熊果酸在制備抗包蟲藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及治療包蟲病的新型藥物的發(fā)現(xiàn)研究，公開了熊果酸在制備抗包蟲藥物中的應用。本發(fā)明通過深入研究熊果酸對細粒棘球蚴的作用效果，探索其作為抗包蟲藥物新藥的應用前景。經(jīng)實驗驗證，熊果酸作用于體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴生發(fā)層細胞，對細胞活性表現(xiàn)出顯著的抑制效果；熊果酸對體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)亦有一定的損傷。熊果酸是一種高效的抗包蟲新型藥物，為治療包蟲病提供了一種新的途徑和手段。
【專利說明】
熊果酸在制備抗包蟲藥物中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種化合物的醫(yī)藥用途，具體涉及熊果酸在制備抗包蟲藥物中的應 用，屬于生物醫(yī)藥領域。
【背景技術】
[0002] 包蟲病(Echinococcosis)，又稱為棘球蝴病(Hydatid diseases)，是世界衛(wèi)生組 織公布的17種被忽視的熱帶病之一?；颊哒`食入被蟲卵污染的食物、水源或者接觸感染的 病犬等后，寄生蟲可在其體內(nèi)進一步發(fā)育，形成棘球蝴，其生長較為緩慢，主要產(chǎn)生占位性 病變。若無有效治療，患者會逐漸喪失勞動能力甚至死亡。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國包蟲病患者 高達60~70萬，受威脅人群約為達6600萬以上。包蟲病嚴重危害人民健康并給畜牧業(yè)帶來 了巨大的經(jīng)濟損失，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會《2015年衛(wèi)生計生工作要點》中提到要"繼 續(xù)實施艾滋病、結(jié)核病、瘧疾、包蟲病、麻風等重點傳染病及地方病防治規(guī)劃和行動計劃"。
[0003] 目前，手術治療是包蟲病治療的首選方法，但鑒于包蟲病的發(fā)病特點，病程長，發(fā) 現(xiàn)時大多數(shù)以為晚期，藥物治療仍然是我國廣大包蟲病患者的主要治療方法?，F(xiàn)階段臨床 治療藥物僅為阿苯達唑和甲苯達唑兩種，且受到藥物吸收差等因素的影響，治愈率僅為 30%左右?，F(xiàn)有藥物難以滿足目前包蟲病治療需求，亟待找到新的有效替代藥物和藥物靶 點，加速包蟲病藥物研發(fā)，提高藥物治療效果，減輕患者疾病負擔。
[0004]
【申請人】長期研究發(fā)現(xiàn)，具有抗癌效果的熊果酸也具有抗包蟲的效果，且該效果目 前國內(nèi)外尚未見報道。熊果酸(化學結(jié)構(gòu)式（I))是一種存在于天然植物中的三萜類化合物， 最早在果皮中發(fā)現(xiàn)，除此之外，各種香草和香料中亦有熊果酸成分。據(jù)報道，熊果酸具有多 種藥理作用，如鎮(zhèn)靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗?jié)?、降低血糖以及提高免疫力等。近年來?究發(fā)現(xiàn)，熊果酸在體外可通過抑制STAT3(信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子3,signal transducers trallscription 3)活化等途徑抑制多種腫瘤細胞的生長。
[0005]
[0006] 目前抗包蟲藥物的研究工作較為緩慢，熊果酸具有抗包蟲效果的發(fā)現(xiàn)為治療包蟲 病提供了新的思路，有望豐富包蟲病的治療手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供熊果酸的新用途，即在制藥中的新應用。
[0008] 本發(fā)明是通過深入研究熊果酸對細粒棘球蝴的作用效果，探索其作為抗包蟲藥物 新藥的應用前景。實驗結(jié)果表明，熊果酸能夠抑制細粒棘球蝴生發(fā)層細胞的生長，對原頭節(jié) 的內(nèi)部結(jié)構(gòu)亦有一定的損傷，是一種高效的抗包蟲新型藥物。
[0009] 本發(fā)明的技術方案是:本發(fā)明提供熊果酸在制備抗包蟲藥物中的應用。
[0010] 進一步地，所述熊果酸具有抑制細粒棘球蝴生發(fā)層細胞活性的功能。
[0011] 進一步地，所述熊果酸具有抑制細粒棘球蝴原頭節(jié)活性的功能。
[0012] 進一步地，所述熊果酸抑制細粒棘球蝴生發(fā)層細胞活性的有效藥物作用濃度為4μ g/ml以上。
[0013]進一步地，所述熊果酸抑制細粒棘球蝴原頭節(jié)活性的有效藥物作用濃度為40yg/ ml以上。
[0014] 進一步地，所述抗包蟲藥物含有藥學上有效量的熊果酸以及藥學上可接受的載 體。
[0015] 進一步地，所述藥物被制成任何一種藥學上可接受的劑型。
[0016] 進一步地，所述任何一種藥學上可接受的劑型包括混懸劑、乳劑、片劑、膠囊劑、顆 粒劑、口服液、注射劑等。
