一種腫瘤融合細(xì)胞疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種腫瘤融合細(xì)胞疫苗的制備方法，將αTCR及βTCR的基因融合為αβTCR，獲得重組質(zhì)粒后將αβTCR構(gòu)建成穿梭質(zhì)粒pMP71?αβTCR，將αβTCR基因轉(zhuǎn)染γδT細(xì)胞，采用電融合技術(shù)融合γδT細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞制成疫苗。本發(fā)明利用αβTCR基因轉(zhuǎn)染γδT細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞形成融合細(xì)胞制備疫苗，該腫瘤疫苗能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞特異性識別，融合細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力最強，并且能夠激活機體受體主動免疫來治療腫瘤。
【專利說明】
一種腫瘤融合細(xì)胞疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種疫苗制備方法，尤其涉及一種腫瘤融合細(xì)胞 的疫苗制備方法，是一種利用CtOTCR基因轉(zhuǎn)染γ δτ細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞形成融合細(xì)胞制備疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤作為一種嚴(yán)重危害人類的身體健康的疾病，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨 勢。根據(jù)衛(wèi)生部腫瘤防治辦公室的數(shù)據(jù)顯示，近20年來，中國每4至5個死亡者中就有1個死 于癌癥，已成為威脅國民健康的頭號殺手。我國每年癌癥發(fā)病人數(shù)約260萬人，死亡約180萬 人。
[0003] 近年來，腫瘤的免疫治療備受關(guān)注，已成為繼手術(shù)、放療、化療后的第4種治療方 法。主要分兩種手段:一是過繼性將體外擴增的具有抗腫瘤活性的特異性毒性免疫細(xì)胞，特 另IJ是將T細(xì)胞輸入到體內(nèi)的被動性免疫治療;二是直接在體內(nèi)刺激抗原遞呈細(xì)胞(APC)擴增 及細(xì)胞因子釋放，達(dá)到抗腫瘤作用的主動性免疫治療。以往，針對腫瘤的免疫治療的研究主 要集中于〇)8+αβΤ細(xì)胞(01)、疆細(xì)胞和細(xì)胞因子方面，008+(^1'細(xì)胞免疫療法主要是通過刺 激αβΤ細(xì)胞來誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，但是在腫瘤細(xì)胞中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)MHC分子的丟失，表現(xiàn)為腫瘤細(xì) 胞對αβΤ細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的耐受，而其他方面的免疫治療也不盡人意，故在較長一段時 間內(nèi)，腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)及臨床研究處于相對停滯狀態(tài)（Lai Q，Ma S，Ge J，Huang Ζ， Huang X, etc .Tcrgammadelta( + )Cd4(-)Cd8(-)T Cells Suppress the Cd8( + )T-Cell Response to Hepatitis B Virus Peptides,and Are Associated with Viral Control in Chronic Hepatitis B.PloS one.2014;9(2):e88475)〇
[0004] 傳統(tǒng)上主要采用有抗原肽刺激樹突狀細(xì)胞(DC)，腫瘤細(xì)胞提取物致敏DC及基因修 飾DC，但因大部分腫瘤缺乏特異性抗原肽，或易誘發(fā)自身免疫性疾病，或缺乏特異性篩選標(biāo) 記分子限制了這些方法的使用與效果。近年來，腫瘤細(xì)胞直接融合DC來致敏DC取得了良好 的效果。盡管DC是體內(nèi)最強的APC，但PBMCs中提取的DC擴增能力很低，多種因子刺激后至多 獲取107個混合DC(包含未成熟，成熟及衰老型），導(dǎo)致它們的抗原提呈能力和持續(xù)時間良莠 不齊，大大降低DC腫瘤疫苗的治療效果(Wu Y，Wu W，Wong麗，etc.Human Gamma Delta T Ce 11s: A Lymphoid Lineage Cell Capable of Professional Phagocytosi s . J Immunol·2009;183(9):5622-5629)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對目前抗腫瘤免疫治療的缺陷，提供一種腫瘤融合細(xì)胞疫苗的制備方 法，是一種利用aOTCR基因轉(zhuǎn)染γδΤ細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞形成融合細(xì)胞制備疫苗的方法。本發(fā)明 通過以下步驟實現(xiàn)：
[0006] 1.取外周血單核細(xì)胞(PBMC)，加入唑來膦酸ΙμΜ和人重組IL-2 400IU/mL并分離出 γ ST細(xì)胞；將HER2369(10-8M)與β2-微球蛋白（10μπιο1/1)加入到細(xì)胞中，37°C，放置2h;每 20min輕輕點到混勻使其充分結(jié)合；用與HER2369結(jié)合的T2細(xì)胞刺激與外周血HLA-A2-T細(xì) 胞;刺激7-14天后，對細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋可得到HER2特異性T細(xì)胞。
