine，N Engl J Med 2006; 354:942-955)。特別地，能夠產(chǎn)生重要的炎性細胞因子諸如干擾素-γ和淋巴毒 素的τ-輔助細胞(稱為I型τ-輔助細胞(Thl))，還有T淋巴細胞⑶8、B淋巴細胞和單核細胞系 的免疫細胞是非常重要的。另外，在阿爾茨海默病中（Henry W. Querfurth，和Frank M.LaFerla，N Engl J Med 2010;362:329-344)，重要的致病作用通過涉及以下的炎性機制 來進行：由于淀粉樣蛋白通過小神經(jīng)膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生白細胞介素1、白細胞介 素6、腫瘤壞死因子α;因此，根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒還能夠在這些疾病的治療中發(fā)揮重要作 用。
[0028] 附圖簡述
[0029] 圖1示出用以STEM模式的場發(fā)射槍掃描顯微鏡拍攝的、通過在聚合物基質(zhì)內(nèi)的根 據(jù)本發(fā)明的納米顆粒取得的典型的簇形成。
[0030] 圖2示出磁性顆粒和金納米棒的混合物構(gòu)建體。
[0031] 圖3示意性地示出由磁鐵礦的納米顆?；虼盆F礦和金納米棒組成的并且包覆有嵌 段聚合物PLGA-b-PEG-C00H的構(gòu)建體模型。
[0032] 圖4示出根據(jù)本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建體的逐步制備過程的布局。
[0033]圖5示出用于純化和選擇淋巴細胞的過程的布局。
[0034] 圖6示出用光學顯微鏡拍攝的裝載有根據(jù)本發(fā)明的納米顆粒的單核細胞/巨噬細 胞的照片。
[0035] 圖7和圖8示出與NH2-PEG-C00H輒合的聚合物PLGA-NHS的lH-NMRo
[0036] 圖9示出根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)物的UV-Vis光譜。
[0037] 圖10示出對根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)物進行的BCA測試。
[0038] 發(fā)明概述
[0039] 描述了磁性納米顆粒，其表面用兒茶酚功能化;和構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含封裝在 生物相容的聚合物基質(zhì)中的多個所述納米顆粒，其中具有治療作用的分子任選地被分散， 所述聚合物基質(zhì)任選地轉(zhuǎn)而被進一步功能化。驚奇地發(fā)現(xiàn)，所述聚合物構(gòu)建體能夠被并入 免疫系統(tǒng)細胞中以引起其工程化。
[0040] 發(fā)明詳述
[0041] 現(xiàn)在已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)，包含封裝在生物相容的聚合物基質(zhì)中的用兒茶酚功能化的 多個磁性納米顆粒的構(gòu)建體能夠克服以上問題，確保在生理介質(zhì)和在人類血液中的必需的 穩(wěn)定性。
[0042] 此外，與通過在以上專利中描述的單分散的無機核所示的過熱作用相比，這些構(gòu) 建體的結(jié)構(gòu)特征幫助確保實施的過熱作用；這種優(yōu)勢歸因于磁性顆粒的所謂的"簇結(jié)構(gòu)" (參見圖1)，所述磁性顆粒傾向于在聚合物基質(zhì)內(nèi)的多個顆粒的結(jié)構(gòu)中心中結(jié)合，進行對過 熱特性的協(xié)同作用。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明用兒茶酚使磁性顆粒功能化對于產(chǎn)生以上簇結(jié)構(gòu)是必需的，并因此允 許獲得關(guān)于過熱特性和隨著時間推移的穩(wěn)定性的比現(xiàn)有技術(shù)中已知的那些構(gòu)建體優(yōu)越的 多的構(gòu)建體。
[0044] 在磁性顆粒中，磁鐵礦是特別優(yōu)選的。如果優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體除了如上所 描述的磁性納米顆粒之外還可以具有多個金納米棒(參見圖2)。
[0045] 通過施加紅外線激光輻射諸如通過C02激光器產(chǎn)生的紅外線激光輻射，納米棒的 存在允許可觀的過熱作用，該過熱作用有助于進一步增強由磁鐵礦的簇結(jié)構(gòu)賦予的過熱作 用。
[0046]這使得組合的激光和無線電波系統(tǒng)得以實現(xiàn)，所述系統(tǒng)對表面區(qū)域或可以經(jīng)由探 針到達的那些區(qū)域使用激光，而對深的區(qū)域使用無線電波。
[0047]磁性納米顆粒可以通過已知的多元醇法來制備，如例如在以上的歐洲專利申請 2512992中所描述的，所述申請描述了制備方法，在該制備方法中：
[0048] i)從FeQ開始制備Fem的多元醇溶液；
[0049] ii)在多元醇合成條件下制備磁鐵礦納米顆粒；
[0050] 以上步驟（i)是熟知的并且描述的根據(jù)以下方程式的酸(還有弱酸諸如乙酸)對鐵 的攻擊的反應(yīng)：
[0051] Fe°+2H+^ Fe2++1/2H2T
[0052] 其后，在低于100°C的溫度的反應(yīng)環(huán)境中通過吹氣和添加 H202 ,使Fe11在多元醇中 的溶液完全氧化成Fem (例如乙酸鹽)是可能的。
[0053]金納米棒以已知的方式在以下多種添加劑的存在下從離子形式的金開始用微波 輔助的合成來制備:烷基三甲基溴化銨，CnTAB n = 10-16;氯化十六烷基吡啶，C16PC;和PVP [就此而言，參見M. Tsu ji，K .Matsumoto，T · Tsu ji，H. Kawazumid，Mater .Lett.59(2005) 3856]或通過在CTAB和AgN03的存在下用抗壞血酸還原HAuCl4來制備(就此而言，參見Ratto F.等人J NANOPARTICLE RESEARCH 2010和[Ratto F.等人J NANOPARTICLE RESEARCH 2012)。
[0054] 如上所描述地獲得的磁性顆粒和/或磁光顆粒的表面用兒茶酚(雙官能團）通過以 下功能化:利用極性基團0H對顆粒的表面的親和力并且允許未結(jié)合至顆粒表面的末端部分 保持適合于隨后并入聚合物/蛋白基質(zhì)中的疏水性反應(yīng)性。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明的聚合物基質(zhì)被理解為由生物可降解的共聚物組成，并且因此能夠允 許藥物的釋放，該釋放必須隨著基質(zhì)在生理環(huán)境中的降解而逐漸地進行。
[0056] 用于該目的的合適的共聚物的實例是:生物可降解的納米膠束、聚酯、聚酯、聚氨 酯、聚碳酸酯和聚谷氨酸、聚醚胺和聚谷氨酸芐酯。
[0057]特別地優(yōu)選的是生物可降解的納米膠束，其由聚乳酸-乙醇酸共聚物和聚乙二醇 羧酸酯的嵌段共聚物(PLGA-b-PEG-C00H，MnPLGA范圍=44-1 OkDa，MnPEG = 2-3kDa)組成，具 有式(I)
[0059]其中 m=[117-330];n=[117-330];p = [60-100]。
[0000]該產(chǎn)物是已知的并且在Drug Delivery的多種其他工作中已經(jīng)被采用，還在臨床 階段I (Clinical Phase I)的層面用于測試抗癌劑(參見X. Shuai等人，2004和X. Shuai， H.Ai,N.Nasonkla,S.Kim,J.Geo,J.Controlled Release,2004,98,415)〇 [0061]事實上，聚合物具有允許組裝納米球系統(tǒng)的特征，具有由PLGA的殘基保證的疏水 性內(nèi)部區(qū)域和由PEG-COOH的末端賦予的親水性外部區(qū)域(參見圖3)。
[0062] 該雙重特征允許納米球?qū)⒂袡C活性成分捕獲在疏水性部分且由于親水性部分在 水溶液中被分散。
[0063] 如果需要的話，聚合物可以與具有治療作用的分子混合，所述具有治療作用的分 子根據(jù)已知的方法且如在下面給出的實施例中闡明的被分散在聚合物基質(zhì)中。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的具有治療作用的分子的實例是例如抗癌藥物(紫杉烷、吉西他濱、長 春新堿等等）、過氧亞硝基清除劑、超氧化物歧化酶抑制劑、維甲酸(蓓薩羅丁）、細胞因子諸 如白細胞介素1 〇、TLR-配體諸如能夠活化TLR2的HP-NAP分子、阿司匹林。
[0065]另外，膠束的PEG-C00H片段的羧酸功能允許與單克隆抗體、蛋白、肽或感興趣的活 性分子(例如，熒光染料)的化學穩(wěn)定鍵合，用于通過細胞過表達物的特異性識別。
[0066] 在可用于根據(jù)本發(fā)明的功能化的抗體中，我們可以提到hERG、hEGFR、I gG、m〇Ab等 等。