[0017] 本發(fā)明評價熊果酸對體外培養(yǎng)的細粒棘球蝴生發(fā)層細胞和原頭節(jié)的作用效果，步 驟如下：
[0018] 1)生發(fā)層細胞和原頭節(jié)的體外培養(yǎng)
[0019] 從繼發(fā)感染的小鼠體內(nèi)取出棘球蝴囊，分離生發(fā)層細胞。將上述生發(fā)層細胞和培 養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中，放置于5 % CO2、相對濕度為95 %的37 °C溫箱培養(yǎng)。
[0020] 在流行區(qū)采集棘球蝴囊，分離和清洗囊中的原頭節(jié)。將上述原頭節(jié)和培養(yǎng)基加入 培養(yǎng)瓶中，放置于5 % CO2、相對濕度為95 %的37 °C溫箱培養(yǎng)。
[0021] 2)熊果酸的作用效果評價
[0022]將不同濃度的熊果酸溶液(4-40μg/ml)分別加入到培養(yǎng)的生發(fā)層細胞和原頭節(jié) 中，觀察其藥物作用效果。
[0023]實驗結(jié)果表明，熊果酸濃度在8-40μg/ml的范圍內(nèi)，對細粒棘球蝴生發(fā)層細胞的活 性的抑制率高達64.68±11.22%以上。熊果酸作用濃度為40μg/ml時，造成細粒棘球蝴原頭 節(jié)的死亡率為45.95 ±5.30 %;該藥物濃度作用下，細粒棘球蝴原頭節(jié)的超微結(jié)構(gòu)亦發(fā)生一 定的改變?？梢?，熊果酸作用于體外培養(yǎng)的細粒棘球蝴生發(fā)層細胞，對細胞活性表現(xiàn)出顯著 的抑制效果；熊果酸對體外培養(yǎng)的細粒棘球蝴原頭節(jié)內(nèi)部結(jié)構(gòu)亦有一定的損傷。熊果酸具 有顯著的抑制細粒棘球蝴生發(fā)層細胞和原頭節(jié)活性的作用，具有較強的抗包蟲效果，是一 種高效的抗包蟲新型藥物，為治療包蟲病提供了一種新的途徑和手段。
【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實施例1中細粒棘球蝴生發(fā)層細胞經(jīng)熊果酸作用后光鏡觀察結(jié)果示 意圖，其中，A代表正常細胞;B代表藥物作用后細胞。
[0025] 圖2是本發(fā)明實施例2中細粒棘球蝴原頭節(jié)經(jīng)熊果酸作用后電鏡觀察結(jié)果示意圖， 其中，A代表正常原頭節(jié);B代表藥物作用后原頭節(jié)。
【具體實施方式】
[0026] 以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0027] 實施例1熊果酸對體外培養(yǎng)的細粒棘球蝴生發(fā)層細胞的作用效果評價
[0028] 1)細粒棘球蝴生發(fā)層細胞的制備
[0029]繼發(fā)棘球蝴小鼠模型的建立:在流行區(qū)采集棘球蝴囊，取出并用HBSS [0030] (Hanks Balanced Salt Solution_，Hanks平衡鹽溶液，一般用于配制細胞培養(yǎng)過 程中的培養(yǎng)基或者清洗細胞)清洗其中的原頭節(jié)。接種時將原頭節(jié)稀釋至4000只/ml備用。 用Iml注射器吸取原頭節(jié)懸液0.5ml，用75%酒精擦涂小鼠皮膚，將原頭節(jié)注入小鼠腹腔內(nèi)。 該模型建立8-10月后可用于后續(xù)實驗。
[0031] 生發(fā)層細胞的分離:剖檢上述小鼠，取出其體內(nèi)的棘球蝴囊，用生理鹽水清洗囊3-5次后將其剪碎后加入0.25 %胰酶，37°C消化10-30分鐘，離心后沉淀即為生發(fā)層細胞團。
[0032] 2)細粒棘球蝴生發(fā)層細胞的培養(yǎng)
[0033]將制備的細胞用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)密度為5 X IO4個/ml，鋪板后置于5 % CO2、相對濕度為 95 %的37 °C溫箱培養(yǎng)，每2-3天換液一次。
[0034] 3)熊果酸的藥效評價方法
[0035]將培養(yǎng)的生發(fā)層細胞調(diào)整密度為5 X IO4個/ml加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200μ1 培養(yǎng)基，分別加入待測熊果酸不同濃度的溶液（用DMSO進行稀釋），使終濃度為4、8、10、20、 40μg/ml。給藥后72小時，用CCK-8試劑盒(購自于日本Do jondo公司）測定細胞活性。
[0036] 計算該待測藥物對生發(fā)層細胞活性的抑制率:細胞活性抑制率=[(對照度吸光度 值-調(diào)零孔吸光度值)_(藥物組吸光度值-調(diào)零孔吸光度值）]/(對照度吸光度值-調(diào)零孔吸 光度值）X 1〇〇%。
[0037] 4)熊果酸對細粒棘球蝴生發(fā)層細胞的作用效果
[0038] 經(jīng)藥物作用72小時后，熊果酸濃度為8-40μg/ml時，對細粒棘球蝴可達64.68土 11.22% %以上的抑制效果，當藥物濃度降低為4μg/ml以下時，則無效(詳見表1)。在顯微鏡 下觀察發(fā)現(xiàn)，正常生發(fā)層細胞結(jié)構(gòu)清晰，有一定的透明度，貼壁生長，呈現(xiàn)圓形或者三角形； 而藥物作用后的生發(fā)層細胞顏色加深，細胞之間的連系減少，細胞有聚成團的趨勢（見圖 1)〇
