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      一種抗腫瘤藥物制劑組合的制作方法

      文檔序號:10705404閱讀:719來源:國知局
      一種抗腫瘤藥物制劑組合的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明提供一種抗腫瘤藥物制劑組合,其包括IFN?γ與IDO抑制劑,或者IFN?γ與AhR抑制劑。本發(fā)明提供的抗腫瘤藥物制劑組合不但可以將分化的腫瘤細(xì)胞殺滅,而且可以將進(jìn)入休眠的腫瘤細(xì)胞殺滅,具有徹底清除腫瘤細(xì)胞的效果。
      【專利說明】
      一種抗腫瘤藥物制劑組合
      技術(shù)領(lǐng)域
      [0001 ]本發(fā)明涉及一種藥物制劑組合,尤其涉及一種抗腫瘤藥物制劑組合。
      【背景技術(shù)】
      [0002]惡性腫瘤作為一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病,近年來尋找有效、毒副作用小的治療方法已成為醫(yī)學(xué)研究的重中之重。
      [0003]腫瘤的生物治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù),其運(yùn)用生物技術(shù)和生物制劑對從病人體內(nèi)采集的免疫細(xì)胞、或免疫因子進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法,來激發(fā),增強(qiáng)機(jī)體自身免疫功能,達(dá)到治療腫瘤的目的。其安全性高、殺瘤特異性強(qiáng)、無毒副作用的優(yōu)點(diǎn),被稱為瘤學(xué)科的“綠色生物療法”。
      [0004]腫瘤休眠(tumordormancy)是臨床上普遍存在的一種現(xiàn)象,也是惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征之一,休眠細(xì)胞的長期存在是惡性腫瘤難以徹底根治的主要原因,也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的根源之一。
      [0005]由于對腫瘤休眠的機(jī)制認(rèn)識不清,使用目前治療腫瘤的方法,雖然能夠暫時(shí)實(shí)現(xiàn)臨床上對腫瘤的治愈,但是由于休眠的腫瘤細(xì)胞沒有被有效殺滅,若干月或年后腫瘤又會復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。
      [0006]因此,如何提供可以將休眠的腫瘤細(xì)胞殺滅,達(dá)到徹底清除腫瘤的作用成為有待解決的問題。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0007]本發(fā)明提供了一種抗腫瘤藥物制劑組合,包括IFN-γ與IDO抑制劑,或者IFN-γ與AhR抑制劑,聯(lián)合使用上述制劑不但可以將分化的腫瘤細(xì)胞殺滅,而且可以將進(jìn)入休眠的腫瘤細(xì)胞殺滅,具有徹底清除腫瘤細(xì)胞的效果。
      [0008]在本申請的方案中,所述IFN-γ與IDO抑制劑,或IFN-γ與AhR抑制劑,作為整體稱作本發(fā)明的抗腫瘤藥物制劑組合。
      [0009]在本申請的方案中,IFN-γ可以是商業(yè)購買的IFN- γ制劑,或者是由腺病毒載體攜帶的IFN- γ制劑;IDO抑制劑包括各種競爭性及非競爭性吲哚胺2,3-雙加氧化酶抑制劑(indoleamine 2,3-d1xygenase)抑制劑;AhR抑制劑包括各種芳經(jīng)受體(arylhydrocarbonreceptor)完全或者部分措抗劑。
      [0010]在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中,所述IDO抑制劑包括1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan),簡稱 1-MT。
      [0011 ]進(jìn)一步的,所述AhR抑制劑包括二甲基甲酰胺,簡稱DMF。
      [0012]更進(jìn)一步的,所述抗腫瘤藥物制劑組合中的IFN- γ、ID0抑制劑以及AhR抑制劑為單位制劑。
      [0013]本發(fā)明的所述抗腫瘤藥物制劑組合中的IFN-γ、IDO抑制劑以及AhR抑制劑為單位制劑。所述單位制劑為滿足一次給藥所需有效成分的制劑,如一單位(針)針劑等?;颊咭淮问┯盟璧乃幬锏牧靠梢苑奖愕赝ㄟ^計(jì)算患者的體重和該患者一次用藥所需單位體重劑量的乘積得到。例如,在制備藥物的過程中,一般認(rèn)為成人體重為50-70kg,可以通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的單位體重劑量之間的等效劑量換算關(guān)系來確定用藥量。例如,可以根據(jù)FDA、SFDA等藥品管理機(jī)構(gòu)提出的指導(dǎo)意見,也可參考(黃繼漢等,“藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算”,《中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)》,2004Sep;9(9):1069-1072)來確定。在本發(fā)明的實(shí)施方式中,可以使用按照人和小鼠的體表面積折算系數(shù)0.0026來換算人和小鼠的劑量。
