葫蘆素b在制備蛋白磷酸酶2a癌性抑制因子抑制劑中的應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種從葫蘆科植物中分離提取的類四環(huán)三萜類化合物葫蘆素B作為蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑的應用。本發(fā)明中葫蘆素B作為蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑中的主要成分，能夠顯著抑制蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子表達，可單獨給藥或者聯合治療,包括與放療、化療、手術治療、其它生長因子抑制劑和性激素抑制劑，以及任何腫瘤治療藥物和方法的聯合應用。
【專利說明】
葫蘆素B在制備蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑中的應用
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種葫蘆素B在制備蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑中的應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤尤其是惡性腫瘤是威脅人類健康的一大疾病，腫瘤治療是當今人類面臨的一大醫(yī)學難題。腫瘤往往是由于癌基因發(fā)生獲得功能性突變、抑癌基因發(fā)生喪失功能性突變所引起。這些基因發(fā)生突變往往導致腫瘤細胞逃逸凋亡、對正常的抗生長信號不敏感、獲得自給自足的生長信號及無限復制的潛能、以及組織浸潤與轉移的能力，進而產生復發(fā)及藥物耐受。因此，腫瘤事實上是細胞信號傳導發(fā)生異常的疾病。針對腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用的因子尋找特異結合并抑制其活性的化合物，對腫瘤的機理研究以及治療都具有積極意義。
[0003]蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(cancerousinhibitor ofprotein phosphatase2A，CIP2A)是蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的內源性癌性抑制因子，通過抑制PP2A的蛋白磷酸酶活性，進而使癌蛋白c-Myc絲氨酸62位組成性磷酸化，穩(wěn)定c_Myc蛋白表達。同時，PP2A作為一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，在腫瘤細胞中發(fā)揮著抑癌因子的作用，作為Akt及ERK的上游因子，PP2A能夠直接去Akt及ERK的磷酸化。據報道，在很多癌癥中，PP2A活性被抑制，與癌細胞的惡性轉化密切相關。在腫瘤細胞中PP2A的活性抑制多是因為腫瘤細胞過表達CIP2A。近年來，CIP2A在包括肺癌，胃癌，乳腺癌在內的各種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中的作用被不斷發(fā)現，通過穩(wěn)定癌蛋白c-Myc功能，及活化Akt、E2F1、PLK1等因子，參與腫瘤的惡性轉化、復發(fā)及藥物耐受。據報道，在癌細胞中，通過抑制CIP2A重激活PP2A的活性能夠顯著抑制腫瘤生長及惡性轉化。因此，篩選直接靶向CIP2A的化合物，對于改善腫瘤治療療效具有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明通過從使用葫蘆素B抑制CIP2A，從而激活其底物抑癌蛋白PP2A活性以達到個體化治療目的。
[0005]本發(fā)明中葫蘆素B可以為任何藥物治療學上可接受的葫蘆素B鹽類，所形成的以葫蘆素B或其鹽為主要成分的CIP2A抑制劑可以為任何藥物治療學上可接受的劑型，葫蘆素B的使用劑量可以為任何藥物治療學上可接受的劑量。
[0006]本發(fā)明用于治療胃癌、乳腺癌、肺癌、及神經膠質瘤。，可單獨給藥或者聯合治療，包括與放療，化療，手術治療，其它生長因子抑制劑和性激素抑制劑，以及任何治療腫瘤的藥物和方法聯合應用。特別是葫蘆素B與順鉑聯合使用能夠有效治療胃癌、肺癌及神經膠質瘤。
[0007]葫蘆素B在細胞和動物荷瘤模型中顯著抑制CIP2A表達，對其它正常組織無明顯毒副作用，同時具有劑量適中，療效顯著，作用靶點明確等優(yōu)點，在臨床上具有廣泛抗癌應用前景。
【附圖說明】
[0008]圖1所示為本發(fā)明葫蘆素B對胃癌、乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤細胞及正常細胞生長的影響。
[0009]圖2所示為本發(fā)明葫蘆素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤細胞中CIP2A表達水平檢測圖。
