N?甲?；?3,4?亞甲二氧基芐基?γ?丁內(nèi)酯在制備抗乙型肝炎病毒的藥物中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了N?甲?；?3,4?亞甲二氧基芐基?γ?丁內(nèi)酯（KNK437）的抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）的作用。具體分析步驟為：將三種細(xì)胞系經(jīng)過(guò)KNK437不同濃度處理一定時(shí)間或者特定濃度處理不同時(shí)間，隨后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、細(xì)胞內(nèi)總RNA和細(xì)胞中DNA，利用酶聯(lián)免疫法、熒光定量PCR依次檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其可以顯著降低乙肝相關(guān)抗原分泌，并抑制乙肝病毒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，表明該藥在乙肝治療方面具有極大的臨床應(yīng)用前景，不同于傳統(tǒng)的抗HBV藥物的作用靶點(diǎn)，KNK437有望解決核苷酸類(lèi)似物藥物的副作用大、應(yīng)答率低和容易形成耐藥株等不足。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
N-甲?；?3,4-亞甲二氧基芐基-γ -丁內(nèi)酯在制備抗乙型肝 炎病毒的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及N-甲?；?3,4-亞甲二氧基芐基-γ-丁內(nèi)酯 (ΚΝΚ437)的藥物新用途，具體是其在制備抗乙型肝炎病毒的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一種能通過(guò)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行復(fù)制的小分子 DNA病毒，它能感染宿主引起乙型病毒性肝炎(Hepatitis B)疾病。HBV感染是世界性的公共 健康問(wèn)題，全球大約有20億人曾感染過(guò)HBV，其中約3億5千萬(wàn)發(fā)展為慢性乙型肝炎。然而慢 性感染會(huì)導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝癌。1992年起，我國(guó)實(shí)施了新生兒免費(fèi)接種疫苗的政 策，注射疫苗以后5歲以下兒童攜帶率已降到0.96%，接種疫苗是一種很有效預(yù)防乙肝的方 式，但其保護(hù)率不能達(dá)到100 %。
[0003] 目前，臨床上治療慢性乙型病毒性肝炎的方式主要有兩種:干擾素 α的注射和核苷 (酸)類(lèi)似物如恩替卡韋、拉米夫定、阿地福韋等藥物的服用。但是這兩種方式都存在一些不 足，干擾素 α，這類(lèi)藥物療程短，通常為6個(gè)月到1年，療效顯著，但是應(yīng)答率低，通常在20 %左 右，副作用大等缺點(diǎn)。而研究發(fā)現(xiàn)拉米夫定3TC持續(xù)用藥1年后耐藥性的發(fā)生概率為23%，5 年后，耐藥性的發(fā)生概率高達(dá)70%。阿德福韋持續(xù)用藥2年和5年后，耐藥性的發(fā)生概率分別 為3 %和29 % ATV持續(xù)用藥1年和5年后耐藥性發(fā)生概率分別為0 %和1.2 %。說(shuō)明核苷(酸） 類(lèi)似物藥物容易引起耐藥性及停藥反彈等缺點(diǎn)，所以急需尋找新型的抗乙型肝炎病毒藥 物。
[0004] ΚΝΚ437是由日本的Kaneka公司合成的一種化學(xué)試劑，別名N-甲?；?3,4-亞甲二 氧基芐基-γ-丁內(nèi)酯，或者3-(1，3_亞芐基內(nèi)酰胺-5-基甲基)-2_氧代-1-吡咯烷羧。其化學(xué) 結(jié)構(gòu)見(jiàn)下圖，KNK43 7能夠通過(guò)影響熱休克因子HSF和HSE的相互作用，來(lái)抑制熱休克蛋白的 mRNA和蛋白的積累，以及影響熱休克蛋白在HeLa細(xì)胞、結(jié)腸癌、鱗狀細(xì)胞癌和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤 的培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)耐熱功能。
[0005] KNK437對(duì)于乙肝病毒直接的抑制作用還沒(méi)有任何報(bào)道。
[0006]
[0007] KNK437的化學(xué)結(jié)構(gòu)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供N-甲?；?3,4-亞甲二氧基芐基-γ -丁內(nèi)酯(KNK437)在制備 抗乙型肝炎病毒藥物中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)利用ΚΝΚ437對(duì)肝癌細(xì)胞系中的乙肝病毒進(jìn)行控制，發(fā)現(xiàn)其可以顯著降 低乙肝相關(guān)抗原分泌，并抑制乙肝病毒在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，表明該藥在乙肝治療方面 具有極大的臨床應(yīng)用前景。