      [0014]在本發(fā)明的方案中,針對體重為20g的小鼠,IFN-γ以5X 14-1 X 15U的量施用給小鼠,IDO抑制劑以15-20mg的量施用給小鼠(例如對于20g的小鼠,將IDO抑制劑用水配制為5mg/mL的溶液,小鼠每天灌服該溶液3_4mL),AhR抑制劑以5mg/kg小鼠體重的量施用。
      [0015]更進(jìn)一步的,根據(jù)針對小鼠的實(shí)驗(yàn),針對人(例如50_70kg體重)的所述IFN-γ單位制劑中包括I X 17?4 X 17U的IFN- γ ;所述IDO抑制劑單位制劑中包括4?8g的IDO抑制劑;所述AhR抑制劑中包括27-50mg的AhR抑制劑。
      [0016]進(jìn)一步的,所述IDO抑制劑為1-MT。
      [0017]更進(jìn)一步的,所述AhR抑制劑為DMF。
      [0018]本發(fā)明提供的抗腫瘤藥物制劑組合的給藥方式為:對患腫瘤個(gè)體施用所述抗腫瘤藥物制劑組合,例如,靜脈、腹腔內(nèi)或者瘤內(nèi)注射IFN- γ,聯(lián)合口服或瘤內(nèi)注射IDO抑制劑;或者靜脈、腹腔內(nèi)或者瘤內(nèi)注射IFN- γ,聯(lián)合灌胃或瘤內(nèi)注射AhR抑制劑。
      [0019]本發(fā)明還提供了一種治療或預(yù)防腫瘤的方法,包括患有腫瘤的個(gè)體或具有腫瘤發(fā)生趨勢的個(gè)體施用所述抗腫瘤藥物制劑組合的過程。具體過程為靜脈、腹腔內(nèi)或者瘤內(nèi)注射IFN- γ,聯(lián)合口服或瘤內(nèi)注射給藥IDO抑制劑;或者靜脈、腹腔內(nèi)或者瘤內(nèi)注射IFN- γ,聯(lián)合灌胃或瘤內(nèi)注射給藥AhR抑制劑。
      [0020]根據(jù)本發(fā)明的方案,可以根據(jù)需要控制抗腫瘤藥物制劑組合中的IFN-y、ID0抑制劑以及AhR抑制劑的量,方便對不同階段的腫瘤患者的給藥。
      [0021]IFN-Y (即γ-干擾素)是一種由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的水溶性二聚體細(xì)胞因子,具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤特性,是一種常見的抗腫瘤生物因子。在本
      【申請人】研究中發(fā)現(xiàn),單獨(dú)的IFN-γ只能殺死部分的腫瘤細(xì)胞,沒有被IFN-γ殺死的腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞特性,并進(jìn)入休眠狀態(tài),由于這些休眠腫瘤細(xì)胞的存在,腫瘤在若干年后又會復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移,因此,僅單獨(dú)施用IFN-γ不足以完全清除腫瘤細(xì)胞。本
      【申請人】經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究出乎意料的發(fā)現(xiàn),將IFN- γ與IDO抑制劑或AhR抑制劑,組合給藥,能夠?qū)崿F(xiàn)對休眠的腫瘤細(xì)胞殺傷。
      [0022]綜上,本發(fā)明的方案具有以下效果:
      [0023]1、本申請的抗腫瘤藥物制劑組合聯(lián)合IFN-γ與DO抑制劑或AhR抑制劑,不但可以將分化的腫瘤細(xì)胞殺滅,而且可以將進(jìn)入休眠的腫瘤細(xì)胞殺滅,具有徹底清除腫瘤細(xì)胞的效果。
      [0024]2、本發(fā)明的抗腫瘤藥物制劑組合具有安全性高、無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。
      [0025]3、通過該組合可以降低IFN-γ臨床用量,從而減少該藥物引起的副反應(yīng)。
      【附圖說明】
      [0026]圖1顯示了腫瘤特異性的CTL細(xì)胞只能殺滅部分0VA-B16腫瘤細(xì)胞,仍有小部分0VA-B16腫瘤細(xì)胞存活。
      [0027]圖2A為腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同處理后再用3D纖維蛋白軟凝膠培養(yǎng)后的形態(tài)(光鏡圖片)。圖2B顯示了從各組取相同數(shù)目的腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中培養(yǎng)三天后的克隆數(shù);圖2C顯示了從各組取相同數(shù)目的存活腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中三天后的克隆數(shù)。
      [0028]圖3A顯示了0VA-B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下細(xì)胞克隆形態(tài)的變化。圖3B顯示了0VA-B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下細(xì)胞相對克隆大小的半定量分析。圖3C顯示了OVA-B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下的細(xì)胞周期測定結(jié)果。圖3D顯示了定量分析G1/S比值。
