樺木酸作為機體鎘清除劑的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及樺木酸的新用途，尤其涉及樺木酸在制備清除機體內(nèi)鎘的藥物、保健品及食品中的應用。本發(fā)明通過體外及體內(nèi)實驗證實樺木酸對正常細胞及小鼠沒有明顯的毒副作用，能減少小鼠肝、腎和睪丸中的鎘殘留量，能促進尿液中鎘的排出；能減輕鎘造成的小鼠肝腎和睪丸組織損傷。樺木酸具備治療機體鎘積累的作用，安全有效，優(yōu)于傳統(tǒng)的治療藥物，從而擴寬了其應用范圍，也為治療重金屬鎘中毒提供了新途徑。
【專利說明】
樺木酸作為機體鎘清除劑的應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及樺木酸的新用途，具體涉及樺木酸在制備清除機體內(nèi)鎘的藥物中的應用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]鎘是銀白色有光澤的金屬，鎘不是人體的必需元素。人體內(nèi)的鎘是出生后從外界環(huán)境中吸取的，普通人鎘接觸主要有四個途徑:空氣，水，食物和煙草。80%的食物鎘來自于谷類和蔬菜，這些食物源于富集鎘的土壤;另外由于煙草能夠選擇性地從土壤中吸收鎘，吸煙者血液中血鎘的濃度明顯大于不吸煙者。鎘進入體內(nèi)以后，由于其10-30年的生物半衰期以及極低的體外排出率，因此對人體產(chǎn)生很大的毒性。體內(nèi)的鎘約50%富集在肝和腎里，對肝和腎的損害極大，表現(xiàn)為尿中含大量低分子量蛋白，由于腎小管功能受損，造成鈣、磷和維生素D代謝障礙，進而造成骨質(zhì)軟化和疏松，嚴重者極易發(fā)生病理性骨折;其余分布于肺、 胰、甲狀腺、睪丸、毛發(fā)等處。相關(guān)的流行病學研究，提示慢性鎘中毒患者可能出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)損害等。鎘污染的現(xiàn)實危害，在于目前還沒有特效的解毒藥物可供使用。
[0003]目前報道過的作用于鎘中毒的藥物主要包括:1)傳統(tǒng)的驅(qū)鎘藥物:氨基羧酸類化合物EDTA，巰基類化合物和DDTC類化合物，此類藥物藥物選擇性不高，長時間使用有較強的腦、腎毒副作用。2)維生素B和維生素C和E，通過抗氧化起一定的保護作用，不能促鎘排出。 3)鋅、鐵、鈣和硒等營養(yǎng)素防治，與特定蛋白結(jié)合來拮抗鎘的毒性，長期攝入鈣會有精神副作用，鋅過量會導致免疫能力傷害，鐵作用于轉(zhuǎn)運蛋白，受蛋白量的限制;此方式拮抗鎘的效率有限，并且并不能減少組織內(nèi)鎘的殘留量。
[0004]樺木酸(betulinic acid，BA)是一種萃取自白樺樹的五環(huán)三砲類化合物，生物效應特別廣泛，目前研究的熱點主要集中在樺木酸的抗腫瘤、抗艾滋、抗病毒、抗炎癥、抗瘧原蟲，特別是在抗腫瘤方向。實驗已經(jīng)證實樺木酸對腫瘤細胞有很強的殺傷作用而對正常細胞幾乎沒有副作用。
[0005]目前，尚未見關(guān)于樺木酸用于治療重金屬鎘中毒的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的第一個目的是提供樺木酸在制備清除機體內(nèi)鎘的藥物中的應用。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供樺木酸在制備清除機體內(nèi)鎘的保健品中的應用。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供樺木酸在制備清除機體內(nèi)鎘的食品中的應用。
[0009]以上目的通過如下實驗加以驗證:1)體外實驗:用樺木酸和氯化鎘聯(lián)合處理三種正常的肝、腎和睪丸細胞，通過CCK-8細胞增殖實驗和流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，確定最佳給藥時間和給藥濃度；同時觀察到樺木酸能在一定程度上拮抗氯化鎘引起的細胞凋亡。
[0010]2)體內(nèi)實驗:(1)昆明小鼠分成四組，一組空白對照組，其他三組分別為3mg/kg，10mg/kg和30mg/kg 三個劑量樺木酸組，灌胃。觀測體重變化，10天后處死小鼠，分析數(shù)據(jù)，檢測HE染色，確定樺木酸在ABC三個劑量對小鼠的毒副作用。