[0010]具體采用以下實(shí)驗(yàn)：
[0011] 運(yùn)用了三種肝癌細(xì)胞系模型:HepG2 · 2 · 15細(xì)胞系、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1 · I XHBV(pCH9-3091) 質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞系和1.3 XHBV(pGEM-l. 3 XHBV)質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞系。適當(dāng)濃度的KNK437處 理細(xì)胞后，用CCK-8的方法測(cè)定了藥物的細(xì)胞毒性、酶聯(lián)免疫法檢測(cè)了表面抗原HBsAg和 HBeAg的分泌、熒光定量PCR的方法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)HBV DNA和RNA水平的變化，
[0012] 本發(fā)明揭示了KNK437的一種新的生物學(xué)功能，能夠抑制HBV HBsAg和HBeAg的分 泌，而且能夠抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，KNK437具有抗乙肝病毒活性，不同于傳統(tǒng)的抗HBV藥物 的作用靶點(diǎn)，KNK437可能作為一種新穎的靶向熱休克蛋白的抗HBV藥物，有望解決核苷酸類(lèi) 似物藥物的一些不足，比如，副作用大、應(yīng)答率低和容易形成耐藥株等。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為KNK437對(duì)HepG2.215和Huh7細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。
[0014] 圖2為KNK437對(duì)細(xì)胞上清中HBsAg分泌的影響。
[0015] 圖3為KNK437對(duì)細(xì)胞上清中HBeAg分泌的影響。
[0016] 圖4為KNK437對(duì)細(xì)胞內(nèi)病毒RNA合成的影響。
[0017] 圖5為KNK437對(duì)細(xì)胞內(nèi)病毒DNA復(fù)制能力的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施 例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
[0019] 實(shí)驗(yàn)材料：
[0020] HepG2.215細(xì)胞和Huh7細(xì)胞均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC);
[0021] 1.3XHBV(pGEM-1.3HBV)質(zhì)粒由以色列魏茲曼科學(xué)院的Yosef Shaul教授惠贈(zèng)，該 質(zhì)粒含有一個(gè)1.3倍HBV基因組片段(4195bp，血清型為adw);
[0022] 1.1 XHBV(pCH9_3091)質(zhì)粒則由德國(guó)弗萊堡大學(xué)的Michael Nassal教授惠贈(zèng)，該 質(zhì)粒含有一個(gè)1.05倍的HBV基因組片段(3375bp，血清型為ayw);
[0023] KNK437購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)的Calbiochem公司；
[0024] 治療HBV的常用藥物恩替卡韋（entecavir-triphosphate，ETV)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)的 Biochemicals 公司；
[0025] CCK-8試劑購(gòu)買(mǎi)于上海的東仁化學(xué)科技公司；
[0026]抗原HBsAg和HBeAg水平檢測(cè)使用的是上?？迫A生物工程股份有限公司生產(chǎn)的乙 型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)診斷試劑盒和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)診斷試劑盒；
[0027] Invitrogen公司的TRIzol reagent試劑；
[0028] TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq II試劑盒。
[0029]【實(shí)施例1】KNK437對(duì)HepG2.215和Huh7細(xì)胞系的細(xì)胞毒性
