栝樓仁二醇降低組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1表達(dá)水平的新功能的制作方法
【專利摘要】栝樓仁二醇是來自于中藥材瓜蔞子的重要活性成分。本申請(qǐng)介紹栝樓仁二醇的一種新功能，通過其對(duì)大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元的作用實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)栝樓仁二醇的加入能夠降低EZH1基因的表達(dá)水平。EZH1是造成組蛋白H3甲基化的關(guān)鍵酶，而組蛋白甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分，其變化表征神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)栝樓仁二醇做出了全局性的應(yīng)激反應(yīng)，表明栝樓仁二醇對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)具有顯著的調(diào)節(jié)作用。
【專利說明】
栝樓仁二醇降低組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1表達(dá)水平的新功能
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本申請(qǐng)屬于藥材活性成分新功能的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及于一種分離于中藥材瓜蔞 子的活性成分可降低海馬神經(jīng)元基因表達(dá)水平的新功能。
【背景技術(shù)】
[0002] 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1，即EZHl，是一種催化組蛋白H3甲基化的關(guān)鍵酶。組蛋白甲基 化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要層次，由EZHl催化產(chǎn)生的組蛋白H3第27位賴氨酸的甲基化是機(jī) 體進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的重要手段，同時(shí)也是組蛋白密碼的重要組成部分。在不同的生理病 理背景下，EZHl表達(dá)量的改變指示著目標(biāo)基因的整體改變，體現(xiàn)出機(jī)體整體上的適應(yīng)性或 損傷性變化。
[0003] 瓜萎子為萌蘆科植物栝樓Trichosanrhes kirilowii Maxim.或雙邊栝樓 Thrchosanrhes rosthornii Harms的干燥成熟種子。前者主產(chǎn)山東長(zhǎng)清、肥城等地，河北、 山西、陜西、江蘇等地均產(chǎn)。后者分布于四川、貴州、云南、廣西、廣東等地。瓜蔞子是一種重 要的中藥藥材，具有潤(rùn)肺化痰、滑腸通便之功效，常用于燥咳痰勃，腸燥便秘。瓜蔞子主要含 有油脂、留醇、三萜等成分，其中栝樓仁二醇是最早得到分離鑒定的一種三萜化合物。研究 表明，瓜蔞子在抗心腦血管疾病、抗炎癥、抗腫瘤及延緩衰老等方面都存在有益效果。但瓜 蔞子活性成分，尤其是栝樓仁二醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能作用目前尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 瓜蔞子為常用中藥材，其購(gòu)自安徽省中醫(yī)院藥房。栝樓仁二醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海生 工有限公司。
[0005] 瓜蔞子活性成分的分離過程為： 取瓜蔞子樣品20g，置于150ml平底燒瓶中，加入5%氫氧化鉀甲醇溶液100ml，稱定重 量，置75°C恒溫水浴中加熱回流3h，冷卻至室溫后加5%氫氧化鉀甲醇溶液補(bǔ)足至反應(yīng)前 的重量，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液50ml，減壓回收至干。以蒸餾水100mL溶解轉(zhuǎn)移至分液 漏斗中，以水飽和的乙酸乙酯提取4次(40 ml X 1，30 ml X 3)，合并乙酸乙酯液。乙酸 乙酯層以蒸餾水洗滌，洗至下層水液PH為中性，用適量無水硫酸鈉干燥過夜。濾過，濾液 減壓回收至干，用甲醇溶解轉(zhuǎn)移至IOml容量瓶中定容。所獲得的液體成分利用HPLC進(jìn)行分 析，并與栝樓仁二醇標(biāo)準(zhǔn)品的流出峰進(jìn)行比較。HPLC的條件為:樣品吸取2 ml進(jìn)樣，甲醇： 1111〇1/1氨水(85:15)洗脫，每21^11收集一份，收集20份后，改用甲醇 ：1111〇1/1(90:10)洗脫， 每2 min收集一份。經(jīng)比較，瓜蔞子活性成分含有栝樓仁二醇。所購(gòu)得栝樓仁二醇的分子式 為：
SI此，我們以栝樓仁二醇標(biāo)準(zhǔn)品作為研 究對(duì)象來進(jìn)行后續(xù)的神經(jīng)系統(tǒng)功能試驗(yàn)。
