混合細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種混合細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用，其中，所述混合細(xì)胞制劑包括：間充質(zhì)干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、以及溶液；在所述混合細(xì)胞制劑中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為(1～10)×105個/ml，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的濃度為(0.1～3)×106個/ml。本發(fā)明混合細(xì)胞制劑可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞再生和修復(fù)、以及抑制自身免疫反應(yīng)對胰島β細(xì)胞的損傷而治療1型糖尿病，無需胰島移植。
【專利說明】
混合細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種混合細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一類發(fā)病人數(shù)眾多，危害大，進(jìn)程緩慢的慢性疾病。其中，1型糖尿病 (TlDM)是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，在遺傳易感因素與環(huán)境因素相互作用下，體內(nèi)的免 疫調(diào)節(jié)逐漸失衡，以胰島細(xì)胞損害導(dǎo)致嚴(yán)重胰島素分泌障礙為特點，血糖持續(xù)升高為標(biāo) VI、J、O
[0003] 目前糖尿病的治療主要依賴藥物和胰島素來控制血糖，不能治愈糖尿病，患者從 發(fā)病開始就需使用藥物治療，需要終生服用降糖藥物和/或注射胰島素，費(fèi)用高昂。雖然胰 島素治療可有效緩解糖尿病癥狀，但是胰島素治療并不能徹底解決胰島辟田胞損傷的問題。
[0004] 胰島移植為治愈糖尿病提供了可能性，但由于胰島來源受限，且配型困難，手術(shù)成 功率低，治療后需要長期服用抗免疫排斥藥物，限制了此技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種混合細(xì)胞制劑，旨在通過促進(jìn)胰島細(xì)胞再生和 修復(fù)、以及抑制自身免疫反應(yīng)對胰島辟田胞的損傷而治療1型糖尿病，無需胰島移植。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種混合細(xì)胞制劑，所述混合細(xì)胞制劑包括:間充質(zhì) 干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、以及溶液;在所述混合細(xì)胞制劑中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為（1~ 10) X IO5個/ml，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的濃度為(0.1~3) X IO6個/ml。
[0007] 優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為(4~6) X IO5個/ml。
[0008] 優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0009] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的濃度為(0.5~1.5) X IO6個/ml。
[0010] 優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0011] 優(yōu)選地，所述溶液為注射液，所述注射液包括組分如下：
[0012] 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~8 %的葡萄糖；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1~2 %的NaCl;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1~2 % 的人血清白蛋白；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90~98%的水。
[0013] 優(yōu)選地，所述注射液包括組分如下：
[0014]質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的葡萄糖；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45 %的NaCl;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 %的人血清 白蛋白；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.05%的水。
[0015] 本發(fā)明還提供一種如上所述的混合細(xì)胞制劑的制備方法，包括步驟如下：
[0016] 獲取所述間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0017] 獲取所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；
[0018] 提供所述溶液，并將所述間充質(zhì)干細(xì)胞、所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞加入所述溶液中。
[0019] 優(yōu)選地，所述獲取調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的步驟，包括：