[0067]實施例（參見實施例10)描述了以上的功能化，特別是使用在意大利專利IT 1， 367,861中描述和要求保護的特異性單克隆抗體hERGl的功能化。
[0068]特別地，hERGl是由雜交瘤產(chǎn)生的針對蛋白HERG1的細胞外部分S5-孔的特異性單 克隆抗體，所述雜交瘤包含在屬于鼠贅生性細胞系NS0的永生化細胞和通過用序列 EQPHMDSRIGWLHN的肽免疫小鼠獲得的淋巴細胞之間的融合的產(chǎn)物。
[0069] 通過進行納米沉淀來制備根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體(在下文中也被稱作"納米生物反 應(yīng)器"或"NBR"），該構(gòu)建體含有用兒茶酚功能化的磁性納米顆粒，其中通過批量或連續(xù)合成 在混合池中以恒定流動混合以下兩種液體：
[0070] -溶解于溶劑中的聚合物的有機溶液，所述溶解于溶劑中的聚合物的有機溶液與 用有機粘合劑包覆的納米顆粒的懸浮液混合，所述聚合物和所述用有機粘合劑包覆的納米 顆粒二者在相同的溶劑中，
[0071] 和
[0072] -Na2HP〇4 的水溶液（ImM)。
[0073] 對于批量合成，在單一步驟中，用注射器將含有聚合物和顆粒的有機懸浮液注射 在水溶液中，而不進行磁力攪拌。
[0074] 對于連續(xù)合成，準備雙聯(lián)蠕動栗系統(tǒng)以進行將有機溶液添加到含水的流(有機體 積/水的比1/10)。相應(yīng)的管直接地從含有有機懸浮液（具有功能化的顆粒和聚合物）和 他 2冊031禮(?!17.4)的溶液的呼吸器(111即）中抽取溶液。
[0075] 獲得雜化顆粒（由用包括在聚合物中的兒茶酚功能化的磁性納米顆粒組成）的分 散體后，有機溶劑的一部分經(jīng)由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除以便在后續(xù)的制備步驟中使有機相的量最 小化。
[0076]然后，將懸浮液對水溶液Na2HP03透析以用于去除有機相并且濃縮到可能獲得從 0.1 % w/w到1 % w/w的濃度的最小體積。
[0077]通過第二次濃縮，通過膜透析獲得更加濃縮的產(chǎn)物是可能的，所述更加濃縮的產(chǎn) 物具有取決于用途的范圍從5 X到20 X的理論濃縮系數(shù)。然后，用0.22μπι的過濾器過濾產(chǎn)物 以去除細菌負荷(bacterial load)。如果用21-24kA/m的交變磁場和160-190kHz的頻率輻 射30分鐘，那么產(chǎn)物具有優(yōu)異的過熱效率，其溫度升高了至少5°C。
[0078] 本文描述的方法允許制備具有集中在從30nm到60nm的范圍內(nèi)的尺寸分布的構(gòu)建 體。
[0079] 測量以掌握關(guān)于懸浮液的靜電穩(wěn)定性及其離子強度的信息的由此獲得的產(chǎn)物的 電勢馬爾文納米粒度電位分析儀_S(Malvern Zetasizer nan〇-S))低于_30mV，這意味著 這些顆粒受到羧基產(chǎn)生的負表面靜電斥力的影響，所述羧基在(生理的)pH 7.4下被部分地 去質(zhì)子化。
[0080]以上描述的實驗條件允許制備具有在稀釋到通常用于細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基 (DMEM、RPMI)中之后的良好穩(wěn)定性的懸浮液，所述懸浮液在因稀釋引起的離子強度條件的 明顯變化后還表現(xiàn)出聚集和沉降的小的趨向性。
[0081]獲得在表面上利用用于靶向遞送和用于在成像技術(shù)中使用的單克隆抗體和/或熒 光染料(例如Cyanine?、Dylight?等等)功能化的產(chǎn)物需要使用NBR作為前體，然后其經(jīng) 歷第二次濃縮過程(參見上文）。
[0082] 通常地，在此階段，產(chǎn)物具有約0.05 % wt. -0.1 % wt.的濃度的無機材料。
[0083] 初始加工步驟用活化劑諸如EDAC[1-乙基-3-(-3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺鹽酸 鹽](摩爾比m)AC/C00H= 10/1)和磺酸基_NHS(NHS/C00H= 1/1)提供聚合物的末端羧基的活 化，該聚合物的末端羧基朝向納米顆粒的外部部分暴露，與極性相接觸，以便促進隨后的通 過單克隆抗體和/或熒光染料的末端胺基團的酯化的攻擊。
[0084]在具有λ600-800ηπι的發(fā)射的熒光染料的情況下（適合于體內(nèi)NIR成像應(yīng)用），因為 僅NHS酯-末端分子是市場上可得的，所以必需提供中間步驟，在該中間步驟中，添加二氨 基-末端連接物用于一方面與熒光染料橋連接(bridge link)，以及另一方面與活化的聚合 物的羧基橋連接。
[0085]納米顆粒的表面被活化后，添加抗體和/或氨基-末端染料溶液，并且保持靜止。 [0086]然后，懸浮液被濃縮并且對含水的Na2HP03透析，并且取決于用途被濃縮到高至 0.2-1.0%wt.的無機相。
[0087]然后，用0.22μπι的過濾器過濾產(chǎn)物以去除細菌負荷。
[0088]本文描述的方法允許制備具有集中在從40nm到70nm的范圍內(nèi)的尺寸分布的構(gòu)建 體。
[0089] 測量以掌握關(guān)于懸浮液的靜電穩(wěn)定性及其離子強度的信息的由此獲得的產(chǎn)物的 電勢ξ(馬爾文納米粒度電位分析儀-S)低于_30mV，但是高于在NBR產(chǎn)物上測量的值，這意味 著由初級產(chǎn)物(raw product)的羧基產(chǎn)生的負電荷被結(jié)合的抗體/染料部分地中和。
[0090] 使用BCA?測試分析與顆粒結(jié)合的抗體的含量：向含有蛋白分析物的溶液添加 合適的試劑后，產(chǎn)生Cu2+的絡(luò)合物，用光譜分析觀察到該Cu 2+的絡(luò)合物在562nm的著色，并且 使用線性校正從其導(dǎo)出抗體的濃度。
[0091] 通過本文描述的程序，例如產(chǎn)生用moAb功能化的納米顆粒是可能的，具有相比于 無機相含量在5 % wt和30 % wt之間的moAb攻擊百分比。
[0092] 納米生物反應(yīng)器/親脂性藥物（下文中NBR_PTX)和納米生物反應(yīng)器/抗體/親脂性 藥物(NBR_hERG_PTX)系統(tǒng)(其中親脂性藥物例如是紫杉醇）的制備與如以上所描述的納米 生物反應(yīng)器的合成過程完全相同，并且因此提供了將之前用兒茶酚功能化的無機納米顆粒 封裝在基于PLGA-b-PEG-C00H的聚合物基質(zhì)內(nèi)。該過程的僅有改變提供了特定量的藥物在 聚合物和功能化的納米顆粒的懸浮液內(nèi)的溶解。
[0093] 然后，使用納米沉淀方法獲得裝載有紫杉醇的納米生物反應(yīng)器(NBR_PTX)，其中將 前面提到的有機溶液劇烈地添加到混合池內(nèi)的Na 2HP04 ImM的水溶液。從批量合成到連續(xù)合 成，不存在懸浮液的形態(tài)特征的變化。應(yīng)用的純化、過濾和濃縮方法與如以上所描述的相 同。
[0094] 對于產(chǎn)物表征，除了確定平均顆粒直徑、它們的電勢ξ和無機相的濃度之外，封裝 的活性成分的量也通過高效液相色譜被確定。
[0095]然后，由此獲得的和表征的產(chǎn)物可以在表面上用靶向單元諸如（hEGR、hEGFR、 IgG、...）被進一步功能化。
[0096]為了這個目的建立的方法準確地遵循如以上所描述的納米生物反應(yīng)器NBR_moAb 的靶向程序。
[0097]事實上，其提供了用活化劑諸如EDAC和磺酸基-NHS活化存在于聚合物上的羧基的 初始步驟和與單克隆抗體反應(yīng)的步驟，所有步驟根據(jù)與在之前關(guān)于NBR_m〇Ab描述的程序中 列出的相同的比例。
[0098]然后進行通常的純化和表征程序。由此獲得的納米顆粒懸浮液的特征為在45nm和 55nm之間的平均流體動力學直徑，同時電勢ξ遠低于-30mV。
[0099] 根據(jù)本發(fā)明的另外的實施方案，如以上定義的構(gòu)建體可以被并入免疫系統(tǒng)的細胞 中，作為用蛋白或用抗體的修飾物(decorat i on)的替代物。
[0100] 令人意外地，如以上所描述的包含用兒茶酚功能化的且用聚乳酸-乙醇酸共聚物 和聚乙二醇羧酸酯的嵌段共聚物（PLGA-b-PEG-C00H，MnPLGA范圍=44-10kDa，MnPEG = 2-3kDa) 包覆的磁鐵礦顆粒的簇的構(gòu)建體容易地被免疫系統(tǒng)的細胞并入而不損害它們的功能 和活力。