[0006] 栝樓仁二醇的生理活性檢測(cè)： 將出生24h內(nèi)的SD大鼠處死并取海馬組織原代培養(yǎng)。將海馬組織放在200目篩網(wǎng)上，用 眼科剪剪小塊過篩，經(jīng)過1000 rpm離心8min后倒掉上清液，加高糖DMEM培養(yǎng)基并加入10%胎 牛血清，巴氏管吹打后種6孔板。培養(yǎng)條件為37°C 5%水平的二氧化碳。每隔三天更換培養(yǎng) 基。在培養(yǎng)至第7天時(shí)，向其中三孔的原代培養(yǎng)細(xì)胞加入終濃度為50 μΜ的栝樓仁二醇，另外 三孔加入同樣體積的無菌水作為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)至14天時(shí)，回收細(xì)胞。使用本領(lǐng)域常規(guī)的 技術(shù)手段提取細(xì)胞中總mRNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用Cy Cle480(R〇Che)熒光定量PCR儀(使用 SybrGreen染料)對(duì)及K/的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。所使用的PCR條件為:95°C預(yù)變性5min， 然后是95°C 10s，60°C 10s，72°C 30s擴(kuò)增共40個(gè)循環(huán)。所使用的引物為：上游 agatgatccctgggtctgtg;下游ttccgctttcttgtcactgg。所獲得的定量數(shù)值為表達(dá)量與 內(nèi)參基因 GAPDH的相對(duì)比值。
[0007] 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所獲得的mRNA相對(duì)定量結(jié)果如圖1所示。
[0008] 從圖1中可以看出，經(jīng)過栝樓仁二醇的處理，/基因的表達(dá)量有所下降，其表達(dá) 量為對(duì)照組的0.74倍。
[0009] 本申請(qǐng)證明了瓜蔞子活性成分栝樓仁二醇對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)表觀遺傳學(xué)機(jī)制 的調(diào)控作用，該結(jié)果意味著栝樓仁二醇可以對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)施加全局性的影響，有利于進(jìn)一步 探討該活性物質(zhì)對(duì)機(jī)體情緒、學(xué)習(xí)記憶、運(yùn)動(dòng)控制等方面能力的影響。
【附圖說明】
[0010]圖1栝樓仁二醇的添加導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)EZHl mRNA表達(dá)水平的變化。
[0011 ] Control指對(duì)照組；substances ' addition指栝樓仁二醇處理組；縱坐標(biāo)為EZHl相 對(duì)GAPDH的mRNA表達(dá)水平。
[0012] 【具體實(shí)施方式】 [0013] 實(shí)施例1 栝樓仁二醇的生理活性檢測(cè)過程為： 將出生24h內(nèi)的SD大鼠處死并取海馬組織原代培養(yǎng)。將海馬組織放在200目篩網(wǎng)上，用 眼科剪剪小塊過篩，經(jīng)過1000 rpm離心8min后倒掉上清液，加高糖DMEM培養(yǎng)基并加入10%胎 牛血清，巴氏管吹打后種6孔板。培養(yǎng)條件為37°C 5%水平的二氧化碳。每隔三天更換培養(yǎng) 基。在培養(yǎng)至第7天時(shí)，向其中三孔的原代培養(yǎng)細(xì)胞加入終濃度為50 μΜ的栝樓仁二醇，另外 三孔加入同樣體積的無菌水作為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)至14天時(shí)，回收細(xì)胞。使用本領(lǐng)域常規(guī)的 技術(shù)手段提取細(xì)胞中總mRNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并使用Cy Cle480(R〇Che)熒光定量PCR儀(使用 SybrGreen染料)對(duì)及K/的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。所使用的PCR條件為:95°C預(yù)變性5min， 然后是95°C 10s，60°C 10s，72°C 30s擴(kuò)增共40個(gè)循環(huán)。所使用的引物為：上游 agatgatccctgggtctgtg;下游ttccgctttcttgtcactgg。所獲得的定量數(shù)值為表達(dá)量與 內(nèi)參基因 GAPDH的相對(duì)比值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離于瓜蔞子的活性成分，其特征在于，其分子化學(xué)本質(zhì)為栝樓仁二醇。2. -種栝樓仁二醇的新功能，其特征在于，該成分的加入可促使大鼠海馬原代培養(yǎng)神 經(jīng)元的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1基因及減量表達(dá)，與對(duì)照組相比，及的mRNA水平減少為對(duì)照 組的0.74倍。
【文檔編號(hào)】A61P25/00GK106074563SQ201610483160
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】朱玫玫