豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用及該豌豆活性肽的制備方法，該肽粉由分子量小于1000Da的肽組成，肽粉來(lái)自于豌豆蛋白水解產(chǎn)物；制備方法如下：(1)利用堿性蛋白酶對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行酶解反應(yīng)后將所得到的豌豆蛋白水解物進(jìn)行冷凍干燥；(2)利用超濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到活性最強(qiáng)的組分；(3)收集活性最高的組分，凍干成粉末即所得豌豆肽粉。(4)將干燥得到的粉末溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液，用于測(cè)定豌豆肽對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。該豌豆活性肽在對(duì)癌細(xì)胞的抑制率能達(dá)到61.92％。
【專利說(shuō)明】
豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明涉及豌豆活性肽的應(yīng)用，尤其是一種豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng) 用及其制備方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 肝癌發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中分別位居第5和第2位，全球每年大約有70萬(wàn)人 死于肝癌，是嚴(yán)重威脅世界人民健康的惡性腫瘤之一。近年來(lái)治療肝癌的主要手段是以手 術(shù)切除為基礎(chǔ)、并輔助化療、熱療等綜合治療。盡管隨著外科治療技術(shù)的提高，其發(fā)病率和 死亡率都呈下降趨勢(shì)。然而由于大多數(shù)原發(fā)性肝癌患者的病情隱匿、潛伏期長(zhǎng)、腫瘤生長(zhǎng)迅 速導(dǎo)致早期診斷困難，而且治療后的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為了肝癌患者死亡的主要原因。因 此，開(kāi)發(fā)出一種適合癌癥病人日常食用及手術(shù)等治療后用于保健的功能性食品能在一定程 度上緩解癌癥病情。
[0003] 豌豆是一種優(yōu)良的植物蛋白資源，豌豆蛋白占干豌豆質(zhì)量的23%~25 %，豌豆蛋 白是一種較好的必需氨基酸源，其組成比較平衡，與FA0/WH0推薦模式較為接近。然而，由于 蛋白的可消化性差，因此豌豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不能充分發(fā)揮。目前我國(guó)的豌豆蛋白一般被 用作飼料，沒(méi)有很好地利用豌豆蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，造成了資源的浪費(fèi)。據(jù)研究表明，目前全 球所面臨的問(wèn)題是隨著蛋白質(zhì)需求量的增加，許多優(yōu)質(zhì)的蛋白資源卻不能被有效利用，因 此將這部分作為副產(chǎn)物的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源加工為高附加值產(chǎn)品的方法就有待改善，經(jīng)過(guò) 水解分離精制得到的多肽，具有高溶解性、高穩(wěn)定性、高吸濕保濕性、抗凝膠性等特點(diǎn)，尤其 是小分子肽，人體吸收速度快，利用率高，同時(shí)具有多種生物活性，是一種能夠利用植物蛋 白資源的手段。
[0004] 現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人體對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收主要是以低肽的形式吸收。據(jù)報(bào) 導(dǎo)，肽的吸收機(jī)制優(yōu)于蛋白質(zhì)和氨基酸。當(dāng)前關(guān)于肽的活性研究主要集中于其抗氧化、抑菌 和降血壓等發(fā)面。關(guān)于抗腫瘤多肽的研究，主要來(lái)源是海洋生物類，本專利開(kāi)發(fā)了一種來(lái)源 于豆類植物蛋白的抗腫瘤多肽，成本更低，為抗腫瘤多肽的原料來(lái)源提供了更優(yōu)的資源。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種制備抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性多肽的方法，優(yōu)選出堿性 蛋白酶酶解豌豆蛋白的方案，得到抗腫瘤肽粗品。經(jīng)過(guò)中空纖維超濾膜裝置和攪拌式超濾 裝置分級(jí)分離純化，得到純度較多的抗腫瘤肽。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的實(shí)施方式如下：
[0007] -種豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0008] -種豌豆活性肽在抑制肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0009] -種豌豆活性肽在抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中的應(yīng)用。
[0010] -種豌豆活性肽在抑制人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中的應(yīng)用。
[0011] -種豌豆活性肽在抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803中的應(yīng)用。
[0012] 而且，所述的豌豆活性肽的分子量小于lOOOKDa。
[0013]而且，所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下：
[0014] ⑴用去離子水配制4%-6%(g/100ml)豌豆蛋白溶液，70°c-90°c下熱處理豌豆蛋 白10min-30min，調(diào)節(jié)pH值為7.5-9.0，加入堿性蛋白酶，在45 °C -60 °C水浴中反應(yīng)4h-6h后， 90°C_100°C 沸水浴滅酶 10min-15min;
[0015] ⑵將水解后得到的豌豆蛋白水解液冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0016] ⑶利用孔徑大小不同的濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于 1000 KDa的超濾組分；
[0017]⑷將分子量小于1000 KDa的超濾組分凍干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0018]而且，所述的分級(jí)分離是采用中空纖維超濾膜裝置和攪拌式超濾裝置聯(lián)合使用。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0020] 1、本發(fā)明采用堿性蛋白酶水解豌豆蛋白的方法制備出一種能抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng) 的活性肽，通過(guò)超濾膜得到純度較高的活性肽組分。該豌豆活性肽在對(duì)癌細(xì)胞的抑制率能 達(dá)到61.92 %。
