丁苯酞及其衍生物在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及 3?正丁基苯酞（簡稱丁苯酞）及其衍生物的新用途，更具體而言是涉及該化合物在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。采用了魚藤酮立體定向注射制作偏側(cè)帕金森病大鼠模型進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明該丁苯酞及其衍生物能有效地改善帕金森所引起的癥狀，具有神經(jīng)保護(hù)作用。
【專利說明】
丁苯酞及其衍生物在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及3-正丁基苯酞(簡稱丁苯酞)及其衍生物的新用途，更具體而言是涉及 該化合物在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 帕金森病(Parkinson disease, PD)是一種常見的慢性進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾 病，其特征性的病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部多巴胺(Dopamine，DA)能神經(jīng)元變性缺失。目前 病因不明，有關(guān)ro發(fā)病機(jī)制的學(xué)說主要包括氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、鈣超載、興奮性氨 基酸毒性作用、細(xì)胞凋亡等。60歲以上人群患病率超過1%，并隨年齡增長而增高。
[0003] 以左旋多巴為代表的替代治療是目前PD的金標(biāo)準(zhǔn)，不但無法阻止疾病的自然進(jìn) 程，而且長期使用后藥效漸減，并伴有嚴(yán)重的副作用。因此，延緩ro變性過程的神經(jīng)保護(hù)治 療成為目前研究和探索的重點(diǎn)，目前較為公認(rèn)的潛在神經(jīng)保護(hù)劑包括司來吉蘭、雷沙吉蘭、 利魯唑(Ril uzoIe)、輔酶Q10(CoQ10)和神經(jīng)營養(yǎng)因子等，但均未得到臨床研究的證實(shí)。迄今 為止，所有的ro治療均為對癥治療，無法阻止疾病的進(jìn)展。尋找一種能減少DA能神經(jīng)元丟 失，阻斷或延緩疾病進(jìn)程的藥物，是目前亟需解決的難題。
[0004] 概括介紹一下丁苯酞及其衍生物的研究進(jìn)展。丁苯酞又名芹菜甲素，是從芹菜籽 中分離出來的一種有效成分，已作為一種多革G點(diǎn)抗腦缺血藥，它還具有改善線粒體功能，抗 氧自由基，降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平以及抑制細(xì)胞凋亡等作用。中國專利CN03137457.3公開了左 旋正丁基苯酞的預(yù)防和治療癡呆的用途；中國專利CN200480029409.0公開了左旋丁基苯 酞在制備預(yù)防和治療腦梗塞的藥物中的應(yīng)用;氨丁苯酞對血小板聚集功能的影響（馬軼濤， 中國藥理學(xué)通報2000Feb; 16(1) : 72~4)。但是現(xiàn)有技術(shù)沒有教導(dǎo)丁苯酞及其衍生物可以用 于制備治療帕金森病的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明一個目的是提供了丁苯酞及其衍生物在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng) 用。其中丁苯酞及其衍生物的劑量占制備出的藥物組合物的重量百分含量為〇. 〇〇 1 %_30%。 優(yōu)選0 · 01 -25%，更優(yōu)選0 · I-15%。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供了一種用于治療帕金森病的藥物組合物，其特征在于 含有治療有效量的丁苯酞及其衍生物以及藥學(xué)可接受的載體。其中丁苯酞及其衍生物的劑 量占藥物組合物的重量百分含量為0.001%-30%。優(yōu)選0.01-25%，更優(yōu)選0.1-15%。
[0007] 本發(fā)明中所指的丁苯酞及其衍生物是指dl-3-n-丁基苯酞、l-3-n-丁基苯酞、氨丁 苯酞(GZ-02)、3-(2'_氧代丁基)異苯并呋喃-1(3H)_酮、丙苯酞、戊苯酞、丁烯苯酞、乙苯酞、 3-( 3'-羥基)丁基苯酞等。
[0008] 本發(fā)明所述的含有治療有效量的丁苯酞及其衍生物的藥物組合物可以口服方法 或非腸道方法給藥，口服方法給藥可以是片劑、膠囊劑;非腸道給藥可以是注射劑等。這些 制劑均是采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法進(jìn)行制備，為了制造片劑、膠囊劑所用的輔料 是常規(guī)的淀粉、環(huán)糊精等，液體制劑包括植物油、PEG等。
[0009] 本發(fā)明公開的用于治療帕金森病的藥物組合物具有以下較好的技術(shù)效果如:能干 預(yù)魚藤酮ro大鼠模型的發(fā)病機(jī)制并改善其病理和行為學(xué)變化，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本發(fā)明 為臨床上提供了一種療效確切的治療藥物，能阻止或延緩帕金森病的進(jìn)程，同時也是丁苯 酞繼腦缺血適應(yīng)癥外的又一新的適應(yīng)癥。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 以下用具體實(shí)施例來解釋本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)被看做對本發(fā)明的限制，具體 保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