      [0029]圖4A顯示了B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下細(xì)胞克隆形態(tài)的變化。圖4B顯示了 B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下細(xì)胞相對克隆大小的半定量分析。圖4C顯示了 B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下的細(xì)胞周期測定結(jié)果。圖4D顯示了定量分析G1/S比值。
      [0030]圖5A顯示了B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下細(xì)胞克隆形態(tài)的變化。圖5B顯示了 B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下細(xì)胞相對克隆大小。圖5C顯示了 B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下克隆數(shù)變化。圖f5D顯示了 B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下細(xì)胞克隆形態(tài)的變化。圖5E顯示了B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下細(xì)胞相對克隆大小。圖5F顯示了B16腫瘤細(xì)胞在不用刺激因素下克隆數(shù)變化。
      [0031]圖6A顯示了聯(lián)合IFN-γ和1-MT或者DMF引起更多的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的流式圖片。圖6Β顯示了定量分析圖6Α中發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)目比例。圖6C顯示了將殺傷后的腫瘤細(xì)胞全部種植到3D纖維蛋白軟凝膠中細(xì)胞克隆數(shù)目形成情況。
      [0032]圖7Α顯示了聯(lián)合IFN-γ和1-MT顯著抑制小鼠黑色素瘤生長;圖7Β顯示了聯(lián)合IFN-T和1-MT明顯延長患黑色素瘤小鼠的生存期;圖7(:顯示了聯(lián)合應(yīng)用IFN- γ和DMF抑制小鼠黑色素瘤生長;圖7D顯示IFN-γ和DMF聯(lián)合治療小鼠黑色素瘤,延緩小鼠生存期;圖7Ε顯示了對大體積的黑色素瘤,IFN- γ和1-MT,或者IFN- γ和DMF聯(lián)合治療也明顯抑制腫瘤生長;圖7F顯示了IFN- γ和1-ΜΤ,或者IFN- γ和DMF聯(lián)合治療體積大的黑色素腫瘤,明顯改善小鼠的生存期;圖7G顯示了聯(lián)合IFN-γ和1-MT治療由Η22皮下注射導(dǎo)致的腫瘤,能夠明顯抑制腫瘤生長;圖7Η顯示了IFN- γ和1-MT聯(lián)合應(yīng)用抑制NOD-SCID小鼠黑色素瘤的生長;圖71顯示了 IFN- γ和1-MT聯(lián)合應(yīng)用抑制NOD-SCID小鼠皮下注射MCF7導(dǎo)致的腫瘤生長。
      【具體實(shí)施方式】
      [0033]下述實(shí)施例中使用的各種腫瘤細(xì)胞、藥物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:
      [0034]0VA-B16腫瘤細(xì)胞系、Β16小鼠黑色素瘤細(xì)胞系(也稱Β16腫瘤細(xì)胞系)、Η22小鼠肝癌細(xì)胞系、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系,均可從美國ATCC中心或中國典型物保藏中心CCTCC購買。
      [0035]OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠,C57BC/L小鼠,4-6周齡、雌性Balb/c小鼠,或者NOD-SCID小鼠,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
      [0036]抗IFN- γ抗體購自PepTech公司;IDO抑制劑(1-ΜΤ)購自美國SIGMA公司;AhR抑制劑(DMF),購自美國SIGMA公司。IFN- γ,3D纖維蛋白軟凝膠,DMEM培養(yǎng)基,PBS均可商購獲得。
      [0037]實(shí)施例1:(:1^細(xì)胞只能殺滅部分^^-816腫瘤細(xì)胞,仍有小部分^^-816腫瘤細(xì)胞存活
      [0038]1、實(shí)驗(yàn)步驟
      [0039]對照組I (PBS+0VA-B16):用普通培養(yǎng)基(例如DMEM培養(yǎng)基)+等體積的PBS在96孔板內(nèi)培養(yǎng)0VA-B16腫瘤細(xì)胞;
      [0040]對照組2(CTL+B16):將B16腫瘤細(xì)胞與CTL細(xì)胞以1:25的比例混合在96孔板內(nèi)用普通培養(yǎng)基(例如DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng);