[0021] 2、本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，應(yīng)用范圍廣泛;對(duì)今后開(kāi)發(fā)利用含有豌豆多肽的保 健品的生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。
[0022] 3、本發(fā)明為患癌病人開(kāi)發(fā)一種安全性高的保健品，同時(shí)為研究和開(kāi)發(fā)多肽的新功 效提供數(shù)據(jù)，有助于滿足人們?nèi)找嫣岣叩纳钏揭蟆?br>【附圖說(shuō)明】：
[0023] 圖1是豌豆蛋白酶解液、蛋白粉、5-FU對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用比較圖；
[0024] 圖2是倒置顯微鏡下觀察的豌豆多肽對(duì)癌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響；
[0025] 圖3是各級(jí)超濾組分對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用比較圖；
[0026]圖4為本發(fā)明方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】：
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 一種豌豆活性肽在抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中的應(yīng)用。
[0029] 所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下：
[0030] (1)蛋白酶解液的制備:準(zhǔn)確稱取6g豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去離子水中混勻，70 °C下熱處理豌豆蛋白15min，按照酶與底物比為lOOOOU/g加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為8.5， 在55°C水浴鍋中反應(yīng)5h后，90°C沸水浴滅酶IOmin，測(cè)定水解度為18.18% ;
[0031] (2)將水解后得到的豌豆蛋白水解液進(jìn)行冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液 DMEM中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液用于測(cè)定對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；
[0032] (3)將用堿性蛋白酶酶解得到的豌豆蛋白酶解液通過(guò)中空纖維膜超濾裝置和攪拌 式超濾裝置分離成分子量（>60KDa，6KDa-60KDa，lKDa-6KDa，〈IKDa)的各個(gè)組分，操作步驟 如下：
[0033] a.安裝超濾裝置
[0034] b.清洗超濾膜
[0035] c.將豌豆蛋白酶解液用蒸餾水稀釋至固形物含量為2%后，用蠕動(dòng)栗輸送進(jìn)中空 纖維中，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)栗的轉(zhuǎn)速和出液口的流速，使裝置的壓力維持在一個(gè)安全范圍內(nèi)，待進(jìn)豌 豆蛋白酶解液全部進(jìn)入中空纖維后，將濃液口的截留液進(jìn)行稀釋重新超濾，重復(fù)多次，直至 濃液口截留液的固形物含量基本保持不變，在此期間收集截留液和濾過(guò)液，并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀濃縮后凍干成肽粉用于檢測(cè)對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
[0036] (4)將所得大活性最強(qiáng)的超濾組分收集，凍干成粉末，即所得豌豆肽粉；
[0037] (5)用MTT法檢測(cè)豌豆蛋白酶解液對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
[0038] 將豌豆肽粉以一定濃度加到細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中，用于檢測(cè)豌豆肽對(duì)癌細(xì)胞體外生 長(zhǎng)的抑制作用，操作步驟如下：
[0039] a.將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X 104個(gè)/mL，以每孔IOOmL接種到96孔板中，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；
[0040] b.向?qū)嶒?yàn)組細(xì)胞中每孔加200uL相應(yīng)的豌豆肽細(xì)胞培養(yǎng)液，空白對(duì)照組加200uL完 全培養(yǎng)液，以含相同濃度豌豆蛋白粉的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照和含相同濃度5-FU的培養(yǎng)液為陽(yáng) 性對(duì)照，在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
[00411 c.吸出舊培養(yǎng)液，每孔加入5mg/mLMTT溶液20uL和細(xì)胞培養(yǎng)液180uL，37攝氏度再 培養(yǎng)4小時(shí)后，小心吸出培養(yǎng)上清液，每孔加入150uLDMS0，震蕩15分鐘，使紫色潔凈物充分 溶解；
[0042] d.用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定每孔的吸光度值(A值），以空白孔調(diào)零，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0043] f.按照以下公式計(jì)算對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率:抑制率
[0044] 圖1為豌豆蛋白酶解液、蛋白粉、5-FU對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用比較圖，從圖中可以 看出豌豆蛋白粉對(duì)HepG2細(xì)胞影響較小，但經(jīng)蛋白酶作用后生成的酶解產(chǎn)物對(duì)HepG2細(xì)胞生 長(zhǎng)的抑制率大大提高，在濃度為lmg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率相當(dāng)于5-氟尿嘧啶的 68.13%〇