[0020]獲取外周血單個核細(xì)胞；
[0021 ]從所述外周血單個核細(xì)胞中分選出CD4+T細(xì)胞；
[0022] 從所述CD4+T細(xì)胞中分選出CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
[0023] 本發(fā)明還提供一種如上所述的混合細(xì)胞制劑在治療自身免疫性疾病的藥物上的 應(yīng)用。
[0024] 優(yōu)選地，所述自身免疫性疾病為1型糖尿病。
[0025] 本發(fā)明技術(shù)方案，通過將間充質(zhì)干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與溶液混合，而制得混合細(xì) 胞制劑，其中，該間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)胰島辟田胞再生和修復(fù)，上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而起到免 疫調(diào)節(jié)的作用;該調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性反應(yīng)，避免T細(xì)胞攻擊胰島 β細(xì)胞，因此，本發(fā)明混合細(xì)胞制劑可以有效調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減輕或消除自身免疫系統(tǒng)攻擊 胰島辟田胞，同時再生和修復(fù)受損胰島辟田胞，從而達(dá)到緩解或治療1型糖尿病的效果，甚至 可以達(dá)到接近治愈的效果。
【附圖說明】
[0026] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖示出的內(nèi)容獲得其他的附圖。
[0027] 圖IA為本發(fā)明實施例1中原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)3天后的細(xì)胞形態(tài)示意圖；
[0028] 圖IB為本發(fā)明實施例1中原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)7天后的細(xì)胞形態(tài)示意圖；
[0029] 圖2為本發(fā)明實施例1中⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的流式鑒定統(tǒng)計圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基 于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其 他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0031] 本發(fā)明提供一種混合細(xì)胞制劑，該混合細(xì)胞制劑包括原料如下：
[0032]間充質(zhì)干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、以及溶液。而且，在該混合細(xì)胞制劑中，該間充質(zhì)干 細(xì)胞的濃度為(1~10) X IO5個/ml，該調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的濃度為(0.1~3) X IO6個/ml。
[0033]本發(fā)明混合細(xì)胞制劑通過將間充質(zhì)干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與溶液混合而成，其中， 該間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)胰島辟田胞再生和修復(fù)，上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞而起到免疫調(diào)節(jié)的作 用；該調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性反應(yīng)，避免T細(xì)胞攻擊胰島β細(xì)胞，因 此，本發(fā)明混合細(xì)胞制劑可以有效調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減輕或消除自身免疫系統(tǒng)攻擊胰島辟田 胞，同時再生和修復(fù)受損胰島辟田胞，從而達(dá)到緩解或治療1型糖尿病的效果，甚至可以達(dá)到 接近治愈的效果。
[0034]需要說明的是，該間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于發(fā)育早期中胚層的具有高度自我更新能 力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，廣泛存在于臍帶、骨髓等多種組織中，可在體外培養(yǎng)擴(kuò) 增，并能在特定條件下分化成肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞 等，除此之外，間充質(zhì)干細(xì)胞還具有低免疫原性和獨特的免疫調(diào)節(jié)作用，能逃避免疫識別、 抑制免疫應(yīng)答;具體地，本發(fā)明間充質(zhì)干細(xì)胞可以來源于臍帶、骨髓、臍血、全身結(jié)締組織或 器官間質(zhì)。該調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell ,Treg)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的T 細(xì)胞亞群，Treg包括：天然型Treg(nature regulatory T cell，nTreg)即CD4+CD25+Treg、 Tr I 型 CD4+Treg、Th3 型 CD4+Treg、以及CD8+Treg;其中，CD4+CD25+Treg是Treg 亞群中的主要組 成成分，主要在胸腺中發(fā)育并經(jīng)自身抗原刺激后在胸腺內(nèi)被陽性選擇，在小鼠和正常人的 外周血及脾臟組織中，CD4+⑶25+Treg約占⑶4+T細(xì)胞的5%~10% ;此類細(xì)胞的功能特征是： 本身缺乏增殖能力，但具有天然的免疫抑制作用，可抑制CD4+或CD8+T細(xì)胞活化、增殖，并能 抑制初始T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞功能。該溶液只要滿足提供間充干細(xì)胞和調(diào)劑性T細(xì)胞存活 以及可用于人體注射的介質(zhì)即可，具體可以是注射液、培養(yǎng)基或緩沖液等等，至于溶液的用 量可根據(jù)實際需求進(jìn)行調(diào)配，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)做法，在此不做贅述。