      [0041 ]實(shí)驗(yàn)組(CTL+0VA-B16):將0VA-B16腫瘤細(xì)胞與CTL細(xì)胞分別以 1:1,1:10,1: 25,1:
      50的數(shù)量比例混合后在96孔板內(nèi)用普通培養(yǎng)基培養(yǎng);
      [0042]各組腫瘤細(xì)胞數(shù)相同;將上述各組腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)后,收集所有細(xì)胞。
      [0043]從各組收集的細(xì)胞一方面通過流式測定檢測細(xì)胞凋亡情況(本實(shí)施例)。另一方面種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,培養(yǎng)3天觀測細(xì)胞克隆形成情況(見實(shí)施例2)。
      [0044]CTL細(xì)胞的獲得方法為:從OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟分離⑶8+T細(xì)胞,這些腫瘤細(xì)胞特異性⑶8+T細(xì)胞經(jīng)抗⑶3/⑶28磁珠激活后成為CTL細(xì)胞(即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)。其中OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠是指其TCR是針對0VA257-264抗原特異性的小鼠,該小鼠中全部⑶8+T細(xì)胞只識別MHC-1類分子遞呈的OVA抗原肽。
      [0045]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
      [0046]從圖1中可以看出,對照組I (PBS+0VA-B16)和對照組2 (CTL+B16)中腫瘤細(xì)胞很少凋亡;在實(shí)驗(yàn)組(CTL+0VA-B16)中,隨著CTL細(xì)胞比例的增加,其對0VA-B16腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用增強(qiáng),凋亡的OVA-B16腫瘤細(xì)胞的比例從15 %增加到70 %。但是,仍有部分(約30% )0VA-B16腫瘤細(xì)胞不能被CTL細(xì)胞殺滅。
      [0047]實(shí)施例2:不能被CTL細(xì)胞殺滅的腫瘤細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性。
      [0048]1、實(shí)驗(yàn)步驟
      [0049]將上述各組腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)4小時(shí)(步驟如實(shí)施例1中所述),并收集所有細(xì)胞后,實(shí)施以下操作:I)從各組取相同數(shù)目的腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠(lmg/mL纖維蛋白)中;2)以0VA-B16: CTL為1: 50的CTL+0VA-B16組(簡稱1:50組)中存活的腫瘤細(xì)胞數(shù)為標(biāo)準(zhǔn),取相同數(shù)目的存活腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中;3)在3天后觀察細(xì)胞生長情況。
      [0050]已知該3D纖維蛋白軟凝膠不利于正常腫瘤細(xì)胞的生長,但適合用于篩選腫瘤再生細(xì)胞(TRC),即具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞,也可稱為腫瘤干細(xì)胞。正常的腫瘤細(xì)胞中本身也含有恒定比例的腫瘤干細(xì)胞。只有腫瘤干細(xì)胞能在3D纖維蛋白軟凝膠中形成細(xì)胞克隆。[0051 ] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
      [0052]圖2A為各組腫瘤細(xì)胞形態(tài)。
      [0053]圖2B為從各組取相同數(shù)目的腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中培養(yǎng)三天后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),可以看出各組細(xì)胞形成的克隆數(shù)接近。這是由于所有實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞來自同一類型的腫瘤細(xì)胞,這些腫瘤細(xì)胞中本身含有恒定比例的腫瘤干細(xì)胞,當(dāng)經(jīng)CTL細(xì)胞殺傷后的各組腫瘤細(xì)胞與對照組腫瘤細(xì)胞全部以相同的細(xì)胞數(shù)種植于上述3D纖維蛋白軟凝膠時(shí),由于含有相同比例的腫瘤干細(xì)胞,這些組中生長出來的克隆數(shù)目接近相同。