[0007] 2.提取HER2特異性T細(xì)胞RNA，用提取的RNA產(chǎn)物來進(jìn)行下一步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條 件：室溫IOmin，42 °C Ih，99 °C 5min滅活A(yù)MV Reverse Transcriptase;將反轉(zhuǎn)錄的 cDNA置于-80度冰箱保存，備用。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板PCR合成TCRa-以及TCRP目的片段，合成的 目的片段帶有Not I、EcoR I酶切位點。提取的RNA產(chǎn)物行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如下:預(yù)熱 95°C，2min; 95°C變性30s，65°C退火30s，70°C延伸2min，（35個循環(huán)）70°C IOmin，4°C停止。凝 膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，參照說明書用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物;或者用PCR純化試劑盒對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后的目的片段與載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，Not I和EcoR I雙酶切目的片 段以及載體PMP71 (比例5:1)，之后進(jìn)行連接，16 °C連接16h，65 °C加熱IOmin使酶滅活，連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至T0P10感受態(tài)細(xì)胞。以堿裂法提取得到ρΜΡ71/ΤΟ?αβ質(zhì)粒。
[0008] 3.用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將穿梭質(zhì)粒ρΜΡ71-αβΤΟ?和骨架質(zhì)粒(腺病毒轉(zhuǎn)染 需要穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒）共轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞，質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000的比率為Iyg :1.5μ1。取 2x105-5x105激活的γ δΤ細(xì)胞，在室溫下將凍存的慢病毒顆粒融化，輕輕混勻，將0.75ml慢 病毒顆粒加入T細(xì)胞中；2周后，使用抗人⑶3，⑶45，⑶4，⑶8，⑶45R0，⑶62L抗體以及FITC標(biāo) 記的羊抗鼠 F(ab'）2抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析;轉(zhuǎn)染成功HER2c^TCR- γ δΤ細(xì)胞。
[0009] 4.采用電融合技術(shù)融合γδτ細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞制成疫苗。將上述轉(zhuǎn)染的HER2-ai3 TCR-γδΤ細(xì)胞與經(jīng)80Gy射線照射后的SA0S-2-LUC細(xì)胞在融合介質(zhì)中洗滌、重懸，細(xì)胞濃度 在5 X 106-15 X 10%1，利用電融合儀進(jìn)行融合得到融合細(xì)胞。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述方法在制備腫瘤融合細(xì)胞疫苗中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明制備對腫瘤細(xì)胞特異性識別且激活機體受體主動免疫的細(xì)胞疫苗，增加特 異性，提高其在體內(nèi)的作用時間和效果。本發(fā)明在制備出腫瘤疫苗后測試其效果，分別對腫 瘤細(xì)胞進(jìn)行CCK-8增殖活性檢測，LDH細(xì)胞毒性反應(yīng)檢測，細(xì)胞凋亡流式檢測。實驗分組:① SA0S-2-LUC腫瘤細(xì)胞對照組、② γ ST+SA0S-2-LUC細(xì)胞組、③HER2c^TCR- γ ST+SA0S-2-LUC 細(xì)胞組、④腫瘤融合細(xì)胞+SA0S-2-LUC細(xì)胞組，每個組別設(shè)置3個重復(fù)孔，37 °C、5 % C02培養(yǎng)。 實驗結(jié)果表明，該腫瘤疫苗能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞特異性識別，融合細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能 力最強，能夠激活機體受體主動免疫來治療腫瘤。
【附圖說明】
[0012]圖1是顯微鏡檢測γ δΤ細(xì)胞體外誘導(dǎo)效果。
[0013] 圖2是流式細(xì)胞術(shù)鑒定γδτ細(xì)胞。
[0014] 圖3是LDH法檢測γ δΤ細(xì)胞對SAOS的殺傷作用。
[0015] 圖4是ELISA檢測HER2特異性（*與Control比較Ρ〈0·05,林*與Control比較Ρ〈 0 · 001，η = 3)。
[0016] 圖5是CCCK-8檢測靶細(xì)胞增殖活性(*與Contro 1比較Ρ〈0 · 05，*#與Control比較Ρ〈 0 · 01，η = 3)。
[0017] 圖6是LDH法檢測靶細(xì)胞毒性反應(yīng)(*與Control比較Ρ〈0· 05，#與Control比較Ρ〈 0 · 01，η = 3)。
[0018]圖7是流式細(xì)胞術(shù)檢測靶細(xì)胞凋亡。