[0035] 進(jìn)一步地，該間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為(4~6) X IO5個/ml。
[0036] 當(dāng)濃度為(4~6) X IO5個/ml時，可以為受損傷的胰島細(xì)胞提供充足的干細(xì)胞，進(jìn) 而對胰島細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)和再生，以及更好的免疫調(diào)節(jié)效果，其改善1型糖尿病的效果更加 顯著。
[0037] 進(jìn)一步地，該調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的濃度為(0.5~1.5) X IO6個/ml。
[0038]當(dāng)濃度為(0.5~1.5) X IO6個/ml時，該調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性 反應(yīng)的效果明顯，更好地減輕或消除自身免疫系統(tǒng)攻擊胰島辟田胞。
[0039] 進(jìn)一步地，該溶液為注射液，該注射液包括組分如下：
[0040] 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~8 %的葡萄糖；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1~2 %的NaCl;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1~2 % 的人血清白蛋白；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90~98%的水。
[0041 ]采用注射液作為間充質(zhì)干細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的載體，為細(xì)胞提供了良好的介質(zhì)， 保證了細(xì)胞的活性，同時便于采用注射的方式移植該混合細(xì)胞制劑，簡化移植工序。
[0042]本發(fā)明還提供一種上述混合細(xì)胞制劑的制備方法，該制備方法包括步驟如下： [0043] Sl、獲取上述間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0044] S2、獲取上述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；
[0045] S3、提供上述溶液，并將間充質(zhì)干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞加入溶液中。
[0046] 本發(fā)明混合細(xì)胞制劑的制備方法簡單、高效，只需將間充質(zhì)干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 和適量的溶液共混即可完成調(diào)配。需要說明的是，該間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過離體組織培養(yǎng) 得到，也可以通過購置商品化的間充質(zhì)干細(xì)胞得到；該調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以通過外周血分離得 到，也可以通過購置商品化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞得到。
[0047]進(jìn)一步地，該步驟S2具體包括：
[0048] S20、獲取外周血單個核細(xì)胞；
[0049] S21、從該外周血單個核細(xì)胞中分選出⑶4+T細(xì)胞；
[0050] S22、從該CD4+T細(xì)胞中分選出CD4+CD25+Treg細(xì)胞。
[0051 ]該步驟S2從CD4+T細(xì)胞中分離出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，分離純度高，分離容易。
[0052]本發(fā)明還提供一種上述混合細(xì)胞制劑在治療自身免疫性疾病的藥物上的應(yīng)用。
[0053]自身免疫性疾病是指機(jī)體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起 的疾病，例如慢性淋巴性甲狀腺炎、甲狀腺功能亢進(jìn)、1型糖尿病、重癥肌無力、慢性潰瘍性 結(jié)腸炎、惡性貧血伴慢性萎縮性胃炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、口眼干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 強(qiáng)直性脊柱炎、硬皮病、結(jié)節(jié)性多動脈炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力等。將本發(fā)明的混合細(xì) 胞制劑應(yīng)用于治療自身免疫性疾病的藥物時，間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫無能性，可以修復(fù)和 再生受損傷組織，且上調(diào)Treg而起免疫調(diào)節(jié)作用；Treg具有免疫抑制性，可以有效抑制T細(xì) 胞對自身組織的免疫攻擊。因此，該混合細(xì)胞制劑的藥物可以有效地治療自身免疫性疾病。
