藏紅花素在制備預(yù)防及治療糖尿病周?chē)懿∽兯幬镏械挠脠D
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了藏紅花素在制備預(yù)防及治療糖尿病周?chē)懿∽兯幬镏械挠猛?，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明針對(duì)藏紅花素具有改善糖尿病引起的血管內(nèi)皮功能受損、緩解周?chē)懿∽兊臐撛谥委熥饔眠M(jìn)行研究，通過(guò)權(quán)威的離體血管張力檢測(cè)方法觀察藏紅花素對(duì)糖尿病模型血管的舒張能力影響，以及在細(xì)胞水平驗(yàn)證其可能的作用機(jī)制，證實(shí)了藏紅花素具有明顯提高糖尿病血管舒張能力、保護(hù)血管內(nèi)皮功能的潛在作用。本發(fā)明探索性發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有治療糖尿病性周?chē)懿∽兊淖饔茫景l(fā)明的提出為臨床治療糖尿病性周?chē)懿∽兲峁┝艘环N新的技術(shù)手段。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
藏紅花素在制備預(yù)防及治療糖尿病周?chē)懿∽兯幬镏械?用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及藏紅花素的新的治療用途，特別涉及藏紅花素在制備治療糖尿病周?chē)?血管病變藥物中的用途，本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病并發(fā)的周?chē)懿∽兪翘悄虿〉闹匾l(fā)癥之一，表現(xiàn)為閉塞性動(dòng)脈硬化 引發(fā)的周?chē)M織中氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，進(jìn)而發(fā)展的痛性痙攣和疼痛為特征的間歇性跛 行，發(fā)病機(jī)制以高血糖引起的血管內(nèi)皮功能損傷為最初的病理改變。血管內(nèi)皮的生理功能 是屏障、分泌和信息傳遞。內(nèi)皮細(xì)胞作為血流和血管壁之間屏障，有選擇性通透功能，也有 合成分泌血管收縮因子、舒張因子及其它因子的功能。目前發(fā)現(xiàn)與內(nèi)皮功能相關(guān)的血管舒 張因子有三種:N0、PGI 2和EDHF。而諸多疾病因素如高血糖、高血脂等常破壞血管內(nèi)皮，異常 改變N0、PGI2和EDHF表達(dá)及活性，致使內(nèi)皮功能受損，主要表現(xiàn)是內(nèi)皮依賴(lài)性脈管舒張功能 減弱，對(duì)乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)的反應(yīng)性降低，內(nèi)皮通透性增加，NO合成減少等。內(nèi) 皮功能受損后期常引發(fā)嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥，加重了疾病的發(fā)展，可以說(shuō)血管內(nèi)皮功能受 損是心血管疾病發(fā)生的最初環(huán)節(jié)，是糖尿病周?chē)懿∽兊年P(guān)鍵過(guò)程。因此，在治療高血糖 過(guò)程中有效兼顧改善血管內(nèi)皮功能將會(huì)起到事半功倍的治療效果。
[0003]藏紅花是一種鳶尾科番紅花種屬花卉植物，含有糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、維生素、類(lèi)黃酮、氨 基酸、天然礦物質(zhì)及樹(shù)膠等多種成份，具有多種生物和藥理活性，被認(rèn)為是一種名貴的中藥 材，其醫(yī)用價(jià)值被廣泛研究。藏紅花的提純物有三種:藏紅花素、藏紅花苦甙和藏花醛，其中 藏紅花素(crocin)被Alavizadeh SH，Rajaei Z等證實(shí)具有較為明確的抗氧化和抗腫瘤作 用。另有相關(guān)報(bào)道稱(chēng)藏紅花素也具有保護(hù)心肌缺血損傷、抗高血壓、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等生 物學(xué)作用。具體如下:Goyal SN等通過(guò)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌梗死動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，口服藏 紅花素可以預(yù)防心梗發(fā)生，提高大鼠的生存能力;杜鵬等證實(shí)靜脈注射藏紅花素可以減小 心肌梗死面積，降低乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH)和肌酸激酶（creatine kinase，CK)的血清含量，治療心肌缺血損傷;Sheng L等發(fā)現(xiàn)藏紅花素可以通過(guò)抑制胰脂肪 酶的活性，降低甘油三酯（triglyceride,TG)、低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein, LDL)和膽固醇的血清含量，減少動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。