用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑。具體地說，本發(fā)明涉及屬于細胞治療技術領域，涉及一種用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，特別是涉及一種包括間充質干細胞特別是GD2表達呈陽性的基質細胞和KDR2表達呈陽性的造血干細胞的治療劑。進一步的，本發(fā)明涉及間充質干細胞特別是GD2表達呈陽性的基質細胞和KDR2表達呈陽性的造血干細胞二者組合在制備用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。本發(fā)明治療劑和治療方法可以有效地用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退，并有效地應用于早老癥和早衰患者。
【專利說明】
用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于細胞治療技術領域，涉及一種用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，特別是涉及一種包括GD2+基質細胞和KDR2+造血干細胞的治療劑。進一步的，本發(fā)明涉及GD2+基質細胞和KDR2+造血干細胞二者組合在制備用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。已經發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明治療劑可以有效地用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有多向分化潛能、免疫調節(jié)和自我復制等特點，日益受到人們的關注。間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，尤其對治療衰老和組織器官損傷修復有很大的臨床應用價值。
[0003]MSC在骨髓中蘊含豐富，但隨著年齡的老化，骨髓中的干細胞數目也會顯著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植給異體可能引起免疫反應，且提取干細胞過程對患者的損傷性和在采集時遇到的其他問題，都直接影響了骨髓MSC的臨床應用，使得尋找骨髓以外其他可替代的間充質干細胞來源成為一個重要的問題。
[0004]近期的研究顯示，臍帶組織和胎盤組織中也含有間充質干細胞并且能成功分離。這種組織來源的間充質干細胞不僅保持了間充質干細胞的生物學特性，而且分離出來的干細胞更原始，有更強的增殖分化能力。其免疫細胞的功能活性低，大大減低了觸發(fā)免疫反應及引起移植物抗宿主病的風險。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡單，對產婦及新生兒無任何危害及損傷。以上原因足以令臍帶間充質干細胞成為骨髓間充質干細胞的理想替代物。
[0005]造血干細胞(通?？s寫為HSC)，是指具有自我更新和多向分化能力的一類細胞。它的基本特性是具有自我更新能力，即經過一個細胞周期活動之后，可以產生兩個與分裂前性質相同的造血干細胞，同時又具有多向分化能力，即在一定的環(huán)境條件下，造血干細胞具有向各系血細胞分化的能力。
[0006]造血干細胞移植目前廣泛應用于惡性血液病(如急性白血病、慢性粒細胞白血病等)、非惡性難治性血液病(如再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征等)遺傳性疾病(先天性免疫缺陷病、地中海貧血等)和某些實體瘤治療。造血干細胞移植是指對病人進行全身照射、化療和免疫抑制預處理后，將正常供體或自體的造血干細胞經血管輸注給病人，使重建正常的造血和免疫功能。
[0007]一般來說，造血干細胞存在于三個部位，分別是骨髓、外周血和臍帶血，根據其來源分別稱之為骨髓造血干細胞、外周血造血干細胞和臍帶血造血干細胞。隨著醫(yī)學和生物技術的發(fā)展，近年來發(fā)現(xiàn)胎盤里含有大量的造血干細胞，與上述三種來源的造血干細胞相比，胎盤中所含造血干細胞的數量很高，而且移植胎盤造血干細胞的配型要求不需要很嚴格，且移植后反應較輕且不需要采用藥物。此外，作為胎盤造血干細胞來源-胎盤，來源廣泛，孕婦生產后往往成為廢棄物，其采集不會引起母親和新生兒任何不適的感覺或產生任何不良的影響。諸多優(yōu)點使胎盤造血干細胞有望取代骨髓造血干細胞、外周血造血干細胞和臍帶血造血干細胞用于造血干細胞移植中。
[0008]目前在國際血液系統(tǒng)疾病的治療中主要采取的造血干細胞移植的方法，根據細胞的來源，可分為三類:骨髓造血干細胞移植(BMT)、動員周圍血干細胞移植(MPST)和臍帶血干細胞移植(UCBT) ο前兩者干細胞來源豐富，一般有核細胞數可達5-10 X 108/Kg，⑶34+細胞(一種造血干/祖細胞的表面標記)可達1-5 XlOVKg，可是由于供者和受體之間需HLA嚴格相符，才能保證移植的成功，否則供者造血干細胞不易在病人體內植活，即使成活也會發(fā)生較嚴重的移植物抗宿主病(GVHD)。在一個家庭的子女中，僅有1/4HLA相符的機率，而在非血緣關系的無關供者中，這種機率只有百分之一，極大的限制了BMT或MPST在臨床上的廣泛應用。
[0009]近十余年來臍帶血造血干細胞移植在臨床上成功的應用促進了臍帶血造血干細胞研究的發(fā)展。臍帶血來自于胎盤，通常在婦女分娩后廢棄，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)臍帶血中含豐富的造血干細胞，其⑶34+細胞的濃度和骨髓類似，約占總細胞數的0.1-0.5 %，而更早期的造血干細胞CD34-還較骨髓濃度更高。作為一種造血細胞的來源，現(xiàn)在利用臍帶血移植手術正在逐漸增加。與BMT相比，UCBT的優(yōu)勢在于減少了嚴重的移植物抗宿主反應，有效的擴大了對于那些缺少合適的人類白細胞抗原配型家庭或者無關供體移植的可能性。臍帶血移植主要的限制在于臍血中的造血干細胞數量有限，這種限制促使臨床中需要使用2倍劑量單位的臍血，移植體重較大的成年受助人;另一種方法是進行體外造血干細胞擴增培養(yǎng)，但體外擴增需要花費時間，費用也高，更重要的是擴增的同時，造血干細胞也發(fā)生分化，臨床應用的結果表明臍血造血干細胞擴增前后對移植無多大差異。