[0054] 現(xiàn)通過實施例對本發(fā)明混合細(xì)胞制劑及其制備方法與應(yīng)用做進(jìn)一步解釋，以詳細(xì) 說明其技術(shù)方案及帶來的技術(shù)效果。
[0055] 實施例1
[0056] 一、獲取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 [0057] (1)、原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離
[0058]人臍帶自手術(shù)臺取下后，浸入含抗生素的生理鹽水中，并在4°C下保存；
[0059]在超凈臺內(nèi)取出人臍帶，用D-PBS緩沖液沖洗凈臍動脈和臍靜脈內(nèi)的殘余血液，用 止血鉗和剪刀剔除洗凈后的上述動、靜脈血管，接著將人臍帶剪成Imm3大小的組織塊后，放 入200ml藍(lán)蓋試劑瓶中；
[0060]向藍(lán)蓋試劑瓶中加入質(zhì)量體積比為0.1 %的Π 型膠原酶30ml，將藍(lán)蓋試劑瓶置于 恒溫振蕩儀內(nèi)持續(xù)消化6h后，采用100目篩網(wǎng)過濾收集原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0061 ] (2 )、原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0062]向步驟（1)收集的原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中加入D-Hank ' s液沖洗3次，然后用含體 積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為(4.8~10) X IO3/ cm2，并接種于25cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的C〇2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后換培養(yǎng)液； [0063] (3)、原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代
[0064]當(dāng)步驟(2)中原代間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長至80 %~90 %匯合后，吸出培養(yǎng)液，用D-Hank ' s液沖洗2次，加入胰蛋白酶/EDTA混合液進(jìn)行消化；
[0065] 接著，先將培養(yǎng)瓶置于37°(：、5^^02飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2分鐘，之后取 出并輕輕叩擊培養(yǎng)瓶側(cè)壁以加速消化；
[0066] 顯微鏡下觀察分離出的細(xì)胞，待細(xì)胞浮起并由梭形變?yōu)閳A形后，立即加入胎牛血 清中止消化，收集所得細(xì)胞懸液，在室溫下以1000轉(zhuǎn)/min離心8分鐘；棄上清，用DMEM. LG/ F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1:2比例傳代，并收集傳代后的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞備用。
[0067]二、獲取調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞）
[0068] (1)、外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分離
[0069] a、用抗凝管（內(nèi)含抗凝液0.2ml)收集血液，搖勻，加入與血液等體積（I: I)的Hank' s液或PBS緩沖液稀釋血液(或者，每ImL全血中加入0.1ml肝素溶液稀釋血液，其中，肝素溶 液:生理鹽水將肝素配成125~250U/ml的無菌液，4°C保存）；
[0070] b、提供淋巴細(xì)胞分層液，并取2ml淋巴細(xì)胞分層液加入15ml的離心管中；
[0071] c、將離心管傾斜45°，用吸管吸取步驟a所得的稀釋血液，在淋巴細(xì)胞分層液面上 Icm處，沿離心管壁徐徐加入稀釋血液，使稀釋血液重疊于淋巴細(xì)胞分層液上，保持兩者界 面清晰(稀釋血液與淋巴細(xì)胞分層液體積比例約為2:1)(或者，將吸管嘴插入離心管底部， 將稀釋血液緩慢加入淋巴細(xì)胞分層液的底部）；
[0072] d、在18~20°C下，水平離心機(jī)以2000r/min離心20min，離心后，離心管中的內(nèi)容物 分為四層，上層為血漿（內(nèi)含血小板），中間層為淋巴細(xì)胞分層液，底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞， 在上、中層液體界面處可見到乳白色混濁的單個核細(xì)胞層，單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單 核細(xì)胞；
[0073] e、用毛細(xì)血管(或Iml注射器)輕輕插入單個核細(xì)胞層，沿試管壁周緣吸取單個核 細(xì)胞，移入另一離心管中；
[0074] 匕加入51111(不含0&2+、1^2+)的他1^'8液或1^111640培養(yǎng)基洗滌2次，混勻，依次以 1500r/min、1000r/min，各離心 IOmin 后吸棄上清；
[0075] g、末次離心且棄上清后，用2ml含10% (體積分?jǐn)?shù))小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，重 懸細(xì)胞形成PBMC懸液；
