專利名稱：一種黑曲霉菌種及其在厭氧發(fā)酵制備低聚果糖中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬低聚果糖制備領(lǐng)域，涉及一種厭氧發(fā)酵法生產(chǎn)低聚果糖的方法。
背景技術(shù)：
低聚果糖是指2 8個(gè)果糖基為鏈節(jié)，以一個(gè)葡萄糖基為鏈的端基，以果糖基一果糖連 接鍵為主體骨架連結(jié)形成的功能性低聚糖。低聚果糖是一種能激活人體益生菌群增殖，促 進(jìn)人體微生態(tài)平衡的益生元，被公認(rèn)為具有調(diào)節(jié)胃腸道功能、降低血酯、調(diào)節(jié)機(jī)體平衡、 提高免疫力等健康作用，也是一種典型的水溶性膳食纖維，已被廣泛用作功能性配料或者 直接服用。
目前，國(guó)內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)的方法主要是先篩選出產(chǎn)低聚果糖酶菌種，然后破碎菌體制 備固定化酶制劑，采用好氧發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行低聚果糖的生產(chǎn)，工藝路線較長(zhǎng)，設(shè)備投入多。 另外好氧發(fā)酵技術(shù)通風(fēng)量大，無菌空氣制備系統(tǒng)能耗高。通常制備的低聚果糖產(chǎn)品外觀混 濁、顏色黃、色澤差，產(chǎn)品透光率85%以下，產(chǎn)品應(yīng)用范圍受到限制，同時(shí)菌體只能利用一 次。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)一種新的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖產(chǎn)品方法，該方法可簡(jiǎn)化工藝路 線，去除無菌空氣制備系統(tǒng)，菌體實(shí)現(xiàn)回收循環(huán)利用，減少了設(shè)備投入，產(chǎn)品具有無色透 明，透光率達(dá)歪1」90%以上，保質(zhì)期長(zhǎng)，成本低等特點(diǎn)。
本發(fā)明提供了一種黑曲霉菌種(A9Pe2^i""s ; &e" BLBll，已在中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所， 保藏時(shí)間2009年3月17日，保藏號(hào)CGMCC No. 2952。
本發(fā)明同時(shí)提供了一種應(yīng)用黑曲霉菌種(A5per^7hsBLB11厭氧發(fā)酵蔗糖溶液 生產(chǎn)低聚果糖產(chǎn)品方法。包括黑曲霉BLB11生產(chǎn)用菌種的培養(yǎng)，使用生產(chǎn)菌種厭氧發(fā)酵蔗糖 溶液和分離提純、加工制備高純度低聚果糖。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括如下步驟 1.菌種分離和篩選
從禹城市甜菜園土壤中分離得黑曲霉菌株BLB-09，操作方法如下 稱取10g土壤，加入90mL無菌水中，震蕩搖勻，酒精擦拭后移入超凈工作臺(tái)。準(zhǔn)備6 支裝有9mL無菌水的試管，編號(hào)1~6。用移液槍移取1000uL懸濁液置于1號(hào)試管，再 移取1000"L1號(hào)試管懸濁液置于2號(hào)試管，依次做六個(gè)試管梯度稀釋。用移液槍分別取4、 5、 6號(hào)試管溶液各200pL (每個(gè)試管取2~4份)置于合適的培養(yǎng)基平板，用涂抹棒均勻 涂抹，培養(yǎng)至平板長(zhǎng)出成熟菌落，鑒定并分離純化黑曲霉菌落，將單菌落接種斜面，并接 種搖瓶，初篩測(cè)定產(chǎn)低聚果糖的轉(zhuǎn)化率。根據(jù)搖瓶產(chǎn)低聚果糖的轉(zhuǎn)化率水平篩選出斜面出
3發(fā)菌株一黑曲霉BLB-09。
分離斜面培養(yǎng)基馬鈴薯30g、蔗糖3.0g、 K2HP04 0. lg、 MgS040.05g、 1.5 2.0g瓊脂， 蒸餾水100mL，自然pH值，12rC滅菌1小時(shí)。培養(yǎng)溫度28~30°C。
搖瓶種子培養(yǎng)基麩皮3 g、尿素0.5 g、蔗糖5 g、可溶性淀粉2 g 、 K2HP04 0. lg、 MgS040.05g，蒸餾水100mL，自然pH值，121。C滅菌1小時(shí)。培養(yǎng)溫度28 30。C。
