自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物及其制備方法和應(yīng)用。該混合物包括多種蛋白質(zhì)和多種小分子，所述混合物的SDS?PAGE變性膠電泳包括至少30個(gè)條帶，其中在分子量大于48kD的條帶中包括明顯可見(jiàn)的7個(gè)條帶，所述7個(gè)條帶的分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD。該混合物的制備方法依次包括血漿收集、密度梯度離心、透析、一次濃縮、去高峰度蛋白、陰離子交換以及二次濃縮步驟。本發(fā)明制備的該混合物不僅可以起到增強(qiáng)記憶力的作用，還可以用于預(yù)防、改善和治療阿爾茲海默癥。
【專利說(shuō)明】
自血漿中分離出的用于増強(qiáng)記憶力的混合物及其制備方法和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種血漿分離物，具體地，涉及一種自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶 力的混合物及其制備方法和應(yīng)用，該混合物可用于預(yù)防、改善和治療阿爾茲海默癥，并具有 增強(qiáng)記憶力的作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茲海默綜合癥又叫阿爾茲海默癥，其特點(diǎn)是病人的記憶和認(rèn)知能力逐漸喪 失。病人在確診后3到9年內(nèi)死亡，占臨床死亡病例的50 %到56 %。該病病因目前的認(rèn)識(shí)是大 腦內(nèi)積累的異常折置的beta-淀粉樣蛋白和Tau蛋白導(dǎo)致了阿爾茲海默癥。
[0003] 阿爾茲海默癥目前市場(chǎng)上的藥物主要是西藥，其特征是必須長(zhǎng)期堅(jiān)持服用，然而 卻療效微小，只能緩解部分癥狀，不能控制病情的發(fā)展。長(zhǎng)期服用的另外一個(gè)缺陷是藥物副 作用大，同時(shí)病人產(chǎn)生藥物依賴性。為此市場(chǎng)上急需療效更好，副作用性更低的藥物。
[0004] 目前的最新研究表明：給年老老鼠持續(xù)注射年輕老鼠的血漿能提升年老老鼠的認(rèn) 知水平（Villeda S.A.Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.Nature Medicine 2014;20:659-663)〇為 此，血漿中可能含有某些物質(zhì)能有效的提升阿爾茲海默癥患者的認(rèn)知水平。但是，這些物質(zhì) 的具體組分、以及分離獲取方法還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種自血漿中分離出的用于增 強(qiáng)記憶力的混合物。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供上述混合物的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三在于提供上述混合物的應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0009] -種自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物，所述混合物包括多種蛋白質(zhì)和 多種小分子，所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳包括至少30個(gè)條帶，其中在分子量大于 48kD的條帶中包括：分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD和289kD 的條帶。
[0010] 在上述混合物中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述混合物的FPLC鑒定具有4個(gè)峰，對(duì) 應(yīng)的蛋白大小分別是：250kD，120kD，I OOkD和80kD。
[0011] 在上述混合物中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，通過(guò)蛋白質(zhì)譜分析，所述混合物至少含 有30個(gè)蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纖維蛋白原和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；通過(guò)小分子質(zhì)譜分析， 所述混合物還至少含有20個(gè)小分子。
[0012] 在上述混合物中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，通過(guò)蛋白質(zhì)譜分析，所述混合物所含蛋 白如下：
[0013] 血漿銅藍(lán)蛋白 I型富半胱氨酸清除受體M130 補(bǔ)體5 L-乳酸脫氫酶A鏈 附睪分泌蛋白Li51 酪氨酸蛋白激酶受體UFO 維生素 D結(jié)合蛋白 生長(zhǎng)分化因子_1] 血管緊張肽原變體 6 -磷酸葡萄糖異構(gòu)酶 Beta-2-糖蛋白〗 抗白細(xì)胞蛋白酶 蛋白AMBP 生長(zhǎng)分化因子8 生長(zhǎng)分化因子5 巢蛋白-1 N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶 可溶性富半胱氨酸清潔受體蛋白SSC5D 血清淀粉樣蛋白P 泛素-40S-核糖體蛋白S27a 脂多糖結(jié)合蛋白 層黏連蛋白亞基beta.-1 生長(zhǎng)分化因子15 超氧化物歧化酶 膜丙氨酸氨肽酶變體 鋅指蛋白688 APOLl蛋白 二肽酶 載脂蛋白D 補(bǔ)體Is亞基 肝羧酸酯酶1 尾鉚釘?shù)鞍撞迦胧荏wWRB 4-羥基苯丙酮酸加雙氧酶 磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4
[0014] 在上述混合物中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，通過(guò)小分子質(zhì)譜分析，所述混合物所含 的小分子如下： L-棕櫚酰肉堿 肌酸酐 硫胺素 己酰肉堿 L-大冬酰胺 肉堿 麥角硫因 氨基乙磺酸 甘油磷脂酰膽堿 L-酪氨酸 2-甲基丁酰肉堿 D-色氨酸 7-甲基鳥(niǎo)嘌呤 L-I丙氦酸 13Ζ-?「酰胺/BE-汴酰胺 膽堿 油酸酰胺 Γ酰肉堿 腺苷 5-氨基戊酸 脫氧鳥(niǎo)嘌呤 甜菜堿 胞嘧啶 泛酸 (3S) -3,6-二氨基己酸/(33,58)-3,5-二氨基己酸 3-甲基組氨酸
[0015] L-賴氨酸 L-脯氨酸 次黃嘌呤 L-乙酰肉堿 L-精氨酸 丙酰肉堿 L-絲氨酸 4-嘧啶甲胺/2-氛基甲革嘧啶 4-羥基脯氨酸 L-組氮酸 N-乙酰-L-丙氨酸 醋甲膽堿 L-谷氨酰胺 核糖胸核苷 焦谷氨酸 二甲基甘氨酸 吡咯烷酮羧酸 L-Alpha-氨基丁酸 N6,N6,N6-三甲基.-L-賴氮酸 L-異亮氨酸 L-犬尿氨酸 L-亮氨酸 Nl-乙酰亞精胺 N-Alpha-乙酰賴氨酸 N-甲基-L-谷氨酸 4-三甲基氨基酸 煙酰胺 乙酰膽堿 L-蘇氨酸/L-卨絲氨酸 D-谷氨酰甘氨酸 L-甲硫氨酸 （S ) -1-吡咯啉-5-羧酸/1-吡咯啉 -2-羧酸 N-乙酰鳥(niǎo)氨酸 4-胍基丁酸 2- 氧代-6-氨基Q酸 甜菜堿醛 3- 羥基-2甲基吡啶-5-羧酸 脫氧腺苷 3-羥基鄰氨基苯甲酸 D-谷氨酸 5'-甲基硫腺嘌呤 十一烷酰肉堿 L-半胱氨酸 鳥(niǎo)嘌呤
[0016] 癸酰肉堿 咪唑乙酸 谷胱甘肽 L-哌啶酸/N4-乙酰氨基r醛 腺嘌呤 N-乙酰谷氨酰胺 非對(duì)稱二甲基箱氨酸 植物鞘氨醇 η-正十五胺 吡哆醛 胍乙酸 酵母氨酸 馬氨酸 鞘氨醇 瓜氨酸 胸腺嘧啶 肌酸。
[0017] 在上述混合物中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述血漿來(lái)源于哺乳動(dòng)物;優(yōu)選地，所 述血漿來(lái)源于人。
[0018] 上述自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物的制備方法，作為一種優(yōu)選實(shí)施 方式，所述制備方法依次包括:血漿收集步驟、密度梯度離心步驟、透析步驟、一次濃縮步 驟、去高峰度蛋白步驟、陰離子交換步驟以及二次濃縮步驟。
[0019] 在上述制備方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述血漿收集步驟中，利用抗凝管 收集血液，再通過(guò)離心收集上清液，得到血漿;優(yōu)選地，所述離心轉(zhuǎn)速為500-1500g，離心時(shí) 間為10-30分鐘。
[0020] 在上述制備方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述密度梯度離心步驟中，將所述 血漿收集步驟得到的血漿與Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液混合，建立密度梯度并離 心，之后將離心管中最上層紅色部分去掉，得到密度梯度離心后產(chǎn)物，其中所述離心的條件 為:轉(zhuǎn)速為10000-30000g，時(shí)間為2-20h;優(yōu)選地，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液 的濃度為40-60%，所述Percoll溶液、Forcol溶液或蔗糖溶液與所述血漿的體積比為（10-15):(卜3) 〇