[0101] 免疫系統(tǒng)細胞通過引入根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體被工程化后，這些免疫系統(tǒng)細胞可以 用于診斷腫瘤疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病(例如阿爾茨海默?。?、心腦血管疾病和傳 染病、移植、自體免疫性疾病，并且還用于治療腫瘤、心腦血管疾病、退行性疾病(例如阿爾 茨海默病）、傳染病、移植、肝硬化和涉及纖維發(fā)生的其他狀況、特征在于多次流產(chǎn)的疾病、 子宮內(nèi)胎兒死亡、新生兒疾病、先天性和獲得性凝血功能障礙、遺傳疾病、自體免疫性疾病， 并且最后用于疼痛緩解。
[0102] 釋放的誘導(dǎo)可以通過不同的方法進行，諸如特定抗原（例如在治療黑素瘤的情況 中的MAGE-3、在治療多發(fā)性硬化中的M0G或髓磷脂抗原等等），或通過合適的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì) 諸如IL-2、⑶40配體、TLR-激動劑、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物(ISC0MS)進行。
[0103] 應(yīng)注意，事實上，免疫系統(tǒng)的細胞的重要特性通過它們到達身體的幾乎所有區(qū)域 的能力來體現(xiàn)，因此，它們作為載體以到達特定區(qū)域的用途超越了由治療的低特異性體現(xiàn) 的納米治療診斷的大的現(xiàn)有局限性，該載體通過根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體攜帶目的區(qū)域 (destination)所需的特定產(chǎn)物。
[0104] 可用于以上目的的免疫系統(tǒng)的細胞例如選自：
[0105] T-淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、自然殺傷細胞、B-淋巴細胞、嗜中性 粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、γ s細胞。
[0106]細胞從單個患者獲取、用所需的納米顆粒裝載并且然后局部地或全身地重新引入 同一患者中。
[0107] 然后，免疫系統(tǒng)的細胞將如以下所描述的被純化，并且為了促進受到所討論的疾 病影響的身體區(qū)域的選擇性/優(yōu)先靶向，細胞可以用相關(guān)的抗原(或過敏原）、免疫調(diào)節(jié)藥物 離體處理，或用免疫增強或免疫抑制分子工程化。
[0108] 選擇用于診斷或治療目的的T細胞的方式之一是富集特定抗原特異性的T淋巴細 胞的數(shù)目，該特定抗原可以是如以上所描述的腫瘤抗原。
[0109] 用本發(fā)明的構(gòu)建體適當?shù)毓こ袒牧馨图毎坏┚臀痪涂梢越柚诤线m的化學 刺激物釋放顆粒，然后，所述顆?？梢栽谔幱跓o線電波范圍內(nèi)的電磁場的輻射下發(fā)揮過熱 療法或釋放活性成分諸如抗腫瘤藥物、在腦組織的氧化應(yīng)激中活躍的分子的清除劑、抗炎 性分子等等。即使納米顆粒保持局限在淋巴細胞自身內(nèi)，它們?nèi)钥梢詧?zhí)行它們的功能。
[0110] 磁性納米顆粒還可以執(zhí)行MRI成像功能，是優(yōu)異的T2T2*造影劑（參見上文的專 利），含有金納米棒的納米顆?？梢栽诩す饨閷?dǎo)的抗腫瘤療法中使用，并且通過光聲光譜型 的方法來識別。
[0111] 淋巴細胞的純化和選擇
[0112] 用于針對腫瘤的T淋巴細胞使用標準化的方法和/或在選擇性MACS?*法的輔 助下從外周血或從腫瘤部位或從預(yù)先施用相關(guān)腫瘤抗原之后的患者的淋巴結(jié)、或從身體的 如視為相關(guān)的其他區(qū)域來純化(Current Protocols in Immunology 2013;D'Elios等人J Immunol 1997；158:962-967)〇
[0113]為了選擇腫瘤特異性T淋巴細胞，將T淋巴細胞與相關(guān)的腫瘤抗原（例如對于黑素 瘤的MAGE-3,以10μg/ml的濃度)一起放置在完全的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)持續(xù)五天。然后，每三 天添加重組人類IL-2,并且然后將使細胞裝載有納米顆粒、洗滌并且然后局部地和/或全身 地施用至患者。
[0114] 用作診斷產(chǎn)品，例如用于通過核磁共振技術(shù)的多發(fā)性硬化的診斷產(chǎn)品的T細胞，針 對它們對髓磷脂抗原或M0G(10μg/ml)或如優(yōu)選地能夠獲得CNS的結(jié)構(gòu)的其他抗原的特異性 被選擇。
[0115] 為了這個目的，將它們與一個或更多個抗原一起培養(yǎng)持續(xù)五天，然后用IL-2擴大， 并且然后用NP裝載。
[0116] 使用合適的相關(guān)抗原，相同的程序可以用于其他神經(jīng)疾病，諸如阿爾茨海默病、帕 金森病、中風和其他心腦血管疾病。
[0117]使用傳統(tǒng)的標準化的方法和/或在選擇性方法MACS?:的輔助下，獲得樹突細胞 (對于它們將抗原呈遞至T淋巴細胞的能力是高效的，并因此很大程度上能夠活化T-淋巴細 胞）（Current Protocols in Immunology 2013;Codolo等人Arthr Rheum 2008;58:3609-17)。它們將與所需的抗原一起孵育36-44小時，然后用NP裝載、洗滌并且重新注入到患者中 用于治療或診斷目的（參見圖5中的過程布局）。
[0118]使用傳統(tǒng)的標準化的方法和/或在選擇性MACS?方法的輔助下獲得具有強的 細胞毒性活性的自然殺傷細胞和/或y δ淋巴細胞(Current Protocols in Immunology, 2013)，然后用所需的NP和可能地用其他免疫調(diào)節(jié)化合物裝載它們、洗滌并且重新引入到患 者中用于治療(例如抗腫瘤）目的或也用于診斷目的。
[0119] 使用傳統(tǒng)的標準化的方法和/或在選擇性MACS?方法的輔助下獲得嗜中性粒 細胞(Current Protocols in Immunology,2013)，然后將用所需的NP和可能地用其他免疫 調(diào)節(jié)化合物裝載它們、洗滌并且重新引入患者內(nèi)用于診斷（例如以鑒定身體中不能通過其 他技術(shù)鑒定出的任何感染病灶的存在）目的或也用于治療目的。
[0120] 另外，可以針對診斷用途和/或治療用途(諸如即將用于治療腫瘤、自體免疫性疾 病、感染、退行性疾病的效應(yīng)細胞)選擇其他細胞類型，諸如B淋巴細胞、嗜酸性細胞、嗜堿性 細胞，所述細胞使用傳統(tǒng)的標準化的方法和/或在選擇性MACS?方法的輔助下獲得 (Current Protocols in Immunology,2013)〇
[0121] 然后，用所需的NP或可能地用其他免疫調(diào)節(jié)化合物裝載它們、洗滌并且重新引入 到患者中。
[0122] 裝載有納米顆粒的免疫細胞可以用于利用合適的成像技術(shù)顯示為疾病的位置的 身體區(qū)域。
[0123] 在4小時后，T細胞和Jurkat細胞最佳地填充有NP。
[0124] 單核細胞/巨噬細胞、樹突細胞、J774A.1細胞能夠并入根據(jù)本發(fā)明的方法的納米 顆粒，其中單核細胞/巨噬細胞、樹突細胞、J774A.1細胞裝載有以在合適的特定培養(yǎng)基(培 養(yǎng)基）中0.05%的濃度的納米顆粒(NP)。為了形成含有NP的培養(yǎng)基，首先分配NP，并且然后 分配特定培養(yǎng)基。
[0125] 培養(yǎng)基由以下組成：
[0126] 完全的 DMEM 10%FBS
[0127] 完全的 DMEM:
[0128] · DMEM高葡萄糖(DME/HIGiOdEUROCLONE)(代碼:ECB7501L)
[0129] ?1^-谷氨酰胺，溶液20〇1111(100\)。"1]1?001)陬）（代碼408 30000)
[0130] ?青霉素-鏈霉素溶液（lOOXhUTCC)(代碼:30-2300)
[0131] · 10% 胎牛血清 FBS:胎牛血清，合格的。（Sigma-Aldrich)(代碼:F6178-100mL)
[0132] 當需要時，將使用患者的自體血清或缺乏血清的培養(yǎng)基代替胎牛血清。
[0133] 在2小時后，單核細胞/巨噬細胞、樹突細胞、J774A.1細胞最佳地填充有NP，但是在 15 '直到24h后并入現(xiàn)象是活躍的。
[0134] 圖6示出用光學顯微鏡拍攝的裝載有納米顆粒的單核細胞/巨噬細胞的照片。
[0135] 鑒于下面給出的實施例，本發(fā)明將被更多且更好地理解，還注意，圖4和圖5,它們 示意性地概括了用于構(gòu)建體的制備和免疫系統(tǒng)的細胞的工程化的多個步驟。
[0136] 實施例1
[0137] 在二甘醇DEG中制備乙酸鐵
[0138] 試劑：
[0139] 40g 卩6(卩6〈99%〈212臟），等于0.716111〇1;80(^水；80(^013(：00!1(80%)，等于 10·67mol ;46·64g含氧水（30%)，等于0·41mol;0·12g濃HCl;DEG(二甘醇）3850g。
[0140] 合成：