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明結(jié)合實施例作進(jìn)一步的說明。
[0020] 實施例1 一種腫瘤融合細(xì)胞疫苗制備方法
[0021] 1.外周血單核細(xì)胞(PBMC)的分離
[0022] 取外周血單核細(xì)胞PBMC(或以RPMI 1640培養(yǎng)基1:1稀釋外周血標(biāo)本，加入含有淋 巴細(xì)胞分離液的離心管(稀釋靜脈血與淋巴細(xì)胞分離液體積比2:1 )，500 X g離心20min。吸 取淋巴細(xì)胞分離液界面乳白色單核細(xì)胞層，以RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌2次以完全培養(yǎng)基調(diào)整 細(xì)胞濃度至IO6細(xì)胞/mL備用。
[0023] 2.γδΤ細(xì)胞的制備
[0024] 1)正常人及OS患者γ δΤ細(xì)胞的分離，計數(shù)外周血單個核細(xì)胞總量，調(diào)整細(xì)胞濃度 為1~2 X 106/mL，取24孔板，每孔加入ImL細(xì)胞懸液，置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
[0025] 2)培養(yǎng)第一天加入唑來膦酸ΙμΜ和人重組IL-2 400IU/mL(Zol+IL-2組）；
[0026] 3)每3d更換一次培養(yǎng)基，添加含人重組IL-2 400IU/mL的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)12-14d 后收獲正常人的γ ST細(xì)胞。結(jié)果見圖1。
[0027] 3. γδΤ細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定
[0028] 胰酶消化下細(xì)胞，1500rpm離心5min，并用0.01Μ PBS清洗細(xì)胞2次；用0.01Μ PBS制 備細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞濃度約為5 X 106/mL。根據(jù)細(xì)胞需要量分細(xì)胞于3個1.5mL干凈的EP管 中。分別標(biāo)記為ctr組；IL-2組、Zol+IL-2組；Ctr組為PBS對照（未處理組）加入TCR-γδΤ-ΡΕ 抗體+CD3-FITC抗體；IL-2組加入TCR- γ δΤ-PE抗體+CD3-FITC抗體；Zol+IL-2組加入TCR- γ ST-PE抗體+⑶3-FITC抗體;上述三組細(xì)胞室溫孵育30min;0.OlM PBS清洗兩遍，重新調(diào)整細(xì) 胞濃度，上機前先用篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，以防止細(xì)胞堵塞分選孔，然后上機檢測。結(jié)果見圖2。 [0029] 4.正常人γ δΤ細(xì)胞殺傷活性驗證
[0030] 將分離得到的正常人γ δΤ細(xì)胞與SAOS共培養(yǎng)4h，LDH法檢測γ δΤ細(xì)胞對SAOS的殺 傷作用，篩選殺傷率較高者進(jìn)行后續(xù)實驗。
[0031] 1)將分離得到的正常人及OS患者γ δΤ細(xì)胞與SAOS細(xì)胞共培養(yǎng)4h;
[0032] 2)依照不同比例進(jìn)行共培養(yǎng)，通常比例設(shè)置，1.5:1;3:1;6 :1;12:1;
[0033] 3)每個組別設(shè)置3個重復(fù)孔，37 °C 5 % C02培養(yǎng)；
[0034] 4)24h后取上清，根據(jù)LDH ELISA檢測試劑盒的說明書步驟操作；
[0035] 5)酶標(biāo)儀讀數(shù)。結(jié)果見圖3。
[0036] 3.HER2特異性T細(xì)胞的制備
[0037] 制備步驟
[0038] 1)用RPMI-1640清洗HLA-A2+T2細(xì)胞（品牌：IBL-America，貨號：Cell-02816)兩次， 以去除細(xì)胞培養(yǎng)基中的多肽；
[0039] 2)將細(xì)胞以2xl06/ml濃度重懸于無血清培養(yǎng)基(AIM-V)中；
[0040] 3)將HER2369(10-8M)與β2-微球蛋白（10μπιο1/1)加入到細(xì)胞中，37°C，放置2h;每 20min輕輕點到混勻使其充分結(jié)合；
[00411 4)RPMI-1640清洗細(xì)胞一次，重懸于培養(yǎng)基中；
[0042] 5)用與HER2369結(jié)合的T2細(xì)胞刺激與從健康志愿者血液中分離得到HLA-A2-T細(xì) 胞；
[0043] 6)刺激7-14天后，對細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋可得到HER2特異性T細(xì)胞。
[0044] 4.pMP71/TCRa 和 pMP71/TCR0 質(zhì)粒構(gòu)建
[0045] HER2特異性T細(xì)胞RNA提?。?br>[0046] 1)收取激活后的HER2特異性T細(xì)胞I X 106,用PBS沖洗2遍；
[0047] 2)去掉上清后，向細(xì)胞沉淀中加入1ml Trizol，吹打成均勻細(xì)胞懸浮液；
[0048] 3) Iml注射器來回抽吸以剪切基因組DNA，然后用注射器直接將樣品轉(zhuǎn)移到一新的 1.5ml EP管中；
[0049] 4)向EP管中加入200微升氯仿，劇烈震蕩30sec，12000rpm離心5min;
[0050] 5)將上清移至另一新的1.5ml EP管中，并加入等體積的異丙醇，室溫放置5min;
[0051 ] 6)12000rpm 離心 5min，吸走上清液；
[0052] 7)加入70%乙醇700微升，不需吹打，12000rpm離心2min;
[0053] 8)盡可能徹底去除上清，室溫干燥使乙醇揮發(fā)；
[0054] 9)用50微升DEPC水溶解沉淀；