[0011] 實(shí)施例1 丁苯酞。
[0012] 在魚藤酮PD大鼠模型中進(jìn)行觀察:給PD大鼠腹腔注射丁苯酞，觀察丁苯酞對ro 大鼠行為學(xué)、中腦氧化應(yīng)激水平和黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的影響。
[0013] -、實(shí)驗(yàn)材料。
[0014] 1.藥物:丁苯酞，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供。
[0015] 2.試劑:魚藤酮、阿撲嗎啡(APO)為Sigma公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMS0)、 酪氨酸羥化酶(TH)單抗、SABC試劑盒為武漢博士德公司產(chǎn)品;GSH試劑盒、MDA試劑 盒和SOD試劑盒為南京建成公司產(chǎn)品。
[0016] 3.儀器:大鼠腦立體定位儀，深圳瑞沃德公司；微量進(jìn)樣器(5μ1)，上海第三分析儀 器廠;721分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡，NikonYSlOO。
[0017] 4.實(shí)驗(yàn)動物:雌性SD大鼠體重200~240g共50只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
[0018] 二、實(shí)驗(yàn)方法。
[0019] 1.偏側(cè)PD大鼠模型的制備:動物經(jīng)10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，剪開顱 部皮膚，暴露顱骨，頭顱水平位固定在立體定位儀上，參照包新民、舒斯云《大鼠腦立體定位 圖譜》在右側(cè)黑質(zhì)致密部（SNpc)和右側(cè)中腦腹側(cè)被蓋(VTA)各注入3yg魚藤酮(溶于0.5μ1 DMSO) ANpc坐標(biāo)：前囟后5.0mm，中線右側(cè)1.8mm，顱骨平面下7.8mm JTA坐標(biāo)：前囟后 5. Omm，中線右側(cè)0.8mm，顏骨平面下7.8mm。于魚藤酮注射后3周，按0.5mg/kg腹腔注射APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，計數(shù)在30min內(nèi)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)的旋次?？傂卧?10次以上的為合格PD模型，共 32只。
[0020] 2.動物分組及給藥:將合格的ro模型隨機(jī)分為4組，每組8只：其中1組為模型對 照組，另外3組為丁苯酞治療組。從第4周開始，分別予生理鹽水2.0ml/kg，丁苯酞20mg/ kg、40 mg/kg、80 mg/kg腹腔注射，每日一次連續(xù)14天。
[0021] 3.旋轉(zhuǎn)行為觀察:腹腔注射給藥結(jié)束后，每組大鼠分別按0.5mg/kg腹腔注射APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，觀察其行為學(xué)變化，記錄30 min旋轉(zhuǎn)次數(shù)并與給藥前進(jìn)行比較。
[0022] 4.中腦氧化應(yīng)激水平測定:旋轉(zhuǎn)行為觀察結(jié)束后，每組各取4只大鼠迅速斷頭取 腦，冰盤上分離出兩側(cè)中腦組織，吸水紙吸干稱重后置于勻漿器內(nèi)，按10%比例加入4°C生理 鹽水，冰盤上充分勻漿，低溫2000r/min離心6分鐘，留上清棄沉淀，即得10%組織勻漿液。 核酸蛋白分析儀測定組織蛋白含量。參照試劑盒說明書測定GSH、MDA含量及SOD活力。 [0023] 5.TH免疫組化:旋轉(zhuǎn)行為觀察結(jié)束后，每組各取4只大鼠，麻醉后4%多聚甲醛灌 注固定，石蠟包埋切片。用TH單抗行黑質(zhì)免疫組織化學(xué)染色，觀察TH陽性細(xì)胞數(shù)量。每只 大鼠取注射點(diǎn)附近中腦黑質(zhì)斷面5張切片計數(shù)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)。
[0024] 6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法:數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用均值土標(biāo)準(zhǔn)差;治療前后及損毀側(cè)與損毀對側(cè) 比較用t檢驗(yàn);組間差異用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，兩兩比較用q檢驗(yàn)。
[0025]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0026](一)旋轉(zhuǎn)行為觀察。
[0027] 1.對照組和各治療組治療前旋轉(zhuǎn)行為無明顯差異(P>0.05)。
[0028I 2、2.與治療前相比，治療后對照組旋轉(zhuǎn)次數(shù)增加，20mg、40mg組旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，但 均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0. 05) dOmg組治療后較治療前旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，且有顯著差異（P〈 0.05)。與對照組治療后相比，80mg組治療后旋轉(zhuǎn)次數(shù)亦明顯減少(P〈0.0 l，表1)。
[0030](二)各組大鼠中腦組織GSH、MDA含量及SOD活力的比較。