[0141] 在氮氣流下，將鐵、乙酸和水溶液以及鹽酸裝載到5000mL 4-頸燒瓶，并且將溫度 升高到90 °C并且維持6小時。使體系在N2下冷卻，并過濾溶液以去除未溶解的Fe。使用滴注 器將含氧水逐滴添加到放置在燒瓶中的澄清溶液中，保持溫度在35°C，持續(xù)lh，獲得具有 2.40%w/w的鐵滴度（iron titer)的等于1628.3g的澄清溶液。然后，過量的酸通過在40°C 的T的第一次真空蒸餾、干燥部分用水再循環(huán)并且通過蒸餾兩次(兩次連續(xù)的洗滌)去除以 及在約50°C的Τ的最終汽提來汽提。將3850g DEG添加到干燥部分以使理論鐵滴度達到 1.01%w/w Fe的值。
[0142] 實施例2
[0143] 在二甘醇中制備Fe3〇4納米顆粒
[0144] 試劑：
[0145] 1.50g Fe0(Fe0〈99%，〈212mm)Fe0 = 0.179mol;150g DEG;DEG中 1/10HC1 濃度37% 的1.2g溶液;在DEG中的300.00g FeAc3(1.01%w/w Fe111)。
[0146] 在犯下將金屬鐵和DEG放置在500mL 4-頸燒瓶中，并且將溫度升高到150°C。將鹽 酸在DEG中的溶液添加到體系并且保持在攪拌下持續(xù)5分鐘。然后，使用注射器以10當量的 等分試樣添加乙酸鐵，以確保顆粒的適當生長，將溫度升高到170°C，使反應(yīng)在24-36小時內(nèi) 終止。
[0147] 將產(chǎn)物冷卻到60°C并且傾注在燒杯中，以磁力保留未反應(yīng)的金屬鐵，并且然后在 0.45μπι玻璃纖維上過濾。
[0148] 450g的磁鐵礦在二甘醇中的納米懸浮液具有等于0.91 % ±0.05的離子鐵的滴度， 該離子鐵的滴度用Fe3〇4表示相當于1.253% ±0.05。對該樣品測量過熱并且值如表中所示。
[0150] SARm:針對金屬(Fe)質(zhì)量表示的比吸收率
[0151] 實施例3
[0152]有機粘合劑N- (3，4-二羥基苯乙基)十二酰胺(DDA)
[0154] Mff=335.48g/mol
[0155] 試劑：
[0156] 25g鹽酸多巴胺，等于0 · 1318mol; 1L THF;45mL三乙胺0 · 32mol ;31 · 20mL十二酰氯 0.135mol；
[0157] 純化和結(jié)晶
[0158] 400mL THF(Aldrich 401757-2L-Lot STBC4923V)
[0159] 935mL乙酸乙酯（Aldrich 34972-2.5L-Lot 57BC011AV)
[0160] 315mL石油醚（Aldrich 77379-2.5L-Lot BCBG7367V)
[0161] 合成：
[0162] 在氮氣氣氛下將鹽酸多巴胺并且然后THF(IL)放置至5L 4-頸燒瓶，并且然后添加 三乙胺，并且在攪拌下保持系統(tǒng)持續(xù)約20'以得到白色懸浮液。
[0163] 向3L平底燒瓶添加 THF(IL)和?；瘎?。攪拌溶液，并且使用蠕動栗以約2mL/min的 速率歷時9h將溶液添加到包含在5L燒瓶中的試劑，獲得黃-橙色的溶液，底部具有些許白色 固體。
[0164] 純化：
[0165] 然后，純化含有合成產(chǎn)物的有機相，并且從在反應(yīng)期間形成的副產(chǎn)物中回收合成 產(chǎn)物。通過以下進行純化:經(jīng)由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器通過兩次循環(huán)（2 X200mL)去除溶劑。在另一方 面，在獨立的漏斗中對固體殘渣、和在合成燒瓶中的痕量殘渣進行水提取和用乙酸乙酯處 理。完全合并有機相，用Na 2S04干燥，并且最終在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中達到干燥。得到57g橙色油狀 產(chǎn)物。
[0166] 結(jié)晶：
[0167] 將450mL的石油醚：乙酸乙酯=7:3的混合物添加到產(chǎn)物中。將懸浮液置于冷水下， 并且白色固體開始結(jié)晶。使體系靜置1天。
[0168]固體在Buckner上過濾、用母液洗滌并且使用油栗干燥。獲得約39g(理論值44g-產(chǎn) 率 88.6%)。
[0169] 使從結(jié)晶（2.45g-橙棕色固體)和從洗滌得到的母液干燥(PR頂E27.13g-深棕色固 體)。
[0170] 實施例4
[0171] Fe3〇4納米顆粒(在THF中）的表面功能化：
[0172] 試劑：
[0173] 40.0g Fe3〇4分散體，等于2.164 · 10-3mol;1089mg DAA，等于3.247 · 10-3mol; 120mL Et0H;80.0g THF。
[0174] 在250mL燒瓶中使1089mg DDA在120mL EtOH中溶解；用60ml注射器將由此制備的 溶液添加到磁鐵礦中。然后，在超聲浴中對其進行聲處理，持續(xù)lh。使樣品靜置幾分鐘，并且 然后添加60mL H20,且NP沉降在釹磁體(magnet)上;分離上清液，并且使納米顆粒再次分散 在80.0g THF中。將4滴三乙胺添加至分散體(在約10分鐘之后，顆粒分散）。
[0175] 表征
[0176] DLS
[0178] 實施例5
[0179] Fe3〇4納米顆粒(在丙酮中）的表面功能化：
[0180] 試劑：
[0181] 4 · 0g Fe3〇4分散體，等于0 · 2 · 10-3mol; 108 · Omg DAA，等于0 · 3 · 10-3mol; 12 · OmL EtOH; 13.6mL丙酮。
[0182] 在超聲浴中對磁鐵礦的懸浮液進行聲處理，持續(xù)lh，然后用25mL注射器將其添加 至lj 108mg DDA在12. OmL EtOH中的溶液中。然后，使其進行聲處理，持續(xù)30min。使樣品靜置持 續(xù)幾分鐘。添加6mL H20，且NP沉降在釹磁體上，然后分離上清液，并且使NP再次分散在 13.6mL丙酮中。將2滴三乙胺添加至分散體(顆粒立即分散）。
[0183] 表征
[0184] DLS
[0186] 實施例6
[0187] 聚合物PLGA-b-PEG-COOH 43-3kDa的合成
[0188] 為了合成嵌段共聚物PLGA-b-PEG-C00H，使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的偶聯(lián)化學 用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使前體PLGA-C00H(MW44-10kDa)活化，并且然后，如以下所描述 的，使加合物與二氯甲烷(DCM)中的氨基-官能部分PEG-NH 2 (MW 2-3kDa)化合：
[0189] 步驟1:用NHS活化羧基官能團
[0190]
[0191] 試劑
[0192]
[0193] 程序
[0194] 在氮氣條件下向5L四-頸燒瓶添加 PLGA-C00H和600mL二氯甲烷。在聚合物溶解后， 添加 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)并且然后添加 N，N二環(huán)己基碳二亞胺(DCC-每次約0.25g);在 惰性氣氛中使體系在攪拌下保持約40h。使用120mL二氯甲烷從固體洗滌漏斗，以便不損失 原始材料。
[0195] 將黃色懸浮液過濾到2L有尾燒瓶中，以便去除二環(huán)己脲。用250mL( X 3)和190ml CH2C12洗滌5L燒瓶。
[0196] 產(chǎn)物在1L燒瓶中通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮到約400mL體積(50ml干DCM洗滌）：獲得稠密 的微黃色懸浮液。
[0197] PLGA-NHS使用400mL( X 4)的冷二乙醚來沉淀。對于每次洗滌，潷析白色固體并去 除上清液。隨后，使用油栗干燥固體，持續(xù)約2h30 '。
[0198] 步驟 2: PLGA-NHS 與 NH2-PEG-C00H 的輒合
[0199] PLGA-NHS
[0201] CHCls
[0202] CH2Cl2-PM=119.38
[0203] DIPEA N-乙基二異丙胺[(CH3)2CH]2NC2H5-PM= 129.24
[0204] COOH-PEG-NH2 HC1 x NH2-PEG-O-C3H6-COOH-PM PEG = 3000da [0205] 試劑
[0206] PLGA-NHS(反應(yīng)中間物）
[0207]
[0208] 程序
[0209] 在配備有機械攪拌器的2L 3-頸燒瓶中，在氮氣流下，使得到的中間物溶解在1L氯 仿中。使用注射器向體系添加 1.2mL DIPEA，并且隨后添加 7g C00H-PEG-NH2(少量添加）。在 惰性氣流下，使體系在攪拌下保持約90h。
[0210] 將黃色溶液從3-頸燒瓶轉(zhuǎn)移到2L 1-頸燒瓶中，并且用100mL氯仿洗滌。