[0010]人類足月胎盤存在大量的造血干細胞，比臍帶血有更多的造血干細胞，而且這些胎盤造血干細胞在冷凍儲存前后都可以分離出來。胎盤造血干細胞菌落形成單位(CFU)的活性是確定的，在免疫缺陷鼠中的移植實驗已經證明胎盤造血干細胞在移植中的潛力。這些結果有力地表明，人類足月胎盤有可能成為一種新型的用于移植的造血干細胞的來源。胎盤中有大量的造血干細胞，胎盤造血干細胞是較為早期的干細胞，能在體內分化成各種細胞，胎盤血內含有豐富的各種階段早期造血干細胞，其含量大約是臍帶血的十幾倍，一個胎盤中的造血干細胞可完全滿足于兩個成年人的需求，若能和臍帶血細胞一起應用于病人，無疑大大增加了造血干細胞的含量，這使造血干細胞可完全應用于所有的適用人群。
[0011]機體機能老化和臟器功能衰退較為特殊且典型的表現(xiàn)為早老癥(人們通常亦稱為早衰癥)。修復機體機能老化以及延緩臟器功能衰退是治療早老癥的必要手段。令人遺憾的是，迄今為止臨床上尚無有效的治療早老癥的方法。
[0012]因此，本領域技術人員迫切期待有一種有效的方法來治療早老癥，從而實現(xiàn)修復機體機能老化以及延緩臟器功能衰退的目的。

【發(fā)明內容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種有效的方法來延緩和治療早老癥，從而實現(xiàn)修復機體機能老化以及延緩臟器功能衰退的目的。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用間充質干細胞與造血干細胞可以有效地修復機體機能老化以及延緩臟器功能衰退，從而達到治療早老癥的目的。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。
[0014]為此，本發(fā)明一方面提供了間充質干細胞與造血干細胞組合在制備用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。
[0015]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質干細胞是GD2+基質細胞。
[0016]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的間充質干細胞。
[0017]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的⑶2+基質細胞。
[0018]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的⑶2+基質細胞，且⑶2陽性表達率大于90%，例如大于95%。
[0019]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細胞來源于:臍帶血、骨髓、胎盤血、和/或動員外周血。
[0020]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細胞是KDR2陽性表達的造血干細胞。
[0021]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細胞是KDR2陽性表達的造血干細胞，該KDR2陽性表達的造血干細胞中KDR2陽性表達率大于85%，例如大于90%。
[0022]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述造血干細胞中⑶34陽性表達率大于80%，例如大于85%。
[0023]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨密封包裝的間充質干細胞和單獨密封包裝的造血干細胞。
[0024]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動物，例如人時所述間充質干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(0.1?10) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為(0.5?5) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為(0.75?1.5) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為17個基質細胞。
[0025]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動物，例如人時所述造血干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(I?5) X 17個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 17個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為3 X 17個單個核細胞?；蛘撸谝粋€實施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動物，例如人時所述造血干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(2?10) X 15個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?5)X 15個單個核細胞，例如每公斤體重用量為(2?4) X 15個單個核細胞。