[0011](2)昆明小鼠分成五組，空白對照組，氯化鎘模型組和三組不同劑量樺木酸預處理組，氯化鎘采取1 mg/kg濃度腹腔注射。每天提前1小時進行灌胃處理再腹腔注射，觀測體重變化，連續(xù)10天，然后饑餓24小時，處死小鼠。HE染色，石墨原子吸收光譜，分析數(shù)據(jù)，確定樺木酸預處理對小鼠鎘中毒的保護效果。[0〇12] 結(jié)論:樺木酸在3mg/kg，10mg/kg和30mg/kg三個齊U量對小鼠沒有明顯的組織毒副作用，僅輕微減輕小鼠體重;樺木酸能減少小鼠肝、腎和睪丸中的鎘殘留量，能促進尿液中鎘的排出；能減輕鎘造成的小鼠肝腎和睪丸組織損傷。
[0013]本發(fā)明的積極進步效果在于:首次發(fā)現(xiàn)了樺木酸對機體鎘積累所致的組織損傷的保護作用；在治療機體鎘積累時，無組織毒副作用，能減少組織的鎘殘留，減少鎘所致的組織損傷，安全有效，優(yōu)于傳統(tǒng)的治療藥物，從而擴寬了其應用范圍，也為治療重金屬鎘中毒提供了新途徑。【附圖說明】
[0014]圖1不同劑量氯化鎘對TM3、293T和L0-2細胞增殖的影響圖；圖2不同劑量樺木酸對TM3、293T和L0-2細胞增殖的影響圖；圖3樺木酸、氯化鎘及樺木酸與氯化鎘同時作用對細胞凋亡的影響圖；圖4不同劑量樺木酸(BA)對小鼠體重和臟器系數(shù)的影響圖；A為不同劑量的樺木酸對小鼠體重的影響;B為不同劑量的樺木酸對小鼠睪丸臟器系數(shù)的影響；C為不同劑量的樺木酸對小鼠肝臟臟器系數(shù)的影響;D為不同劑量的樺木酸對小鼠腎臟臟器系數(shù)的影響；圖5不同劑量樺木酸對小鼠肝腎生化指標的影響圖；A為不同劑量的樺木酸對小鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響;B為不同劑量的樺木酸對小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響;C為不同劑量的樺木酸對小鼠尿素氮的影響；圖6不同劑量樺木酸對小鼠肝組織病理變化的影響；A為空白對照；B為3 mg/kg BA組;C為 10 mg/kg BA組;D為30 mg/kg BA組；圖7不同劑量樺木酸對小鼠腎組織病理變化的影響；A為空白對照；B為3 mg/kg BA組;C為 10 mg/kg BA組;D為30 mg/kg BA組；圖8不同劑量樺木酸對小鼠睪丸組織病理變化的影響；A為空白對照；B為3 mg/kg BA組;C為 10 mg/kg BA組;D為30 mg/kg BA組；圖9不同劑量樺木酸預處理對氯化鎘中毒小鼠體重與臟器系數(shù)的影響圖；A不同劑量的樺木酸預處理對鎘中毒小鼠的體重的影響 B不同劑量的樺木酸預處理對鎘中毒小鼠肝臟臟器系數(shù)的影響 C不同劑量的樺木酸預處理對鎘中毒小鼠腎臟臟器系數(shù)的影響 D不同劑量的樺木酸預處理后小鼠睪丸的直接形態(tài)大小 E不同劑量的樺木酸預處理對鎘中毒小鼠睪丸臟器系數(shù)的影響圖10不同劑量樺木酸預處理對鎘中毒小鼠肝腎睪丸組織中鎘殘留量與尿液中鎘含量的影響圖；A小鼠肝臟中錦殘留量;C小鼠睪丸中錦殘留量;B小鼠腎臟中錦殘留量;D小鼠尿液中錦含量；圖11不同劑量樺木酸預處理對鎘中毒小鼠肝組織病理變化的影響圖；圖12不同劑量樺木酸預處理對鎘中毒小鼠腎組織病理變化的影響圖；圖13不同劑量樺木酸預處理對鎘中毒小鼠睪丸組織病理變化的影響圖；圖14不同劑量樺木酸預處理對鎘中毒小鼠肝腎生化指標的影響圖?！揪唧w實施方式】
[0015]通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
[0016]本發(fā)明中，所述的樺木酸為植物白樺樹中提取的三萜類化合物，市售可得。本實驗中，昆明小鼠皆來自湖北省疾病控制中心的潔凈鼠。293T:正常腎上皮細胞、L0-2:正常肝細胞、TM3:正常睪丸間質(zhì)細胞，均來自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。樺木酸溶解于玉米油中灌胃處理，氯化鎘進行腹腔注射。樺木酸分為低中高三個劑量，氯化鎘采取低劑量注射。除特殊說明外，本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。[〇〇17]【實施例1】樺木酸對氯化鎘誘導正常細胞凋亡的影響通過CCK-8細胞增殖實驗從時間梯度和濃度梯度檢測氯化鎘對三種正常細胞TM3、293T 和L0-2細胞的活性抑制，確定急性低劑量中毒的最佳給藥劑量和作用時間，然后用這個時間梯度來選擇最佳給藥樺木酸濃度，再用樺木酸和氯化鎘聯(lián)合作用于細胞，流式檢測。 [〇〇18]1、不同劑量氯化鎘對TM3、293T和L0-2細胞增殖的影響三種正常細胞TM3、293T和L0-2細胞與不同濃度氯化鎘溶液分別孵育12h、24h和48h后 CCK-8檢測細胞活性，所得結(jié)果如圖1。從圖中可以看到，24小時，氯化鎘在10 wii/1對三種正常細胞產(chǎn)生了明顯的活性抑制，48小時時這種抑制更加明顯，由于本發(fā)明偏重于急性中毒， 因此，鎘的急性中毒模型采用氯化鎘的濃度為10 Mi/1，作用24小時。[〇〇19]2、不同劑量樺木酸對TM3、293T和L0-2細胞增殖的影響由圖2可見，不對三種正常細胞產(chǎn)生抑制作用的最大樺木酸濃度，為20mg/ml。因此，在本發(fā)明的實施例中采用這個濃度處理鎘中毒的細胞或小鼠模型。
[0020]3、樺木酸、氯化鎘及樺木酸與氯化鎘同時作用對細胞凋亡的影響細胞計數(shù)后鋪六孔板，分為空白對照組、樺木酸對照組(20mg/ml)、氯化鎘對照組(10ii m/1)，及給藥20mg/ml的樺木酸lh后，給藥1mi/1的氯化鎘組，一起孵育24小時，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。從圖3中可以看到，樺木酸幾乎不促進細胞凋亡，氯化鎘能明顯導致細胞凋亡，樺木酸和氯化鎘聯(lián)合孵育細胞，細胞凋亡情況有明顯的減輕，因此，樺木酸能拮抗氯化鎘所致的細胞凋亡。[〇〇21]【實施例2】樺木酸毒副作用的檢測四組昆明小鼠共24只每組6只，一組空白對照組，其他三組分別為3mg/kg，10mg/kg和 30mg/kg三個劑量樺木酸組，灌胃。每天記錄小鼠的體重，10天后處死小鼠，稱取臟器重量， 獲得臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=(器官重量/小鼠體重)*1〇〇〇;分析生化數(shù)據(jù)，檢測HE染色，確定樺y蜘獾明淋壺面_渰苗姐m/#中歸輕面拆姐IS氺琳畧吆回士、s
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[3300]o M / _| I r.l=Fl ~f^~r 廣 l"1r，f~/ -gfc- fi I c 1--"Tl.XH -v I /是隨著樺木酸劑量的增加，肝的門管區(qū)和中央靜脈的病變情況逐漸降低，在30mg/kg時恢復到與空白對照組接近的水平。[〇〇32]4、不同劑量樺木酸預處理對鎘中毒小鼠腎組織病理變化的影響從圖12中可以看到，氯化鎘十天處理后，腎小球和腎小管出現(xiàn)了明顯的病變，細胞排列胡亂無序，大量氧化空泡變性。但是隨著樺木酸劑量的增加，腎的腎小管和腎小球的病變情況逐漸降低，氧化空泡減少，細胞逐漸規(guī)則，在30mg/kg時恢復到與空白對照組接近的水平。 [〇〇33]5、不同劑量樺木酸預處理對鎘中毒小鼠睪丸組織病理變化的影響從圖13中可以看到，氯化鎘十天處理后，隨BA劑量增加，睪丸生殖上皮細胞的病理狀態(tài)逐漸減輕，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。
[0034]6、不同劑量樺木酸預處理對鎘中毒小鼠肝腎生化指標的影響試劑盒檢測小鼠的肝腎生化指標結(jié)果如圖14A、B、C所示，在圖中，氯化鎘能引起谷草轉(zhuǎn)氨酶，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和尿素氮的明顯上升，但是樺木酸預處理后，這種變化會降低，并且呈劑量依賴正相關(guān)。
[0035]結(jié)論:樺木酸預處理能拮抗氯化鎘所致的小鼠體重的下降，能減小氯化鎘誘導產(chǎn)生的肝、腎和睪丸組織損傷，起一定的保護作用，保護效果與劑量呈依賴正相關(guān)。能有效降低小鼠肝、腎和睪丸組織中鎘的殘留量，能增加尿液中鎘的排出量，殘留量與排出量皆與劑量呈依賴正相關(guān)。
【主權(quán)項】
1.樺木酸在制備清除機體內(nèi)鎘的藥物中的應用。2.樺木酸在制備清除機體內(nèi)鎘的保健品中的應用。3.樺木酸在制備清除機體內(nèi)鎘的食品中的應用。
【文檔編號】A23L33/00GK106074562SQ201610429009
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】楊芳, 樊榮, 羅大級, 胡鵬超, 王瑩
【申請人】武漢大學