最近Razavi BM等發(fā)現(xiàn)，藏紅花素可 降低殺蟲(chóng)劑二嗪農(nóng)對(duì)血管的慢性損傷作用。諸多研究初步說(shuō)明藏紅花素具有多種生物學(xué)作 用，但是對(duì)于藏紅花素在改善或修復(fù)糖尿病引發(fā)的血管內(nèi)皮功能損傷以及治療糖尿病周?chē)?血管病變中的應(yīng)用，目前沒(méi)有報(bào)道。本發(fā)明通過(guò)明確藏紅花素對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮功能的調(diào) 節(jié)作用，為糖尿病血管并發(fā)癥的對(duì)癥治療提供依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供藏紅花素在制備治療糖尿病周?chē)懿∽兯?物中的用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了藏紅花素具有改善糖尿病性周?chē)軆?nèi)皮功能的作用，為其將 來(lái)用于臨床糖尿病周?chē)懿∽兊闹委熖峁┮环N新的技術(shù)手段。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：
[0006] 本發(fā)明首先確定了藏紅花素對(duì)血管張力的大體作用，即舒張功能，且初步明確了 該作用與內(nèi)皮有直接的依賴(lài)關(guān)系。本發(fā)明通過(guò)比較靜息和收縮狀態(tài)下藏紅花素對(duì)血管環(huán)張 力的影響，發(fā)現(xiàn)藏紅花素有減弱PE(苯腎上腺素）的縮血管作用，推測(cè)出藏紅花素對(duì)病理因 素(糖尿病等）引起的血管縮窄有更直接的擴(kuò)張作用。另外我們研究還發(fā)現(xiàn)，提前使用藏紅 花素可抵抗PE的縮血管作用，說(shuō)明藏紅花素也具有降低或預(yù)防病理因素對(duì)血管破壞的風(fēng) 險(xiǎn)。其次檢測(cè)藏紅花素對(duì)糖尿病模型血管舒張能力的影響，發(fā)現(xiàn)藏紅花素可提高糖尿病血 管的舒張能力，有效減弱PE的縮血管作用。最后通過(guò)培養(yǎng)原代血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察藏紅花素 對(duì)內(nèi)皮功能相關(guān)蛋白eNOS(內(nèi)皮一氧化氮合酶)的影響，結(jié)果表明藏紅花素可以提高eNOS的 表達(dá)水平以及磷酸化水平，eNOS表達(dá)及磷酸化水平增高導(dǎo)致內(nèi)皮合成NO增多，最終引起血 管擴(kuò)張。本發(fā)明的提出為藏紅花素在臨床糖尿病性周?chē)懿∽兊念A(yù)防和治療提供了新的 理論支持。
[0007] 在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出了藏紅花素在制備預(yù)防及治療糖尿病周?chē)?病變藥物中的用途。
[0008] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的藥物具有提高糖尿病人血管舒張能力的作用。
[0009] 在本發(fā)明中，所述的藏紅花素通過(guò)提高eNOS的表達(dá)水平來(lái)達(dá)到提高糖尿病人血管 的舒張能力，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或治療糖尿病周?chē)懿∽兊哪康摹?br>[0010] 本發(fā)明探索性發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有治療糖尿病性周?chē)懿∽兊淖饔?，本發(fā)明的提 出為臨床治療糖尿病性周?chē)懿∽兲峁┝诵碌募夹g(shù)手段。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為去內(nèi)皮后，不同濃度的藏紅花素對(duì)PE收縮的血管張力無(wú)影響；
[0012] T示加 PE后血管的張力，"▼"示加藏紅花素后血管的張力；
[0013] 圖2為在正常組和糖尿病模型組，各濃度藏紅花素均可使PE收縮的血管舒張，隨著 藏紅花素作用濃度的增加舒張率升高，呈劑量依賴(lài)性。