[0021] 在上述制備方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述透析步驟中，將所述密度梯度 離心后的產(chǎn)物放入透析袋或管中進(jìn)行透析，透析后收集透析袋或管中的產(chǎn)物，作為透析產(chǎn) 物;其中所述透析時(shí)使用的透析緩沖液為Tr i S-鹽酸緩沖液，磷酸緩沖液或HBS緩沖液;優(yōu)選 地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH值為7.0-9.2，所述磷酸緩沖液的濃度為 1.0-500mM、pH值為6.0-9.2，所述HBS緩沖液的濃度為0.5-500mM、pH值為6.4-8.4;更優(yōu)選 地，所述透析緩沖液為lmM、pH值為8的Tris鹽酸緩沖液;透析時(shí)間為20-72h，透析體積比是 1:100-1:10000ο
[0022] 在上述制備方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述一次濃縮步驟中，將所述透析 產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，得到一次濃縮后產(chǎn)物，其中濃縮前體積是濃縮后體積的10倍以上;優(yōu)選地， 所述濃縮是采用濃縮管離心的方式進(jìn)行的，所述濃縮管允許1.5-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述離 心時(shí)轉(zhuǎn)速為2000-4000g。
[0023] 在上述制備方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述去高峰度蛋白步驟中，采用去 高峰度蛋白試劑盒將一次濃縮后產(chǎn)物中的高峰度蛋白去掉，得到去高峰度蛋白產(chǎn)物;優(yōu)選 地，所述去高峰度蛋白試劑盒中的洗脫緩沖液對(duì)去高峰度蛋白柱子上的一次濃縮后產(chǎn)物進(jìn) 行洗脫時(shí)得到的洗脫液，為所述去高峰度蛋白產(chǎn)物;優(yōu)選地，去掉的所述高峰度蛋白的含量 是5mg/ml〇
[0024] 在上述制備方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述陰離子交換步驟中，將所述去 高峰度蛋白產(chǎn)物加到陰離子交換柱中，用含有20-500mM氯化鈉的TriS-鹽酸緩沖液進(jìn)行梯 度洗脫，當(dāng)洗脫體積為15-35ml時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為40-85ml時(shí)停止收集洗脫 液，收集得到的洗脫液為陰離子交換后產(chǎn)物;優(yōu)選地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH{t*7.0-9.2。
[0025] 在上述制備方法中，作為一種優(yōu)選實(shí)施方式，在所述二次濃縮步驟中，將所述陰離 子交換后產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，得到二次濃縮后產(chǎn)物即所述混合物，其中濃縮前體積是濃縮后體 積的10倍以上;優(yōu)選地，所屬濃縮是采用濃縮管離心的方式進(jìn)行的，所述濃縮管允許1.5-2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述離心時(shí)轉(zhuǎn)速為2000-4000g。
[0026] -種藥物組合物，包含上述混合物和藥學(xué)上可接受的載體;優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可 接受的載體為:藥學(xué)上可接受的緩沖液、蛋白質(zhì)、明膠、單糖、多糖、氨基酸、螯合劑、糖醇、聚 乙二醇、以及表面活性劑中的一種或多種。更加優(yōu)選地，所述藥物組合物包括如下組分:1倍 體積的上述混合物，9倍體積的8.5wt %NaCl或1.5M、pH7.0的I3BS;進(jìn)一步地，所述藥物組合 物中還包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺，其中，所述白蛋白在所述藥物組合物中的質(zhì)量體 積百分比為2%，所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為1%，所述谷氨酰胺 在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為3%。
[0027] -種緩釋制劑，包含上述混合物或者上述藥物組合物、以及藥學(xué)上可接受的生物 相容物質(zhì);優(yōu)選地，所述緩釋制劑的劑型為脂質(zhì)體、微球、水凝膠、微型滲透栗或微膠囊。
[0028] 上述混合物、上述藥物組合物以及上述緩釋制劑在預(yù)防、改善或/和治療記憶力減 退類疾病的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述記憶力減退類疾病為阿爾茲海默癥。
[0029] 上述混合物、上述藥物組合物以及上述緩釋制劑在增強(qiáng)記憶力藥物中的應(yīng)用。
[0030] 包含上述混合物、上述藥物組合物或者上述緩釋制劑的試劑盒。
[0031]相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0032] 1、本發(fā)明制備的該血漿組分可以用于預(yù)防、改善和治療阿爾茲海默癥，該血漿組 分經(jīng)驗(yàn)證可以延緩阿爾茲海默癥的疾病進(jìn)程并有可能逆轉(zhuǎn)阿爾茲海默癥的病理性嚴(yán)重程 度，此外其還可以起到增強(qiáng)記憶力的作用。
[0033] 2、本發(fā)明提供的從血漿中分離出的混合物可以比血漿和目前藥物更有效的提升 阿爾茲海默癥患者的認(rèn)知水平。與此同時(shí)，長(zhǎng)期服用這種血漿組分可以大大降低長(zhǎng)期服用 西藥帶來(lái)的副作用和藥物依賴。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1:雞尾酒組分1(即本發(fā)明的從血漿中分離出的混合物）制備陰離子柱層析結(jié) 果。小鼠血漿經(jīng)過(guò)密度梯度離心、透析、濃縮和去高峰度蛋白后，進(jìn)行陰離子柱層析。使用陰 離子柱SourceQ吸附蛋白，再用含500mM氯化鈉的Tris緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，得到洗脫曲線。 當(dāng)洗脫體積為35毫升時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為45毫升時(shí)停止收集洗脫液。收集的 洗脫液經(jīng)過(guò)濃縮后即為雞尾酒組分I。
[0035]圖2:雞尾酒組分ISDS-變性膠電泳鑒定結(jié)果。泳道M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);泳道1-3:雞 尾酒組分。
[0036]圖3:雞尾酒組分IFPLC鑒定結(jié)果。雞尾酒組分制備好后，其蛋白組分用FPLC檢測(cè)， 蛋白峰為紫外280nm處的吸光度。
[0037] 圖4:雞尾酒組分I促進(jìn)原代海馬細(xì)胞增值的活性圖。往原代海馬細(xì)胞的培養(yǎng)基里 分別加入雞尾酒組分I，其他血漿組分A和B，以及未處理的血漿，作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組海馬細(xì) 胞只加 DMEM培養(yǎng)基。一天后在顯微鏡下對(duì)海馬細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)目占對(duì)照 組細(xì)胞數(shù)目的比例。
[0038] 圖5:雞尾酒組分I促進(jìn)原代海馬細(xì)胞之間突觸形成的活性圖。往原代海馬細(xì)胞的 培養(yǎng)基里分別加入雞尾酒組分I，其他血漿組分A和B，以及未處理的血漿，作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照 組海馬細(xì)胞只加 DMEM培養(yǎng)基。一天后在顯微鏡下對(duì)突觸數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組突觸數(shù) 目占對(duì)照組突觸數(shù)目的比例。
[0039] 圖6:雞尾酒組分I提升阿爾茲海默癥小鼠的記憶力動(dòng)物模型數(shù)據(jù)圖。將雞尾酒組 分I系統(tǒng)地注射到阿爾茲海默癥小鼠模型中。通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)給藥對(duì)阿爾茲海默癥小 鼠記憶力的提升作用。
[0040] 圖7:不同處理后的原代海馬細(xì)胞圖。往原代海馬細(xì)胞的培養(yǎng)基里分別加入雞尾酒 組分I，其他血漿組分A和B，以及未處理的血漿，作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組海馬細(xì)胞只加 DMEM培養(yǎng) 基。一天后在顯微鏡下對(duì)海馬細(xì)胞進(jìn)行成像。圖中（a)，（b)，（c)，（d)，（e)分別是雞尾酒組分 I、其他血漿組分A、B、未處理的血漿、DMEM培養(yǎng)基（即對(duì)照組)處理后的原代海馬細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 為了更好地對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征和效果進(jìn)行說(shuō)明，下面采用【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于此。
[0042] 本發(fā)明提供的一種從血漿中分離出的混合物，所述混合物包括多種蛋白質(zhì)和多種 小分子，所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳包括至少30個(gè)條帶，其中在分子量大于48kD的 條帶中包括明顯可見(jiàn)的7個(gè)條帶，所述7個(gè)條帶的分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD， 115kD，175kD，250kD和289kD。