[0010]圖3所示為本發(fā)明葫蘆素B激活胃癌、乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤細胞中CIP2A底物PP2A活性檢測圖ο
[0011]圖4所示為本發(fā)明葫蘆素B和順鉑聯合應用的協同抗胃癌、乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤細胞的作用效果對比圖。
【具體實施方式】
[0012]下面結合具體實施例進一步解釋本發(fā)明。實施例中用到的主要材料如下:
[0013]葫蘆素B:購自上海源葉生物科技有限公司，純度經高效液相色譜(HPLC)測定大于95%。使用二甲基亞楓(DMSO)配置成lOOmmol/L的儲液，凍于-20度，每次使用時用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。
[0014]細胞系:實施例中所用細胞系均購自ATCC或中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。
[0015]抗體:CIP2A，抗體購自美國Santa &1^公司沖？24，64?0!1抗體購自美國(^11SignalingTechnology公司DPP2A蛋白磷酸酶活性測定試劑盒購自美國Upstate公司。
[0016]實施例1葫蘆素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤細胞生長
[0017]分別將處于對數生長期的各種類型的癌細胞系SGC7901(胃癌)、MCF-7/Adr(乳腺癌)、NC1-H1975(肺癌)、和DBTRG(神經膠質瘤)細胞及人正常支氣管上皮細胞16-HBE，人正常胃黏膜上皮細胞GES-1接種于96孔板(每孔接種約5000個細胞，90μ1培養(yǎng)基)，培養(yǎng)(37°C，5%⑶2培養(yǎng)箱)24小時后用不同濃度梯度(10-1200nmol/L)的葫蘆素B(Cucurbitacin B,CuB)處理5種細胞。分別培養(yǎng)20和44小時后每孔加入10μ1濃度為5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。終止反應后，吸掉培養(yǎng)基，每孔加入150μ1 二甲基亞砜，低速振蕩充分溶解，然后用酶標儀測定490nm處的吸光值(0D490)。根據生長抑制率結果，計算出CuB對6種細胞24小時的半數抑制濃度(IC5q)，具體IC5q值見圖1F，結果顯示CuB可抑制多種不同類型的癌細胞的增殖(圖1A-1D)，且對正常的16-!fflE和GES-1毒性相對較小(圖1E)。
[0018]實施例2葫蘆素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤細胞的CIP2A蛋白表達。
[0019]具體實施方法如下:
[0020]分別將各種類型的癌細胞系SGC7901(胃癌)、MCF-7/Adr(乳腺癌)、NC1-H1975(肺癌)和DBTRG(神經膠質瘤)細胞按照一定的密度接種于6孔板，24小時后待細胞融合度達到80%后，分別以不同濃度的(:118處理5607901細胞(0醒01/1、251111101/1、50醒01/1、100醒01/L)，MCF-7/Adr(0nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L)，NC1-H1975 細胞(Onmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L)、DBTRG細胞(0nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/1^)，24小時后用1\503 Loading Buf fer裂解細胞提取總蛋白，以同等量的蛋白進行Western Blot免疫印跡實驗，分別用抗CIP2A和抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)抗體來進行免疫印跡，檢測加藥處理情況下它們表達的變化情況。結果如圖2所示，胃癌細胞SGC7901(圖2A)，乳腺癌細胞MCF-7/Adr(圖2B)，肺癌細胞NC1-H1975(圖2C)，以及神經膠質瘤細胞DBTRG(圖2D)中，CuB都能夠劑量依耐性地下調CIP2A蛋白的表達。
[0021]實施例3葫蘆素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤細胞中CIP2A的底物蛋白PP2A的磷酸酶活性
[0022]具體實施方法如下:
[0023]分別將各種類型的癌細胞系SGC7901(胃癌)、MCF-7/Adr(乳腺癌)、NC1-H1975(肺癌)和DBTRG(神經膠質瘤)細胞按照一定的密度接種于1cm培養(yǎng)皿，24小時后待細胞融合度達到70 % -80 %左右，分別以不同濃度的CuB處理SGC7901細胞(Onmo I/L、25nmo I/L、50nmo I /L、100nmol/L)，MCF-7/Adr(0nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L)，NC1-H1975 細胞(Onmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L)、DBTRG細胞(Onmol/L、10nmoI/L、200nmoI/L、400nmo I/L)，24小時后用RIPA裂解液裂解四種經過不同濃度的CuB處理的細胞，蛋白溶液置于-20 0C保存。各取I OOyg蛋白，分別與4yg PP2A抗體孵育，4 0C孵育1小時。在混合液中分別加入40μ1的蛋白A瓊脂糖珠(proteinA agarose beads)，4°C孵育2小時。離心收集beads，用預冷的700ylPBS洗滌3次，然后用500ylSer/ThrAssay Buffer洗滌一次。下一步，加入750臟01凡的磷肽化1108。11(^6。1^(16)30<€孵育10分鐘，期間不斷攪拌。下一步，加入10(^1的孔雀石綠磷酸檢測溶液(Malachite Green Phosphate Detect1n Solut1n)，混勾后在650nm波長下，多功能酶標儀(B1-Tek)檢測吸收值。如圖3所示可知，葫蘆素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神經膠質瘤細胞中CIP2A的底物蛋白PP2A的磷酸酶活性。實驗結果表明，隨著濃度的增加，PP2A酶活性呈現明顯上升趨勢。*表示與對照組相比有顯著差異(*，p<0.05;**，ρ<0.01)。
[0024]實施例4葫蘆素B和順鉑協同抑制胃癌、肺癌及神經膠質瘤細胞檢測實驗
[0025]將各種類型的癌細胞系SGC7901(胃癌)、MCF-7/Adr(乳腺癌)、NC1-H1975(肺癌)和DBTRG(神經膠質瘤)細胞預貼壁24小時以后，用不同濃度的CuB(0nmOl/L、25nmOl/L、50nmol/L)聯合順鉑(0ymol/L、10ymol/L、20ymol/L)處理BGC823細胞；用不同濃度的CuB(01、50醒01/1、1001111101/1)聯合順鉑01、1(^11101/1、2(^11101/1)處理從:1-!11975細胞；用不同濃度的(^1113((^1]101/1^、50111]101/1^、100111]101/1^)聯合順鉬((^1]101/1^、1(^1]101/1^、2(^1]101/1^)處理膠質瘤U251細胞，44小時后加入MTT檢測試劑再孵育4小時，然后用酶標儀測定其在490nmol/L的吸光值(0D490)。結果如圖4所示，葫蘆素B聯合順鉑處理，可明顯降低胃癌，肺癌及神經膠質瘤細胞的0D490，表現出顯著的協同效果，但是葫蘆素B聯合順鉑不能顯著降低乳腺癌的0D490。葫蘆素B和順鉑協同抑制胃癌，肺癌及神經膠質瘤細胞。
[0026]上述詳細說明是針對發(fā)明的可行實施例的具體說明，該實施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實施或變更，均應當包含于本發(fā)明的專利范圍內。
[0027]另外，本領域技術人員還可在本發(fā)明權利要求公開的范圍和精神內做其它形式和細節(jié)上的各種修改、添加和替換。當然，這些依據本發(fā)明精神所做的各種修改、添加和替換等變化，都應包含在本發(fā)明所要求保護的范圍之內。
【主權項】
1.一種蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑，其特征在于使用葫蘆素B抑制蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子。2.根據權利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑，其特征在于葫蘆素B可以為任何藥物治療學上可接受的葫蘆素B鹽類。3.根據權利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑，其特征在于葫蘆素B可以為任何藥物治療學上可接受的劑型。4.根據權利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑，其特征在于:葫蘆素B及其類似物可以為任何藥物治療學上可接受的劑量。5.根據權利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑，其特征在于用于治療胃癌及神經膠質瘤。6.根據權利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制劑，其特征在于可單獨給藥或者聯合治療，包括與放療、化療、手術治療、其它生長因子抑制劑和性激素抑制劑，以及任何腫瘤治療藥物和方法的聯合應用。7.根據權利要求6所述的聯合治療方法，其特征在于葫蘆素B可以與順鉑聯合使用。
【文檔編號】A61K31/575GK106074567SQ201610522886
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】劉瑩, 郭陽, 張亮, 劉雪文, 段超, 黃秋月
【申請人】湖北醫(yī)藥學院