[0055] 10)取溶解的RNA 2微升加入1ml DEPC水中，紫外分光光度計測量260nm和280nm的 吸光度值。按IOD = 40微克RNA計算RNA的產(chǎn)率:0D260/280在1.8-2.0視為提取的RNA純度很 尚；
[0056] 11)用提取的RNA產(chǎn)物來進(jìn)行下一步RT反應(yīng)。
[0057] 表1 RT反應(yīng)條件
[0059] RT 反應(yīng)條件：室溫 1〇111；[11，42。0111，99。05111；[11滅活4]\^1^￥6186 1'瓜118(31^口七&86;將 反轉(zhuǎn)錄的cDNA置于-80度冰箱保存，備用。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板PCR合成TCRa-以及 TCRP目的片段，合成的目的片段帶有Not I、EcoR頂每切位點。
[0060] 表2 PCR體系

[0065] PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)熱95°C，2min;95°C變性30s，65°C退火30s，70°C延伸2min， (35個循環(huán))70°C10min，4°C停止。凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，參照說明書用凝膠回收試劑盒回 收PCR產(chǎn)物;或者用PCR純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。純化后的目的片段TCR-HER2-la和 TCR-HER2-li3(具體序列詳見序列表)與載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，具體操作如下：
[0066] Not I和EcoR I雙酶切目的片段以及載體pMP71(比例5:1)，之后進(jìn)行連接，過程見 表4。
[0067] 表4 Not I和EcoR I雙酶切體系：
L 0072 J 16Γ連接16h，65uc加熱1〇!1^11便_火沽，連接嚴(yán)物轉(zhuǎn)化全TOPlO感受態(tài)細(xì)胞。
[0073] 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài)細(xì)胞：
[0074] 1)無菌狀態(tài)下取新鮮感受態(tài)500微升；如果使用凍存的感受態(tài)細(xì)胞時，則將其從- 70°C冰箱取出，置于冰上，待其解凍后立即吸取500微升，剩余的感受態(tài)可棄去，不能再凍存 復(fù)用；
[0075] 2)每管加入2微升連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min;
[0076] 3)42。(：熱激458，冰上靜置2!1^11;
[0077] 4)每管加200μ1 S.0.C培養(yǎng)基，37°C，300rpm Ih;
[0078] 5)用無菌彎頭玻璃鋪菌器將100微升菌液鋪于含氨卞青霉素 (Amp)的LB平板表面， 37°C平放20min，然后倒置培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆進(jìn)行測序及PCR驗證。
[0079] 堿裂解法小量提取質(zhì)粒(QIAGEN公司質(zhì)粒提取試劑盒）：
[0080] 1)用無菌牙簽從LB平板上挑取單個菌落，接種于3mL含氨芐青霉素（lOOyg/mL)的 LB培養(yǎng)液中，37 °C 230 X g，劇烈振搖12~16h;
[0081 ] 2)取2mL菌液置eppendorf管中，12000 X g離心2min，棄上清液；
[0082] 3)用250yL的Solution〗（含RNase A)充分懸浮細(xì)菌沉淀(注意不要殘留細(xì)小菌塊， 可以使用振蕩器(Vortex)等劇烈振蕩使菌體充分懸?。?br>[0083] 4)加入150yL的Solutionn輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5~6次，隨后將離心管放置于冰 上1~2min，使菌體充分裂解，形成透明溶液(此步驟不宜超過2min);
[0084] 5)加入150uL Solutionm，立即溫和顛倒離心管數(shù)次，室溫放置Smint3WOOOXg離 心12min。要得到更好的質(zhì)粒提取效果，請于步驟2和步驟3,冰上放置；
[0085] 6)將420uL結(jié)合緩沖液加入離心吸附柱中，然后將步驟5中的上清加入A型離心吸 附柱中（盡量去除雜質(zhì)），混勻，12000 X g離心30s。倒掉廢液收集管中的廢液；
[0086] 7)加入750uL漂洗液于離心吸附柱中，靜置Imin后，12000 Xg離心15s。倒掉廢液收 集管中的廢液。重復(fù)一次。倒掉廢液后。再次于12000 X g離心2min，盡量除去漂洗緩沖液； [0087] 8)小心取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5mL Eppendorf離心管中，加入適 量dH20水或洗脫緩沖液(Elution buffer)，室溫放置2~5min后，12，000 X g離心Imin;
[0088] 9)柱子上還掛有適量質(zhì)粒DNA，重復(fù)步驟8，取20uL洗脫，室溫放置1~3min，12000 X g離心Imin，最后將洗脫的體積合為一管。
[0089] 以克隆得到的pMP71/TCRa和pMP71/TCRf3質(zhì)粒為模板，進(jìn)行αβΤΟ?的基因融合及克 隆，獲得重組質(zhì)粒后將ai3TCR連接到腺病毒穿梭質(zhì)粒ρΜΡ71載體中構(gòu)建穿梭質(zhì)粒ρΜΡ71_αβ TCR;具體操作步驟如下:aPTCR重組質(zhì)粒與ρΜΡ71載體分別進(jìn)行Not I、EcoR I雙酶切，酶切 體系見表6。
[0090]表 6
[0093]將酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，準(zhǔn)備連接，過程參見表7。