[0030] 將HepG2.2.15和HuH7細(xì)胞以IO4個(gè)細(xì)胞/孔的量接種于96孔板中，培養(yǎng)12h后，加入 不同濃度的KNK437進(jìn)行刺激，KNK437的濃度依次為:0μΜ、0. ΙμΜ、ΙμΜ、10μΜ、20μΜ、50μΜ、100μ Μ、500μΜ;處理時(shí)間分別為2天、4天、6天，最后檢測(cè)時(shí)，去除上清，PBS洗三次，再加入新鮮不 含血清的培養(yǎng)基，其中含有10%的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h，即可在酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD490吸 光值。以未加藥對(duì)照吸光值作為細(xì)胞生長(zhǎng)速率的相對(duì)值1，其它各孔吸光值與之比較，得到 各自細(xì)胞生長(zhǎng)速率相對(duì)值。
[0031] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1)可以看出，KNK437在檢測(cè)濃度100μΜ以?xún)?nèi)，對(duì)兩種細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒 性。當(dāng)藥物處理2天和4天時(shí)，HepG2.215細(xì)胞的相對(duì)值都超過(guò)95%，說(shuō)明細(xì)胞的生長(zhǎng)不受影 響。而當(dāng)KNK437的濃度達(dá)到500μΜ處理6天后，細(xì)胞相對(duì)值分別下降了 15%左右，表明KNK437 對(duì)HepG2.215和Huh7細(xì)胞沒(méi)有毒性，在低濃度范圍內(nèi)不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0032] 后續(xù)實(shí)施例中采用KNK437的最高濃度為20μΜ，該藥物濃度不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 [0033]【實(shí)施例2】ΚΝΚ437處理三種肝癌細(xì)胞系細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg檢測(cè)（1)將 HepG2 · 2 · 15和轉(zhuǎn)染了 1 · 1/1 · 3 XHBV質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)液中加入ΙμΜ、ΙΟμΜ和20μΜ ΚΝΚ437，以及30ηΜ恩替卡韋(ETV)作為抗HBV陽(yáng)性對(duì)照藥物處理6天，每?jī)商鞊Q液，收集6天后 細(xì)胞上清于-40 °C待用；
[0034] (2)將HepG2.2.15和轉(zhuǎn)染了 1.1/1.3 XHBV質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20μΜ的 ΚΝΚ437，分別處理細(xì)胞2天、4天、6天，以及陽(yáng)性對(duì)照30nM ETV處理6天，每?jī)商鞊Q一次新鮮培 養(yǎng)液，并收集細(xì)胞上清于-40 °C待用；
[0035] (3)將（1)和(2)中所收集的細(xì)胞上清解凍后1000 Og離心5分鐘以去除細(xì)胞殘?jiān)?，隨 后將上清于37°C溫箱中預(yù)熱30分鐘；
[0036] (4)每個(gè)樣品取出500μ1使用上海科華HBsAg酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)上清中乙肝s抗 原含量，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
[0037] (5)每個(gè)樣品取出500μ1使用上海科華HBeAg酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)上清中乙肝e抗 原含量，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0038] (6)重復(fù)（1)~（5)實(shí)驗(yàn)步驟兩次，得到3批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 6繪圖軟件，繪制柱狀圖并計(jì)算p值，分析用藥組與未用藥組間是否存在差異；
[0039] 從圖IA中可以看到，1μΜ、10μΜ、20μΜ三種濃度的KNK437處理HepG2.2.15細(xì)胞6天 后，細(xì)胞分泌上清中HBsAg沒(méi)有明顯的變化。從圖IB中可以看出，在相同濃度KNK437的刺激 下，細(xì)胞分泌上清中H B s A g也沒(méi)有明顯的變化。綜上所述，K N K 4 3 7的刺激不能夠引起 H印G2 · 2 · 15細(xì)胞HBsAg的分泌。