[0026]根據本發(fā)明第一方面的用途，其中所述治療劑在用于哺乳動物例如人時，先使用間充質干細胞，在I個月之后使用造血干細胞。
[0027]進一步的，本發(fā)明第二方面提供了一種用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，其呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨密封包裝的間充質干細胞和單獨密封包裝的造血干細胞。
[0028]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質干細胞是GD2+基質細胞。
[0029]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的間充質干細胞。
[0030]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的⑶2+基質細胞。
[0031]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的⑶2+基質細胞，且GD2陽性表達率大于90%，例如大于95%。
[0032]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細胞來源于:臍帶血、骨髓、胎盤血、和/或動員外周血。
[0033 ]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細胞是KDR2陽性表達的造血干細胞。
[0034]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細胞是KDR2陽性表達的造血干細胞，該KDR2陽性表達的造血干細胞中KDR2陽性表達率大于85%，例如大于90%。
[0035]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述造血干細胞中CD34陽性表達率大于80%，例如大于85 %。
[0036]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述間充質干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(0.1?10) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為(0.5?5) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為(0.75?1.5) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為17個基質細胞。
[0037]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述造血干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(I?5) X 17個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 17個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為3 X 17個單個核細胞?；蛘?，在一個實施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述造血干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(2?10) X 15個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?5)X 15個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 15個單個核細胞。
[0038]根據本發(fā)明第二方面的治療劑，其中所述治療劑在用于哺乳動物例如人時，先使用間充質干細胞，在I個月之后使用造血干細胞。
[0039]本發(fā)明所用的間充質干細胞可以使用本領域已知的方法來制備。
[0040]例如，對于通過胎盤獲得的間充質干細胞，可以參照中國專利申請?zhí)?01210292509.9中的方法獲得，例如通過該文獻方法獲得的GD2陽性表達率不低于90%的GD2+基質細胞。在一個實例中，獲得該GD2+基質細胞的方法包括以下步驟:
[0041 ] (I)胎盤組織清洗:胎盤組織是在生物安全柜內進行處理，根據胎盤大小使用適量PBS緩沖液對胎盤組織進行沖洗2-3遍，使胎盤組織表面殘留血液沖洗干凈，胎盤表面無血液凝塊；
[0042](2)胎盤組織消化處理:使用手術剪從步驟(I)得到的胎盤組織上剪下胎盤小葉，把小葉轉移到培養(yǎng)皿上，加入25ml PBS緩沖液并把胎盤小葉盡量剪碎，加入25ml 0.25%胰酶(Gibco)(胰酶跟PBS緩沖液體積比例為1:1)并混勻組織，把培養(yǎng)皿放進37°C的恒溫搖床里消化20分鐘；
[0043](3)胎盤組織過濾處理:往培養(yǎng)皿里加入5ml FBS(Gibco)并混勻以達到終止消化的目的，把消化過后的胎盤組織碎片轉移到200目金屬過濾器上，對胎盤組織碎片進行研磨并利用另一培養(yǎng)皿收集過濾完的液體，分開兩次往金屬過濾器加入1ml的PBS緩沖液清洗組織并繼續(xù)研磨，將收集的濾液轉移至50ml離心管，以速度HOOrpm離心10分鐘，去除上清液并加入I3BS緩沖液重懸細胞，以速度HOOrpm離心10分鐘，去除上清液，加入I3BS緩沖液重懸細胞，抽取小量樣本進行細胞計數，以速度1400rpm離心10分鐘以達到清洗細胞的效果；
[0044](4)配制胎盤全細胞凍存液:所述胎盤全細胞凍存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO(二甲基亞砜)和65重量份的DMEM-Fl2，配好的凍存液放在4°C冰箱保存直至使用；