[0094] 表7連接體系
[0096] 16°C連接16h，65°C10min使酶失活，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至T0P10感受態(tài)中。質(zhì)粒的提 取參照上法。將陽性克隆進(jìn)行PCR及測序驗證。
[0097] 堿裂解法小量提取質(zhì)粒(QIAGEN公司質(zhì)粒提取試劑盒)方法見上。
[0098] 重組質(zhì)粒的大量提取(QIAGEN公司無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒），大量制備穿梭質(zhì)粒 為轉(zhuǎn)染做準(zhǔn)備：
[0099] 1)收集菌體:500ml離心管收集菌體，4500rpm lOmin，加 STE 15m懸浮菌液于50ml 離心管中；
[0100] 2)4°C，8000rpm，15min去上清，菌液懸浮于solution I 3.2mL;
[0101] 3)加 solution II 6.4mL，立即溫和震蕩，至菌體清亮，室溫放置3-10min;
[0102] 4)加 solution III 4.8mL，立刻搖勾，于(TC放3_5min;
[0103] 5)4°C，8000rpm，15rain，收集上清于50ml離心管；
[0104] 6)加等體積氯仿:異戊醇(24:1)混勾，4°C，8000rpm，15min;
[0105] 7)取上清于50ml離心管中，加0.6倍體積的異丙醇，20°C30min;
[0106] 8)4°C，8000rpm，15min，去上清；
[0107] 9)加 Iml 50XTE，溶解沉淀，再加 Iml RNase酶母液(終濃度lmg/ml)，37°C1-2h;
[0108] 10 )加2倍體積的無水乙醇和I /10體積的NaAc (3M，pH5.2 )，混勻5miη，4 °C， 9000rpm，15min，去上清；
[0109] 11)70%乙醇洗滌lmin，9000rpm lmim;
[0110] 12)500ul TE溶解，-20°C保存。
[0111] 5.穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建
[0112] PS:腺病毒包裝中的難點主要在于怎么將外源基因表達(dá)框構(gòu)建至腺病毒骨架載體 上。由于腺病毒骨架載體比較大（~30kb)，而且載體中的一些常用酶切位點幾乎都有多個， 如果用常規(guī)的酶切-連接的方式將外源基因構(gòu)建至腺病毒骨架載體上，成功率很低，因此， 目前的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)基本上都是用穿梭載體利用同源重組的方法將外源基因構(gòu)建至腺 病毒骨架載體上?，F(xiàn)在使用的慢病毒載體大多是四質(zhì)粒系統(tǒng)，四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，即是 Gag/P0l、Rev、VSV-G(代替HIV-l的EnV)分別獨立放置在3個質(zhì)粒上即骨架質(zhì)粒(pGag/P 0l、 pReV、pVSV-G)，另外的一個就是可以放目的基因的質(zhì)粒即穿梭質(zhì)粒。VSV-G來源于水泡口炎 病毒具有廣泛的嗜性，能夠感染大多數(shù)細(xì)胞。四質(zhì)粒系統(tǒng)將Gag/Pol、Rev分別放在不同的載 體上，增強了病毒載體的安全性。
[0113] 慢病毒顆粒獲取
[0114] I) 75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)293T細(xì)胞，選取融合度60-70 % 293T細(xì)胞，換液后三小 時后備用；
[0115] 2)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將穿梭質(zhì)粒ρΜΡ71-αβΤΟ?和骨架質(zhì)粒(腺病毒轉(zhuǎn)染 需要穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒)共轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞，質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000的比率為Iyg :1.5μ1;
[0116] 表8
[0118] (四質(zhì)粒之間比例可以根據(jù)實際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，以達(dá)到最大感染效率。）
[0119] 3)待細(xì)胞長滿培養(yǎng)板時，將其消化轉(zhuǎn)移至IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0120] 4)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后約IO-Hd時，可觀察到病毒病變斑出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)1-2天使病變斑擴 大；
[0121] 5) 1000 g離心5min收集細(xì)胞，將細(xì)胞于-80°C和37 °C反復(fù)凍融3次后1000 g離心 IOmin，上清液即為初次收獲的病毒液。
[0122] 慢病毒的濃縮
[0123] 1)取收集的293T細(xì)胞上清液約35ml收集于50ml離心管中，2000rpm離心10min，去 除293T細(xì)胞碎片；
[0124] 2)將獲得的上清液置于冰上，用60ml注射器連接0.45μπι針頭濾器將離心后的上清 液過濾于35ml超速離心管中，25 ,OOOrpm離心3小時；
[0125] 3)將離心管輕輕取出，置于冰上；
[0126] 4)在病毒專用超凈臺中，打開金屬離心管，吸去部分離心后的病毒上清，用鑷子取 出超速離心管，吸去大部分上清，剩余約4ml;