[0014] 圖3為藏紅花素抵抗PE的血管收縮作用；
[0015]在正常組和糖尿病模型組中，用藏紅花素預(yù)孵育血管環(huán)后，不同濃度PE的血管收 縮作用均明顯下降；
[0016] 圖4為Western blotting法檢測(cè)藏紅花素對(duì)eNOS表達(dá)的影響；
[0017] 藏紅花素有上調(diào)總eNOS(t-eNOS)表達(dá)及提高eNOS的磷酸化水平(ρ-eNOS)的作用； [0018]圖5為對(duì)圖3結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。
[0019] a圖表示藏紅花素促進(jìn)p-eNOS表達(dá)上調(diào)，b圖表示藏紅花素促進(jìn)t-eNOS表達(dá)上調(diào)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修 改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0021] 實(shí)施例1藏紅花素對(duì)動(dòng)脈環(huán)張力的影響
[0022] 1、糖尿病大鼠模型的制備
[0023] (1)選雄性SD大鼠，體重180-220g，月齡4-6周。常規(guī)飼料、自由飲水飼養(yǎng)一周。
[0024] (2)禁食(不禁水)過(guò)夜，尾靜脈測(cè)空腹血糖，稱(chēng)體重。
[0025] (3)用無(wú)菌的0 · IM檸檬酸緩沖液(PH = 4 · 2)配制1 %的STZ(即用即配），按照60mg/ kg用量一次性腹腔注射。注射后每日給予充足的食物和水，勤換墊料，保持干燥環(huán)境。
[0026] (4)注射后7天空腹血糖達(dá)16.7mmol/l為穩(wěn)定模型，進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。
[0027] 2、離體微血管張力測(cè)試
[0028] (1)模型鼠麻醉后，分離主動(dòng)脈，快速置于預(yù)冷的Krebs溶液中，并持續(xù)通入混合氣 體95%〇2和S^CO2t3Krebs溶液成份(mmol/L):NaCl 120;NaHC03 25;KC1 4.8;NaH2P〇4 1.2; MgS〇4 1.2;Glucose 11.0;CaCl2 1·8〇
[0029] (2)清除血管周?chē)慕Y(jié)締組織，切成2mm長(zhǎng)的血管環(huán)，穿過(guò)兩根金屬絲固定于微血 管張力檢測(cè)儀的Krebs溶液浴槽中，浴槽內(nèi)持續(xù)通入95 % O2和5 % CO 2的混合氣體，恒溫于37 °C平衡20min，調(diào)節(jié)血管環(huán)靜息張力，Krebs溶液平衡2h，每20min換液一次。
[0030] (3)用ΙμΜ去氧腎上腺素（PE)預(yù)收縮血管環(huán)，收縮峰值達(dá)15min后，加入乙酰膽堿 (Ach，ΙΟμΜ)使預(yù)收縮的血管環(huán)舒張超過(guò)80%，可認(rèn)為血管內(nèi)皮完整，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0031] (4)ΡΕ再次預(yù)收縮血管環(huán)，用梯度乙酰膽堿(Ach，0.1nM-10yM)舒張血管環(huán)，作劑 量-舒張反應(yīng)曲線(xiàn)。以PE誘發(fā)的最大收縮幅度為100%，計(jì)算藏紅花素孵育后血管張力幅度 與PE誘發(fā)的最大收縮幅度比率，以此來(lái)反應(yīng)血管張力的變化，評(píng)價(jià)藏紅花素對(duì)血管內(nèi)皮舒 張反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
[0032] 第一、實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)藏紅花素對(duì)動(dòng)脈環(huán)靜息狀態(tài)下和收縮狀態(tài)下張力的影響，確 定藏紅花素對(duì)血管張力的大體作用。
[0033] 第二、實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)血管去內(nèi)皮組（用特制毛刷去除血管內(nèi)皮)和內(nèi)皮完整組，評(píng)估 藏紅花素對(duì)血管環(huán)舒張能力的影響，且證實(shí)是否為內(nèi)皮依賴(lài)型的調(diào)節(jié)作用。
[0034]第三、比較正常血管和糖尿病模型血管在PE處理后Ach的擴(kuò)血管作用，證實(shí)糖尿病 性血管損傷模型建立完成，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