采用紫外線、微波及硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理。通過產(chǎn)低聚果糖的轉(zhuǎn)化率測(cè)定篩選得到
優(yōu)良的高產(chǎn)胞外酶菌株，用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)低聚果糖的生產(chǎn)。具體操作步驟如下
菌種誘變
1) 紫外線誘變接種環(huán)挑取黑曲霉BLB-09斜面孢子于裝有無菌水的三角瓶中，置于磁
力攪拌器上振蕩lh，使孢子萌發(fā)。將孢子懸液倒入含無菌大頭針的無菌平皿。打開平皿蓋，
在事先預(yù)熱好的20 W的紫外燈下24 cm處照射Os、 20s、 40s、 60s、 80s、 100s、 120 s，不 同照射劑量菌液稀釋到10"，黑暗處放置1 h。再用生理鹽水分別稀釋菌液到l(T3，吸取稀 釋好尚菌液O.l mL涂布56 Be'麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板。將涂好 的平皿用黑布包好，置生化培養(yǎng)箱28 'C培養(yǎng)5d左右，至長(zhǎng)出成熟菌落，統(tǒng)計(jì)致死率。
2) 微波誘變選取紫外誘變后致死率90%以上菌株進(jìn)行篩選，得優(yōu)良菌株UV-62繼續(xù) 微波處理。
采用頻率為2450 MHz，功率1200 W的微波爐，低火，分別以0、 20、 40、 60、 80、訓(xùn)s 輻射處理菌株UV-62，操作步驟如紫外誘變，然后菌液稀釋涂布50 Be'麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板， 培養(yǎng)5d，挑取單菌落至斜面培養(yǎng)。經(jīng)篩選得優(yōu)良菌株WB-26。
3)硫酸二乙酯誘變對(duì)菌株WB-26進(jìn)行硫酸二乙酯處理。取活化好的菌種WB-26斜 面，用0,2mol/L， pH7.0的磷酸緩沖液洗下孢子，裝入帶玻璃珠的三角瓶中震蕩2h，鏡檢菌 懸液，調(diào)節(jié)孢子數(shù)為10:l(rS/mL。取出制備好的孢子懸液lOmL，加入1%硫酸二乙酯0.2mL， 混勻后置于恒溫震蕩箱中，28°C，分別震蕩IO， 20， 30， 40， 50， 60， 70min，待反應(yīng)完成 后后，立即加入25y。硫代硫酸鈉溶液0.5mL終止反應(yīng)。同時(shí)另取孢子懸液10mL。不加硫酸 二乙酯作為對(duì)照。用0.2mol/L， pH7.0的磷酸緩沖液將對(duì)照及誘變后的孢子懸液分別稀釋至 IO"4。分別吸取1(T2、 l(T3、 10^的孢子懸液0.2mL加到5GBe'麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平皿上涂布， 然后置生化培養(yǎng)箱28'C培養(yǎng)5d左右，至長(zhǎng)出成熟菌落，統(tǒng)計(jì)致死率，并從平皿中隨機(jī)挑選 單菌落，
篩選選取平板菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，測(cè)定轉(zhuǎn)化率。
轉(zhuǎn)化率測(cè)定以10%蔗糖溶液為底物，加入適量菌體細(xì)胞，總體積為20mL，置于三角瓶 中，在最適反應(yīng)溫度，轉(zhuǎn)速200r/min的恒溫回旋式搖床中反應(yīng)60min，取出于85°。水浴10min 將菌體滅活，冷至室溫，于10000r/min臺(tái)式離心機(jī)上離心2min，取上層清液，作為HPLC 法測(cè)定蔗果三糖含量的試液。從中篩選出高轉(zhuǎn)化率菌株黑曲霉(A;wg//tom'gw) BLBll。
2、生產(chǎn)用菌種培養(yǎng) _
產(chǎn)低聚果糖黑曲霉菌種BLB-11經(jīng)斜面培養(yǎng)后，接入一級(jí)或二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得 到擴(kuò)大培養(yǎng)的生產(chǎn)用菌種；定期鏡檢至菌絲生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期末，然后即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐使用。