[0045](5)胎盤全細胞凍存:將步驟(3)得到的胎盤組織過濾液離心后去除上清液，在4°C的低溫環(huán)境下，加入步驟(4)得到的全細胞凍存液，然后以每一管每毫升4X 17到I X 18的細胞密度加入凍存管里，此過程需在4°C的低溫條件下進行，將凍存管放入程序降溫盒里，先在4°C的溫度條件下低溫冷藏0.5小時，再-80°C的溫度條件下冷凍I天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用；
[0046]必要時，可以進一步地包括與凍存方法配套使用的復蘇方法:
[0047](6)凍存胎盤全細胞復蘇:將步驟(4)冷凍的胎盤全細胞從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養(yǎng)基(其例如包含15%FBS+1%L_Glutamine+0.05%Gentamicin+84%DMEM-F12)進行點滴法清洗胎盤全細胞，解凍獲得的細胞懸液與間充質干細胞培養(yǎng)基的體積比為1:3(lml:3ml)，將混合有間充質干細胞培養(yǎng)基的細胞懸液轉移到離心管，以速度HOOrpm離心10分鐘清洗DMSO，去除上清液，加入PBS緩沖液重懸細胞，并以I份細胞懸液比2-3份紅細胞裂解液的比例加入紅細胞裂解液(Roche)，在15-25°C的環(huán)境下培養(yǎng)10-15分鐘，放進離心機以速度HOOrpm離心10分鐘進行離心，離心后去除上清液，觀察紅細胞裂解情況，如有需要再重復紅細胞裂解的步驟進行裂解，最后加入PBS緩沖液重懸細胞并抽取小量樣本進行細胞計數，放進離心機以速度1400rpm離心10分鐘進行離心以清洗細胞，去除上清液；
[0048]必要時，可以進一步地包括復蘇后間充質干細胞分離和擴增的方法:
[0049](7)細胞培養(yǎng):向步驟(6)得到的全細胞中補加適量的間充質干細胞培養(yǎng)基重懸細胞，轉移到T25培養(yǎng)瓶，再將T25培養(yǎng)瓶放進C02濃度為5%的37°C培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天時將T25培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進行第一次半換液，繼續(xù)培養(yǎng)，在第9天時將T25培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，進行第二次半換液，在第12天把平皿里面的培養(yǎng)基抽走，加入15ml間充質干細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，往后每2天進行一次全換液；
[0050](8)細胞傳代:當T25培養(yǎng)瓶里面的貼壁細胞融合率達到80%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)將貼壁細胞脫離T25培養(yǎng)瓶底部，離心后移除上清液，并加入間充質干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，接種于T25細胞培養(yǎng)瓶進行傳代，并進行擴增培養(yǎng);此后每兩天換液一次直至融合率達到80 %后，即得，必要時再進行傳代。
[0051]必要時，可以進一步地針對以上步驟(8)所得胎盤間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項:細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；
[0052]必要時，可以進一步地將以上步驟(8)所得傳代后的胎盤間充質干細胞于液氮中凍存，備用。
[0053]在上述獲得的⑶2陽性表達率不低于90%的⑶2+基質細胞的這種胎盤間充質干細胞過程中，對所獲得的細胞進行GD2陽性表達率檢測，選取GD2陽性表達率不低于90%例如不低于95%的GD2+基質細胞作為本發(fā)明使用的間充質干細胞。
[0054]又例如，對于通過臍帶獲得的間充質干細胞，可以參照中國專利申請?zhí)?01210159916.2中的方法獲得，例如通過該文獻方法獲得的GD2陽性表達率不低于90%的GD2+基質細胞。在一個實例中，獲得該GD2+基質細胞的方法包括以下步驟:
[0055](I)配制臍帶組織凍存液:所述臍帶組織凍存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的DMS0(二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide)，配好的冷存液放在4°C冰箱保存直至使用；
[0056](2)消毒和清洗:在生物安全柜中，用酒精對臍帶組織表面進行消毒，將臍帶從中間剪開，平鋪在無菌1cm細胞培養(yǎng)平皿上，利用PBS清洗組織，以減小組織上面的紅細胞；
[0057](3)臍帶組織處理:將步驟(2)得到的臍帶組織轉移至另一個1cm細胞培養(yǎng)平皿中，將臍帶組織剪成大小lcm3的正方形狀；
[0058](4)臍帶組織冷存:在4°C的低溫環(huán)境下，將組織塊和凍存液加入凍存管中，然后將凍存管放入程序降溫盒，先在4°C的溫度條件下低溫冷藏0.5小時，再-80 V的溫度條件下冷凍I天，然后將凍存管于液氮中冷凍，備用；
[0059]必要時，可以進一步地包括與凍存方法配套使用的復蘇方法:
[0060](5)凍存臍帶組織復蘇:將步驟(4)冷凍的臍帶組織從液氮中取出，放在恒溫水浴里解凍至一半凍存液開始融化，利用間充質干細胞培養(yǎng)基(其例如包含15%FBS+1%L-Glutamine+0.05%Gentamicin+84%DMEM-F12)進行點滴法清洗臍帶組織，利用10um過濾器將廢液去掉；