[0035]第四、檢測(cè)藏紅花素對(duì)血管環(huán)舒張功能的影響。正常組和糖尿病模型組動(dòng)脈血管 環(huán)先用PE(l(T5m〇l/L)使其收縮張力達(dá)到平臺(tái)，此后累積加入梯度濃度的藏紅花素（10- 9m〇l/L-l(T5m〇l/L)，觀察血管環(huán)的張力的變化，并計(jì)算舒張率。
[0036] 第五、檢測(cè)藏紅花素對(duì)抗PE的血管收縮作用。先給藏紅花素（l(T6m〇l/L)預(yù)孵育 20min后再累積加入不同濃度梯度的PE(l0- 9mol/L-l0-5mol/L)，分析藏紅花素對(duì)血管的舒 張能力的調(diào)節(jié)作用。
[0037] 3、結(jié)果
[0038] (1)藏紅花素累積給藥前后的終張力對(duì)靜息主動(dòng)脈環(huán)張力無(wú)顯著影響，隨著藏紅 花素濃度的逐漸增大，藏紅花素顯示了輕微的血管舒張作用;但用PE預(yù)收縮血管后，藏紅花 素可明顯舒張血管，說(shuō)明藏紅花素對(duì)靜息狀態(tài)下主動(dòng)脈環(huán)張力無(wú)顯著性影響，但對(duì)已處于 收縮狀態(tài)的血管有較好的舒張作用，推測(cè)藏紅花素對(duì)病理因素(糖尿病等）引起的血管縮窄 有更直接的擴(kuò)張作用。
[0039] (2)在去內(nèi)皮組各個(gè)濃度的藏紅花素均不能改變血管張力幅度(如圖1)，而在內(nèi)皮 完整組藏紅花素可降低PE收縮血管的張力，說(shuō)明藏紅花素的擴(kuò)血管作用依賴(lài)于血管內(nèi)皮。 [0040] (3)正常組和糖尿病模型組預(yù)先均用PE(l(T5m 〇l/L)收縮血管，張力達(dá)到平臺(tái)后，累 積加入不同濃度的藏紅花素，發(fā)現(xiàn)各組血管張力均有下降，血管舒張率增加（如圖2)，說(shuō)明 藏紅花素對(duì)正常血管和糖尿病血管在其收縮狀態(tài)下均有舒張作用。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn) 藏紅花素對(duì)正常血管的舒張作用要強(qiáng)于糖尿病血管，這也從另一角度說(shuō)明了本實(shí)驗(yàn)中糖尿 病確實(shí)對(duì)血管有所損傷，并影響了血管內(nèi)皮依賴(lài)性的擴(kuò)張作用。但在本研究中藏紅花素對(duì) 糖尿病血管的舒張率可達(dá)54.44% (表1所示），這也充分證明了藏紅花素的作用效果。
[0041 ] 表1藏紅花素對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張效應(yīng)的影響（％± s,n = 6)
[0043] (4)用藏紅花素分別預(yù)處理正常組和糖尿病模型組血管20min后，各濃度PE對(duì)血管 的收縮能力下降(如圖3)，說(shuō)明藏紅花素具有抵抗PE的血管收縮作用。
[0044] 實(shí)施例2藏紅花素對(duì)HUVECs中eNOS表達(dá)的影響
[0045] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0046] 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)用含5%FBS、1%ECGS的ECM培養(yǎng)液培養(yǎng)，37°C、5%⑶2 及飽和濕度的條件下實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用中的細(xì)胞為3-10代，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中嚴(yán)格按 照無(wú)菌操作原則進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中取用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分別給予藏紅花素(〇.1μΜ、1μΜ、 10μΜ、100μΜ 和 ΙΟΟΟμΜ)孵育 48h。
[0047] 2、western blotting分析
[0048] 提取細(xì)胞總蛋白，western blotting分析p-eN0S、t_eN0S和β-actin表達(dá)變化情 況，具體操作步驟如下：
[0049] (1)細(xì)胞總蛋白的提?。河妙A(yù)冷的PBS漂洗藏紅花素孵育后的HUVEC細(xì)胞二次，每個(gè) 孔中加入80μ1蛋白裂解液，在冰上邊裂解邊搖勻30min。用細(xì)胞刮將加有蛋白裂解液的細(xì)胞 刮下，并轉(zhuǎn)移至經(jīng)過(guò)冷卻的離心管中，于12000rpm離心5min。小心取上清即為細(xì)胞總蛋白。 上清液轉(zhuǎn)移分裝于離心管中，存于_80°C備用。