[0039]表1不同濃度熊果酸對細粒棘球蝴生發(fā)層細胞的抑制作用
[0040]
[0041 ]實施例2熊果酸對體外培養(yǎng)的細粒棘球蝴原頭節(jié)的作用效果評價 [0042] 1)細粒棘球蝴原頭節(jié)的制備
[0043]棘球蝴原頭節(jié)的采集:在流行區(qū)采集棘球蝴囊，吸取含有原頭節(jié)的囊液，將此囊液 傾至容量為50ml的圓底離心管中，自然沉淀IOmin后，去上清液，隨后用生理鹽水將含原頭 節(jié)的沉淀物洗滌5-8次。在倒置顯微鏡下計數(shù)，并觀察原頭節(jié)存活狀況。
[0044] 2)細粒棘球蝴原頭節(jié)的體外培養(yǎng)
[0045]培養(yǎng)器皿可用25cm2培養(yǎng)瓶，將上述處理后的原頭節(jié)和培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中，然后 置于5%⑶2、相對濕度為95%的37°C溫箱培養(yǎng)，每4-5天換液一次。3)熊果酸的藥效評價方 法
[0046]將培養(yǎng)的原頭節(jié)加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200μ1培養(yǎng)基，分別加入待測熊果酸 不同濃度的溶液（用DMSO進行稀釋），使終濃度為4、8、10、20、40μg/ml。給藥后72小時，用美 蘭染液對原頭節(jié)進行染色，死亡的原頭節(jié)會被染成深藍色，計數(shù)進行原頭節(jié)活性計算。
[0047]原頭節(jié)活性=活的原頭節(jié)數(shù)目/原頭節(jié)總數(shù))< 100%。
[0048] 4)電鏡觀察
[0049] 將藥物作用后的原頭節(jié)用I3BS清洗2-3次，加入2.5 %的戊二醛4°C固定2小時以上。 經(jīng)過一系列的清洗、固定、包埋、切片和染色等步驟處理后，上機對樣本進行觀察。
[0050] 5)熊果酸對細粒棘球蝴原頭節(jié)的作用效果
[0051 ] 經(jīng)藥物作用72小時后，僅在40μg/ml濃度造成原頭節(jié)的死亡率為45.95±5.30%， 其余濃度未對原頭節(jié)的活性有明顯的作用效果(詳見表2)。掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，對照組正常原頭 節(jié)表皮合胞體結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)部各種細胞和囊泡排列整齊;同對照組正常原頭節(jié)相比，藥物作 用后的原頭節(jié)表面較為粗糙，合胞體結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微腫脹，內(nèi)部各種細胞和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空泡(見 圖2)。
[0052]表2不同濃度熊果酸對細粒棘球蝴原頭節(jié)活性的影響
【主權(quán)項】
1. 熊果酸在制備抗包蟲藥物中的應用。2. 如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述熊果酸具有抑制細粒棘球蝴生發(fā)層細胞 活性的功能。3. 如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述熊果酸具有抑制細粒棘球蝴原頭節(jié)活性 的功能。4. 如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述熊果酸抑制細粒棘球蝴生發(fā)層細胞活性 的有效藥物作用濃度為4yg/m 1以上。5. 如權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述熊果酸抑制細粒棘球蝴原頭節(jié)活性的有 效藥物作用濃度為40μg/ml以上。6. 如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述抗包蟲藥物含有藥學上有效量的熊果酸 以及藥學上可接受的載體。7. 如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物被制成任何一種藥學上可接受的劑 型。8. 如權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述任何一種藥學上可接受的劑型包括混懸 劑、乳劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、注射劑。
【文檔編號】A61P33/10GK106074564SQ201610517861
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】尹建海, 曹建平, 劉叢珊, 張皓冰, 沈玉娟
【申請人】中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所