[0211] 借助于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將產(chǎn)物濃縮到約550ml (蒸餾液體積CHCl3 = 650ml)。將產(chǎn)物從 2L燒瓶中轉(zhuǎn)移到1L 1-頸燒瓶(用250mL CHC13洗滌）。
[0212]沉淀聚合物并且用250mL( X 5)的冷二乙醚洗滌:在開始時，必須緩慢地添加懸浮 液并用玻璃棒搖動以防止過飽和。在每次洗滌時，將體系置于冰浴中，并且然后去除上清液 (含有季鹽和未反應(yīng)的有機雜質(zhì)的乳白色懸浮液）。
[0213]用250mL( X5)去離子水洗滌橡膠狀外觀的白色固體以去除痕量的未反應(yīng)的C00H-PEG-NH2〇
[0214] 將體系置于真空（首先為液環(huán)栗，且其后為油栗），交替真空干燥（油栗-阱，在-30 °C)，瓦解聚合物以促進干燥，并且在冰箱中儲存過夜。重復(fù)該程序直到不再觀察到重量損 耗。
[0215] 將產(chǎn)物儲存在冰箱中。
[0216] 回收到86.80g的聚合物(產(chǎn)率為約83%)。
[0217] 實施例7
[0218] 合成（？11^-13^^6-〇)0!112-31^)&)
[0219]步驟1:用NHS活化羧基官能團
[0220]
[0221]試劑技術(shù)規(guī)格：
[0222] 試劑
[0223] 7g PLGA-C00H 7000-17000(50:50聚（DL-丙交酯-共-乙交酯），羧酸酯末端基團） -0·582mmol
[0224] 150mL CH2C12(二氯甲烷->99.9%)，用于PLGA-C00H的溶解
[0225] 0.27g NHS(N-羥基琥珀酰亞胺-98%)，用30mL CH2C12洗滌-2.34mmol
[0226] 〇.51g DCC(N，N二環(huán)己基碳二亞胺-99%)，用50mL CH2CI2洗滌-2.493mmol
[0227] 70mL CH2C12(二氯甲烷>99.9%，用于在Buckner上過濾前洗滌500mL燒瓶
[0228] 55〇1^二乙醚（厶1(14(*彡99.8%)
[0229] 在氮氣條件下向500mL燒瓶添加 PLGA-C00H和150mL二氯甲烷。在聚合物溶解后，添 加 NHS(用于漏斗洗滌的30mL CH2C12)，并且然后添加 DCC-連續(xù)添加（用于漏斗洗滌的50mL CH2Cl2)〇
[0230] 在惰性氣氛中，使體系在攪拌下保持約24小時。
[0231] 在Buckner上過濾無色溶液(具有在懸浮液中的白色固體)到1L有尾燒瓶中，以便 去除二環(huán)己脲。用70ml CH2C12洗滌500mL燒瓶。
[0232] 將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到梨形1-頸燒瓶，并且通過Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，在約lh后，獲得稠 的白色懸浮液。
[0233] 步驟 2: PLGA-NHS 與 NH2-PEG-C00H 的輒合
[0235] 試劑
[0236] 在稠的懸浮液中的PLGA-NHS (反應(yīng)中間物）
[0238] 程序
[0239] 在氮氣條件下，在500mL燒瓶中溶解中間物100(X2)和60mL CHC13。使用注射器， 向體系添加0.3 5mL DI PEA，并且隨后添加具有2OmL漏斗洗滌的CHC13的1.8 2g⑶0H-PEG-NH2。在惰性氣流下，體系在攪拌下保持96h。
[0240]由于棕色和白色殘余物的存在而在Buckner上過濾的懸浮液從4-頸燒瓶轉(zhuǎn)移到 500mL 1-頸燒瓶，用幾 mL氯仿洗滌。
[0241] 產(chǎn)物借助于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器來濃縮（體積CHC13蒸餾液=170mL)。向黃色溶液添加 120mL冷的二乙醚（白色懸浮液-用玻璃棒摩擦-冰浴）、60mL(白色懸浮液-冰?。?0mL(沉淀 的開始-冰?。?、60mL(冰箱持續(xù)約1小時）。產(chǎn)物用1 OOmL( X 2)冷的二乙醚洗滌。在每次洗滌 時，將體系置于冰箱中，并且然后去除上清液(含有季鹽和未反應(yīng)的有機雜質(zhì)的乳白色懸浮 液）。使在醚中的三個級分干燥（1.20g)。
[0242] 用100mL(X3)去離子水(冰浴)洗滌橡膠狀外觀的白色固體以去除痕量的未反應(yīng) 的C00H-PEG-NH2。
[0243]將共聚物（18.10g)置于真空條件下Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中并且然后與油栗連接（乙 醇-干冰阱）持續(xù)約4h(7.78g-干燥與瓦解交替）。產(chǎn)物經(jīng)歷瓦解，且然后被放置在真空下，使 干燥、瓦解和冷凍的階段交替。重復(fù)該程序直到不再觀察到重量損耗。
[0244] 產(chǎn)物儲存在冰箱中。
[0245] 回收到7.52g的聚合物(產(chǎn)率為88%_86%)。
[0246] (2g)P.M.:11300g/mol-0.1769mmol
[0247] (5g)P.M.:15400g/mol-0.3246mmol
[0248] mmol PLGA C00H:0.5015
[0249] g PLGA PEG C00H(mol 2g*P.M.2g) + (mol 5g*P.M.5g) = 2.529+5.972 = 8.5g
[0250] 用PM=12000進行計算。預(yù)測8.74g PLGA PEG C00H
[0251] 實施例8
[0252] 建立納米生物反應(yīng)器(NBR)
[0253]試劑：
[0254] 40.0g Fe3〇4_DDA，等于9.5e-04mol Fe3〇4;220.0mg PLGA-b-PEG-⑶0H，等于5e- 06mol聚合物;400ml磷酸鹽緩沖液ImM。
[0255] 在已將220.0mg聚合物溶解在5mL THF中后，在有機溶液中注入40.0g Fe3〇4_DDA。 使用60mL注射器，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮產(chǎn)物以去除存在的THF。當不再存在有機蒸汽的形成 和凝結(jié)時，終止過程。
[0256] 然后濃縮產(chǎn)物，并且根據(jù)以下的過程用具有Pellicon 2mini lOOkDa膜的Cogent Μ系統(tǒng)透析：
[0257] 系統(tǒng)已經(jīng)排干水后，引入以1.5的理論因子濃縮的且然后用2000mL UP水緩沖的 10_3M透析的NBR的懸浮液。
[0258] 在將系統(tǒng)保持在NaOCl 1 : 10中持續(xù)30分鐘后，將懸浮液在具有500kDa膜的 Pellicon XL系統(tǒng)中進一步濃縮到100mL的體積。
[0259] 已達到20 X的理論濃縮系數(shù)(無機物的理論濃縮:1.0% )后，終止過程。
[0260] 然后，懸浮液用Millipore Sterivex 0·22μπι PES過濾器過濾。將其儲存在冰箱 中。
[0261 ] 表征
[0268] 在培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性
[0269] 樣品在DMEM+10%FBS+谷氨酰胺+抗生素中稀釋到1:20(0.05%?七無機相） ：它是澄 清的，無聚集體。
[0270] DLS
[0272] 實施例9
[0273] 連續(xù)的納米生物反應(yīng)器制備(NBR)
[0274]試劑：
[0275] 200mg PLGA-b-PEG-C00H，等于4.4e-06mol聚合物；52.6g THF;36.4g Fe3〇4_DDA， 等于8.6e-04mol Fe3〇4;具有在pH 7.4=10-3M的磷酸鹽緩沖液的 1000mL H2O MilliQ。
[0276]向 lOOmL愛倫美氏（Erlenmeyer)燒瓶添加0 · 2g聚合物PLGA-b-PEG-⑶0H和52 · 6g THF，攪拌直到完全溶解(幾分鐘）。最后，添加36.4g Fe3〇4_DDA。
[0277]合成：
[0278]在校準后設(shè)置雙聯(lián)蠕動栗系統(tǒng)以執(zhí)行將有機溶液添加到含水的流中（THF/水體積 比=1/10)。相應(yīng)的管直接地從含有THF溶液(具有PLGA-b-PEG-⑶0H和顆粒)和在2.5L瓶中 制備的磷酸鹽緩沖溶液的呼吸器抽取溶液。
[0279]產(chǎn)物首先在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中汽提以去除THF，并且然后使其干燥;揮發(fā)性組分已經(jīng)蒸 發(fā)后，回收產(chǎn)物。
[0280] 然后濃縮產(chǎn)物，并用具有Pellicon 2mini lOOkDa膜的Cogent Μ系統(tǒng)透析：
[0281] 清空系統(tǒng)，回收到254.5g產(chǎn)物。
[0282] 理論濃縮系數(shù):4·7Χ