斜面培養(yǎng)基5GB6麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基麥芽浸膏3克、葡萄糖10克、酵母浸膏3克、
4蛋白胨5克、瓊脂20克水1000毫升；pH自然，溫度28 3(TC
種子培養(yǎng)基麩皮3 g、尿素0. 5 g、蔗糖5 g、可溶性淀粉2 g 、 K2HP040. lg、 MgS040. 05g， 蒸餾水100mL，自然pH值，121。C滅菌1小時(shí)。培養(yǎng)溫度28 30。C。
3、 厭氧發(fā)酵
將菌種以P"4(mV/V的量(菌種與蔗糖溶液體積比)轉(zhuǎn)入蔗糖溶液中，在厭氧發(fā)酵罐中 進(jìn)行厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化，蔗糖濃度10 60%， pH值4 7,反應(yīng)溫度25 6(TC,厭氧發(fā)酵反應(yīng) 10 36小時(shí)，得到低聚果糖含量50%以上的反應(yīng)液；
優(yōu)選的蔗糖溶液濃度為40 60%，菌種加入量為10 20%。
4、 分離提純、加工
發(fā)酵完成后用0.1 1微米的微濾膜行過濾回收菌體，菌體回收利用于下一批次生產(chǎn)， 料液進(jìn)行滅菌處理，加入新型生物絮凝劑，絮凝溫度60 9(TC，時(shí)間10 30分鐘，使菌體 蛋白形成大的顆粒；
料液進(jìn)行過濾脫色處理，脫色溫度60 9(TC，脫色10 30分鐘，過濾速度明顯加快， 糖液清亮，透光率達(dá)到90%以上；
對(duì)脫色過濾后的料液采用固定床離交凈化、濃縮、干燥、包裝等手段制取相應(yīng)的液體或 固體產(chǎn)品。
發(fā)明效果
本發(fā)明表明菌種在厭氧發(fā)酵罐中厭氧轉(zhuǎn)化蔗糖生成低聚果糖，包括蔗果三糖、蔗果四 糖、蔗果五糖、蔗果六糖等，發(fā)酵過程不需要空壓設(shè)備提供無菌空氣，減少設(shè)備投入，降 低能源消耗。發(fā)酵結(jié)束后，反應(yīng)液利用微濾膜回收菌體，料液經(jīng)過滅菌、加入生物絮凝劑， 使菌體形成大的顆粒，提升過濾速度。然后通過精制除去糖液中的雜質(zhì)，制備的低聚果糖 透光率達(dá)到90%以上，產(chǎn)品組分50 60%,產(chǎn)品質(zhì)量明顯提升。
如工業(yè)化生產(chǎn)低聚果糖50噸轉(zhuǎn)化罐，原好氧發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖需要配備相應(yīng)的空氣壓 縮機(jī)、無菌空氣管路系統(tǒng)，而且無菌空氣過濾濾芯也要經(jīng)常更換。50噸單罐配備無菌空氣 系統(tǒng)投資大約在40萬元，每小時(shí)耗電量240kWh以上，100噸單罐配備無菌空氣系統(tǒng)投資大 約在70萬元，每小時(shí)耗電量420kWh以上，能源消耗大。生產(chǎn)量越大，罐體越多，設(shè)備投 資及相關(guān)基礎(chǔ)投資更大。采用厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化技術(shù)可以去除好氧發(fā)酵所需的如上述大量的基 礎(chǔ)投資和無菌空氣制備設(shè)備投資，節(jié)省占地空間，同時(shí)減少大量的能源消耗。微濾膜技術(shù) 實(shí)現(xiàn)菌體的回收利用，進(jìn)一步減少能源消耗，精制手段使產(chǎn)品質(zhì)量明顯提升。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 取4000克蔗糖加入15升厭氧發(fā)酵罐中，加水6000克，加熱溶解后，調(diào)解料 液pH值5，然后接入擴(kuò)大培養(yǎng)的低聚果糖生產(chǎn)菌種，菌種接入量10% (V/V)，溫度控制在 50'C，反應(yīng)時(shí)間15小時(shí)。發(fā)酵轉(zhuǎn)化完畢，微濾膜過濾回收菌體，菌體回收利用于下一批次 生產(chǎn)，然后料液升溫至10(TC滅菌10分鐘，加入適量生物絮凝劑，絮凝溫度60 9(TC，絮 凝完畢料液中加入0. 05 0. 1%活性炭脫色處理，處理30分鐘，后經(jīng)精制、濃縮、包裝等處 理，得到低聚果糖含量57.2%的成品液體，產(chǎn)品透光率94.6%。