[0127] 5)用5ml移液管反復(fù)吹打剩余的4ml病毒上清約10次，0.75ml/管進(jìn)行分裝，放入-80 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0128] 慢病毒轉(zhuǎn)染γδτ細(xì)胞
[0129] 1)取2x105-5x105激活的γ δΤ細(xì)胞，在室溫下將凍存的慢病毒顆粒融化，輕輕混 勻，將0.75ml慢病毒顆粒加入T細(xì)胞中；
[0130] 2)向24孔板中加入凝聚胺，用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整至終濃度8μg/ml，將24孔板放 入離心機離心，2500rpm，1.5小時。離心后將24孔板放于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜； [0131] 3)離心過夜培養(yǎng)的24孔板，去掉大部分含慢病毒顆粒的上清培養(yǎng)液，加入新鮮的 RPMI-1640培養(yǎng)液，擴增T細(xì)胞；
[0132] 4)每2天計數(shù)T細(xì)胞，向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入IL-2 400IU/ml，維持細(xì)胞密度為 0.5-lxl06/ml；
[0133] 5)2周后，使用抗人0)3,0)45,004,008,0)45肋，0)621^抗體以及？11'(：標(biāo)記的羊抗鼠 F(ab'）2抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析；
[0134] 6)轉(zhuǎn)染成功 ΗΕΚ2αβΤα?-γδΤ 細(xì)胞。
[0135] HER2-c^TCR- γ δΤ細(xì)胞體外功能檢測（此步驟驗證HER2-1的抗腫瘤免疫應(yīng)答以及 多肽識別特異性）
[0136] A:效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共培養(yǎng)驗證HER2特異性（黑色素瘤細(xì)胞系SK-Mel 29表達(dá) HER2/neu以及SA0S-2-LUC細(xì)胞作為靶細(xì)胞）
[0137] 1)用0.25%胰酶消化相應(yīng)細(xì)胞后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基中和胰酶，離心后調(diào)整細(xì) 胞密度為lxl〇6/ml，取100ul(lxl05)腫瘤細(xì)胞接種于U型96孔板中，設(shè)置3個復(fù)孔；
[0138] 2)HER2特異性T細(xì)胞在無 IL-2的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜，使T淋巴細(xì)胞靜息；
[0139] 3)收取靜息的T淋巴細(xì)胞，離心去掉上清，將細(xì)胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液中，計 數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為lxl〇6/ml，取100ul(lxl05)T細(xì)胞接種于U型96孔板中已經(jīng)接種相應(yīng)腫 瘤細(xì)胞的孔中，將96孔板放置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。只有T細(xì)胞的孔作為陰性 對照孔。
[0140] B: IFN- γ ELISA檢測HER2特異性
[0141] 1)包被:按說明書指導(dǎo)，將Capture抗體稀釋于IX包被緩沖液中，向試劑盒提供的 微孔板中的各反應(yīng)孔中各加0.1 ml，塑料貼紙覆M微孔板，放置4 °C過夜。
[0142] 2)封閉：將過夜后的微孔板用自動ELISA洗板機洗漆4次后，拋干，用IX分析緩沖液 100UI封閉1小時。
[0143] 3)加樣:將微孔板再次洗漆4次后，拋干，向各反應(yīng)孔加入待檢測的T細(xì)胞與腫瘤細(xì) 胞共培養(yǎng)的上清液IOOul，相應(yīng)稀釋倍數(shù)的上清液及IFN- γ標(biāo)準(zhǔn)品（1000pg/ml，倍比稀釋至 15.6pg/ml)，室溫鮮育2小時。
[0144] 4)加檢測抗體:微孔板洗滌4次后，拋干，按說明書指定將Detect ion抗體用IX分析 緩沖液稀釋，取100UI加入各反應(yīng)孔中，室溫孵育1小時。
[0145] 5)加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗:微孔板洗漆4次后，拋干，將HRP標(biāo)記的抗體用IX 分析緩沖液稀釋，向各反應(yīng)孔中各加100UI，室溫孵育0.5小時。
[0146] 6)微孔板洗漆4次后，拋干，向各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液IOOul，避 光孵育15分鐘。
[0147] 7)向各反應(yīng)孔中加入IM硫酸IOOul終止反應(yīng)。
[0148] 8)結(jié)果判定:在EUSA檢測儀上，以空白對照孔調(diào)零，檢測各孔450nm吸光值(0D值）， 計算IFN-γ濃度值。結(jié)果見圖4。
[0149] 6.ΗΕΚ2αβΤΟ?_γδΤ和骨肉瘤細(xì)胞的融合、純化。
[0150] SA0S-2-LUC人骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)
[0151] SA0S-2-LUC細(xì)胞復(fù)蘇后在用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中 lOOU/mL青霉素和100g/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，制成單細(xì)胞懸液，于37 °C、5 % CO2培養(yǎng) 箱培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)，每3d換液1次。0.25%的胰蛋白酶消化傳代。換液后，在倒置顯微鏡下觀察 細(xì)胞形態(tài)及生長情況。