      [0054]圖2C為從各組取相同數(shù)目的存活腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,3天后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),可以看在1:50組中,其克隆形成數(shù)目明顯增多,相比于其他組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異。這是由于以1:50組中存活的腫瘤細(xì)胞數(shù)(包括休眠的腫瘤細(xì)胞和正常的沒有被殺傷的腫瘤細(xì)胞)為基準(zhǔn)進(jìn)行種植,即各組僅取存活的腫瘤細(xì)胞種植,種植的存活腫瘤細(xì)胞數(shù)與1:50組中存活腫瘤細(xì)胞數(shù)相同,由于1:50組中添加的CTL最多,在這些存活的腫瘤細(xì)胞中休眠腫瘤干細(xì)胞的比例最高,其余各組由于添加的CTL少,相應(yīng)的休眠腫瘤干細(xì)胞比例低而未被殺傷的腫瘤細(xì)胞的比例高,因此在1:50組中,其克隆形成數(shù)目明顯多于其他組。同時(shí)也說明不能被CTL細(xì)胞殺滅的腫瘤細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性。
      [0055]實(shí)施例3:(:11細(xì)胞與0¥4-816腫瘤細(xì)胞共孵育后獲得的上清液能導(dǎo)致0¥4-816腫瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠。
      [0056]1.實(shí)驗(yàn)步驟:
      [0057]對照組(PBS):將正常0VA-B16腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,用普通培養(yǎng)基(例如DMEM培養(yǎng)基)+等體積的PBS培養(yǎng)3-7天,觀察細(xì)胞生長情況并進(jìn)行細(xì)胞周期測定;
      [0058]實(shí)驗(yàn)組I (INF- γ ):將0VA-B16腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后,將該普通培養(yǎng)基換成普通培養(yǎng)基+等體積上清液的培養(yǎng)基(即條件培養(yǎng)基I),該上清液為CTL細(xì)胞與0VA-B16腫瘤細(xì)胞共孵育后獲得的上清液,該上清液中含有INF-γ,繼續(xù)培養(yǎng)0VA-B16腫瘤細(xì)胞3-5天后,觀察細(xì)胞生長情況并進(jìn)行細(xì)胞周期測定。
      [0059]實(shí)驗(yàn)組2(抗-1NF- γ ):將0VA-B16細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后,將該普通培養(yǎng)基換成普通培養(yǎng)基+等體積上清液+抗-1NF-γ的培養(yǎng)基(即條件培養(yǎng)基2),該上清液為CTL細(xì)胞與0VA-B16細(xì)胞共孵育的上清液,該上清液中含有INF- γ,繼續(xù)培養(yǎng)0VA-B16腫瘤細(xì)胞3-5天后,然后觀察細(xì)胞生長情況并進(jìn)行細(xì)胞周期測定。
      [0060]CTL細(xì)胞與0VA-B16腫瘤細(xì)胞共孵育后獲得的上清液例如可以從實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)過程中獲得。
      [0061 ]細(xì)胞周期測定是根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行的。
      [0062]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
      [0063]相比對照組,條件培養(yǎng)基I刺激0VA-B16的腫瘤細(xì)胞3天后,細(xì)胞克隆大小明顯減小,繼續(xù)培養(yǎng)2天,細(xì)胞克隆大小保持不變;但是,如果將條件培養(yǎng)基I再換成用普通培養(yǎng)基后培養(yǎng)2天,細(xì)胞克隆則明顯變大(圖3Α中間一列第7天的數(shù)據(jù)為換成普通培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)),提示條件培養(yǎng)基I誘導(dǎo)0VA-B16細(xì)胞進(jìn)入休眠。如果在條件培養(yǎng)基I中同時(shí)加入抗-1NF-T即條件培養(yǎng)基2,則會逆轉(zhuǎn)條件培養(yǎng)基I導(dǎo)致的細(xì)胞休眠,提示條件培養(yǎng)基I內(nèi)的IFN-γ是導(dǎo)致細(xì)胞休眠的因子(見圖3Α、圖3Β)。細(xì)胞周期測定的結(jié)果與上述結(jié)果一致,即條件培養(yǎng)基導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G0/G1期,而抗-1NF-γ抗體則能逆轉(zhuǎn)這一過程(見圖3C、圖3D)。
      [0064]實(shí)施例4:1FN- γ導(dǎo)致Β16腫瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠。
      [0065]1.實(shí)驗(yàn)步驟:
      [0066]將Β16腫瘤細(xì)胞進(jìn)行以下操作:
      [0067]對照組(PBS):將3000個(gè)正常Β16腫瘤細(xì)胞種植于位于24孔板上的3D纖維蛋白軟凝膠中(單個(gè)含凝膠孔中凝膠體積為250yL,凝膠上面加入的普通培養(yǎng)基是ImL),用普通培養(yǎng)基+PBS(其加入的體積很小只有I微升)培養(yǎng)3-8天;觀察細(xì)胞生長情況并進(jìn)行細(xì)胞周期測定;