[0283] 理論濃度:0.078%
[0284] 濃縮和透析所需的時間：20'。
[0285] 產(chǎn)物在具有500kDa膜的Pellicon XL中進一步濃縮。最終濃縮所需的時間：lh。
[0286] 回收的：扣除膜內(nèi)的約l-2mL的死體積，11 · 5g。
[0287] 理論濃度(考慮V死1.5mL):14%
[0288] 表征
[0289] DLS
[0290]
[0291] #用于在血清中以0.05%的穩(wěn)定性測試(理論）
[0292] ICP
[0294] 實施例10
[0295] 建立具有moAb的靶向納米生物反應(yīng)器(NBR_hERG)
[0296]試劑：
[0297] 40.3811^陬1?，等于0.533以111〇1-(：00!1;2.3211^磺酸基-順5 0.23111]\1溶液，等于0.5334 mol;190yL EDAOHC1 28mM溶液，等于0.053mmol;2.64mL 1.52mg/mL hERG溶液，等于4.0mg hERG(2 · 7e-08mo 1); 1500mL Na2HP03的水溶液，=10-3M。
[0298] 向無菌的250mL容器添加40.38mL NBR并且然后添加0.19mL EDAC(0.028M)和 2.32mL磺酸基-NHS。在40'（靜置）后，用15.52mL磷酸鹽緩沖液ImM稀釋2.64mL的hERGl溶液 (1 · 52mg/mL = 4 · Omg)，并且將其添加到42 · 89mL活化的NBR中。（V終=61 · 05mL;Fe3〇4 = 0.056%)。使其靜置過夜。
[0299] 設(shè)置系統(tǒng)用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析產(chǎn)物。將系統(tǒng)用300mL H2〇 Mi 11 iQ洗滌，流動400mL的0.5 %的次氯酸鈉，并且然后使系統(tǒng)滅菌持續(xù)約30min。然后，將其 用400mL緩沖液ImM洗滌。
[0300] 然后，將產(chǎn)物濃縮到22mL的體積，將栗速設(shè)置為約15mL/min(P = 0.27巴）。第一透 析滲透液(permeate)還經(jīng)由BCA?測試分析。
[0301] 產(chǎn)物用100mL(4體積）的緩沖液ImM以15mL/min(P = 0.27巴）的速度透析，并且濃縮 到4.7mL的體積。
[0302]最后，產(chǎn)物用0.22μΜ PES過濾器過濾。將其儲存在冰箱中。
[0303]如此獲得的產(chǎn)物在以0.05%wt稀釋在培養(yǎng)基中后表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性;不存在肉 眼可見的聚集體形式或絮凝的固體形式。
[0314] BCA 測試
[0315] 為了執(zhí)行BCA測試，NBR_hERG的濃度相對于相應(yīng)的無抗體(NBR)的濃度標準化，因 此無抗體(NBR)充當空白。通過添加相關(guān)試劑顯現(xiàn)染色后，通過UV-vis分光光度計分析樣 品，然后將吸光度值內(nèi)推到之前(使用BSA標準品）制備的校準曲線上，并且外推出當量moAb 濃度。存在于NBR_hERG上的抗體的凈量通過從對應(yīng)于NBR_hERG的樣品的moAb值減去在洗脫 液中和在空白（NBR)中發(fā)現(xiàn)的moAb值來計算。參見下面的等式：
[031 6] CmoAb(NBR-moAb)凈一CmoAb(NBR-moAb) _CmoAb( NBR) _CmoAb(i姍液）
[0317] 以下是測量的實驗值：
[0318] mAb 洗脫液= 45yg/mL
[0319] mAb NBR = 435yg/mL
[0320] mAb NBR_hERG = 863yg/mL
[0321] 實際的減13(11^匕陬1〇^1?-11^匕陬1〇=428以8/11^
[0322] 比 mAb/Fe3〇4 = 0.14
[0323] 實施例11
[0324] 建立具有Fluo-染料(NBR_Fluo)的靶向納米生物反應(yīng)器
[0325] 試劑技術(shù)規(guī)格：
[0329] Flu〇-NH2溶液的制備
[0330] 將熒光團用770yL DMS0溶解，獲得lnmol/yL的溶液。在12mL小瓶中，添加4950yL ImM磷酸鹽緩沖液并添加50yL的熒光團Alexa Fluor 750溶液(50nmol)。然后，將其置于磁 力攪拌下，并且然后添加 l〇〇yL的132yg/mL的1，4_二氨基丁烷溶液（相當于150nmol = 13.2g)。在黑暗中和在氮氣流條件下，使溶液反應(yīng)持續(xù)24h。如此獲得的NH2-末端熒光團將 用于隨后的合成步驟，而無需純化。
[0331] 磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制備
[0332] 準確稱量5.0mg的磺酸基-NHS并且然后使用ImM磷酸鹽緩沖液溶解在100mL燒瓶 中。
[0333] EDAC 溶液（0.028mM)的制備
[0334] 向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL ImM緩沖液。加蓋并搖動以促進混合。該溶液 必需在臨反應(yīng)前制備。
[0335] 合成：
[0336] 向l〇〇mL容器添加30.00mL NBR DF并且添加0.14mL EDAC(0.028M)和 1.72mL磺酸 基-NHS(0.23mM)。
[0337] 總體積：30 · 00mL+0 · 14mL+l · 72mL = 31 · 86mL
[0338] 在40'（靜置）后，添加2.64mL的Alexa Fluor 750溶液（10nmol/mL)。
[0339] 使其靜置持續(xù)4h。
[0340] 進行對照DLS(NBR_Fluo TQ)。
[0341] 純化：
[0342] 設(shè)置系統(tǒng)用于使用Pell icon XL 500kDa PES膜和具有容易裝載的II頭部的蠕動 栗Masterflex L/S透析產(chǎn)物。然后，系統(tǒng)通過使0.5%的次氯酸鈉流動并且使反應(yīng)持續(xù)約30 分鐘來滅菌。在用無菌的MilliQ水洗滌并且用ImM磷酸鹽緩沖液(也是無菌的)設(shè)置系統(tǒng)后， 將栗速設(shè)置為約12mL/min(P = 0.25毫巴），將產(chǎn)物濃縮到1 OmL的體積(收集23ml的滲透液）。 保留第一滲透液的比率用于UV-VIS分析。然后用40mL (4體積）的緩沖液ImM對產(chǎn)物透析，以 12mL/min(P = 0.25毫巴）的速度工作。此時，產(chǎn)物被濃縮到6mL的體積。
[0343] 回收的：5.00g
[0344] 理論合成濃縮系數(shù)：5.8 X
[0345] 相比于NBR的理論濃縮系數(shù)：5X
[0346] 過濾：
[0347] 產(chǎn)物用0.22μΜ Millex PES過濾器過濾。為了純化全部的產(chǎn)物，需要一個過濾器。 將產(chǎn)物儲存在冰箱中。
[0348] 回收的 NBR_27_F 1 uo_01DF = 4 · 49g
[0349] 表征
[0350] DLS
[0351] R0366/2013；R0368/2013
[0353] Z 電勢
[0354] R0368/2013
[0356] ICP
[0357] R0368/2013
[0362] 實施例12
[0363] 建立具有Fluo-染料的靶向納米生物反應(yīng)器(NBR_Fluo)
[0364] 試劑技術(shù)規(guī)格：
[0368] Flu〇-NH2溶液的制備
[0369] 向12mL小瓶添加5mL ImM磷酸鹽緩沖液、50nmol(l瓶)花菁5、NHS酯，并且然后添加 150nmol(13.2g)l，4-二氨基丁烷。在黑暗中、在磁力攪拌和氮氣流條件下，使溶液反應(yīng)持續(xù) 24h。由此獲得的NH 2-末端熒光團將用于隨后的合成步驟，而無需純化。
[0370] 磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制備
[0371] 準確稱量5 .Omg的磺酸基-NHS，并且然后使用ImM磷酸鹽緩沖液溶解在100mL燒瓶 中。
[0372] H)AC 溶液（0.028mM)的制備
[0373] 向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL緩沖液ImM。加蓋并搖動以促進混合。該溶液必 需在臨反應(yīng)前制備。
[0374] 合成：
[0375] 向50mL無菌容器添加30.00mL NBR并且添加0.14mL EDAC(0.028M)和 1.72mL磺酸 基-NHS(0.23mM)。
[0376] 總體積：30 · 00mL+0 · 14mL+l · 72mL = 31 · 86mL。
[0377] 在40 '（靜置)后，添加2 · 64mL的花青苷-5-NH2溶液（lOnmol/mL)。