[0040] 從圖2A中可以發(fā)現(xiàn)，ΙμΜ、10μΜ、20μΜ濃度的KNK437刺激HepG2.2.15細(xì)胞6天后，上 清中HBeAg的分泌降低，并且隨著KNK437濃度的遞增，HBeAg降低的趨勢(shì)增大。20μΜ KNK437 刺激6天后，上清中H B e A g的水平已降至陰性對(duì)照的7 0 %左右。如圖2 B所示，2 0 μ M濃度的 ΚΝΚ437刺激HepG2.2.15細(xì)胞2至6天后，上清中HBeAg的水平均降低，其降低程度隨著刺激時(shí) 間的增加而增大。綜上所述，KNK437的刺激能夠引起HepG2.2.15細(xì)胞HBeAg分泌的降低，并 且表現(xiàn)出一定的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。
[0041 ]由圖2C中可以看出，Huh7細(xì)胞轉(zhuǎn)染l.lxHBV質(zhì)粒后，不同濃度的KNK437處理細(xì)胞6 天后，上清中HBsAg的表達(dá)水平不存在明顯的變化。當(dāng)濃度達(dá)到最高20μΜ時(shí)，HBsAg的表達(dá)水 平只下降了25.8%。如圖2D所示，20μΜ ΚΝΚ437刺激I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞后，不同時(shí) 間均引起上清中HBsAg分泌減少，但是減少的幅度不是很大。綜上所述，KNK437的刺激能夠 輕微影響I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞的HBsAg分泌。
[0042] 由圖2C中可以看出，1μΜ、10μΜ、20μΜ三種濃度的KNK437刺激6天后，細(xì)胞上清中 HBeAg的分泌水平下降，其下降程度隨著ΚΝΚ437濃度的增加而增大。20μΜ ΚΝΚ437刺激6天 后，上清中HBeAg的水平已降至陰性對(duì)照的40%左右。從圖2D中可以發(fā)現(xiàn)，I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 的Huh7細(xì)胞在20μΜ ΚΝΚ437刺激下，隨著刺激時(shí)間的遞增，其上清中HBeAg的分泌水平依次 降低。綜上所述，ΚΝΚ437能夠抑制I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞分泌HBeAg，并且具有劑量和 時(shí)間依賴(lài)性。
[0043]由圖2E結(jié)果可知，不同濃度KNK437處理瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1.3xHBV質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞6天后， 當(dāng)KNK437濃度達(dá)到最高20μΜ時(shí)，HBsAg的表達(dá)水平才有明顯下降，下降了56.4%。由圖2F結(jié) 果可知，20μΜ ΚΝΚ437處理瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1.3x HBV質(zhì)粒的Huh7不同時(shí)間后，上清中HBsAg的表達(dá) 水平與KNK437存在時(shí)間依賴(lài)性，處理最長(zhǎng)時(shí)間6天時(shí)，下了54.6%。綜上結(jié)果可知，KNK437能 夠抑制1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞分泌HBsAg。
[0044]由圖2E所示，可以看出1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞經(jīng)KNK437刺激6天后，只有 KNK437濃度為20μΜ時(shí)，上清中HBeAg水平才明顯下降，下降了54.9%。從圖2F中可以看出，20 μΜ ΚΝΚ437刺激1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞2天后，上清中HBeAg水平出現(xiàn)下降的情況，并且 刺激時(shí)間越長(zhǎng)，HBeAg下降越明顯。綜上所述，1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7后，HBeAg分泌減少需要 較高濃度KNK437的刺激。
[0045]【實(shí)施例3】KNK437處理三種肝癌細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)病毒mRNA水平檢測(cè) [0046] (1)將接種于六孔板內(nèi)的HepG2 · 2 · 15和轉(zhuǎn)染了含1 · 1/1 · 3 XHBV質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞培 養(yǎng)液中加入1μΜ、10μΜ和20μΜ KNK437,以及30nM恩替卡韋（ETV)作為抗HBV陽(yáng)性對(duì)照藥物處 理6天，每?jī)商鞊Q液，6天后每孔細(xì)胞中加入相應(yīng)的RNAiso Plus裂解液，一般六孔細(xì)胞培養(yǎng) 皿，每孔加 Iml RNAiso Plus裂解液。室溫放置5min，使細(xì)胞充分裂解，將細(xì)胞吹散均勻，然 后收集到1.5ml無(wú) RNase的離心管；