[0043] 所述混合物的FPLC鑒定具有4個(gè)明顯峰。所述混合物的制備過(guò)程包括如下步驟:透 析、一次濃縮、去高峰度蛋白、陰離子交換、二次濃縮。經(jīng)過(guò)以上步驟制備的混合物經(jīng)過(guò)FPLC 純化鑒定具有4個(gè)明顯的峰（詳見(jiàn)圖3)，即橫坐標(biāo)在8-18之間的4個(gè)峰，從左到右4個(gè)明顯的 峰對(duì)應(yīng)的蛋白大小分別是：250kD，120kD，IOOkD和80kD。
[0044] 通過(guò)蛋白質(zhì)譜分析，所述混合物至少含有30個(gè)蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白， 纖維蛋白原和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；通過(guò)小分子質(zhì)譜分析，所述混合物還至少含有20個(gè)小分子。
[0045] 具體地，通過(guò)蛋白質(zhì)譜(比如MS/MS)分析鑒定，所述混合物所含蛋白如下表1。
[0046] 耒1蛋白席譜?吹加 MS /MS析鑒宙潤(rùn)合物所含蛋白結(jié)里

[0049] 通過(guò)小分子質(zhì)譜分析(比如UPLC-MS/MS)鑒定，所述混合物所含的小分子如下表2。 1 表2 MS2確認(rèn)混合物中存在的小分子



[0055] 所述血漿來(lái)源于哺乳動(dòng)物，比如人、鼠等;優(yōu)選地，所述血漿來(lái)源于人。
[0056] -種上述從血漿中分離出的混合物的制備方法，該混合物是通過(guò)對(duì)血漿進(jìn)行一系 列處理后獲得的，處理步驟依次包括血漿收集、密度梯度離心、透析、一次濃縮、去高峰度蛋 白、陰離子交換以及二次濃縮步驟。具體如下：
[0057] 本發(fā)明中使用的各種培養(yǎng)基和常用試劑均采用常規(guī)方法配制，實(shí)施例中涉及的分 子生物學(xué)操作如未注明具體試驗(yàn)條件和方法，請(qǐng)參照SambrookJ等主編，科學(xué)出版社，2002， 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)或相應(yīng)產(chǎn)品的說(shuō)明書。
[0058] 在所述血漿收集步驟中，利用抗凝管收集血液，通過(guò)離心收取上清，從而獲得血 漿;優(yōu)選地，所述離心的轉(zhuǎn)速為 500_1500g(比如 510g、600g、700g、800g、900g、1000g、1100g、 1200g、1300g、1400g、1480g)，離心時(shí)間為 10-30分鐘（比如12min、15min、20min、25min、 28min)〇
[0059] 在所述密度梯度離心步驟中，將所述血漿收集步驟得到的血漿與Percoll溶液或 Ficoll溶液或蔗糖溶液混合建立密度梯度并離心，之后將離心管中最上層紅色部分去掉， 得到密度梯度離心后產(chǎn)物，其中所述離心的條件為:轉(zhuǎn)速為10000-30000g(比如10010g、 10500g、IlOOOg、12000g、13000g、14000g、15000g、16000g、17000g、18000g、19000g、20000g、 2100(^、2200(^、2300(^、2400(^、2500(^、2600(^、2700(^、2900(^)，離心時(shí)間為2-2011(比如 3111；[11、5111；[11、10111；[11、15111；[11、18111；[11);優(yōu)選地，所述?61'0011溶液或？;[0011溶液或鹿糖溶液的濃 度為40-60 % (比如41 %、45 %、50 %、52 %、55 %、58 % )，所述Perco 11溶液或Fi co 11溶液或 蔗糖溶液與所述血漿的體積比為（10-15): (1-3)(比如10.5:1、12:1、13:1、14:1、14.8:1、 10·5:2、12:2、13:2、14:2、14·8:2、10·5:3、12:3、13:3、14:3、14·8:3)。通過(guò)密度梯度離心可 以去除血漿中少量的具有較強(qiáng)的毒性的紅色色素小分子。
[0060] 不同濃度的Perco 11溶液的配制方法:先用9 (體積)份Perco 11原液(Pharmacia公 司產(chǎn)品）與1 (體積)份8.5wt %NaCl或1.5M PBS混合達(dá)到生理性滲透壓，此時(shí)得到的為100% Perco11溶液，然后用生理溶液(0.85wt %NaCl或0.15M PBS)稀釋100 %Perco11溶液到所需 濃度。
[0061 ] 不同濃度的Ficoll溶液的配制方法:先用9 (體積)份Fi co 11原液(Pharmac ia公司 產(chǎn)品）與1 (體積)份8.5wt %NaCl或1.5M PBS混合達(dá)到生理性滲透壓，此時(shí)得到的為100 % Fi co 11溶液，然后用生理溶液(0.85wt % NaCl或0.15M PBS)稀釋100 % Fi co 11溶液到所需濃 度。
[0062 ]不同濃度的鹿糖溶液的配制方法:在室溫將鹿糖固塊(Pharmac i a公司產(chǎn)品）加入 至8.5wt %NaCl或1.5M PBS溶液中至飽和，邊加邊攪拌。飽和蔗糖溶液濃度為2.3M，即為 100%蔗糖溶液。然后用生理溶液(〇.85wt%NaCl或0.15M I3BS)稀釋100%蔗糖溶液到所需 濃度。
[0063]在所述透析步驟中，將所述密度梯度離心后產(chǎn)物放入透析袋或管中進(jìn)行透析，透 析后收集透析袋或管中的產(chǎn)物，作為透析產(chǎn)物，用于之后的一次濃縮步驟，其中所述透析時(shí) 使用的透析緩沖液為0.2-200mM、pH7.0-9.2的Tris-鹽酸緩沖液（比如：0.3mM、pH7.0的 Tris-鹽酸緩沖液，lmM、pH7.0的Tris-鹽酸緩沖液，20mM、pH7.0的Tris-鹽酸緩沖液，50mM、 pH7.0的Tris-鹽酸緩沖液，10011^、？!17.0的1^8-鹽酸緩沖液，15011^、？!17.0的1^8-鹽酸緩 沖液，18011^、？!17.0的1^8-鹽酸緩沖液，19511^、？!17.0的1^8-鹽酸緩沖液，0.31111、？!18.0的 Tris-鹽酸緩沖液，lmM、pH8.0的Tris-鹽酸緩沖液，30mM、pH8.0的Tris-鹽酸緩沖液，60mM、 pH8.0的Tris-鹽酸緩沖液，90mM、pH8.0的Tris-鹽酸緩沖液，150mM、pH8.0的Tris-鹽酸緩沖 液，18OmM、pH8 · 0 的 Tr i S-鹽酸緩沖液，195mM、pH8 · 0 的Tr i s-鹽酸緩沖液，0 · 3mM、pH9 · 0 的 Tris-鹽酸緩沖液，lmM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，30mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，60mM、 pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，90mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，150mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖 液，180mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，195mM、pH9.0的Tris-鹽酸緩沖液，），1.0-500mM、 pH6.0-9.2的磷酸緩沖液（比如：1.5mM、pH6.5的磷酸緩沖液，30mM、pH6.5的磷酸緩沖液， 90mM、pH6.5的磷酸緩沖液，160mM、pH6.5的磷酸緩沖液，200mM、pH6.5的磷酸緩沖液，300mM、 pH6.5的磷酸緩沖液，400mM、pH6.5的磷酸緩沖液，460mM、pH6.5的磷酸緩沖液，490mM、pH6.5 的磷酸緩沖液，1.5mM、pH7.5的磷酸緩沖液，30mM、pH7.5的磷酸緩沖液，90mM、pH7.5的磷酸 緩沖液，160mM、pH7.5的磷酸緩沖液，200mM、pH7.5的磷酸緩沖液，300mM、pH7.5的磷酸緩沖 液，400mM、pH7.5的磷酸緩沖液，460mM、pH7.5的磷酸緩沖液，490mM、pH7.5的磷酸緩沖液， 1.5mM、pH8.5的磷酸緩沖液，30mM、pH8.5的磷酸緩沖液，90mM、pH8.5的磷酸緩沖液，160mM、 pH8.5的磷酸緩沖液，200mM、pH8.5的磷酸緩沖液，300mM、pH8.5的磷酸緩沖液，400mM、pH8.5 的磷酸緩沖液，460mM、pH8.5的磷酸緩沖液，490mM、pH8.5的磷酸緩沖液，1.5mM、pH9.0的磷 酸緩沖液，30mM、pH9.0的磷酸緩沖液，90mM、pH9.0的磷酸緩沖液，160mM、pH9.0的磷酸緩沖 液，200mM、pH9.0的磷酸緩沖液，300mM、pH9.0的磷酸緩沖液，400mM、pH9.0的磷酸緩沖液， 460mM、pH9 · 0 的磷酸緩沖液，490mM、pH9 · 0 的磷酸緩沖液）或0 · 5-500mM、pH6 · 4-8 · 4HBS 的緩 沖液（比如：lmM、pH6.5HBS的緩沖液，50mM、pH6.5HBS的緩沖液，100mM、pH6.5HBS的緩沖液， 150mM、pH6 · 5HBS的緩沖液，200mM、pH6 · 5HBS的緩沖液，250mM、pH6 · 5HBS的緩沖液，300mM、 pH6.5HBS 的緩沖液，350mM、pH6.5HBS 的緩沖液，450mM、pH6.5HBS 的緩沖液，495mM、pH6.5HBS 的緩沖液，lmM、pH7.5HBS的緩沖液，50mM、pH7.5HBS的緩沖液，100mM、pH7.5HBS的緩沖液， 150mM、pH7 · 5HBS的緩沖液，200mM、pH7 · 5HBS的緩沖液，250mM、pH7 · 5HBS的緩沖液，300mM、 pH7 · 5HBS 的緩沖液，350mM、pH7 · 5HBS 的緩沖液，450mM、pH7 · 5HBS 的緩沖液，495mM、pH7 · 5HBS 的緩沖液，150mM、pH8.2HBS的緩沖液，200mM、pH8.2HBS的緩沖液，250mM、pH8.2HBS的緩沖 液，300mM、pH8 · 2HBS的緩沖液，350mM、pH8 · 2HBS的緩沖液，450mM、pH8 · 2HBS的緩沖液， 495mM、pH8.2HBS的緩沖液）；所述透析袋或管的孔徑為0.2-0.3nm;優(yōu)選地，所述透析緩沖液 為lmM、pH = 8的Tris鹽酸緩沖液;更優(yōu)選地，所述透析的時(shí)間為20-72h(比如21h、25h、30h、 35h、40h、45h、55h、65h、7Ih)，透析體積比（即透析袋中物質(zhì)與處于透析袋外部的透析緩沖 液的體積比）是1:100-1:10000(比如1:150、1:500、1:1000、1:1500、1:2500、1:3500、1: 4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:9500)。通過(guò)透析步驟，可以去除上一步密 度梯度離心中的介質(zhì)即蔗糖、Percoll或Ficoll，以防止該介質(zhì)對(duì)下游產(chǎn)品制備產(chǎn)生不良影 響。