[0031] 對照組損毀側(cè)與損毀對側(cè)相比，GSH含量及SOD活力顯著降低、MDA含量顯著增 高(p〈0.05)。隨著丁苯酞劑量的增加，各治療組損毀側(cè)GSH含量和SOD活力逐漸增高，MDA 含量逐漸降低;且與對照組損毀側(cè)相比，均有顯著差異（20mg、40mg組p <0.05,80mg組？〈 O.Ol，表2)。
[0033](三)各組大鼠黑質(zhì)區(qū)域TH陽性細(xì)胞數(shù)目比較。
[0034] 1.對照組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較損毀對側(cè)明顯減少(p〈0.01)，細(xì)胞纖維亦減 少。SOmg組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較損毀對側(cè)仍明顯減少(p〈0.05)，但與對照組損毀側(cè)相 比明顯增多(p (OJS)JOmgdOmg組損毀側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)較對照組損毀側(cè)無顯著增 加 (P >0.05,表3)。
[0036] (四）結(jié)論。
[0037] 本研究中，與對照組損毀側(cè)相比，治療組損毀側(cè)中腦GSH含量增高、MDA含量降低、 SOD活力增強(qiáng)。GSH是腦內(nèi)最重要的抗氧化物質(zhì)，它與H202反應(yīng)生成氧化型谷胱甘肽，從 而清除氧自由基，GSH含量的多少是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì) 過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，而腦組織又富含對自由基損傷易感的多不飽和脂肪酸，故MDA含量變 化間接反應(yīng)了腦組織受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD作為體內(nèi)清除超氧陰離子的特異 酶，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用，其活力高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基 的能力。本發(fā)明中，隨著丁苯酞劑量增加，治療組損毀側(cè)中腦GSH含量、SOD活力逐漸增高， MDA含量逐漸降低，顯示出丁苯酞的抗氧自由基作用呈量效關(guān)系。
[0038] TH陽性細(xì)胞計數(shù)是顯示藥物是否具有DA能神經(jīng)元保護(hù)作用最重要的病理學(xué)指 標(biāo)，而旋轉(zhuǎn)行為的改變則是最重要的行為學(xué)指標(biāo)。本發(fā)明中，20mg和40mg組損毀側(cè)TH陽性 細(xì)胞數(shù)較對照組損毀側(cè)無明顯區(qū)別，而SOmg組損毀側(cè)TH性細(xì)胞數(shù)較對照組損毀側(cè)明顯增 加。旋轉(zhuǎn)行為方面，與治療前相比，20mg和40mg組治療后旋轉(zhuǎn)次數(shù)無明顯減少，而80mg組 治療后旋轉(zhuǎn)次數(shù)則明顯減少，這與TH陽性細(xì)胞計數(shù)的改變有一定的相似性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明丁苯酞能夠干預(yù)魚藤酮ro大鼠模型的發(fā)病機(jī)制并改善其病理和行為學(xué)變化，具有神經(jīng) 保護(hù)作用。
[0039] 實(shí)施例2左旋丁苯酞。
[0040]在魚藤酮PD大鼠模型中進(jìn)行觀察：給PD大鼠腹腔注射左旋丁苯酞，觀察左旋丁 苯酞對ro大鼠行為學(xué)、中腦氧化應(yīng)激水平和黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的影響。
[0041] -、試驗(yàn)材料同實(shí)施例1。
[0042] 二、試驗(yàn)方法同實(shí)施例1。
[0043] 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0044](一)旋轉(zhuǎn)行為觀察。
[0045] 1.對照組和各治療組治療前旋轉(zhuǎn)行為無明顯差異(P>0.05)。
[0046] 2.與治療前相比，治療后對照組旋轉(zhuǎn)次數(shù)增加，20mg組旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，但無統(tǒng)計 學(xué)意義(？>〇.〇5)。4〇1^、8〇1^組治療后較治療前旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，且有顯著差異(4〇1^組卩〈 0.05，80mg組P〈0.01)。與對照組治療后相比，80mg組治療后旋轉(zhuǎn)次數(shù)亦明顯減少（P〈 0.01，表 1)〇 ? 、、、、夂、K、? '
[0048](二)各組大鼠中腦組織GSH、MDA含量及SOD活力的比較。
[0049] 對照組損毀側(cè)與損毀對側(cè)相比，GSH含量及SOD活力顯著降低、MDA含量顯著增 高(p〈0.05)。隨著丁苯酞劑量的增加，各治療組損毀側(cè)GSH含量和SOD 活力逐漸增高，MDA含量逐漸降低;且與對照組損毀側(cè)相比，均有顯著差異(20mg組p <0.05,40mg 組、80mg 組p〈0.01，表2)。 ^ 2 UM 、、·〇!> I 、Χ、 ? I
[0051](三)各組大鼠黑質(zhì)區(qū)域TH陽性細(xì)胞數(shù)目比較。