[0076] h、細(xì)胞計數(shù):取20ul PBMC懸液加20ul 0.4%臺盼蘭染液，3~5分鐘后取樣進(jìn)行計 數(shù)；
[0077] (2)、Treg細(xì)胞的免疫磁珠法分選
[0078]首先，將上述制備的PBMC懸液采用間接法標(biāo)記出帶有磁性的非⑶4+T細(xì)胞，同時標(biāo) 記PETD25熒光抗體，將標(biāo)記好的PBMC懸液放入磁珠自動分選儀的磁場，陰性選擇出⑶4+T細(xì) 胞；
[0079] 其次，將分選出的⑶4+T細(xì)胞(其中的⑶25+T細(xì)胞標(biāo)記有PE)加入抗PE的磁珠，使⑶4 +T細(xì)胞中的⑶25+T細(xì)胞都標(biāo)記有磁珠，然后，經(jīng)過磁珠自動分選儀的磁場陽性選擇⑶4+⑶25 +Treg細(xì)胞，陰性選擇⑶4+⑶251細(xì)胞;具體按⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞的分選試劑盒說明書進(jìn)行 操作；
[0080] 最后，收集上述流式分選的⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞，并按1:1結(jié)合⑶3/⑶28磁珠微珠種 在多孔板里，用添加10 %熱滅活血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，第2天擴(kuò)大培養(yǎng)體積并添加 IL-2， 第5、7、9、12天傳代到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶并繼續(xù)添加11^-2;密度達(dá)到（2~3)\105個細(xì)胞>1時 即可收集，且收集的每袋CD4 +CD25+Treg細(xì)胞的濃度為5 X IO5個/ml。
[0081] 三、混合細(xì)胞制劑的制備
[0082] 提供人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞I X IO7個、CD4+⑶25+Treg細(xì)胞2 X IO7個、以及溶液20ml， 其中，該溶液包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45%的NaCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的 人血清白蛋白以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.05 %的水;將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞和 溶液混合，制備成新鮮的非冷藏保存的細(xì)胞懸浮液。在該混合細(xì)胞制劑中，人臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞濃度為5 X IO5個/ml，⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞的濃度為I X IO6個/ml。
[0083] 實施例2
[0084] 一、獲取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 [0085]請參見實施例1，與實施例1相同。
[0086] 二、獲取調(diào)節(jié)性T細(xì)胞
[0087]請參見實施例1，與實施例1相同。
[0088]三、混合細(xì)胞制劑的制備
[0089] 提供人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞8\106個、0)4+0)25+1'代8細(xì)胞1\107個、以及溶液2〇1111， 其中，該溶液包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45%的NaCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的 人血清白蛋白以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.05 %的水;將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、CD4+CD25+Treg細(xì)胞和 溶液混合，制備成新鮮的非冷藏保存的細(xì)胞懸浮液。在該混合細(xì)胞制劑中，人臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞濃度為4 X IO5個/ml，⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞的濃度為0.5 X IO6個/ml。
[0090] 實施例3
[0091 ] -、獲取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 [0092]請參見實施例1，與實施例1相同。
[0093] 二、獲取調(diào)節(jié)性T細(xì)胞
[0094]請參見實施例1，與實施例1相同。
[0095]三、混合細(xì)胞制劑的制備
[0096] 提供人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞1.2 X IO7個、CD4+CD25+Treg細(xì)胞3 X IO7個、以及溶液 20ml，其中，該溶液包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45 %的NaCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%的人血清白蛋白以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.05%的水；將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、CD4+CD25+ Treg細(xì)胞和溶液混合，制備成新鮮的非冷藏保存的細(xì)胞懸浮液。在該混合細(xì)胞制劑中，人臍 帶間充質(zhì)干細(xì)胞濃度為6 X IO5個/ml，⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞的濃度為1.5 X IO6個/ml。