[0064] 在所述一次濃縮步驟中，將所述透析步驟得到的產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，得到一次濃縮后 產(chǎn)物，其中濃縮前體積是濃縮后體積的至少10倍(比如：15倍、30倍、40倍、50倍、70倍、90倍、 100倍）；所述濃縮的具體方法包括濾膜濃縮和濃縮管濃縮。優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮管 離心的方式進(jìn)行的，所述濃縮管允許1.5-2.5KD(比如1.6KD、1.8KD、1.9KD、2. OKD、2.2KD、 2.41?)的物質(zhì)通過(guò)，所述離心時(shí)轉(zhuǎn)速為2000-400(^(比如210(^、230(^、250(^、3000 8、 320(^、350(^、380(^)。該步驟的目的是讓血漿組分體積變小，從而更高效的實(shí)現(xiàn)下一步中 高峰度蛋白的去除。
[0065] 在所述去高峰度蛋白步驟中，采用去高峰度蛋白試劑盒將一次濃縮后產(chǎn)物中的高 峰度蛋白去掉，從而得到去高峰度蛋白產(chǎn)物;優(yōu)選地，所述去高峰度蛋白試劑盒中的洗脫緩 沖液對(duì)去高峰度蛋白柱子上的一次濃縮后產(chǎn)物進(jìn)行第一次洗脫時(shí)得到的洗脫液，即為所述 去高峰度蛋白產(chǎn)物。該步驟的目的是去掉血漿中含量是5mg/ml的高峰度蛋白，以防止血漿 中的有效組分無(wú)法發(fā)揮功效。
[0066] 在所述陰離子交換步驟中，將所述去高峰度蛋白產(chǎn)物加到陰離子交換柱中，用含 有氯化鈉(20_500mM)的Tri s鹽酸緩沖液(0.2-200mM，pH7.0-9.2)進(jìn)行梯度洗脫，當(dāng)洗脫體 積為15-35ml時(shí)（比如16ml、20ml、25ml、30ml、34ml)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體積為40-85ml 時(shí)（比如57ml、60ml、65ml、75ml、83ml)停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液即為陰離子交換 后產(chǎn)物。其中，含有氯化鈉（20-500mM)的Tri s鹽酸緩沖液(0 · 2-200mM，pH7 · 0-9 · 2)可以是： 含有25mM氯化鈉的lmM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有25mM氯化鈉的lmM、pH8.2的Tris鹽酸 緩沖液，含有251^氯化鈉的1禮、？!19.0的1^8鹽酸緩沖液，含有10〇1111氯化鈉的11111、？!17.2的 Tris鹽酸緩沖液，含有IOOmM氯化鈉的lmM、pH8.2的Tris鹽酸緩沖液，含有IOOmM氯化鈉的 111^、？!19.0的1^8鹽酸緩沖液，含有20〇11^氯化鈉的111^、？!17.2的1^8鹽酸緩沖液，含有 200mM氯化鈉的lmM、pH8.2的Tris鹽酸緩沖液，含有200mM氯化鈉的lmM、pH9.0的Tris鹽酸緩 沖液，含有40〇11^氯化鈉的111^、？!17.2的1^8鹽酸緩沖液，含有40〇11^氯化鈉的111^、？!18.2的 Tris鹽酸緩沖液，含有400mM氯化鈉的lmM、pH9.0的Tris鹽酸緩沖液，含有490mM氯化鈉的 111^、？!17.2的1^8鹽酸緩沖液，含有49〇11^氯化鈉的111^、？!18.2的1^8鹽酸緩沖液，含有 490mM氯化鈉的lmM、pH9.0的Tris鹽酸緩沖液，含有30mM氯化鈉的100mM、pH7.2的Tris鹽酸 緩沖液，含有150mM氯化鈉的100mM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有400mM氯化鈉的100mM、 pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有480mM氯化鈉的100mM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有30mM氯 化鈉的190mM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖液，含有150mM氯化鈉的190mM、pH7.2的Tris鹽酸緩沖 液，含有400mM氯化鈉的190mM、pH8.2的Tris鹽酸緩沖液，含有480mM氯化鈉的190mM、pH9.0 的Tris鹽酸緩沖液。該步驟的目的是去除血漿組分中帶負(fù)電荷的成分，以防止這些成分對(duì) 疾病的毒害作用，帶負(fù)電荷成分的存在幾乎會(huì)導(dǎo)致血漿組分沒(méi)有療效。收集洗脫體積為上 述范圍內(nèi)的洗脫液可以獲得療效顯著的血漿成分。
[0067] 在所述二次濃縮步驟中，將所述陰離子交換后產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，得到二次濃縮后產(chǎn) 物即所述混合物，其中濃縮前體積是濃縮后體積的至少10倍(比如：15倍、30倍、40倍、50倍、 70倍、90倍、100倍）;所述二次濃縮的具體方法包括濾膜濃縮和濃縮管濃縮。優(yōu)選地，所述濃 縮是采用濃縮管離心的方式進(jìn)行的，所述濃縮管允許1.5-2.5KD(比如1.6KD、1.8KD、1.9KD、 2.01(0、2.21(0、2.41(0)的物質(zhì)通過(guò)，所述離心時(shí)轉(zhuǎn)速為2000-400(^(比如210(^、2300 8、 250(^、300(^、320(^、350(^、380(^)。二次濃縮的目的是提高雞尾酒組分的濃度和粘度，從 而提尚單位成分的療效。
[0068] -種藥物組合物，包含上述混合物和藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的 載體可以為:藥學(xué)上可接受的各種常用緩沖液(比如磷酸鹽、檸檬酸鹽以及其他有機(jī)酸緩沖 液）、蛋白質(zhì)(如白蛋白和免疫球蛋白，其可大大提升產(chǎn)品的穩(wěn)定性）、明膠、單糖、多糖、氨基 酸、螯合劑（如EDTA)、糖醇（如甘露醇）、聚乙二醇、以及表面活性劑如TWEEN和PLURONICS中 的一種或多種。
[0069] 優(yōu)選地，所述藥物組合物包括如下組分：1倍體積的上述混合物（即二次濃縮后產(chǎn) 物），9倍體積的8.5wt % NaC 1或1.5M PBS (pH7.0)。更優(yōu)選地，所述藥物組合物中還包括白蛋 白、葡萄糖以及谷氨酰胺，其中，所述白蛋白在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為2% (w/v)，所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為l%(w/v)，所述谷氨酰胺在所 述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為3%(w/v)。
[0070] 所述藥物組合物的劑型可以是:溶液劑、注射劑、靜脈注射乳劑、糖漿劑、膠漿劑、 混懸劑、微球劑、微囊、片劑、散劑、顆粒、丸劑、凍干粉、氣霧劑、噴霧劑。
[0071] 所述藥物組合物可以按照如下方式給藥:靜脈滴注、靜脈注射、肌肉注射、腹腔注 射、肝動(dòng)脈注射、皮下包埋、鼻粘膜給藥和口服。給藥劑量是〇.〇l-lml/kg(比如:0.02ml/kg、 0·05ml/kg、0·lml/kg、0·4ml/kg、0·6ml/kg、0·8ml/kg、0·9ml/kg)。
[0072] -種緩釋制劑，包含:上述混合物或者上述藥物組合物、以及藥學(xué)上可接受的生物 相容物質(zhì);優(yōu)選地，所述緩釋制劑的劑型為脂質(zhì)體、微球、水凝膠、微型滲透栗或微膠囊。
[0073] 上述混合物、上述藥物組合物和/或上述緩釋制劑在預(yù)防、改善或/和治療記憶力 減退類疾病的藥物中的應(yīng)用;優(yōu)選地，所述記憶力減退類疾病是阿爾茲海默癥。
[0074] 上述混合物、上述藥物組合物和/或上述緩釋制劑在增強(qiáng)記憶力藥物中的應(yīng)用。
[0075] -種包含上述混合物、上述藥物組合物和/或上述緩釋制劑的試劑盒。所述試劑盒 中還可以含有陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照等。