[0152] 融合細(xì)胞制備
[0153] 將上述轉(zhuǎn)染的HER2-a0TCR- γ δΤ細(xì)胞與經(jīng)80Gy射線照射后的SA0S-2-LUC細(xì)胞在融 合介質(zhì)中洗滌、重懸，細(xì)胞濃度在5X106-15X106/ml，利用電融合儀進(jìn)行融合。得到骨肉瘤 融合細(xì)胞。具體操作步驟如下：
[0154] 1)融合條件：融合電極3.2mm;AC 50V，5Sec;DC 250V，30ySec;2pulses(ECM 2001 型細(xì)胞融合儀:美國BTX公司）；
[0155] 2)HER2-c^TCR- γ δΤ細(xì)胞：SA0S-2-LUC = 5:1，用0.3M葡萄糖溶液洗一次，將總數(shù)為 5 X 106個的細(xì)胞懸浮在0.5ml葡萄糖溶液中；
[0156] 3)把細(xì)胞加到電極槽中，按上述條件設(shè)定融合儀參數(shù)，觸發(fā)融合按鈕放電融合；
[0157] 4)用吸管轉(zhuǎn)移細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中加含10%FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。
[0158] MACS純化融合細(xì)胞
[0159] 利用MACS系統(tǒng)(MiniMACS磁性分離儀;德國Miltenyi Biotec GmbH公司）純化骨肉 瘤融合細(xì)胞操作步驟如下：
[0160] 1)融合后細(xì)胞在培養(yǎng)24h后用胰蛋白酶消化，收集107個細(xì)胞懸浮在80μ1 PBS中；
[0161] 2)加20μ1 1:10稀釋的0X62 mAb，工作濃度1:50,混勻后在4°C放置IOmin;
[0162] 3)加 Iml PBS，300g離心10min，共洗2次；
[0163] 4)細(xì)胞重懸在80μ1 PBS中，加20μ1已標(biāo)記的磁微球，在4°C放置15min;
[0164] 5)用Iml的PBS洗細(xì)胞1次，300g離心10min收集細(xì)胞，重懸在500μ1 PBS中；
[0165] 6)細(xì)胞加到預(yù)先用500μ1 PBS洗過的分離柱中；
[0166] 7)收集流出液，再用500μ1 PBS洗3次柱子，流出液收集到一起；
[0167] 8)把分離柱從架子上取下來，然后加500μ1 roS，用針芯快速推出緩沖液，把細(xì)胞 洗脫下來；
[0168] 9)將分離純化后的細(xì)胞置瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0169] g.靶細(xì)胞的增值活性檢測
[0170] 1)將凍存的SA0S-2-LUC細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，離心后，用含10%FBS的1640完全培養(yǎng)基進(jìn) 行培養(yǎng)；
[0171 ] 2)待SA0S-2-LUC細(xì)胞長滿后進(jìn)行傳代分盤，接于96孔板中進(jìn)行CCK-8實驗；
[0172] 3)取處于對數(shù)生長期的3403-2-〇](：細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，接種5\105/1^細(xì) 胞于96孔板中，每孔加入200yL的培養(yǎng)液，于37°C，5%C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0173] 4)進(jìn)行實驗分組：① SA0S-2-LUC control組、② γ ST+SA0S-2-LUC細(xì)胞組、③HER2a βΤΟ?-γδΤ+3Α03-2-Ι?(：細(xì)胞組、④骨肉瘤融合細(xì)胞+SA0S-2-LUC細(xì)胞組，每個組別設(shè)置3個 重復(fù)孔，37°C、5%C02培養(yǎng)；
[0174] 5)分別于24h、48h加入CCK-8試劑，每孔20yL，繼續(xù)于培養(yǎng)箱37°C，5 %⑶2培養(yǎng)3h 后，450nm波長進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖5 〇
[0175] H.靶細(xì)胞的毒性反應(yīng)檢測
[0176] 1)取處于對數(shù)生長期的3403-2-〇](：細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，接種5\105/1^細(xì) 胞于96孔板中，每孔加入200yL的培養(yǎng)液，于37°C，5%C02
[0177] 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0178] 2)進(jìn)行實驗分組：① SA0S-2-LUC control組、② γ ST+SA0S-2-LUC細(xì)胞組、③HER2a βΤΟ?-γδΤ+3Α03-2-Ι?(：細(xì)胞組、④骨肉瘤融合細(xì)胞+SA0S-2-LUC細(xì)胞組，每個組別設(shè)置3個 重復(fù)孔，37°C、5%C02培養(yǎng)；
[0179] 3)24h后取上清，根據(jù)LDH ELISA檢測試劑盒的說明書步驟操作;結(jié)果見圖6。
[0180] i靶細(xì)胞凋亡檢測
[0181] 共培養(yǎng)48h后，利用Annexin V和PI雙染靶細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡
[0182] 1)從正常人血液中分離PBMC細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)分離，收獲γ δΤ細(xì)胞；
[0183] 2)進(jìn)行實驗分組：① SA0S-2-LUC control組、② γ ST+SA0S-2-LUC細(xì)胞組、③HER2a CTCR+SAOSHUC細(xì)胞組、④骨肉瘤融合細(xì)胞+SA0S-2-LUC細(xì)
[0184] 胞組，37°C、5%C02 培養(yǎng) 48h;
[0185] 3)PBS洗滌細(xì)胞兩次，收集細(xì)胞1~5X105細(xì)胞；
[0186] 4)加入500yL的AnnexinV Binding Buffer懸浮細(xì)胞；
[0187] 5)加入5yL AnnexinV-FITC混勾后，加入5yLPropidium Iodide(周期檢測只加5yL Propidium Iodide)，混勾；
[0188] 7)用流式細(xì)胞儀檢測(Ex = 488nm; Em = 530nm)凋亡情況。結(jié)果見圖7 〇
【主權(quán)項】
1. 一種腫瘤融合細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)： (1) 取外周血單核細(xì)胞，加入唑來膦酸ΙμΜ和人重組IL-2400IU/mL并分離出γ δτ細(xì)胞； 將HER2369與β2-微球蛋白加入到細(xì)胞中，37°C，放置2h;每20min輕輕點到混勻使其充分結(jié) 合，用與HER2369結(jié)合的T2細(xì)胞刺激與外周血HLA-A2-T細(xì)胞，刺激7-14天后，對細(xì)胞進(jìn)行稀 釋得到HER2特異性T細(xì)胞； (2) 提取HER2特異性T細(xì)胞RNA，用提取的RNA產(chǎn)物進(jìn)行下一步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反轉(zhuǎn)錄的 cDNA置于-80度冰箱保存，備用，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板PCR合成TCRa-以及TCRi3目的片 段，合成的目的片段帶有Not I、EcoR I酶切位點，提取的RNA產(chǎn)物行PCR反應(yīng)，凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物，參照說明書用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，或者用PCR純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn) 行純化，純化后的目的片段與載體進(jìn)行酶切反應(yīng)，Not I和EcoR I雙酶切目的片段以及載體 PMP71，比例5:1，之后進(jìn)行連接，16°C連接16h，65°C加熱lOmin使酶滅活，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 T0P10感受態(tài)細(xì)胞，以堿裂法提取得到ρΜΡ71/ΤΟ?αβ質(zhì)粒； (3) 用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將穿梭質(zhì)粒pMP71-a0TCR和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293Τ細(xì) 胞，質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000的比率為lyg: 1.5μ1，取2x105-5x105激活的γ δΤ細(xì)胞，在室溫下將凍 存的慢病毒顆粒融化，輕輕混勻，將〇. 75ml慢病毒顆粒加入Τ細(xì)胞中，2周后，使用抗人⑶3， ⑶45，⑶4，⑶8，⑶45R0，⑶62L抗體以及FITC標(biāo)記的羊抗鼠 F(ab '）2抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分 析，轉(zhuǎn)染成功HEI^aOTCR- γ δΤ細(xì)胞； (4) 采用電融合技術(shù)融合γδΤ細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞制成疫苗，將上述轉(zhuǎn)染的HER2-c^TCR-y δΤ細(xì)胞與經(jīng)80Gy射線照射后的SA0S-2-LUC細(xì)胞在融合介質(zhì)中洗滌、重懸，細(xì)胞濃度在5X 106-15 X 106/ml，利用電融合儀進(jìn)行融合得到融合細(xì)胞。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤融合細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：室溫l〇min，42°Clh，99°C5min滅活A(yù)MV Reverse Transcriptase。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤融合細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于，步驟(2)PCR 反應(yīng)程序如下：預(yù)熱95°C，2min;95°C變性30s，65°C退火30s，70°C延伸2min，（35個循環(huán)）70 °C10min，4°C 停止。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法在制備腫瘤融合細(xì)胞疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/00GK106075417SQ201610539799
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月6日
【發(fā)明人】朱健, 陶惠民, 梁成振
【申請人】浙江大學(xué)