[0378]使其靜置持續(xù)4h。
[0379] 純化：
[0380] 設(shè)置系統(tǒng)用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析產(chǎn)物。
[0381] 此時，產(chǎn)物被濃縮到10mL的體積(收集23mL滲透液）。將栗速設(shè)置到約12mL/min(P = 0.25毫巴）；t = 4/
[0382] 保留第一滲透液的比率用于UV-VIS分析。
[0383] 用40mL(4體積）的緩沖液ImM透析。v 12mL/min(P = 0.25毫巴）；t = ll'。
[0384] 此時，產(chǎn)物被濃縮到6mL的體積;t = 5 '。
[0385] 回收的：4.29g
[0386] 理論合成濃縮系數(shù):5.5 X
[0387] 相比于NBR的理論濃縮系數(shù):4.8 X
[0388] 過濾：
[0389] 產(chǎn)物用0.22μΜ Millex PES過濾器過濾。為了純化全部的產(chǎn)物，需要一個過濾器。 將產(chǎn)物儲存在冰箱中。
[0390] 回收的NBR_Fluo = 4. llg
[0391] 實施例13
[0392] 具有moAb和Fluo-染料的靶向納米生物反應(yīng)器(NBR_hERG-Fluo)的制備
[0393] 試劑技術(shù)規(guī)格：
[0398] Flu〇-NH2溶液的制備
[0399] 向12mL小瓶添加5mL ImM磷酸鹽緩沖液、50nmol(l瓶)花菁5NHS-酯，置于磁力攪拌 下并且然后添加100yL的13.2mg/100mL的1,4-二氨基丁燒溶液(相當于150nmol = 13.2yg)。 在黑暗中且在氮氣流條件下，使溶液反應(yīng)持續(xù)24h。由此獲得的NH2-末端熒光團將用于隨后 的合成步驟，而無需純化。
[0400] 磺酸基-NHS溶液(0.23mM)的制備
[04011準確稱量5.0mg的磺酸基-NHS，并且使用ImM磷酸鹽緩沖液溶解在100mL燒瓶中。 [0402] H)AC 溶液（0.028mM)的制備
[0403]向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL緩沖液ImM。加蓋并搖動以促進混合。該溶液必 需在臨反應(yīng)前制備。
[0404] 合成：
[0405] 向無菌的100mL容器添加7.95mL緩沖液ImM并且然后添加4.79mL NBR。溫和攪拌混 合物以混合，并且然后添加2.29mL EDAC(0.028M)和2.79mL磺酸基-NHS(0.23mM)。
[0406] 總體積：7 · 95mL+4 · 79mL+2 · 29mL+2 · 79mL= 17 · 83mL。
[0407] 在40'（靜置）后，添加2.5mL的花青苷5-NH2酯溶液（10nm 〇l/mL)。然后將3.2mL的 hERGl溶液（1.5mg/mL = 4.8mg)在52.32mL磷酸鹽緩沖液ImM中稀釋并且添加到含有活化的 NBR和熒光團的懸浮液中。使其靜置過夜。
[0408] 純化：
[0409] 設(shè)置系統(tǒng)用于使用已經(jīng)用于NBR_19的Pellicon XL 500kDa PES膜透析產(chǎn)物。用 300mL H20 Mi 11 iQ洗滌，然后使400mL的0.5 %次氯酸鈉流動，并且保留在次氯酸鹽中持續(xù) 約30分鐘。用400mL緩沖液ImM洗滌系統(tǒng)。
[0410]此時，產(chǎn)物被濃縮到20mL的體積(收集50mL滲透液）。將栗速設(shè)置為約14mL/min(P = 0.25毫巴）；t = 15'。
[0411]保留第一滲透液的比率用于BCA測試。
[0412]用 80mL(4 體積）的緩沖液 ImM 透析。v 14mL/min(P = 0.2 毫巴）；t = 16'。
[0413]此時，產(chǎn)物被濃縮到l〇mL的體積;t = 4'。
[0414] 回收的：6.46g
[0415] 相比于NBR的理論稀釋系數(shù)：1.3 X
[0416] 過濾：
[0417] 產(chǎn)物用0.22μΜ Millex PES過濾器過濾。為了純化全部的產(chǎn)物，需要一個過濾器。 將產(chǎn)物儲存在冰箱中。
[0418] 回收的 NBR_hERG-Fluo = 7.79g
[0419] 表征
[0426] 實施例14[0427] 裝載有活性成分的納米生物反應(yīng)器(NBR_PTX和NBR_hERG_PTX)的制備[0428] 試劑技術(shù)規(guī)格：
[0430] 試劑：
[0431] 35.6g Fe3〇4-DDA(40.0mL)(195.8mg Fe3〇4) 490mg/L(在水中）
[0432] 212.6mg PPGC43-3.1 490mg/L(水中）
[0433] 21.2mg PTX
[0434] 400ml磷酸鹽緩沖液lmM(實際值:440mL)
[0435] 60mL注射器25G針頭
[0436] THF溶液[具有PLGA-PEG(5 · 5mg/g)、PTX(0 · 55mg/g)和Fe304(5 · 5mg/g)]的制備
[0437] 將212.6mg PPGC43-3.1溶解于4mL(4mL小瓶）THF中，并且將21.2mg PTX溶解在 2.12mL THF(4mL小瓶)中，且然后將其添加到lOOmL燒瓶中的35.6g Fe3〇4_DDA。
[0438] 合成：
[0439] 使用具有25G針頭的60mL注射器，將THF溶液堆積在400ml的磷酸鹽緩沖液ImM中。
[0440] 獲得的 NBR_PTX :455.8g [0441 ] 汽提
[0442] 將產(chǎn)物在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中處理以去除存在的THF。為了該目的，將產(chǎn)物移到100011114? 瓶并且設(shè)置以下條件：
[0443] 浴T 40°
[0444] 壓力：154毫巴
[0445] 轉(zhuǎn)速:80rpm
[0446] 在lh后，完成揮發(fā)性組分的蒸發(fā)后，回收產(chǎn)物并且稱重。
[0447] 回收的 NBR_PTX 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)物(Rotavap) =418 · 22g(37 · 58g 去除的 THF)
[0448] 透析和濃縮：
[0449] 產(chǎn)物根據(jù)以下的程序用具有50kDa膜的AMIC0N系統(tǒng)濃縮和透析。
[°450] 1)用5 OmL滲透的（〇 smo t i z e d) H2O洗滌以去除膜中的雜質(zhì)。
[0451 ] 2)用具有在出0 UP中的50mL磷酸鹽緩沖液10-3Μ的溶液洗滌系統(tǒng)。
[0452] 系統(tǒng)排干水后，添加 NBR_PTX并且濃縮到約100mL。
[0453] 其后，用150mL緩沖液ImM進行4次洗滌。最后，濃縮到75mL，棄掉45mL洗脫液。
[0454] 清空系統(tǒng)，回收到59.40g的產(chǎn)物(NBR_PTX)。
[0455] 理論濃縮系數(shù)= 7.7 X
[0456] 過濾：
[0457] 產(chǎn)物用Millipore Sterivex 0·22μΜ PES過濾器（圓柱形過濾器)過濾。
[0458] 表征
[0463] 穩(wěn)定性：
[0464] 在DMEM+10%FBS+谷氨酰胺+抗生素中以1:8稀釋的濃縮的樣品是透明的，無聚集 體。
[0465] DLS
[0466] R0211/2013
[0470] 實施例15
[0471 ] 裝載有活性成分的納米生物反應(yīng)器(NBR_PT-X和NBR_hERG_PTX)的制備
[0472] 試劑技術(shù)規(guī)格：
[0473]
[0476] pH 7.4的 1500mL磷酸鹽緩沖液[] = 10-3M
[0477] 磺酸基-NHS溶液(0 · 23mM)的制備
[0478] 稱量5. Omg的磺酸基-NHS并且使用ImM磷酸鹽緩沖液溶解在lOOmL燒瓶中。
[0479] H)AC 溶液（0.028mM)的制備
[0480]向4mL小瓶添加2.7mg EDAC和0.5mL緩沖液ImM。加蓋并搖動以促進混合。該溶液必 需在臨反應(yīng)前制備。
[0481] 合成：
[0482] 向無菌的40mL容器添加2.36mL緩沖液ImM并且然后添加4.26mL NBR_PTX。溫和攪 拌混合物以混合，并且然后添加1.19mL EDAC(0.028M)和1.45mL磺酸基-NHS。
[0483] 總體積：2 · 36mL+4 · 26mL+l · 19mL+l · 45mL = 9 · 26mL
[0484] 在40 '（靜置）后，添加通過用27.25mL緩沖液ImM稀釋0.833mL的hERGl溶液（3mg/ mL)獲得的HERG1 溶液。（％= 37 · 34mL; Fe3〇4 = 0 · 056 % )。