[0045] 圖2為倒置顯微鏡下觀察豌豆蛋白酶解液對(duì)癌細(xì)胞形態(tài)的影響 [0046] a: 100%DEME培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)；
[0047] b:含lmg/mL豌豆蛋白酶解液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)；
[0048] c:含lmg/mL5-FU的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞形態(tài)。
[0049] 從圖中可以看出，用100 %DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞呈紡錘狀，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞貼壁 較好;經(jīng)藥物作用后大多數(shù)細(xì)胞變圓，皺縮，邊界不清，即死細(xì)胞較多。
[0050] 圖3為各級(jí)超濾組分(濃度為lmg/mL)對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，從圖中可以看出 分子量在IKDa以下的肽段對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，經(jīng)分離后，活性組分純度較 高，相比分離前，分子量在IKDa以下的肽粉活性增強(qiáng)。對(duì)癌細(xì)胞的抑制率能達(dá)到61.92%。 [0051 ] 實(shí)施例2
[0052] 一種豌豆活性肽在抑制人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中的應(yīng)用。
[0053]所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下：
[0054] ⑴蛋白酶解液的制備:準(zhǔn)確稱取Sg豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去離子水中混勻，70 °C下熱處理豌豆蛋白15min，按照酶與底物比為lOOOOU/g加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為8.5， 在55°C水浴鍋中反應(yīng)4h后，90°C沸水浴滅酶15min，測(cè)定水解度為16.39% ;
[0055] ⑵將水解后得到的豌豆蛋白水解液冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0056] ⑶利用孔徑大小不同的濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于 1000 KDa的超濾組分；
[0057]⑷將分子量小于1000 KDa的超濾組分凍干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0058] 實(shí)施例3
[0059] 一種豌豆活性肽在抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803中的應(yīng)用。
[0060]所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下：
[00611 ⑴蛋白酶解液的制備:準(zhǔn)確稱取6g豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去離子水中混勻，70 °C下熱處理豌豆蛋白15min，按照酶與底物比為lOOOOU/g加入堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為8.0， 在50°C水浴鍋中反應(yīng)4h后，90°C沸水浴滅酶15min，測(cè)定水解度為17.10% ;
[0062]⑵將水解后得到的豌豆蛋白水解液冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM 中，制備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0063]⑶利用孔徑大小不同的濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于 1000 KDa的超濾組分；
[0064]⑷將分子量小于1000 KDa的超濾組分凍干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0065]以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。2. -種豌豆活性肽在抑制肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用。3. -種豌豆活性肽在抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中的應(yīng)用。4. 一種豌豆活性肽在抑制人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中的應(yīng)用。5. -種豌豆活性肽在抑制人胃癌細(xì)胞MGC-803中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其 特征在于:所述的豌豆活性肽的分子量小于lOOOKDa。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述的豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其 特征在于:所述的豌豆活性肽的制備方法為，步驟如下： ⑴用去離子水配制4%-6%，g/100ml豌豆蛋白溶液，70-90°C下熱處理豌豆蛋白10-30min，調(diào)節(jié)pH值為7.5-9.0，加入堿性蛋白酶，在45-60 °C水浴中反應(yīng)4-6h后，90-100 °C沸水 浴滅酶l〇_15min; ⑵將水解后得到的豌豆蛋白水解液冷凍干燥，將干燥粉溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM中，制 備成含不同濃度豌豆肽的細(xì)胞培養(yǎng)液； (3)利用孔徑大小不同的濾膜對(duì)豌豆蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離，得到分子量小于 lOOOKDa的超濾組分； ⑷將分子量小于l〇〇〇KDa的超濾組分凍干成粉末，得到豌豆活性肽粉。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的豌豆活性肽在抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用，其特征在于:所述的 分級(jí)分離是采用中空纖維超濾膜裝置和攪拌式超濾裝置聯(lián)合使用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106075384SQ201610445484
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】王艷萍, 潘芬
【申請(qǐng)人】天津科技大學(xué)