[0050] (2)蛋白濃度測(cè)定:依照蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0051 ] (3)將提取的蛋白加入1 /4體積5 X電泳加樣緩沖液，混勻后置入100 °C水中加熱 5min，使蛋白變性，再迅速將加熱的蛋白樣本置于冰上。根據(jù)測(cè)定的蛋白樣本濃度，上樣量 經(jīng)過(guò)調(diào)整，電泳槽中每孔加約IOOyg蛋白量，采用預(yù)染marker做分子參照，電泳初始電壓設(shè) 為70V，待樣本進(jìn)入濃縮膠與分離膠交界后改電壓為120V。
[0052] (4)轉(zhuǎn)膜，恒定電流250mA轉(zhuǎn)膜1-2h(根據(jù)分子量大?。?。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，硝酸纖維素膜 置入TBST緩沖液中短暫漂洗后，放入封閉奶粉中室溫下溫和振蕩lh。把膜放入稀釋的一抗 (見(jiàn)下表2)中，4°C過(guò)夜。
[0053]表2-抗、二抗的稀釋濃度
[0055] (5)回收一抗，在TBST液中洗膜3次，每次lOmin，然后把硝酸纖維素膜置于稀釋的 二抗(見(jiàn)表2)中室溫下溫和振蕩Ih(避光），后在TBST中洗膜3次，每次lOmin。
[0056] (6)曝光、顯影及定影:取ECL試劑A和試劑B適量，混合Imin后均勻滴加于硝酸纖維 素膜上，用食物保鮮膜覆蓋硝酸纖維素膜后放入膠片盒，在暗室內(nèi)同時(shí)放入X光膠片并作方 向標(biāo)記，曝光，洗片。根據(jù)曝光的情況調(diào)整曝光時(shí)間。用底片掃描儀掃描光膠片，通過(guò)凝膠成 像系統(tǒng)或Quantity one 4.6.2分析軟件讀取目的電泳條帶的密度掃描值，并分析。
[0057] 2、結(jié)果
[0058]蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，藏紅花素可以提高eNOS的表達(dá)水平以及磷酸化水平（圖4)，說(shuō)明藏 紅花素的血管作用與提高eNOS的磷酸化有關(guān)，eNOS表達(dá)及磷酸化水平增高，內(nèi)皮合成NO增 多，最終引起血管擴(kuò)張。
[0059]綜上，本發(fā)明通過(guò)比較靜息和收縮狀態(tài)下藏紅花素對(duì)血管環(huán)張力的影響，發(fā)現(xiàn)藏 紅花素有減弱PE的縮血管作用，推測(cè)出藏紅花素對(duì)病理因素(糖尿病等）引起的血管縮窄有 更直接的擴(kuò)張作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，藏紅花素可明顯降低PE對(duì)糖尿病血管的收縮作用， 尋其機(jī)制發(fā)現(xiàn)或許與其提高eNOS表達(dá)和磷酸化水平，進(jìn)而改善血管內(nèi)皮功能有關(guān)。另外研 究還發(fā)現(xiàn)，提前使用藏紅花素可抵抗PE的縮血管作用，說(shuō)明藏紅花素也具有降低或預(yù)防病 理因素對(duì)血管破壞的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的提出為臨床糖尿病性周?chē)懿∽兊念A(yù)防和治療提供 了新的技術(shù)手段。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 藏紅花素在制備預(yù)防及治療糖尿病周?chē)懿∽兯幬镏械挠猛尽?. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物具有提高糖尿病人血管舒張能力 的作用。3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的藏紅花素通過(guò)提高eNOS的表達(dá)水平來(lái) 達(dá)到提高糖尿病人血管舒張能力，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或治療糖尿病周?chē)懿∽兊哪康摹?br>【文檔編號(hào)】A61P3/10GK106074477SQ201610415865
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日 公開(kāi)號(hào)201610415865.3, CN 106074477 A, CN 106074477A, CN 201610415865, CN-A-106074477, CN106074477 A, CN106074477A, CN201610415865, CN201610415865.3
【發(fā)明人】楊慧科, 呂艷華, 趙玉嬌, 肖建兵, 楊樹(shù)才, 李雪梅, 李鑫磊, 李曉冬, 馬晶, 張雅芳
【申請(qǐng)人】哈爾濱醫(yī)科大學(xué)