[0097] 驗證方法及驗證結(jié)果
[0098] 一、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)觀察
[0099] 在實施例1的原代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，采用顯微鏡進(jìn)行觀察，培養(yǎng)3 天后的細(xì)胞形態(tài)如圖IA所示，培養(yǎng)7天后的細(xì)胞形態(tài)如圖IB所示。新分離的臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞呈紡錘形，原代培養(yǎng)6h后有大量細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞呈梭形、多角形。根據(jù)圖IA和圖IB可 知，培養(yǎng)3天后細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞平行或漩渦狀排列；培養(yǎng)7天后細(xì)胞可達(dá)80 %融合;且繼 續(xù)觀察可得，傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，排列更加整齊。
[0100] 因此，本實施例1中原代培養(yǎng)的細(xì)胞具備間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)而實施例1 采用人臍帶組織培養(yǎng)的細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0101] 二、CD4+CD25+Treg細(xì)胞的流式鑒定
[0102] 1、在每個流式上樣管中加入IOOul實施例1制備的⑶4+⑶25+Treg細(xì)胞懸液，CD4+ CD25+Treg細(xì)胞數(shù)約為IxlO6個；
[0103] 2、按照細(xì)胞表面抗原染色方法標(biāo)記表面抗原(如⑶4、⑶8、⑶25等）；
[0104] 3、標(biāo)記表面抗原后的細(xì)胞用預(yù)冷的Flow Cytometry Staining Buffer或預(yù)冷的 PBS洗滌；
[0105] 4、旋渦、震蕩、重懸洗滌后的細(xì)胞，然后加入1ml的固定/破膜（Fixation/ Permeabilization Buffer)工作液，并再次旋禍混勾；
[0106] 5、避光，4°C孵育30~60分鐘；
[0107] 6、加入2ml Permeabilization Buffer工作液離心洗滌，孵育后的細(xì)胞并棄去上 清液；
[0108] 7、重復(fù)步驟5-6洗滌細(xì)胞；
[0109] 8、（可選）加入稀釋好的2%(2ul)的正常大鼠血清（用Permeabilization Buffer 工作液進(jìn)行稀釋)IOOul，在避光4°C孵育15分鐘；
[0110] 9、提供封閉液，并直接加入稀釋好的焚光標(biāo)記F0XP3抗體（用Permeabi lizat ion Buffer工作液進(jìn)行稀釋)20ul，避光4°C孵育至少30分鐘；
[0111] 10、加入2ml Permeabilization Buffer工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液；
[0112] 11、重復(fù)步驟10洗滌細(xì)胞；
[0113] 12、用適量體積的Flow Cytometry Staining Buffer重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測并分 析，檢測分析結(jié)果如圖2所示。
[0114] 根據(jù)圖2可知，經(jīng)流式細(xì)胞檢測，經(jīng)過分選的CD4 + CD25 + Treg細(xì)胞陽性率達(dá)到 94.3 %，因此，實施例1中外周血單個核細(xì)胞經(jīng)免疫磁珠法分選后得到的細(xì)胞為⑶4+⑶25+ Treg細(xì)胞。
[0115] 動物實驗
[0116] SD大鼠由四川大學(xué)實驗動物中心提供。一次性腹腔注射60mg/kg鏈脲唑菌素 (Streptozotocin，STZ) 3d后，連續(xù)3d尾靜脈檢測血糖，血糖均>16.7mmo 1/1，則糖尿病成模。 糖尿病成模后，大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組(n = 12)和混合細(xì)胞制劑移植組(n = 12);另設(shè) 正常對照組(n = 6)。糖尿病大鼠表現(xiàn)為消瘦，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，動作遲緩，毛發(fā)黃干欠光 澤，飲水量、尿量、血糖高，體重減輕。
[0117] 上述混合細(xì)胞制劑移植組共有三組，分別采用實施例1、實施例2和實施例3制備的 混合細(xì)胞制劑進(jìn)行治療，具體治療過程如下：
[0118] 1、麻醉：以1 %戊巴比妥鈉，40mg/Kg，取腹腔內(nèi)注射給藥；
[0119] 2、切口：仰臥位固定后，術(shù)區(qū)皮膚以碘酒常規(guī)消毒后，選取正中小切口，暴露門靜 脈，以8-0血管縫合線先預(yù)作一荷包，再在荷包處穿刺，以22G套管針穿刺門靜脈主干；
[0120] 3、輸注：以混合細(xì)胞制劑作移植，門靜脈內(nèi)移植輸注容積為1.5ml;退出套管針，結(jié) 扎穿刺點，檢查無活動性出血點后，逐層縫合關(guān)閉切口；
[0121 ] 4、復(fù)溫:術(shù)畢以紅外線燈照射復(fù)溫，約30分鐘；
[0122] 5、檢測：第1、2、3、6周分別于每周一注射一次混合細(xì)胞制劑，注射后測量大鼠體 重，斷尾約Icm取血測血糖(羅氏羅康全活力型血糖儀），檢測完后放單只代謝籠。