      [0068]實(shí)驗(yàn)組(IFN-γ):B16腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后,將該普通培養(yǎng)基換成普通培養(yǎng)基+IFN-γ的培養(yǎng)基,IFN-γ的濃度分別為50ng/mL,100ng/mL,刺激B16腫瘤細(xì)胞3-5天后,觀察細(xì)胞生長情況并進(jìn)行細(xì)胞周期測定。
      [0069]其中IFN-γ為多5U/ng,細(xì)胞周期測定是根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。
      [0070]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
      [0071]隨培養(yǎng)時(shí)間延長,對照組中B16腫瘤細(xì)胞克隆逐漸變大;實(shí)驗(yàn)組中,對B16腫瘤細(xì)胞用100ng/mL的IFN-γ刺激后3天與刺激后5天相比,細(xì)胞克隆大小維持不變(見圖4A、圖4B)。如果將刺激因素IFN-γ去除后3天,細(xì)胞克隆大小又開始明顯增大(圖4A中間一列以及右邊一列第8天的數(shù)據(jù)為換成普通培養(yǎng)基后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))。
      [0072]與此結(jié)果相一致,細(xì)胞周期測定結(jié)果顯示,IFN-γ刺激將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,其G1/S期比值相比于對照組明顯升高(見圖4C、圖4D)。
      [0073]實(shí)施例5:1DO抑制劑逆轉(zhuǎn)IFN- γ導(dǎo)致的腫瘤休眠。
      [0074]1.實(shí)驗(yàn)步驟:
      [0075]將Β16腫瘤細(xì)胞進(jìn)行以下操作:
      [0076]對照組I (I3BS):將3000個(gè)正常Β16腫瘤細(xì)胞種植于位于24孔板上的3D纖維蛋白軟凝膠中(單個(gè)含凝膠孔中凝膠體積為250yL,凝膠上面加入的普通培養(yǎng)基是ImL),用普通培養(yǎng)基+PBS (其加入的體積很小只有I微升)培養(yǎng)3-5天;
      [0077]對照組2(IFN-Y):將B16腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后,在普通培養(yǎng)基中加入IFN-γ (100ng/mL)處理3-5天;
      [0078]實(shí)驗(yàn)組:將B16腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,在普通培養(yǎng)基中加入IFN- γ (100ng/mL)和1-MT(0.2mM)處理細(xì)胞3_5天,或在普通培養(yǎng)基中加入IFN- γ (100ng/mL)和DMF( 20μΜ)處理細(xì)胞3-5天;
      [0079]檢測各組細(xì)胞克隆大小及克隆形成數(shù)目,其中IFN-γ為彡5U/ng。
      [0080]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
      [0081 ] B16腫瘤細(xì)胞經(jīng)IFN-γ和1-MT聯(lián)合刺激后,其克隆大小相比IFN-γ單獨(dú)處理組明顯減小;并且隨刺激時(shí)間延長,其克隆大小變得越來越小(見圖5A、圖5B)。計(jì)數(shù)克隆數(shù)目發(fā)現(xiàn),聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和1-MT后,B16腫瘤細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯減少,相比對照組有顯著差異(見圖5C)。
      [0082]與此結(jié)果類似,B16腫瘤細(xì)胞經(jīng)IFN-γ和DMF聯(lián)合刺激后,其克隆大小相比IFN-γ單獨(dú)處理組明顯減??;并且隨刺激時(shí)間延長,其克隆大小變得越來越小(見圖5D、圖5E)。克隆數(shù)目計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和DMF刺激后,B16腫瘤細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯減少,相比對照組有顯著差異(見圖5F)。
      [0083]實(shí)施例6:聯(lián)合應(yīng)用CTL細(xì)胞和IDO抑制劑,或聯(lián)合應(yīng)用CTL細(xì)胞和AhR抑制劑能殺滅0VA-B16腫瘤細(xì)胞,特別是能殺滅休眠的0VA-B16的腫瘤細(xì)胞。
      [0084]1.實(shí)驗(yàn)步驟:
      [0085]對照組(PBS):將5000個(gè)0VA-B16腫瘤細(xì)胞種植于96孔板內(nèi)(單個(gè)孔體積為100微升),僅用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)加等體積PBS培養(yǎng)3-5天;