實(shí)施例2取6000克蔗糖加入15升厭氧發(fā)酵罐中，加水5000克，加熱溶解后，調(diào)解料液pH值5.5，然后加入擴(kuò)大培養(yǎng)的低聚果糖生產(chǎn)菌種，菌種接入量20%，溫度控制在3(TC， 反應(yīng)時(shí)間20小時(shí)。發(fā)酵轉(zhuǎn)化完畢，微濾膜過濾回收菌體，菌體回收利用于下一批次生產(chǎn)， 然后料液升溫至10(TC滅菌10分鐘，加入適量生物絮凝劑，絮凝溫度60 9(TC，絮凝完畢 料液中加入0.05 0.1%活性炭脫色處理，處理30分鐘，后經(jīng)精制、濃縮、包裝等處理，得 到低聚果糖含量58%的成品液體，產(chǎn)品透光率93. 2%。
實(shí)施例3 取5000克蔗糖加入15升厭氧發(fā)酵罐中，加水5000克，加熱溶解后，調(diào)解料液 pH值6，然后加入擴(kuò)大培養(yǎng)的低聚果糖生產(chǎn)菌種，菌種接入量15%，溫度控制在50'C，反 應(yīng)時(shí)間25小時(shí)。發(fā)酵轉(zhuǎn)化完畢，微濾膜過濾回收菌體，菌體回收利用于下一批次生產(chǎn)，然 后料液升溫至10(TC滅菌10分鐘，加入適量生物絮凝劑，絮凝溫度60 9(TC，絮凝完畢料 液中加入0.05 0. 1%活性炭脫色處理，處理30分鐘，后經(jīng)精制、濃縮、包裝等處理，得到 低聚果糖含量56. 8%的成品液體，產(chǎn)品透光率92. 6%。
實(shí)施例4 取6000克蔗糖加入15升厭氧發(fā)酵罐中，加水5000克，加熱溶解后，調(diào)解料液 pH值7，然后加入擴(kuò)大培養(yǎng)的低聚果糖生產(chǎn)菌種，菌種接入量20%，溫度控制在3(TC，反 應(yīng)時(shí)間30小時(shí)。發(fā)酵轉(zhuǎn)化完畢，微濾膜過濾回收菌體，菌體回收利用于下一批次生產(chǎn)，然 后料液升溫至10(TC滅菌10分鐘，加入適量生物絮凝劑，絮凝溫度60 9(TC，絮凝完畢料 液中加入0.05 0.1%活性炭脫色處理，處理30分鐘，后經(jīng)精制、濃縮、包裝等處理，得到 低聚果糖含量56. 5%的成品液體，產(chǎn)品透光率93. 2%。
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉菌種(Aspergillus niger)BLB-11，已于已于2009年3月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.2952。
2. —種應(yīng)用黑曲霉"印^^7'77i/s /7&er) BLB-ll菌種厭氧發(fā)酵制備低聚 果糖方法，其特征包括黑曲霉BLB11生產(chǎn)用菌種的培養(yǎng)，使用生產(chǎn)菌種厭氧發(fā)酵 蔗糖溶液和分離提純加工制備高純度低聚果糖。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用黑曲霉(Asper^7"s/7iger) BLB-ll菌種厭氧發(fā) 酵制備低聚果糖方法，其特征在于黑曲霉BLB11生產(chǎn)用菌種的培養(yǎng)方法為黑 曲霉菌種BLB-11經(jīng)斜面培養(yǎng)后，接入一級(jí)或二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到擴(kuò)大培 養(yǎng)的生產(chǎn)用菌種；定期鏡檢至菌絲生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期末，然后即可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐使用；斜面培養(yǎng)基5GB6麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基麥芽浸膏3克、葡萄糖10克、酵母 浸膏3克、蛋白胨5克、瓊脂20克水1000毫升；pH自然，溫度28 30。C;種子培養(yǎng)基麩皮3 g、尿素0. 5 g、蔗糖5 g、可溶性淀粉2 g 、 K2HP04 0. lg、 MgS040.05g，蒸餾水100mL，自然pH值，121'C滅菌1小時(shí)。培養(yǎng)溫度28 30。C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用黑曲霉U^wg說^ BLB-11菌種厭氧 發(fā)酵制備低聚果糖方法，其特征在于用于生產(chǎn)的BLB11菌種的培養(yǎng)方法為5° B 6麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基麥芽浸膏3克、葡萄糖10克、酵母浸膏3克、蛋白胨5 克、瓊脂20克水1000毫升；pH自然，溫度28 30。C。
5. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用黑曲霉(^y/ wgz7/^ "/ger) BLB-ll菌種厭氧發(fā) 酵制備低聚果糖方法，其特征在于生產(chǎn)低聚果糖的操作工藝方法為將生產(chǎn)用菌種 轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵罐內(nèi)，在厭氧條件下，控制蔗糖濃度10 60%，菌體細(xì)胞加入量 1-40%， pH值4 7，反應(yīng)溫度25 6(TC，厭氧發(fā)酵反應(yīng)10~36h，得到含低聚果 糖反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)過微濾膜除菌、脫色、精制、濃縮得到低聚果糖液體產(chǎn)品， 噴霧干燥得到固體低聚果糖產(chǎn)品。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用黑曲霉(A/^g///^ "/gw) BLB-ll菌種厭氧發(fā) 酵制備低聚果糖方法，其特征在于蔗糖溶液濃度為40 60%，菌種加入量為10 20%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用黑曲霉U^w^7/"s "/ger) BLB-11菌種厭氧 發(fā)酵制備低聚果糖方法，其特征在于厭氧發(fā)酵后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行微濾膜除菌，菌體 循環(huán)使用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用黑曲霉(^pwgz7/^ "/ge。 BLB-11菌種厭氧 發(fā)酵制備低聚果糖方法，其特征厭氧發(fā)酵后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行脫色處理，脫色溫度 60 90°C，脫色10 30min，然后進(jìn)行過濾處理。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的制備低聚果糖的方法，采用菌體厭氧發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)低聚果糖，低聚果糖組分含量50％以上。本方法工藝簡(jiǎn)單，減去好氧發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖所需配備的無菌空氣制備系統(tǒng)及相關(guān)的電力用品，設(shè)備投入少，能源消耗低，可大大節(jié)約能源。本發(fā)明適用于生產(chǎn)低聚果糖的為黑曲霉(Aspergillus niger)BLB-11，經(jīng)過一級(jí)或二級(jí)培養(yǎng)得到擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種，菌種轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵罐內(nèi)，在厭氧條件下，調(diào)整蔗糖濃度10～60％，菌體細(xì)胞加入量1-40％，pH值4～7，反應(yīng)溫度25～60℃，厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化反應(yīng)10～36h，得到低聚果糖含量50％以上的反應(yīng)液，反應(yīng)液經(jīng)過微濾、脫色、精制、濃縮得到低聚果糖液體產(chǎn)品，濃縮后經(jīng)干燥處理得到固體低聚果糖產(chǎn)品。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101659924SQ20091001845
公開日2010年3月3日 申請(qǐng)日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者張友亮, 欒慶民, 熊曉蘭, 袁衛(wèi)濤, 陳杰喜 申請(qǐng)人:保齡寶生物股份有限公司