[0061]必要時，可以進一步地包括復蘇后間充質干細胞分離和擴增的方法:
[0062](6)臍帶組織貼壁處理:將復蘇的凍存臍帶組織平鋪于另一個1cm細胞培養(yǎng)平皿中，每個平皿中的組織塊數量維持在10-15塊，使組織塊風干10-15分鐘直至組織貼在平皿上；
[0063](7)臍帶組織培養(yǎng):沿平皿邊緣慢慢加入間充質干細胞培養(yǎng)基(其例如包含15%FBS+1 % L-Glutamine+0.05% Gentami cin+84 % DMEM-F12)至組織淹沒即可；將平皿置于 C02濃度為5%的37 °C培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第五天時將平皿從培養(yǎng)箱取出，補加5ml間充質干細胞培養(yǎng)基;在第十天將平皿內的培養(yǎng)基轉移，加入15ml新鮮的間充質干細胞培養(yǎng)基;在第十二天清除所有臍帶組織塊并繼續(xù)培養(yǎng)，此后每兩天進行一次全換液；
[0064](8)細胞傳代:當平皿里面的貼壁細胞融合率達到60%左右，可利用消化酶(TrypLE Express)將貼壁細胞脫離平皿底部，離心后移除上清液，并加入間充質干細胞培養(yǎng)基重新懸浮細胞，接種于T25細胞培養(yǎng)瓶進行傳代，并進行擴增培養(yǎng);此后每兩天換液一次直至融合率達到80 %后，即得，必要時再進行傳代；
[0065]必要時，可以進一步地針對以上步驟(8)所得臍帶間充質干細胞，檢測以下項目的至少一項:細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；
[0066]必要時，可以進一步地將以上步驟(8)所得傳代后的臍帶間充質干細胞于液氮中凍存，備用。
[0067]在上述獲得的⑶2陽性表達率不低于90%的⑶2+基質細胞的這種臍帶間充質干細胞過程中，對所獲得的細胞進行GD2陽性表達率檢測，選取GD2陽性表達率不低于90%例如不低于95%的GD2+基質細胞作為本發(fā)明使用的間充質干細胞。
[0068]本發(fā)明所用的造血干細胞可以使用本領域已知的方法來制備。
[0069]例如，對于通過胎盤獲得的造血干細胞，可以參照中國專利申請?zhí)?014104050724中的方法獲得，例如通過該文獻方法獲得的造血干細胞中CD34陽性表達率大于80%，例如大于85% ;并且，通過該文獻方法獲得的造血干細胞中KDR2陽性表達率大于85%，例如大于90 % ο在一個實例中，獲得該KDR2陽性表達的細胞的方法包括以下步驟:胎盤的收集、胎盤的初檢、胎盤的預消毒、胎盤及母血檢測、胎盤造血干細胞的灌洗、造血干細胞的濃縮純化。各步驟具體為:
[0070](I)胎盤的收集:在手術室無菌環(huán)境下收集胎盤及母血，存放于無菌的胎盤儲運盒中，貼好標簽、條碼，胎盤儲運盒的溫度保持在4-10°C，24小時內送達實驗室；
[0071](2)胎盤的初檢:檢查胎盤儲運盒盒內溫度、標簽、送達日期、儲運盒是否有滲漏、是否有母血血樣；
[0072](3)胎盤的預消毒:將胎盤的胎兒面展開放置于胎盤沖洗盒的底部，用生理鹽水沖洗胎盤表面，打開胎盤沖洗盒底面的排水孔，去掉沖洗的生理鹽水，檢查胎盤表面鈣化情況；
[0073](4)胎盤及母血檢測:對所取的胎盤和母血樣本進行檢測，檢測的項目包括肝炎病毒檢測、艾滋病毒檢測、性病檢測、組織配型(HLA)檢測、造血干/祖細胞定性檢測(CFU-GM);
[0074](5)胎盤造血干細胞的灌洗:將胎盤在無菌條件下用無菌生理鹽水清洗掉胎盤上的血凝塊及積血，采用消毒劑消毒后，將灌洗液針頭插入胎盤臍動脈中，胎盤灌注回收瓶針頭插入臍靜脈中，止血鉗夾緊，緩慢開啟恒流栗，灌洗液經膠管、開關、蠕動栗、針頭、胎盤動脈、胎盤、胎盤靜脈、胎盤灌注回收瓶針頭，最后在灌洗液回收瓶中接收灌洗液；
[0075](6)造血干細胞的濃縮純化:將灌洗出來的灌洗液，在離心機中以1500-2000rpm離心15-20分鐘，去掉上清液，收集沉淀和下層的液體，將收集到的沉淀和下層的液體與生理鹽水按2: 1-1:2的比例混勻得混合液，然后將混合液和淋巴細胞分離液按2: 1-1: 2的比例分別加入到離心管中，添加的順序為先在離心管中加入淋巴細胞分離液，再緩慢加入混合液，加入過程中注意保持淋巴細胞分離液的液面平整，加完后以2200-2500rpm離心20-25分鐘，離心時慢加速慢減速，離心結束后，收集中間白膜層到新的離心管中，以2:1 -1:2的比例加生理鹽水混勻，1200-1500rpm離心10-15分鐘；離心結束后去掉上清液，加入10-20mL生理鹽水吹打沉淀，再1200-1500rpm離心10-15分鐘，離心結束后，去掉上清液，用DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，收集造血干細胞群，將重懸的細胞群進行細胞和霉菌培養(yǎng)，造血干細胞定量檢測(CD34)，造血干細胞活性檢測(臺盼藍染色)，造血干細胞定性檢測(CFU-GM)。
[0076]在上述獲得的⑶34陽性表達率大于80%例如大于85%，且KDR2陽性表達率大于85 %例如大于90 %的造血干細胞過程中，對所獲得的造血干細胞進行⑶34陽性表達率檢測和KDR2陽性表達率，選?、?4陽性表達率大于80 %例如大于85 %且KDR2陽性表達率大于85 %例如大于90 %的造血干細胞過作為本發(fā)明使用的造血干細胞。
[0077]或者，在一個實施方案中，本發(fā)明所用的造血干細胞可照如下方法獲得:取造血干細胞來源組織(包括但不限于臍帶血、骨髓、胎盤血、動員外周血)，按8:1?1:8比例加入羥乙基淀粉，混合均勻后，轉移到AXP造血干細胞分離系統(tǒng)配套處理耗材內，裝入AXP造血干細胞分離系統(tǒng)，放入離心機，以離心率(RCF) 1200?1600離心10?30min，再以RCF50?200離心5?15min后取出，自動分離得到單個核細胞，導出AXP數據得到造血干細胞的分離數量。使用流式細胞儀檢測分離的到的細胞的CD34和KDR2含量。然后將分離得到的細胞按8:1?1:8比例加入DMSO，程序降溫至-90°C后放入液氮環(huán)境下凍存。使用前，放在37度水浴中復蘇。使用上述方法獲得的⑶34陽性表達率大于80%例如大于85%，且KDR2陽性表達率大于85%例如大于90%的造血干細胞。