[0047] (2)將接種于六孔板內(nèi)的HepG2.2.15和轉(zhuǎn)染了I. l/1.3xHBV質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞培養(yǎng) 液中加入20μΜ的KNK437,分別處理細(xì)胞2天、4天、6天，以及陽(yáng)性對(duì)照30nM ETV處理6天，每?jī)?天換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)一定時(shí)間后每孔細(xì)胞中加入相應(yīng)的RNAiso Plus裂解液，一般六 孔細(xì)胞培養(yǎng)皿，每孔加 Iml RNAiso Plus裂解液。室溫放置5min，使細(xì)胞充分裂解，將細(xì)胞吹 散均勾，然后收集到1.5ml無(wú) RNase的離心管；
[0048] (3)將（1)和(2)步驟中收集的細(xì)胞裂解液加入1/5體積的氯仿，劇烈顛倒混勻，室 溫放置5min;
[0049] (4)將（3)中所得到的樣品在4°C離心機(jī)，12000rpm/min，離心15min，小心取出樣 品，樣品分為三層:紅色的有機(jī)相下層、中間DNA薄層、含RNA的上清；
[0050] (5)將(4)中上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml無(wú) RNase離心管，不要將上清取的太干凈，避免 取到DNA薄層；
[0051] (6)向（5)取出的上清中加入等體積的異丙醇，劇烈顛倒混勻，室溫靜置IOmindX 淀RNA。離心后可看見(jiàn)底部有白色沉淀，棄上清，向管中加入1ml 70%乙醇(DEPC水配制），上 下顛倒，洗滌沉淀。然后4°C，12000rpm/min，離心5min;
[0052] (7)將(6)中上清丟棄，將沉淀放置室溫5min，干燥沉淀。加入20μ1 DEPC處理水，室 溫放置5min，使沉淀充分溶解。然后將得到的mRNA置于-80°C保存或直接進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí) 驗(yàn)；
[0053] (8)將（7)提取的RNA樣品，嚴(yán)格按照Vazyme公司的HiScript Q RT SuperMix forqPCR(+gDNAwiper)試劑盒操作，反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
[0054] (9)將(8)中的cDNA嚴(yán)格按照Vazyme公司的AceQ qPCR試劑盒，配制熒光定量PCR反 應(yīng)體系；
[0055] (10)將（9)配制好的反應(yīng)體系在Roche公司的LightCycler 96Real_Time PCR system儀器上進(jìn)行反應(yīng)。以管家基因 Actin作為內(nèi)參，相比較得出樣品的相對(duì)值；
[0056] (11)重復(fù)（1)~（10)實(shí)驗(yàn)步驟兩次，得到3批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 6繪圖軟件，繪制柱狀圖并計(jì)算p值，分析用藥組與未用藥組間是否存在差異；
[0057] 由圖3A中可以看出，1μΜ、10μΜ、20μΜ三種濃度的KNK437刺激6天后，HepG2.215細(xì)胞 內(nèi)的RNA水平下降，其下降程度隨著KNK437濃度的增加而增大。20μΜ KNK437刺激6天后，RNA 水平已降至陰性對(duì)照的65.7%。從圖38中可以看出，2(^]?1(疆437處理!^62.215細(xì)胞不同 時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)HBV RNA水平在處理2天后明顯下降，下降了60.4%，接著處理4天和6天后并 沒(méi)有明顯的進(jìn)一步下降。綜上所述，ΚΝΚ437能夠抑制HepG2.215細(xì)胞內(nèi)RNA的轉(zhuǎn)錄，并且具有 劑量依賴(lài)性。