[0076] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明混合物的制備、鑒定和應(yīng)用進(jìn)行說(shuō)明。以下實(shí)施例中使 用的原代海馬細(xì)胞是按照如下參考文獻(xiàn)培養(yǎng)的：Guo, W.，Y.Ji，et al.(2014). "Neurona 1 activity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions·〃J Cell Sci 127(Pt 10):2249-2260。
[0077] 實(shí)施例1:混合物的制備
[0078] (I)從成年小鼠采血，收集血漿
[0079] 將100只成年的C75BL/6品系的小鼠（該小鼠也可以使用其他品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物代替， 比如:BALB/cA品系的小鼠，DBA/2品系的小鼠，SD大鼠 ，Wi s tar大鼠）用20 vo 1 %的二氧化碳 (即二氧化碳含量為20vol%的氣體)麻醉，然后用采血針從小鼠眼部放血至采血管(采血管 為抗凝管）內(nèi)，邊放血邊搖晃采血管，防止血液凝固。將含有血液的采血管放入離心機(jī)，設(shè)定 轉(zhuǎn)速為l〇〇〇g，離心30分鐘。然后用移液器小心吸取上清，即為收集到的血漿。
[0080] (2)從小鼠血漿中分離出雞尾酒組分即本發(fā)明的混合物
[0081 ] (a)密度梯度離心
[0082]首先將血漿進(jìn)行密度梯度離心:往總體積為13毫升的離心管內(nèi)加入12毫升濃度為 50%的Percoll，然后再加入1毫升的小鼠血漿；將離心管放入超速離心機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為 12000g，設(shè)定溫度為4攝氏度，離心5個(gè)小時(shí)。密度梯度離心后，用移液器去除離心管中最上 層紅色部分，將離心管中剩余的血衆(zhòng)組分連同Percol 1-起進(jìn)行透析。
[0083] (b)透析
[0084]透析選用一般的透析袋，透析袋孔徑約為0.25納米。將密度梯度離心后獲得的血 漿組分連同Percoll-同加入到透析袋中，然后將透析袋放入IL的燒杯中，燒杯中透析袋外 加入IL的ImM Tris鹽酸緩沖液(pH8.0)，邊攪拌邊透析。透析溫度為4°C，透析時(shí)間為24小 時(shí)。透析結(jié)束后，將透析袋中的剩余的血漿組分作為透析產(chǎn)物，待進(jìn)行一次濃縮。
[0085] (c) 一次濃縮
[0086]將透析后的血漿組分加入到體積為2毫升的濃縮管中，濃縮管允許大小為2千道爾 頓的物質(zhì)通過(guò)。將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為3000g，設(shè)定溫度為4°C，啟動(dòng)離心機(jī)，開(kāi) 始濃縮，直到最終體積為500微升。之后，將剩余的透析后的血漿再次加入該離心管中以使 血漿組分的體積達(dá)到2mL，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積為500微升。如此循 環(huán)濃縮，直到將透析后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升。將該500微升血漿組分作為 一次濃縮產(chǎn)物，記為血漿組分A，待進(jìn)行去高峰度蛋白處理。
[0087] (d)去高峰度蛋白
[0088] 去高峰度蛋白采用BIO-RAD公司生產(chǎn)的型號(hào)為163-3006的去高峰度蛋白試劑盒， 將濃縮后獲得的500微升血漿加入到去高峰度蛋白的柱子中，然后將該柱子放到4°C的冰 箱，放置5個(gè)小時(shí)。之后往柱子中加入2毫升的沖洗緩沖液，4攝氏度離心5分鐘，離心轉(zhuǎn)速為 10000g。然后再往柱子中加入500微升的洗脫緩沖液，4°C放置30分鐘，然后4°C離心5分鐘， 離心轉(zhuǎn)速為l〇〇〇〇g，之后洗脫下來(lái)的血漿組分即為去高峰度蛋白后的血漿組分，記為血漿 組分B，將該血漿組分B待用陰離子交換柱進(jìn)一步純化。
[0089] (e)陰離子交換
[0090]將去除過(guò)高峰度蛋白后的500微升血漿組分加到陰離子交換柱Source Q中，用含 有500mM氯化鈉的Tr i s鹽酸緩沖液(200mM，pH8.0)進(jìn)行梯度洗脫，其中陰離子交換柱的填料 為Q Sepharose(購(gòu)自GE Healthcare)，平均粒度為3微米，陰離子交換柱體積為25毫升，洗 脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml。當(dāng)洗脫體積為35毫升時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體 積為45毫升時(shí)停止收集洗脫液;此部分洗脫液具有療效活性。收集的洗脫液作為陰離子交 換產(chǎn)物，待進(jìn)行二次濃縮后。參見(jiàn)圖1，其為陰離子柱層析結(jié)果，使用陰離子柱Source Q吸附 蛋白，再用氯化鈉梯度溶液洗脫，本圖為洗脫曲線。
[0091] (f)二次濃縮
[0092] 將陰離子交換后的血漿組分加入到體積為2毫升的濃縮管中，濃縮管允許大小為2 千道爾頓的物質(zhì)通過(guò)，將濃縮管放入離心機(jī)中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為3000g，設(shè)定溫度為4°C，啟動(dòng)離 心機(jī)，開(kāi)始濃縮，直到最終體積為500微升。之后，將剩余的陰離子交換后的血漿再次加入該 離心管中以使?jié)饪s罐中溶液的體積為2毫升，以相同的參數(shù)進(jìn)行離心，再次濃縮至最終體積 為500微升。如此循環(huán)濃縮，直到將陰離子交換后的血漿組分最終濃縮到體積為500微升。該 500微升的血漿組分，即為從小鼠血漿中分離得到的雞尾酒組分，將其命名為雞尾酒組分I。 [0093]實(shí)施例2:實(shí)施例1制備的雞尾酒組分ISDS-PAGE變性膠電泳鑒定
[0094] 從上述雞尾酒組分里取出2微升，在紫外280nm下測(cè)定其吸光度，從而計(jì)算雞尾酒 組分的蛋白濃度。取一定體積的雞尾酒組分，與1微升5X蛋白上樣緩沖液(購(gòu)自北京蘭博利 德生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)D621)混合，即為需要進(jìn)行電泳的樣品，該樣品里面有10微克的 蛋白質(zhì)。將電泳樣品升溫至100°c，加熱20分鐘使蛋白質(zhì)變性，然后立即將樣品放到冰上，等 待5分鐘后開(kāi)始跑SDS-PAGE變性還原膠(所述SDS變性還原膠的配制方法如下：30(w/v) %的 丙烯酰胺Acr-Bis (購(gòu)自 GE Heal thcare)取 1 · 3ml、1 · 5M TriS-鹽酸緩沖液（pH8 · 8，購(gòu)自 GE Healthcare)取 1.3ml、10(w/v)% 的SDS取0.05ml、10% (w/v)過(guò)硫酸銨（購(gòu)自 GE Healthcare)取0 · 05ml、TEMED(購(gòu)自GE Healthcare)取0 · 003ml、以及水取2 · 3ml，共計(jì)5ml， 混合后在室溫即可凝固成膠）。跑膠時(shí)，每個(gè)泳道的蛋白上樣量為10微克，設(shè)定跑膠電壓為 100V，開(kāi)始跑膠，跑膠時(shí)間為1小時(shí)。跑完膠后，用考馬斯亮藍(lán)染色液(該染色液的制備方法 為:將2.5g考馬斯亮藍(lán)R-250溶于500ml 95%乙醇溶液，加入100mL 85 %的乙酸溶液，然后， 用蒸餾水補(bǔ)充至1000ml，此染液放4°C至少6個(gè)月保持穩(wěn)定)對(duì)膠進(jìn)行染色，可以發(fā)現(xiàn)雞尾酒 組分里至少含有10條肉眼可見(jiàn)多肽（圖2)，其分子量分別為從小到大依次是31kD，56kD， 681^)，771^)，1151^)，1281^)，1651^)，1751^)，2501^)和2891^)。其中在分子量大于481^)的條帶中包 括明顯可見(jiàn)的7個(gè)條帶，所述7個(gè)條帶的分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD， 175kD，250kD和289kD。
[0095]實(shí)施例3:實(shí)施例1制備的雞尾酒組分IFPLC鑒定
[0096] 從雞尾酒組分里取出2微升，在紫外280nm下測(cè)定其吸光度，從而計(jì)算雞尾酒組分 的蛋白濃度。先用20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.0)平衡FPLC柱子(Superdex 200)，之后將 一定體積的雞尾酒組分注射到FPLC柱子中，注射的雞尾酒組分含蛋白質(zhì)300微克。然后讓雞 尾酒組分以每分鐘1毫升的速度流過(guò)FPLC柱子，發(fā)現(xiàn)雞尾酒組分里含有明顯可見(jiàn)的4個(gè)峰， 參見(jiàn)圖3,峰從左到右4個(gè)明顯的峰(橫坐標(biāo)在8-18之間的4個(gè)峰)對(duì)應(yīng)的蛋白大小分別是： 250kD，120kD，IOOkD和80kD。
[0097]實(shí)施例4:實(shí)施例1制備的雞尾酒組分I蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定