[0078]進一步的，在凍存前，可以將本發(fā)明所述間充質干細胞即⑶2+基質細胞和KDR2+造血干細胞各自獨立地分裝于瓶子中，接著將兩個瓶子置于本發(fā)明所述藥盒中，得到本發(fā)明用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，接著將該治療劑在凍存條件下保存。
[0079]根據本發(fā)明記載的在動物試驗中獲得的結果，本發(fā)明人嘗試將本發(fā)明方法用于人特別是具有早老癥特征的患者以修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退。結果顯示，本發(fā)明方法不但在動物試驗中呈現(xiàn)優(yōu)良的結果，而且在人體中呈現(xiàn)令人鼓舞結果。
[0080]本發(fā)明任一方面或該任一方面的任一實施方案所具有的任一技術特征同樣適用其它任一實施方案或其它任一方面的任一實施方案，只要它們不會相互矛盾，當然在相互之間適用時，必要的話可對相應特征作適當修飾。下面對本發(fā)明的各個方面和特點作進一步的描述。
[0081]本發(fā)明所引述的所有文獻，它們的全部內容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準。此外，本發(fā)明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術語和短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準。
【具體實施方式】
[0082]通過下面的實施例可以對本發(fā)明進行進一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細描述。
[0083]在本發(fā)明的具體實驗中，使用到的胎盤間充質干細胞即GD2+基質細胞是參照中國專利申請?zhí)?01210292509.9之實施例1、6、7的方法獲得的，并且⑶2陽性表達率大于95%。
[0084]在本發(fā)明的具體實驗中，使用到的臍帶間充質干細胞即GD2+基質細胞是參照中國專利申請?zhí)?01210159916.2之實施例1、6、7的方法獲得的，并且⑶2陽性表達率大于95%。
[0085]在本發(fā)明的具體實驗中，使用到的胎盤造血干細胞是參照中國專利申請?zhí)?014104050724之實施例1的方法獲得的，并且CD34標志物陽性表達率大于85%、KDR2標志物陽性表達率大于90 %。
[0086]在本發(fā)明的具體實驗中，使用到的臍帶血造血干細胞其⑶34標志物陽性表達率大于85%、KDR/2標志物陽性表達率大于90%，并且是參照如下方法制備的:按8:1?1:8比例加入羥乙基淀粉，混合均勻后，轉移到AXP造血干細胞分離系統(tǒng)配套處理耗材內，裝入AXP造血干細胞分離系統(tǒng)，放入離心機，以離心率(RCF) 1200?1600離心10?30min，再以RCF50?200離心5?15min后取出，自動分離得到單個核細胞，導出AXP數據得到造血干細胞的分離數量。使用流式細胞儀檢測分離的到的細胞的CD34和KDR2含量。然后將分離得到的細胞按8:1?1:8比例加入DMSO，程序降溫至-90°C后放入液氮環(huán)境下凍存。使用前，放在37度水浴中復蘇。
[0087]實施例1:使用胎盤間充質干細胞即⑶2+基質細胞與臍帶血KDR2+造血干細胞治療衰老小鼠
[0088]一、動物的選擇和分組
[0089 ] 1、動物的選擇:模型小鼠為健康C57BL/6 J小鼠，雌性，8周齡，重18?22g，60只。
[0090]2、動物分組:單純隨機分為對照組、模型組、治療組三組，每組20只。
[0091]二、建立小鼠衰老模型
[0092]模型組和治療組每日頸背部皮下注射5%的D-半乳糖，注射量為0.25ml/10g，連續(xù)給藥8-16周建立衰老動物模型。對照組則給予相同體積的生理鹽水。
[0093]三、輸注
[0094]衰老模型建成兩周之后，治療組注射⑶2+胎盤MSC和KDR2+臍帶血HSC。采用表達綠色熒光蛋白的慢病毒載體標記GD2+MSC及臍帶血KDR2+HSC，以確定⑶2+MSC及臍帶血KDR2+HSC在小鼠各臟器的植入情況。檢測治療前后衰老相關指標:包括小鼠體重、胸腺、脾臟、血清、肝組織、肺臟、腦組織過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量的變化。
[0095]治療組第一個療程:經小鼠尾靜脈輸注人源GD2+胎盤MSC單細胞懸液2 X 16/
0.2mL/只，每周給藥一次，共給藥4次為一個療程。第二個療程:第一周經小鼠尾靜脈輸注人源⑶2+胎盤MSC單細胞懸液2 X 106/0.2mL/只，第二周輸注人源KDR2+臍帶血HSC單細胞懸液2 X 106/0.2mL/只，以后每療程均輸注GD2+胎盤MSC;對照組和衰老模型組給予同等劑量的細胞培養(yǎng)液。
[0096]四、方法
[0097]1、用尾靜脈注射架固定小鼠。
[0098]2、用酒精棉球擦尾巴使血管擴張;注射狀態(tài)為尾巴發(fā)白，緊靠白色的尾骨兩側清晰可見兩根紅色靜脈。
[0099]3、用左手的食指，中指，無名指及大拇指將小鼠尾巴固定。握住Iml注射器前面
0.1CM處。右手小指搭在拽著鼠尾的左手拇指處，按此手形進針。
[0100]4、注射:注射時左手扯尾，使尾巴緊貼桌面，尾巴與桌邊緊貼轉彎處為進針部位，一般選擇距離尾尖1/4或1/3處進針。針頭入皮膚后馬上把針頭略往上，平行進針，針扎入時有落空感，緩慢推注。
[0101]五、結果:
[0102]1.治療組在受體小鼠中定植，治療組小鼠胸腺、脾臟、血清、肝組織、肺臟、腦組織MDA及CAT含量明顯低于對照組、SOD活力明顯高于對照組并且存在顯著性差異(P彡0.05)，與模型組相比，則存在極顯著性差異(PS0.01)，有統(tǒng)計學意義。
[0103]2.各組小鼠的組織病理切片顯示，模型組小鼠的各臟器結構嚴重破壞，而細胞治療組小鼠的各臟器損傷有明顯修復。結果可見MSC對衰老小鼠的臟器損傷有修復作用，從而發(fā)揮其抗衰老作用。
[0104]六、結論:GD2+MSC與KDR2+HSC聯(lián)合治療明顯改善D-半乳糖誘導亞急性衰老模型小鼠的衰老相關指標，表明GD2+MSC和KDR2+HSC 二者組合使用具有顯著的修復機體機能老化和臟器功能衰退的作用。
[0105]補充試驗:參照以上實施例1，但是在治療時僅使用GD2+MSC以及僅使用KDR2+HSC治療，卻發(fā)現(xiàn)均未呈現(xiàn)任何治療作用。
[0106]實施例2:MSC+HSC治療衰老小鼠的機制研究
[0107]衰老相關B-半乳糖苷酶(SAKal)活性檢測
[0108]1、細胞標本收集分別取對照組和治療組治療后1(1、3(1、5(1、7(1、14(1、28(1 MSC，以3%中性甲醛室溫固定5min后染色。
[0109]2、SAKa I 染色
[0110]先將X-Gal以20/L的濃度溶入二甲基甲酰胺配成X-Gal儲存液，常溫儲存?zhèn)溆?。新鮮染液的配制:lmg/mL X-Gal+40mmol/L檸檬酸緩沖液(PH 6.0)+5mmol/L亞鐵氰化鉀+5mmol/L鐵氛化鉀+150mmol/L NaCl+2mmol/L MgCbo
[0111]染色:將標本浸入新鮮染液室溫染色12?16h，蒸餾水漂洗，中性紅或Giemsa染液復染，光鏡下觀察。
[0112]3、SAKal顯色結果觀察
[0113]SA-P-Gal染色陽性細胞比率以顯微鏡下隨機所選5個視野/玻片的陽性染色細胞均數作為每張玻片的陽性率，陽性率以3張玻片的均數±標準差計算。
[0114]4、衰老相關B-半乳糖苷酶(SAKal)活性檢測結果
[0115]對照組SA-P-Gal染色陽性率為3.03±0.66 % ;而GD2+MSC和KDR2+HSC治療后IcU3d、7d、14d、28d后MSC的SA-P-Gal染色陽性率分別為2.92±0.58%，3.17±0.76%，3.13土
0.76%，2.37±0.76%，2.61 ±0.76%;它們分別與對照組比較，均無顯著差異(ρ>0.05)。實驗組和對照組間無顯著差異，說明⑶2+MSC與KDR2+HSC不能引起MSC衰老。
[0116]5.細胞衰老相關基因？161吐4&、？53、？21(^?1/￥&^的相對表達
[0117](I )pl6:GD2+MSC 與 KDR2++HSC 治療后 ld、3d、7d、14d 的 MSC 的 ρ16 未見明顯升高，與對照組間無顯著差異(Ρ>0.05)<^2+Μ3(:與KDR2+HSC治療后28d的ρ16與對照組間的差異有極顯著意義(Ρ〈0.001)，明顯降低。
[0118](2)ρ21: GD2+MSC與KDR2+HSC治療后Id、7d、14d、28d的MSC的p21未見明顯升高，與對照組間無顯著差異(P>0.05)。⑶2+MSC與KDR2+HSC治療后3d的p21與對照組間的差異有顯著意義(p〈0.05)，明顯降低。
[0119](3453:602+]\^(:與1(01?2+!^(:治療后1(1、3(1、7(1、14(1、28(1的]\^(:的？53與對照組相比明顯降低，組間差異有顯著意義(P〈0.05)。
[0120]以上結果顯示⑶2+MSC與KDR2+HSC組合治療對于衰老小鼠有顯著的治療作用。
[0121]本發(fā)明人在充分的生物學試驗基礎上，使用本發(fā)明方法嘗試治療患者早老癥的患者，結果顯示本發(fā)明方法具有對早老癥優(yōu)異的治療作用，這種治療作用還體現(xiàn)在其能夠修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退。
[0122]補充試驗:參考實施例1的方法，使用胎盤間充質干細胞即GD2+基質細胞與KDR2+胎盤造血干細胞治療衰老小鼠，結果顯示與實施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。
[0123]補充試驗:參考實施例1的方法，使用臍帶間充質干細胞即GD2+基質細胞與KDR2+胎盤造血干細胞治療衰老小鼠，結果顯示與實施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。
[0124]補充試驗:參考實施例1的方法，使用臍帶間充質干細胞即GD2+基質細胞與KDR2+臍帶血造血干細胞治療衰老小鼠，結果顯示與實施例1呈現(xiàn)基本相同的治療效果。
[0125]產業(yè)實用性
[0126]本發(fā)明屬于細胞治療技術領域，涉及一種用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，特別是涉及一種包括GD2+基質細胞和KDR2+造血干細胞的治療劑。進一步的，本發(fā)明涉及GD2+基質細胞和KDR2+造血干細胞二者組合在制備用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。本發(fā)明治療劑可以有效地用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退。
【主權項】