[0123] 請參照如下表1和表2,表1為混合細(xì)胞制劑移植組、糖尿病對照組和正常對照組的 大鼠血糖變化，表2為混合細(xì)胞制劑移植組、糖尿病對照組和正常對照組的大鼠體重變化。
[0124] 表1
[0126]表2
[0128] 由表1和表2可知，本發(fā)明實施例1至3中，隨著治療時間的增加，大鼠血糖不斷降 低，大鼠體重不斷增加;且相較于糖尿病對照組，大鼠血糖顯著降低，大鼠體重顯著增加，因 此，實施例1至3制備的混合細(xì)胞制劑可以有效地治療1型糖尿病;進(jìn)一步地，本發(fā)明實施例1 中，治療6周后，大鼠血糖降低至6.4+0.3mmol/L，接近正常對照組的大鼠血糖，大鼠增加至 406.8 ± 22.5g，接近正常對照組的大鼠體重，因此，本發(fā)明實施例1制備的混合細(xì)胞制劑可 以達(dá)到接近治愈1型糖尿病的效果。
[0129] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是在本 發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思下，利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效變換，或直接/間接運(yùn)用在其 他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域均包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種混合細(xì)胞制劑，其特征在于，所述混合細(xì)胞制劑包括： 間充質(zhì)干細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、以及溶液； 在所述混合細(xì)胞制劑中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為（1~10) X 1〇5個/ml，所述調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的濃度為(〇. 1~3) X 106個/ml。2. 如權(quán)利要求1所述的混合細(xì)胞制劑，其特征在于，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為(4~6) Xl〇MVml〇3. 如權(quán)利要求1或2所述的混合細(xì)胞制劑，其特征在于，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的濃度為(0.5 ~1.5) X106個/ml。4. 如權(quán)利要求3所述的混合細(xì)胞制劑，其特征在于，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為CD4+CD25+調(diào)節(jié) 性T細(xì)胞。5. 如權(quán)利要求1所述的混合細(xì)胞制劑，其特征在于，所述溶液為注射液，所述注射液包 括組分如下： 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~8%的葡萄糖； 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 1~2 %的NaCl; 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1~2%的人血清白蛋白； 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90~98 %的水。6. 如權(quán)利要求5所述的混合細(xì)胞制劑，其特征在于，所述注射液包括組分如下： 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的葡萄糖； 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇.45%的似(：1; 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 5 %的人血清白蛋白； 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.05 %的水。7. -種權(quán)利要求1至6任意一項所述的混合細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，包括步 驟如下： 獲取所述間充質(zhì)干細(xì)胞； 獲取所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 提供所述溶液，并將所述間充質(zhì)干細(xì)胞、所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞加入所述溶液中。8. 如權(quán)利要求7所述的混合細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，所述獲取調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 的步驟，包括： 獲取外周血單個核細(xì)胞； 從所述外周血單個核細(xì)胞中分選出CD4+T細(xì)胞； 從所述⑶4+T細(xì)胞中分選出⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。9. 一種權(quán)利要求1至6任意一項所述的混合細(xì)胞制劑在治療自身免疫性疾病的藥物上 的應(yīng)用。10. 如權(quán)利要求9所述的混合細(xì)胞制劑在治療自身免疫性疾病的藥物上的應(yīng)用，其特征 在于，所述自身免疫性疾病為1型糖尿病。
【文檔編號】A61P37/02GK106074602SQ201610454955
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】曾憲卓, 唐熙
【申請人】深圳愛生再生醫(yī)學(xué)科技有限公司