[0098]將雞尾酒組分轉(zhuǎn)移到FALCON管中，加入兩倍體積的樣品緩沖液(緩沖液的配方為： 7 · 5M尿素 UREA，1 · 5M硫脲THIOUREA，4(w/v) % 3-[ 3-(膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽 CHAPS，0.05 (w/v) %十二烷基硫酸鈉 SDS，IOOmM二硫蘇糖醇DDT，各組分前的所示濃度是其 相應(yīng)組分在緩沖液中的濃度），并通過(guò)3kDa molecular weight cut-off spin columns (Pall GmbH，Austria)離心管離心濃縮。濃縮液用二硫蘇糖醇進(jìn)行還原反應(yīng)，得到還原產(chǎn) 物;其中，濃縮液與二硫蘇糖醇的體積比為1:3,反應(yīng)時(shí)間為15分鐘，溫度為室溫。再將該還 原產(chǎn)物與碘乙酰胺進(jìn)行反應(yīng)，得到烷基化產(chǎn)物;其中，該還原產(chǎn)物與碘乙酰胺的體積比1:1， 反應(yīng)時(shí)間為15分鐘，溫度為室溫;隨后用胰蛋白酶在37°C進(jìn)行消化反應(yīng)過(guò)夜，其中烷基化產(chǎn) 物與胰蛋白酶的體積比1:1，得到消化后的肽段。胰蛋白酶消化所得肽段通過(guò)C18色譜柱純 化，得到樣品。所得樣品真空離心干燥并隨后保存在-20°C冰箱中用于MS/MS分析。MS/MS分 析具體如下：HPLC用的是Ultimate 3000系統(tǒng)，其中配備了PepMap100 C_18trap column(300 4111\51]1111)和？6。]\^。100018&11&171:;[0&1(301111]111(75以111\25〇1]1111)兩根柱子。質(zhì)譜儀米用 Amazon speed ETD，MS數(shù)據(jù)采集范圍為400-1400m/z，MS/MS的肽段處理范圍為100-2800m/ z。隨后，每個(gè)MS數(shù)據(jù)會(huì)自動(dòng)搜索與其匹配的三個(gè)質(zhì)量最好的CID MS/MS峰譜。噴嘴口電壓設(shè) 置為1400伏特。氮?dú)獗Ｗo(hù)的溫度為150°C，流速為3升/分鐘。MS的蛋白質(zhì)識(shí)別和無(wú)標(biāo)記定量 (LFQ)數(shù)據(jù)分析采用開(kāi)放源代碼軟件MaxQuantl. 3.0.5。通過(guò)搜索SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)(版本 10/2003 20354項(xiàng))對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果參見(jiàn)表1。
[0099 ]實(shí)施例5:實(shí)施例1制備的雞尾酒組分I小分子質(zhì)譜鑒定
[0100]取200微升的雞尾酒組分樣本放入玻璃瓶?jī)?nèi)，將玻璃瓶插在冰內(nèi)15分鐘。再將玻璃 瓶于通風(fēng)櫥內(nèi)用1毫升注射器向其中加入800微升甲烷/二氯甲烷混合液（甲烷與二氯甲烷 的體積比為2:1)。然后再將玻璃瓶插放回冰內(nèi)，超聲粉碎2分鐘。粉碎結(jié)束后將玻璃瓶放在 冰上靜置20-30分鐘，之后放在震蕩儀上震蕩混勻1分鐘。然后放在冰箱內(nèi)靜置5分鐘，看其 分層后再放在震蕩儀上震蕩混勻，共重復(fù)3-5次。之后室溫2000rpm離心20分鐘，離心后會(huì)分 三層，上層為代謝產(chǎn)物（用M標(biāo)注），中間為蛋白質(zhì)，下層為脂類（用LP標(biāo)注），用250微升的注 射器輕輕吸取玻璃瓶?jī)?nèi)的上層溶液至一個(gè)新的1.5毫升EP管內(nèi)；用250ul的注射器吸取玻璃 瓶?jī)?nèi)的下層溶液至另一個(gè)新的1.5毫升EP管內(nèi)。將吸出的下層液體同時(shí)放在4 °C離心機(jī)內(nèi) 13000rpm離心10分鐘，吸取上清液至新的1.5毫升EP管內(nèi)用UPLC-MS/MS高分辨液質(zhì)聯(lián)用分 析儀對(duì)小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀用于代謝產(chǎn)物的鑒定，其重 要參數(shù)如下表3,鑒定結(jié)果參見(jiàn)表2。
[0101 ] 表3 Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀鑒定參數(shù)
[0104] 實(shí)施例6:實(shí)施例1制備的雞尾酒組分I體外促使原代海馬細(xì)胞增值的活性
[0105] 從雞尾酒組分里取出2微升，在紫外280nm下測(cè)定其吸光度，從而計(jì)算雞尾酒組分 的蛋白濃度。用24孔板培養(yǎng)大鼠來(lái)源的原代海馬細(xì)胞(本發(fā)明中使用的原代海馬細(xì)胞的培 養(yǎng)方法均參照以下文獻(xiàn)中記載的方法:Guo,W.，Y.Ji，et al. (2014) ."Neuronal activity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions·〃J Cell Sci 127 (Pt 10) :2249-2260.)，培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為DMEM，培養(yǎng)條件為37°C，5vol%二氧化碳。等到細(xì) 胞密度達(dá)到每孔4X IO5個(gè)細(xì)胞時(shí)，往培養(yǎng)基里加入雞尾酒組分，每個(gè)孔中加入的雞尾酒組 分含蛋白1000微克，作為實(shí)驗(yàn)組1-雞尾酒組分。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組中還包括以下三組：即往不同孔 的培養(yǎng)基里分別加入蛋白含量為1000微克的小鼠血漿(實(shí)施例1的第（1)步制備得到的）、蛋 白含量為1000微克的血漿組分A(實(shí)施例1的第(2)步(c)中制備得到的）和蛋白含量為1000 微克的血漿組分B(實(shí)施例1的第(2)步(d)中制備得到的），分為命名為實(shí)驗(yàn)組2-小鼠血漿、 實(shí)驗(yàn)組3-血漿組分A、實(shí)驗(yàn)組4-血漿組分B。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，在對(duì)照組中，等到細(xì)胞密度達(dá) 到每孔4 X IO5個(gè)細(xì)胞時(shí)，往孔的培養(yǎng)基中添加100微升的DMEM培養(yǎng)基。之后在原先的條件下 繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，然后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算各實(shí)驗(yàn) 組細(xì)胞數(shù)目占對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的比例。參見(jiàn)圖4,可以發(fā)現(xiàn)相比血漿、血漿組分A和B而言，雞 尾酒組分可以明顯促進(jìn)原代海馬細(xì)胞的增值，細(xì)胞數(shù)目占對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目約為150%。
[0106] 實(shí)施例7:實(shí)施例1制備的雞尾酒組分I體外促使原代海馬細(xì)胞突觸形成的活性
[0107] 從雞尾酒組分里取出2微升，在紫外280nm下測(cè)定其吸光度，從而計(jì)算雞尾酒組分 的蛋白濃度。用24孔板培養(yǎng)原代海馬細(xì)胞，培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為DMEM，培養(yǎng)條件為37°C， 5vol %二氧化碳。等到細(xì)胞密度達(dá)到每孔4 X IO5個(gè)細(xì)胞時(shí)，往培養(yǎng)基里加入雞尾酒組分，每 個(gè)孔中加入的雞尾酒組分含蛋白1000微克，作為實(shí)驗(yàn)組1-雞尾酒組分。同時(shí)實(shí)驗(yàn)組中還包 括以下三組：即往不同孔的培養(yǎng)基里分別加入蛋白含量為1000微克的小鼠血漿(實(shí)施例1的 第（1)步制備得到的）、蛋白含量為1000微克的血漿組分A(實(shí)施例1的第(2)步(c)中制備得 到的）和蛋白含量為1000微克的血漿組分B(實(shí)施例1的第(2)(d)中步制備得到的），分為命 名為實(shí)驗(yàn)組2-小鼠血漿、實(shí)驗(yàn)組3-血漿組分A、實(shí)驗(yàn)組4-血漿組分B。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，在對(duì) 照組中，等到細(xì)胞密度達(dá)到每孔4 X IO5個(gè)細(xì)胞時(shí)，往孔的培養(yǎng)基中添加100微升的DMEM培養(yǎng) 基。之后在原先的條件下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，然后在光學(xué)顯微鏡下對(duì)各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 進(jìn)行突觸計(jì)數(shù)，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組突觸數(shù)目占對(duì)照組突觸數(shù)目的比例。參見(jiàn)圖5,可以發(fā)現(xiàn)相比 血漿、血漿組分A和B而言，雞尾酒組分可以明顯促進(jìn)原代海馬細(xì)胞形成突觸，突觸數(shù)目占對(duì) 照組突觸數(shù)目約為210%。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后在顯微鏡下對(duì)海馬細(xì)胞進(jìn)行成像，參見(jiàn)圖 7,從圖7中可以看出：相比血漿、血漿組分A和B而言，雞尾酒組分可以明顯促進(jìn)原代海馬細(xì) 胞的增值，突觸形成數(shù)目占對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目約為210%。