[0058]由圖3C中可以看出，三種濃度的KNK437刺激I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞6天后， 細(xì)胞內(nèi)RNA水平下降，其下降程度隨著KNK437濃度的增加而增大。20μΜ KNK437刺激6天后， 細(xì)胞中RNA的水平已降至陰性對(duì)照的76 %左右。從圖3D中可以發(fā)現(xiàn)，I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的 Huh7細(xì)胞在20μΜ ΚΝΚ437刺激下，隨著刺激時(shí)間的遞增，其細(xì)胞中RNA水平依次降低。綜上所 述，ΚΝΚ437能夠抑制I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞內(nèi)RNA水平，并且具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。 [0059]由圖3E中可以看出，三種濃度的KNK437刺激1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞6天后， 細(xì)胞內(nèi)RNA水平下降，其下降程度隨著KNK437濃度的增加而增大。20μΜ KNK437刺激6天后， 細(xì)胞內(nèi)RNA水平已降至陰性對(duì)照的73 %左右。從圖3F中可以發(fā)現(xiàn)，1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7 細(xì)胞在20μΜ KNK437刺激下，隨著刺激時(shí)間的遞增，其細(xì)胞中RNA水平依次降低。綜上所述， ΚΝΚ437能夠抑制1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞內(nèi)RNA水平，并且具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。 [0060]【實(shí)施例4】KNK437處理三種肝癌細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)病毒DNA水平檢測(cè) [00611 (1)將接種于六孔板內(nèi)的HepG2.2.15和轉(zhuǎn)染了含1.1/1.3 XHBV質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞培 養(yǎng)液中加入1μΜ、10μΜ和20μΜ KNK437,以及30nM恩替卡韋（ETV)作為抗HBV陽(yáng)性對(duì)照藥物處 理6天，每?jī)商鞊Q液，6天后收集細(xì)胞，凍存于-80°C待用；
[0062] (2)將接種于六孔板內(nèi)的HepG2.2.15和轉(zhuǎn)染了 1.1/1.3 XHBV質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞培養(yǎng) 液中加入20μΜ的KNK437,分別處理細(xì)胞2天、4天、6天，以及陽(yáng)性對(duì)照30nM ETV處理6天，每?jī)?天換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)一定時(shí)間后收集細(xì)胞，凍存于_80°C待用；
[0063] (3)每一樣品中加入NP40裂解液(NaCl 2.19g，lM Tris · HCl(pH8.0)12.5ml，NP40 2.5ml，0.5M EDTA0.5ml，去離子水溶解，定容至250ml，使用時(shí)加入1/100的IOOmM PMSF)，冰 上消化20min，使細(xì)胞充分裂解。用刮鏟刮下細(xì)胞收集到1.5ml離心管，4°C，12000rpm/min， 離心10min。將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管；
[0064] (4)各樣品取相同蛋白含量的上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管，依次加入2ylDNAase Ι(5υ/μ1)、1μ1 RNaseA(10mg/ml)、1.6yl IM MgC12(終濃度80mM)，混勻，37°C恒溫箱放置 2h，充分去除細(xì)胞內(nèi)基因組DNA和RNA;
[0065] (5)將(4)樣品取出，每一樣品加入3μ1 0.5M EDTA，在60°C放置lOmin，終止反應(yīng)， 以免破壞后續(xù)釋放的病毒DNA;
[0066] (6)接著加入20μ1 10%SDS(1/10體積，終濃度為 1%)，再加入ΙμL Proteinase K (終濃度為I〇〇μg/ml)，混勻，37 °C恒溫箱放置2h;
[0067] (7)將樣品取出加入1倍體積的Tris飽和苯酚，顛倒混勻，室溫下，10000rpm/min， 離心10min;
[0068] (8)將(7)中上清小心轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管，然后加入0.5μ1糖原(終濃度0.05μ g/μL)，顛倒混勻；再加入20μ1 3Μ NaAc ΡΗ5.2(1/10體積），顛倒混勻;再加入400μ1 100% 乙醇(2倍體積），顛倒混勻，-20 °C冰箱放置2.5h或者過(guò)夜，沉淀DNA;
[0069] (9)取出樣品，4°C，12000rpm/min，離心15min。離心后可看見(jiàn)底部有白色沉淀，棄 上清，加入1ml 70%乙醇洗滌沉淀，4°C，12000rpm/min，離心5min;