1.間充質干細胞與造血干細胞組合在制備用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑中的用途。2.根據權利要求1的用途，其中所述間充質干細胞是GD2+基質細胞。3.根據權利要求1的用途，其特征在于: 其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的間充質干細胞； 其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的GD2+基質細胞;和/或其中所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的GD2+基質細胞，且GD2陽性表達率大于90%，例如大于95%。4.根據權利要求1的用途，其特征在于: 其中所述造血干細胞來源于:臍帶血、骨髓、胎盤血、和/或動員外周血； 其中所述造血干細胞是KDR2陽性表達的造血干細胞； 其中所述造血干細胞是KDR2陽性表達的造血干細胞，該KDR2陽性表達的造血干細胞中KDR2陽性表達率大于85%，例如大于90% ;和/或 其中所述造血干細胞中⑶34陽性表達率大于80%，例如大于85%。5.根據權利要求1的用途，其中所述治療劑呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨密封包裝的間充質干細胞和單獨密封包裝的造血干細胞。6.根據權利要求5的用途，其特征在于: 所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述間充質干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(0.1?10) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為(0.5?5) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為(0.75?1.5) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為17個基質細胞； 所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述造血干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(I?5) X 17個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 17個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為3 X 17個單個核細胞;或者，在一個實施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述造血干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(2?10) X 15個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?5) X 15個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 15個單個核細胞;和/或 所述治療劑在用于哺乳動物例如人時，先使用間充質干細胞，在I個月之后使用造血干細胞。7.用于修復機體機能老化和延緩臟器功能衰退的治療劑，其呈藥盒的形式，該藥盒中包括單獨密封包裝的間充質干細胞和單獨密封包裝的造血干細胞。8.根據權利要求7的治療劑，其特征在于: 所述間充質干細胞是GD2+基質細胞； 所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的間充質干細胞； 所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的GD2+基質細胞； 所述間充質干細胞是來源于胎盤和/或臍帶的GD2+基質細胞，且GD2陽性表達率大于90%，例如大于95 %。9.根據權利要求7的治療劑，其特征在于: 所述造血干細胞來源于:臍帶血、骨髓、胎盤血、和/或動員外周血； 所述造血干細胞是KDR2陽性表達的造血干細胞； 所述造血干細胞是KDR2陽性表達的造血干細胞，該KDR2陽性表達的造血干細胞中KDR2陽性表達率大于85%，例如大于90% ;和/或 所述造血干細胞中⑶34陽性表達率大于80%，例如大于85%。10.根據權利要求7的治療劑，其特征在于: 所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述間充質干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(0.1?10) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為(0.5?5) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為(0.75?1.5) X 17個基質細胞，例如每公斤患者體重用量為17個基質細胞； 所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述造血干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(I?5) X 17個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 17個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為3 X 17個單個核細胞;或者，在一個實施方案中，其中所述治療劑在用于哺乳動物例如人時所述造血干細胞的劑量是每公斤患者體重用量為(2?10) X 15個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?5) X 15個單個核細胞，例如每公斤患者體重用量為(2?4) X 15個單個核細胞;和/或 所述治療劑在用于哺乳動物例如人時，先使用間充質干細胞，在I個月之后使用造血干細胞。
【文檔編號】A61P43/00GK106074604SQ201610551770
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】許曉椿, 肖海蓉, 劉冰, 程霞, 周丹
【申請人】博雅干細胞科技有限公司