      [0086]對照組2(1-MT):將5000個(gè)0VA-B16腫瘤細(xì)胞種植于96孔板內(nèi),用普通培養(yǎng)基18小時(shí)后,在普通培養(yǎng)基(例如DMEM培養(yǎng)基)中加入1-MT(0.2mM或者0.5mM)處理0VA-B16腫瘤細(xì)胞3-5天;
      [0087]對照組3(DMF):將5000個(gè)0VA-B16腫瘤細(xì)胞種植于96孔板內(nèi),用普通培養(yǎng)基18小時(shí)后,在普通培養(yǎng)基中加入DMF( 20μΜ或者50μΜ)處理0VA-B16腫瘤細(xì)胞3-5天;
      [0088]實(shí)驗(yàn)組:將5000個(gè)0VA-B16腫瘤細(xì)胞種植于96孔板內(nèi),用普通培養(yǎng)基18小時(shí)后,然后在普通培養(yǎng)基中加入從OT-1小鼠脾臟中分離出的CTL細(xì)胞(其中CTL細(xì)胞與0VA-B16腫瘤細(xì)胞的數(shù)量比例為30-50:1)和1-MT(0.2mM或者0.5mM),或者在普通培養(yǎng)基中加入所述CTL細(xì)胞和DMF(20μΜ或者50μΜ),刺激OVA-B16腫瘤細(xì)胞24小時(shí)后,收集所有腫瘤細(xì)胞:一方面檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況;另一方面將同等數(shù)目的腫瘤細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中,培養(yǎng)3天觀測細(xì)胞克隆形成情況。
      [0089]2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
      [0090]單獨(dú)使用CTL細(xì)胞導(dǎo)致約38% 0VA-B16腫瘤細(xì)胞凋亡,單獨(dú)使用1-MT或者DMF處理細(xì)胞并沒有引起顯著的細(xì)胞凋亡(見圖6Α、圖6Β)。但是,聯(lián)合應(yīng)用CTL細(xì)胞和1-MT則引起約60%細(xì)胞發(fā)生凋亡,相比單獨(dú)使用CTL細(xì)胞處理組,差異具有顯著性(見圖6Α、圖6Β)。與此結(jié)果類似,聯(lián)合使用CTL細(xì)胞和DMF引起更多0VA-B16腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,與單獨(dú)使用CTL細(xì)胞處理組相比,其凋亡細(xì)胞數(shù)目增加了一倍左右,并且隨著DMF劑量增高,其凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多(見圖6Α、圖6Β)。
      [0091]將相同數(shù)目的經(jīng)不同因素處理的0VA-B16細(xì)胞種植于3D纖維蛋白軟凝膠中發(fā)現(xiàn),單獨(dú)使用CTL細(xì)胞組或者單獨(dú)使用1-MT處理組,其細(xì)胞克隆形成數(shù)目與對照組相比無顯著差異;但是,聯(lián)合應(yīng)用CTL和1-MT相比單獨(dú)使用CTL細(xì)胞處理,則細(xì)胞克隆數(shù)目明顯減少(220個(gè)比360個(gè))(見圖6C)。
      [0092]單獨(dú)使用DMF處理,在高劑量情況下,其細(xì)胞克隆形成數(shù)目較對照組明顯減少;而CTL細(xì)胞和DMF聯(lián)合處理則更進(jìn)一步較少細(xì)胞克隆形成數(shù)目(見圖6C)。
      [0093]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:聯(lián)合應(yīng)用CTL細(xì)胞和IDO抑制劑,或聯(lián)合應(yīng)用CTL細(xì)胞和AhR抑制劑能殺滅0VA-B16腫瘤細(xì)胞,特別是能殺滅休眠的0VA-B16的腫瘤細(xì)胞。
      [0094]實(shí)施例7:聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和IDO抑制劑,或IFN-γ和AhR抑制劑能抑制荷瘤小鼠腫瘤生長,延長生存期。
      [0095]1、聯(lián)合應(yīng)用IFN- γ和IDO抑制劑(參見圖7Α和圖7Β):
      [0096]I)實(shí)驗(yàn)步驟
      [0097]構(gòu)建荷瘤小鼠:4-6周C57BL/C小鼠40只,隨機(jī)分為4組,小鼠體重為20g;每只老鼠皮下接種3 X 14Bie小鼠黑色素瘤細(xì)胞,10天后能觀察到腫瘤生成;接種黑色素瘤細(xì)胞第3天開始分別對荷瘤小鼠以下不同方式給藥:
      [0098]對照組I(Con),對荷瘤小鼠僅尾靜脈注射PBS;
      [0099]對照組2(IFN- γ ): IFN- γ單獨(dú)處理荷瘤小鼠,每只老鼠尾靜脈注射I X 15U的IFN- γ,每三天注射一次,共注射3次;
      [0100]對照組3(1-ΜΤ): 1-MT單獨(dú)處理荷瘤小鼠,將1-MT按照5mg/mL的劑量溶于小鼠的飲用水,每只老鼠每天約飲用3-4mL飲用水,連續(xù)給藥10天;
      [0101 ] 實(shí)驗(yàn)組I(IFN- γ /1-MT):對荷瘤小鼠分別給予IFN- γ和1-MT(即聯(lián)合應(yīng)用IFN- γ和1-ΜΤ),給藥方法同前。