[0485] 使其靜置過夜。
[0486] 純化：
[0487] 設(shè)置系統(tǒng)用于使用Pellicon XL 500kDa PES膜透析產(chǎn)物。用300mL H20 MilliQ洗 滌，然后使400mL的0.5 %次氯酸鈉流動，并且保持在次氯酸鹽中持續(xù)約30min。用400mL緩沖 液ImM洗滌系統(tǒng)。
[0488] 此時，產(chǎn)物被濃縮到13mL的體積(收集25mL滲透液）。將栗速設(shè)置為約13mL/min(P = 0.2毫巴）；t = 5'。
[0489] 保留第一滲透液的比率用于BCA測試。
[0490] 用60mL(4體積）的緩沖液ImM透析。v 13mL/min(P = 0.2毫巴）；t = 14'。
[0491 ]此時，產(chǎn)物被濃縮到10mL的體積;t = 10 '。
[0492] 回收的：7.40g
[0493] 理論合成濃縮系數(shù)：5.5 X
[0494] 相比于NBR_PTX的理論稀釋系數(shù):2.8 X
[0495] 過濾：
[0496] 產(chǎn)物用0.22μΜ Sterivex PES過濾器過濾。為了純化全部的產(chǎn)物，需要一個過濾 器。將產(chǎn)物儲存在冰箱中。
[0497] 回收的NBR_PTX = 6.88g
[0498] 表征
[0499] DLS
[0505] 程序的實際產(chǎn)率= 94.5%
[0506] 實施例16
[0507] 將NBR并入淋巴細胞中
[0508] T細胞和Jurkat細胞能夠并入用由
【申請人】開發(fā)的方法的納米顆粒。T細胞/Jurkat 細胞裝載有以在合適的特定培養(yǎng)基(培養(yǎng)基）中0.05%的濃度的NP。為了形成含有NP的培養(yǎng) 基，首先分配NP，并且然后分配特定培養(yǎng)基。培養(yǎng)基由以下組成：
[0509] · RPMI 1640培養(yǎng)基，w 2.0g/L NaHC03-w/o L-谷氨酰胺。（BI0CHR0M)(代碼： F1215)-500mL 添加有：
[0510] · L-谷氨酰胺，溶液200mM(100 X )。（EUR0CL0NE)(代碼:ECB3000D)-5 · 5mL，未稀釋
[0511] ?丙酮酸鈉，100禮(100\)。（6讓(：〇)(代碼：11360-039)-5.511^，未稀釋
[0512] · MEM NEAA最小必需培養(yǎng)基非必需氨基酸（100 XhWibco)(代碼：11140-035 )-5.5mL，未稀釋
[0513] · GENT0MIL(慶大霉素）80mg/2ml(AIC N°029314059)-12mL小瓶
[0514] ?2-巰基乙醇(16代1〇(代碼:444203)-使用5.51^如下的2-巰基乙醇 ：在99.9631^ 無菌H2〇中的37μ1 2-巰基乙醇(終體積100mL)。
[0515] · 10% 胎牛血清 FBS:胎牛血清，合格的。（Sigma-Aldrich)(代碼:F6178)。
[0516] 當必需時，將使用患者的自體血清或缺乏血清的培養(yǎng)基代替胎牛血清。
【主權(quán)項】
1. 磁性納米顆粒，所述磁性納米顆粒的表面用兒茶酚功能化，并且其中所述磁性顆粒 由納米級磁鐵礦顆粒組成。2. 構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含封裝在生物相容的聚合物基質(zhì)中的多個根據(jù)權(quán)利要求1所 述的納米顆粒，其中具有治療作用的分子任選地被分散。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體還包含多個金納米棒。4. 根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的構(gòu)建體，其中所述生物相容的聚合物基質(zhì)由生物可降解的 共聚物組成。5. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體，其中所述生物可降解的共聚物選自：生物可降解的納 米膠束、聚酯、聚氨酯、聚碳酸酯和聚谷氨酸、聚醚胺和聚谷氨酸芐酯。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體，其中所述生物可降解的納米膠束由聚乳酸-乙醇酸共 聚物和聚乙二醇羧酸酯(PLGA-b-PEG-COOH)組成，具有式（I)其中m= [117-330] ;n= [117-330] ;p= [60-100]。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，其中所述具有治療作用的分子選自：抗癌劑、過氧亞 硝基清除劑、超氧化物歧化酶抑制劑、維甲酸、細胞因子、阿司匹林。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建體，其中所述膠束的片段PEG-C00H的末端羧基用單克隆 抗體、蛋白、肽或感興趣的活性分子進一步功能化，用于通過細胞過表達物的特異性識別。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的構(gòu)建體，其中所述抗體選自hEGR、hEGFR、I gG、moAb。10. -種用于制備根據(jù)權(quán)利要求2-6所述的構(gòu)建體的方法，其中：通過批量或連續(xù)合成 在混合池中以恒定流動將以下混合： -溶解在溶劑中的聚合物的有機溶液，所述溶解在溶劑中的聚合物的有機溶液與用有 機粘合劑包覆的納米顆粒的懸浮液混合， 所述聚合物和所述用有機粘合劑包覆的納米顆粒二者在相同的溶劑中， -和 -Na2HP〇4的水溶液（ImM)。11. 一種用于制備根據(jù)權(quán)利要求7和8所述的構(gòu)建體的方法，其中所述片段PEG-C00H的 末端羧基被活化以促進隨后的通過氨基末端基團的酯化的攻擊。12. 人類免疫系統(tǒng)的細胞，所述人類免疫系統(tǒng)的細胞含有根據(jù)權(quán)利要求2-8所述的構(gòu)建 體。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的細胞，其中所述人類免疫系統(tǒng)的細胞選自：T-淋巴細胞、單 核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、自然殺傷細胞、B-淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜 堿性粒細胞、γ S細胞。14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米級顆粒和根據(jù)權(quán)利要求2-9所述的構(gòu)建體用于過熱療法 治療的用途。15. 根據(jù)權(quán)利要求12和13所述的細胞用于診斷癌癥、退行性疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、 心腦血管疾病、傳染病、移植、自體免疫性疾病的用途，和還用于治療腫瘤、心腦血管疾病、 退行性疾病(例如阿爾茨海默?。?、傳染病、移植、肝硬化和特征在于纖維發(fā)生的其他疾病、 特征在于復(fù)發(fā)性胎兒丟失的疾病、子宮內(nèi)胎兒死亡、新生兒疾病、先天性和獲得性凝血功能 障礙、遺傳疾病、自體免疫性疾病的用途，和最后用于疼痛緩解的用途。16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性納米顆粒作為MRI成像工具的用途。17. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有納米棒的納米顆粒用于診斷和治療腫瘤疾病的用途。
【文檔編號】A61K49/18GK106068128SQ201580003992
【公開日】2016年11月2日
【申請日】2015年1月7日 公開號201580003992.6, CN 106068128 A, CN 106068128A, CN 201580003992, CN-A-106068128, CN106068128 A, CN106068128A, CN201580003992, CN201580003992.6, PCT/2015/50122, PCT/IB/15/050122, PCT/IB/15/50122, PCT/IB/2015/050122, PCT/IB/2015/50122, PCT/IB15/050122, PCT/IB15/50122, PCT/IB15050122, PCT/IB1550122, PCT/IB2015/050122, PCT/IB2015/50122, PCT/IB2015050122, PCT/IB201550122
【發(fā)明人】吉奧瓦尼·巴迪, 科斯坦薩·拉瓦格利, 馬羅·康默斯弗蘭奇尼, 馬里奧·米爾科·德里奧斯, 瑪莉莎·貝納加諾, 馬克·比托斯
【申請人】卡羅比亞意大利（共同）股份公司