[0070] (10)棄上清，將沉淀放置室溫IOmin，干燥沉淀。加入20μ1 TEbuf fer，室溫放置 IOmin，使沉淀充分溶解，渦旋30s，充分混勻，得到DNA樣品；
[0071 ] (11)將（10)中的DNA按照Vazyme公司的AceQ qPCR試劑盒配制熒光定量PCR反應(yīng)體 系；
[0072] (12)將（11)配制好的反應(yīng)體系在Roche公司的LightCycler 96Real-Time PCR system儀器上進(jìn)行反應(yīng)。以PCH9-3091做標(biāo)曲，相比較得出樣品的相對(duì)值；
[0073] (13)重復(fù)（1)~（12)實(shí)驗(yàn)步驟兩次，得到3批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad Prism 6繪圖軟件，繪制柱狀圖并計(jì)算p值，分析用藥組與未用藥組間是否存在差異；
[0074]由圖4A中可以看出，HepG2.215細(xì)胞經(jīng)不同濃度的KNK437刺激以后，細(xì)胞內(nèi)HBV DNA水平明顯下降，而隨著濃度的升高，下降的程度增大。KNK437濃度升高到20μΜ時(shí)，抑制率 95%以上。由圖48可以發(fā)現(xiàn)，2(^]?1(疆437處理拖？62.215細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)冊(cè)￥0嫩 水平明顯下降，隨著刺激時(shí)間的遞增，其細(xì)胞中DNA水平依次降低。處理6天時(shí)，HBV DNA水平 的抑制率已經(jīng)高達(dá)98.6%。綜上所述，ΚΝΚ437能夠抑制HepG2.215細(xì)胞內(nèi)DNA水平，并且具 有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。
[0075]由圖4C中可以看出，三種濃度的KNK437刺激I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞6天后， 細(xì)胞內(nèi)DNA水平下降，其下降程度隨著KNK437濃度的增加而增大，但抑制程度比HepG2.215 細(xì)胞弱。當(dāng)濃度升高到20μΜ時(shí)，HBV DNA水平抑制率最高，達(dá)到了42.7%。從圖4D中可以發(fā) 現(xiàn)，I. IxHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞在20μΜ ΚΝΚ437刺激下，隨著刺激時(shí)間的遞增，其細(xì)胞中 DNA水平依次降低。綜上所述，ΚΝΚ437能夠抑制I. I xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞內(nèi)DNA水平，并 且具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。
[0076]由圖3E中可以看出，三種濃度的KNK437刺激1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞6天后， 細(xì)胞內(nèi)DNA水平下降，其下降程度隨著KNK437濃度的增加而增大。20μΜ KNK437刺激6天后， 細(xì)胞內(nèi)DNA水平已降至陰性對(duì)照的66 %左右。從圖3F中可以發(fā)現(xiàn)，1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7 細(xì)胞在20μΜ KNK437刺激下，隨著刺激時(shí)間的遞增，其細(xì)胞中DNA水平依次降低。綜上所述， ΚΝΚ437能夠抑制1.3xHBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞內(nèi)DNA水平，并且具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。 [0077]綜上所述，本發(fā)明首次證實(shí)KNK437夠從轉(zhuǎn)錄水平抑制HBV RNA的合成，進(jìn)而影響到 下游DNA及抗原分泌水平。這一發(fā)現(xiàn)不僅拓寬了 HBV治療的思路，而且增加了聯(lián)合用藥的選 擇，對(duì)其臨床使用具有一定的理論指導(dǎo)意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.N-甲?；?3，4-亞甲二氧基芐基-γ -丁內(nèi)酯在制備抗乙型肝炎病毒藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/4025GK106074503SQ201610407438
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】胡康洪, 黃亞運(yùn), 程智逵, 孫鴿, 魏艷紅
【申請(qǐng)人】湖北工業(yè)大學(xué)