[0052] 對照組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較損毀對側(cè)明顯減少(p〈0.01)，細(xì)胞纖維亦減少。 40mg、80 mg組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較損毀對側(cè)仍明顯減少(p〈0.05)，但與對照組損毀 側(cè)相比明顯增多(P〈0.05) jOmg組損毀側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)較對照組損毀側(cè)無顯著增加 (p >0.05,表3)。 Ms： 't I ： H IH h I ^ t J ii 41
[0054] (四)結(jié)論。
[0055] 本研究中，左旋丁苯酞組與對照組損毀側(cè)相比，治療組損毀側(cè)中腦GSH含量明顯 增高、MDA含量明顯降低、SOD活力明顯增強(qiáng)，隨著左旋丁苯酞劑量增加，治療組損毀側(cè)中 腦GSH含量、SOD活力逐漸增高，MDA含量逐漸降低，顯示出左旋丁苯酞的抗氧自由基作用 呈量效關(guān)系。
[0056] 本研究中，20mg組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較對照組損毀側(cè)無明顯區(qū)別，而40mg、 80mg組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較對照組損毀側(cè)明顯增加。旋轉(zhuǎn)行為方面，與治療前相比， 20mg組治療后旋轉(zhuǎn)次數(shù)無明顯減少，而40mg、80mg組治療后旋轉(zhuǎn)次數(shù)則明顯減少，這與TH 陽性細(xì)胞計數(shù)的改變有一定的相似性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明左旋丁苯酞在40mg/kg劑量下就能夠 明顯干預(yù)魚藤酮ro大鼠模型的發(fā)病機(jī)制并改善其病理和行為學(xué)變化，具有神經(jīng)保護(hù)作用。 [0057] 實(shí)施例3丙苯酞。
[0058] 在魚藤酮PD大鼠模型中進(jìn)行觀察:給PD大鼠腹腔注射丙苯酞，觀察丙苯酞對 大鼠行為學(xué)、中腦氧化應(yīng)激水平和黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的影響。
[0059] 一、試驗(yàn)材料同實(shí)施例1。
[0060]二、試驗(yàn)方法同實(shí)施例1。
[00611三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0062](一)旋轉(zhuǎn)行為觀察。
[0063] 1.對照組和各治療組治療前旋轉(zhuǎn)行為無明顯差異(P>0.05)。
[0064] 2.與治療前相比，治療后對照組旋轉(zhuǎn)次數(shù)增加，20mg、40mg組旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，但均 無統(tǒng)計學(xué)意義(PMhOS)t3SOmg組治療后較治療前旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，且有顯著差異(P〈0.05)。 與對照組治療后相比，80mg組治療后旋轉(zhuǎn)次數(shù)亦明顯減少(P〈0.05，表1)。
[0066](二)各組大鼠中腦組織GSH、MDA含量及SOD活力的比較。
[0067] 對照組損毀側(cè)與損毀對側(cè)相比，GSH含量及SOD活力顯著降低、MDA含量顯著增 高(p〈0.05)。隨著丁苯酞劑量的增加，各治療組損毀側(cè)GSH含量和SOD活力逐漸增高，MDA 含量逐漸降低;且與對照組損毀側(cè)相比，均有顯著差異（20mg、40mg組p <0.05,80mg組？〈 0.01，表2)。
[0069](三)各組大鼠黑質(zhì)區(qū)域TH陽性細(xì)胞數(shù)目比較。
[0070] 對照組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較損毀對側(cè)明顯減少(p〈0.01)，細(xì)胞纖維亦減少。 SOmg組損毀側(cè)TH陽性細(xì)胞數(shù)較損毀對側(cè)仍明顯減少(p〈0.05)，但與對照組損毀側(cè)相比 明顯增多(P〈〇.〇5)。20 mg、40 mg組損毀側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)較對照組損毀側(cè)無顯著增 加 (P >0.05,表3)。 ?κ' 、 -…、hi 、 、、 ?、' "
[0072](四）結(jié)論。
[0073]本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丙苯酞能夠干預(yù)魚藤酮PD大鼠模型的發(fā)病機(jī)制并改善其病理和 行為學(xué)變化，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但只有在較高劑量作用才明顯。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 丁苯酞及其衍生物作為制備治療帕金森病神經(jīng)保護(hù)的藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于丁苯酞為左旋丁苯酞、消旋丁苯酞。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于丁苯酞衍生物為丙苯酞。
【文檔編號】A61K31/365GK106074497SQ201610439427
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2010年1月13日
【發(fā)明人】牛鋒, 黃憗, 王濤, 黃金莎, 曹菊林, 郭海波
【申請人】石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司