[0108] 實(shí)施例8:實(shí)施例1制備的雞尾酒組分I有效提升阿爾茲海默癥小鼠的記憶力 [0109] 本實(shí)施例米用5XFAD阿爾茲海默癥小鼠模型，訂購(gòu)于美國(guó)jackson laboratory，并 按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行繁殖和飼養(yǎng)。每一只實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蠖纪ㄟ^(guò)鼠尾進(jìn)行基因鑒定，確保 APP基因和PSl基因的穩(wěn)定突變。雞尾酒組分通過(guò)鼠尾靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，給藥組保證30 微克蛋白/次的給藥劑量，在24天內(nèi)每三天給藥1次，共給藥8次。水迷宮實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)小鼠 的學(xué)習(xí)能力和記憶力，無(wú)給藥組為20只14周齡的5XFAD雄性小鼠，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前24天接受 了8次Saline(即生理鹽水)注射，給藥組為20只14周齡5XFAD雄性小鼠，在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前24 天接受8次給藥，陰性對(duì)照組為20只14周齡的C57BL/6雄鼠，同樣接受Saline注射。
[0110]水迷宮實(shí)驗(yàn)在上午8點(diǎn)到下午1點(diǎn)間進(jìn)行。水迷宮空間記憶訓(xùn)練期為4天，每天4次， 每次訓(xùn)練間隔時(shí)間為10分鐘。在實(shí)驗(yàn)中，每四個(gè)小鼠被隨機(jī)分為一個(gè)訓(xùn)練組。對(duì)于每個(gè)訓(xùn)練 組，水迷宮的平臺(tái)位置被隨機(jī)分配，且在整個(gè)訓(xùn)練中保持不變。訓(xùn)練中，小鼠從任意位置釋 放入水迷宮中，并允許它在120秒中搜索隱藏的平臺(tái)。如果小鼠沒(méi)有在120秒內(nèi)找到平臺(tái)，它 將被引導(dǎo)到平臺(tái)。每次訓(xùn)練中找到平臺(tái)所用的時(shí)間和所經(jīng)過(guò)的距離被智能攝像頭自動(dòng)記錄 下來(lái)。水迷宮測(cè)試在最后一次訓(xùn)練48小時(shí)后進(jìn)行，每只小鼠被釋放入沒(méi)有放置平臺(tái)的水迷 宮中，并允許其自由活動(dòng)60秒。其游動(dòng)路線被智能攝像頭自動(dòng)記錄下來(lái)。測(cè)試期比訓(xùn)練期時(shí) 間短一倍，以避免小鼠產(chǎn)生抑郁行為。小鼠在目標(biāo)象限所花費(fèi)的時(shí)間與其他三個(gè)象限所花 費(fèi)的時(shí)間被記錄下來(lái)，用于對(duì)小鼠記憶力的評(píng)估。其結(jié)果參見(jiàn)圖6,從圖6中可以看出，給藥 組即注射雞尾酒組分的小鼠目標(biāo)象限所花費(fèi)的時(shí)間與正常對(duì)照組基本相同，說(shuō)明雞尾酒組 分對(duì)阿爾茲海默癥小鼠記憶力有明顯的提升作用。
[0111] 實(shí)施例9雞尾酒組分Π 的制備
[0112] 除步驟(2)_(e)不同于實(shí)施例1以外，其他制備步驟均與實(shí)施例1相同，在本實(shí)施例 中，步驟(2)_(e)具體如下：
[0113]陰離子交換：
[0114] 將去除過(guò)高峰度蛋白后的500微升血漿組分加到陰離子交換柱Source Q中，用含 有200mM氯化鈉的Tris鹽酸緩沖液(100mM，pH8.0)進(jìn)行梯度洗脫，其中陰離子交換柱的填料 為Q Sepharose(購(gòu)自GE Healthcare)，平均粒度為3微米，陰離子交換柱體積為25毫升，洗 脫速度為4ml/min，上樣速度為3ml/ml。當(dāng)洗脫體積為20毫升時(shí)開(kāi)始收集洗脫液，當(dāng)洗脫體 積為80毫升時(shí)停止收集洗脫液。收集的洗脫液作為陰離子交換產(chǎn)物，待進(jìn)行二次濃縮后。
[0115] 該實(shí)施例得到的雞尾酒組分，命名為雞尾酒組分Π 。
[0116] 實(shí)施例10雞尾酒組分III的制備
[0117] 除步驟(2)_(a)不同于實(shí)施例1以外，其他制備步驟均與實(shí)施例1相同，在本實(shí)施例 中，步驟(2)_(a)具體如下：
[0118] 密度梯度離心
[0119] 首先將血漿進(jìn)行密度梯度離心:往總體積為13毫升的離心管內(nèi)加入10毫升濃度為 40 %的蔗糖，然后再加入3毫升的小鼠血漿;將離心管放入超速離心機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為30000g， 設(shè)定溫度為4攝氏度（°C )，離心20個(gè)小時(shí)。密度梯度離心后，用移液器去除離心管中最上層 紅色部分，將離心管中剩余的血漿組分連同蔗糖一起進(jìn)行透析。
[0120] 實(shí)施例11雞尾酒組分IV的制備
[0121] 除步驟(2)_(a)不同于實(shí)施例1以外，其他制備步驟均與實(shí)施例1相同，在本實(shí)施例 中，步驟(2)_(a)具體如下：
[0122] 密度梯度離心
[0123] 首先將血漿進(jìn)行密度梯度離心:往總體積為13毫升的離心管內(nèi)加入11毫升濃度為 60 %的Ficol 1，然后再加入2毫升的小鼠血漿；將離心管放入超速離心機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為 15000g，設(shè)定溫度為4攝氏度，離心10個(gè)小時(shí)。密度梯度離心后，用移液器去除離心管中最上 層紅色部分，將離心管中剩余的血漿組分連同F(xiàn)icoll-起進(jìn)行透析。
[0124] 實(shí)施例12
[0125] 按照實(shí)施例2-5的鑒定方法分別對(duì)雞尾酒組分Π -IV進(jìn)行鑒定，雞尾酒組分Π -IV 的SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果表明，雞尾酒組分Π -IV里均含有分子量從小到大依次是31kD， 56kD，68kD，77kD，115kD，128kD，165kD，175kD，250kD和289kD的 10條肉眼可見(jiàn)多肽，且在分 子量大于48kD的7個(gè)條帶非常清晰，其分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD， 175kD，250kD和SSgkD 13FPLC鑒定結(jié)果表明，雞尾酒組分Π -IV均有蛋白大小分別是250kD、 120kD、IOOkD和80kD的峰。蛋白質(zhì)質(zhì)譜和小分子質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，雞尾酒組分Π -IV中均 含有表1和表2所不的蛋白質(zhì)和小分子。
[0126] 實(shí)施例13
[0127] 按照實(shí)施例6的方法分別檢測(cè)雞尾酒組分Π -IV體外促使原代海馬細(xì)胞增值的活 性。
[0128] 檢測(cè)結(jié)果表明，雞尾酒組分Π -IV也可以明顯促進(jìn)原代海馬細(xì)胞的增值，其中，雞 尾酒組分π組的細(xì)胞數(shù)目是對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的5倍;雞尾酒組分m組的細(xì)胞數(shù)目是對(duì)照組 細(xì)胞數(shù)目的6倍;雞尾酒組分IV組的細(xì)胞數(shù)目是對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的5.5倍。
[0129] 實(shí)施例14
[0130] 按照實(shí)施例7的方法分別檢測(cè)雞尾酒組分II-IV體外促使原代海馬細(xì)胞突觸形成 的活性。
[0131] 檢測(cè)結(jié)果表明，雞尾酒組分II-IV也可以明顯促進(jìn)原代海馬細(xì)胞的增值，其中雞尾 酒組分II組的突觸形成數(shù)目是對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的7倍;雞尾酒組分III組的突觸形成數(shù)目是 對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的6.5倍;雞尾酒組分IV組的突觸形成數(shù)目是對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目的8倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物，其特征在于，所述混合物包括多 種蛋白質(zhì)和多種小分子，所述混合物的SDS-PAGE變性膠電泳包括至少30個(gè)條帶，其中在分 子量大于48kD的條帶中包括:分子量從小到大依次是56kD，68kD，77kD，115kD，175kD，250kD 和289kD的條帶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物，其特征在于，所 述混合物的FPLC鑒定具有4個(gè)峰，對(duì)應(yīng)的蛋白大小分別是:250kD，120kD，lOOkD和80kD。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物，其特征在于，通 過(guò)蛋白質(zhì)譜分析，所述混合物至少含有30個(gè)蛋白，包括白蛋白，球蛋白，角蛋白，纖維蛋白原 和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；通過(guò)小分子質(zhì)譜分析，所述混合物還至少含有20個(gè)小分子。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物，其特征在于，通 過(guò)蛋白質(zhì)譜分析，所述混合物所含蛋白如下： 血漿銅藍(lán)蛋白 I型富半腕氮酸清除受體M130 拂體5 心乳酸脫氨酶A鏈 附睪分泌蛋白Li51 酪氨酸蛋白激酶受體UFO 維生素 D結(jié)合蛋白 生長(zhǎng)分化因子U 血管緊張膚原變體 6-憐酸葡萄糖異構(gòu)酶 Beta-2-糖蛋白I 抗白細(xì)胞蛋白酶 蛋白AMBP 生長(zhǎng)分化因子8 生長(zhǎng)分化因子5 巢靈白-1 N-石醜胞壁酸-丙氨酸醜胺酶 可溶性富半腕氨酸清潔受體蛋白SSC5D 血清淀粉樣蛋白P 泛素-40S-核髓體蛋白S27a 脂多糖結(jié)合蛋白 層黏連蛋白亞基be化-1 生長(zhǎng)分化因子15 超氧化物歧化酶 膜丙氨酸氨化酶變體 鋒指蛋白688 APOL1蛋白 二膚酶 載脂蛋白D 補(bǔ)體Is亞基 肝綾酸釀酶1 尾柳釘?shù)鞍撞迦胧荏wWRB 4-超基苯丙麗酸加觀氧酶 憐脂醜己醇胺結(jié)合蛋白4。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物，其特征在于， 通過(guò)小分子質(zhì)譜分析，所述混合物所含的小分子如下： k糕擱醜肉堿 肌酸醉 硫胺素 己脫肉堿 以巧冬醜胺 肉堿 麥角硫因 氨基己瞞酸 片油稱脂醜膽堿 以酪氯酸 2-甲基了嚇肉堿 D-色氨酸 7-甲基鳥(niǎo)嗦嶺 以苯丙氨酸 BZ-異醜胺/13E-芥醜胺 膽堿 油酸醜胺 T醜肉堿 腺巧 5-氨基戊酸 脫氧鳥(niǎo)嗎吟 甜菜堿 胞嗦晦 泛酸 (3S) -3,6-二氨基己酸僻S，5S)-3,5-二氨皋曰龍 3-甲基巧氮酸 心賴氯酸 k脯氨酸 次黃噪嶺 以乙醜肉堿 以精氨酸 丙觀肉堿 絲気酸 4-啼巧甲胺任-氨基甲基曝蠟 4-徑基脯氨酸 以組氨酸 N-石酌-L·丙氨酸 醋甲膽堿 以谷氯酣胺 核糖胸核巧 焦谷氯酸 二甲暮甘氨酸 郵咯婉麗猿酸 LAlpha-氨基T酸 N6腫6，N6-蘭甲基-以賴氨酸 心巧亮氨酸 心犬尿氨酸 L-亮氨酸 N1 -芭醜亞精胺 N-Alpha-乙醜賴氨酸 N-甲皂-L-谷氯酸 4-Ξ：甲基氨趣了酸 煙酌胺 玄醜膽喊 心蘇氯酸化-商絲氯酸 D-谷氯醜甘氯酸 L-甲疏氨酸 （S ) -1 -化咯晰-5-殷酸巧-批咯嚇 -2-錢酸 N-石醜鳥(niǎo)氨酸 4-狐基了酸 2- 氧代-6-氨暮己酸 巧菜堿酸 3- 啓基-2甲基郵巧-5-接酸 脫氧腺昔 3-駐基鄰氨基苯甲酸 D-谷氨酸 5'-甲基硫腺囑吟 l·二燒醜肉堿 心半脫氮酸 鳥(niǎo)嚷時(shí) 癸醜肉堿 咪哇乙酸 谷腕甘化 心販喧酸/N4-己醜氨基了繼 腺噪嶺 N-己醜谷氯醜胺 非對(duì)稱二甲基精氨酸 植物稍氨醇 η-正十五胺 化咳酸 狐石酸 酵母氨酸 鳥(niǎo)氯酸 觸氨醇 瓜氨酸 胸腺嚼瞎 肌酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物，其特征在于，所 述血漿來(lái)源于哺乳動(dòng)物;優(yōu)選地，所述血漿來(lái)源于人。7. -種權(quán)利要求1-6任一所述自血漿中分離出的用于增強(qiáng)記憶力的混合物的制備方 法，其特征在于，依次包括:血漿收集步驟、密度梯度離屯、步驟、透析步驟、一次濃縮步驟、去 高峰度蛋白步驟、陰離子交換步驟W及二次濃縮步驟。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述血漿收集步驟中，利用抗凝管收集血液，再通過(guò)離屯、收集上清液，得到血漿;優(yōu) 選地，所述離屯、轉(zhuǎn)速為500-1500g，離屯、時(shí)間為10-30分鐘。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述密度梯度離屯、步驟中，將所述血漿收集步驟得到的血漿與化rcoll溶液、Forcol 溶液或薦糖溶液混合，建立密度梯度并離屯、，之后將離屯、管中最上層紅色部分去掉，得到密 度梯度離屯、后產(chǎn)物，其中所述離屯、的條件為:轉(zhuǎn)速為10000-30000g，時(shí)間為2-20h;優(yōu)選地， 所述Percoll溶液、Forcol溶液或薦糖溶液的濃度為40-60%，所述化rcoll溶液、Forcol溶 液或薦糖溶液與所述血漿的體積比為(10-15): (1-3)。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述透析步驟中，將所述密度梯度離屯、后的產(chǎn)物放入透析袋或管中進(jìn)行透析，透析 后收集透析袋或管中的產(chǎn)物，作為透析產(chǎn)物;其中所述透析時(shí)使用的透析緩沖液為化is-鹽 酸緩沖液，憐酸緩沖液或皿S緩沖液;優(yōu)選地，所述化is-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH 值為7.0-9.2，所述憐酸緩沖液的濃度為1.0-500mM、pH值為6.0-9.2，所述皿S緩沖液的濃度 為0.5-500mM、pH值為6.4-8.4;更優(yōu)選地，所述透析緩沖液為lmM、pH值為8的Tris鹽酸緩沖 液;透析時(shí)間為20-7化，透析體積比是1:100-1:10000。11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述一次濃縮步驟中，將所述透析產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，得到一次濃縮后產(chǎn)物，其中濃縮前 體積是濃縮后體積的10倍W上;優(yōu)選地，所述濃縮是采用濃縮管離屯、的方式進(jìn)行的，所述濃 縮管允許1.5-2.51(0的物質(zhì)通過(guò)，所述離屯、時(shí)轉(zhuǎn)速為2000-4000邑。12. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述去高峰度蛋白步驟中，采用去高峰度蛋白試劑盒將一次濃縮后產(chǎn)物中的高峰度 蛋白去掉，得到去高峰度蛋白產(chǎn)物;優(yōu)選地，所述去高峰度蛋白試劑盒中的洗脫緩沖液對(duì)去 高峰度蛋白柱子上的一次濃縮后產(chǎn)物進(jìn)行洗脫時(shí)得到的洗脫液，為所述去高峰度蛋白產(chǎn) 物;優(yōu)選地，去掉的所述高峰度蛋白的含量是5mg/ml。13. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于， 在所述陰離子交換步驟中，將所述去高峰度蛋白產(chǎn)物加到陰離子交換柱中，用含有20- 500mM氯化鋼的化is-鹽酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，當(dāng)洗脫體積為15-35ml時(shí)開(kāi)始收集洗脫液， 當(dāng)洗脫體積為40-85ml時(shí)停止收集洗脫液，收集得到的洗脫液為陰離子交換后產(chǎn)物;優(yōu)選 地，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH值為7.0-9.2。14. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，在所述二次濃縮步驟中，將所述陰離 子交換后產(chǎn)物進(jìn)行濃縮，得到二次濃縮后產(chǎn)物即所述混合物，其中濃縮前體積是濃縮后體 積的10倍W上;優(yōu)選地，所屬濃縮是采用濃縮管離屯、的方式進(jìn)行的，所述濃縮管允許1.5- 2.5KD的物質(zhì)通過(guò)，所述離屯、時(shí)轉(zhuǎn)速為2000-4000g。15. -種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-6任一所述的混合物和藥學(xué)上可接受的載體。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體為：藥 學(xué)上可接受的緩沖液、蛋白質(zhì)、明膠、單糖、多糖、氨基酸、馨合劑、糖醇、聚乙二醇、W及表面 活性劑中的一種或多種。17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括如下組分：1 倍體積的權(quán)利要求1 -5任一所述的混合物，9倍體積的8.5wt %化Cl或1.5M、pH7. ο的PBS;優(yōu) 選地，所述藥物組合物中還包括白蛋白、葡萄糖W及谷氨酷胺，其中，所述白蛋白在所述藥 物組合物中的質(zhì)量體積百分比為2%，所述葡萄糖在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比 為1 %，所述谷氨酷胺在所述藥物組合物中的質(zhì)量體積百分比為3%。18. -種緩釋制劑，包含權(quán)利要求1-6任一所述的混合物或者權(quán)利要求15-17任一所述 的藥物組合物、W及藥學(xué)上可接受的生物相容物質(zhì)；優(yōu)選地，所述緩釋制劑的劑型為脂質(zhì) 體、微球、水凝膠、微型滲透累或微膠囊。19. 權(quán)利要求1-6任一所述的混合物、權(quán)利要求15-17任一所述的藥物組合物W及權(quán)利 要求18所述緩釋制劑在預(yù)防、改善或/和治療記憶力減退類疾病的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選地， 所述記憶力減退類疾病為阿爾茲海默癥。20. 權(quán)利要求1-6任一所述的混合物、權(quán)利要求15-17任一所述的藥物組合物W及權(quán)利 要求18所述緩釋制劑在增強(qiáng)記憶力藥物中的應(yīng)用。21. -種包含權(quán)利要求1-6任一所述的混合物、權(quán)利要求15-17任一所述的藥物組合物 或者權(quán)利要求18所述緩釋制劑的試劑盒。
【文檔編號(hào)】A61K35/16GK106074600SQ201610474296
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】崔文宏
【申請(qǐng)人】田野