      [0102]黑色素瘤細(xì)胞接種后第13天,開始測量腫瘤大小,并且觀察小鼠生存期。
      [0103]2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
      [0104]IFN-γ或者1-MT單獨(dú)用藥引起小鼠腫瘤生長緩慢,而聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和1-MT則導(dǎo)致明顯的腫瘤生長抑制,接種黑色素瘤細(xì)胞后第23天后小鼠腫瘤體積降低70%,相比對照組,差異具有顯著性意義(見圖7Α)。觀測小鼠生存期發(fā)現(xiàn),單獨(dú)使用IFN-γ或者1-MT延長小鼠生存期,而聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和1-MT對小鼠生存期的延長作用最明顯(見圖7Β)。
      [0105]2、聯(lián)合應(yīng)用IFN- γ和AhR抑制劑(參見圖7C和圖7D)
      [0106]I)實(shí)驗(yàn)步驟
      [0107]構(gòu)建荷瘤小鼠方法同前述項(xiàng)I。接種黑色素瘤細(xì)胞10天后能觀察到腫瘤生成;接種黑色素瘤細(xì)胞第3天開始分別對荷瘤小鼠以下不同方式給藥:
      [0108]對照組I(Con),對荷瘤小鼠僅尾靜脈注射PBS;
      [0109]對照組2(1?.丫):1?.丫單獨(dú)處理荷瘤小鼠,每只老鼠尾靜脈注射I X 15U的IFN- γ,每三天注射一次,共注射3次;
      [0110]對照組3(DMF):DMF單獨(dú)處理荷瘤小鼠,DMF用量為每天5mg/kg小鼠體重,給藥方式為灌胃,給藥10天;
      [0111]實(shí)驗(yàn)組I (IFN- γ /DMF):小鼠分別給予IFN- γ和DMF(即聯(lián)合應(yīng)用IFN- γ和DMF),給藥方法同前。
      [0112]黑色素瘤細(xì)胞接種第13天,開始測量腫瘤大小,并且觀察小鼠生存期。
      [0113]2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
      [0114]IFN-γ或者DMF單獨(dú)用藥引起小鼠腫瘤生長緩慢,而聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和DMF則導(dǎo)致明顯的腫瘤生長抑制,接種黑色素瘤細(xì)胞后第23天后小鼠腫瘤體積降低70%,相比對照組,差異具有顯著性意義(見圖7C)。觀測小鼠生存期發(fā)現(xiàn),單獨(dú)使用IFN-γ或者DMF延長小鼠生存期,而聯(lián)合應(yīng)用IFN- γ和DMF對小鼠生存期的延長作用最明顯(見圖7D)。
      [0115]3、IDO或者AhR抑制劑對大體積腫瘤的治療實(shí)驗(yàn)(參見圖7Ε,圖7F和圖7G)
      [0116]I)實(shí)驗(yàn)步驟
      [0117]荷瘤小鼠的構(gòu)建:將IX 15Bie小鼠黑色素瘤細(xì)胞皮下,培養(yǎng)10天,觀察到腫瘤長至IJ7毫米Χ7毫米(即體積大的黑色素腫瘤),然后第11天開始分別對荷瘤小鼠以下不同方式給藥:
      [0118]對照組(Con),對荷瘤小鼠僅尾靜脈注射PBS;
      [0119]實(shí)驗(yàn)組1(DMF/IFN- γ ):小鼠分別給予IFN- γ和DMF(即聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和DMF);DMF給藥方式為:每三天瘤內(nèi)注射給藥DMF 5mg/kg小鼠體重,共3次;IFN-γ給藥方式為:每三天瘤內(nèi)注射給藥I X 15U的IFN-γ,共3次;
      [0120]實(shí)驗(yàn)組2 (1-MT/1FN- γ ):小鼠分別給予IFN- γ和1-MT (即聯(lián)合應(yīng)用IFN- γ和1-MT),1-MT給藥方式為:瘤內(nèi)注射給藥(250ug/只小鼠體重,每三天給一次,總共3次);IFN- γ給藥方式為:每三天瘤內(nèi)注射給藥I X 15U的IFN- γ,共注射3次;
      [0121]黑色素瘤細(xì)胞接種后第10天,開始測量腫瘤大小,并且觀察小鼠生存期。
      [0122]2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
      [0123]相比于對照組,IFN-γ和1-ΜΤ,或IFN-γ和DMF聯(lián)合治療明顯抑制黑色素瘤腫瘤生長(見圖7Ε),并且顯著延長小鼠生存期(見圖7F)。
      [0124]與此結(jié)果相一致,將IX 105Η22小鼠肝癌細(xì)胞接種到C57BL/C小鼠皮下構(gòu)建荷瘤小鼠,13天后,觀察到腫瘤長到7毫米X 7毫米,同時(shí)開始測量腫瘤大小,并在第14天開始給藥,給藥方式同上,IFN-γ和1-MT聯(lián)合治療也顯著抑制Η22小鼠肝癌細(xì)胞導(dǎo)致的大體積(7毫米Χ7毫米)腫瘤生長(見圖7G),聯(lián)合使用IFN-γ和DMF也能獲得相似的效果(未顯示)。這些結(jié)果說明IFN- γ和1-MT,或IFN- γ和DMF聯(lián)合治療不但對小體積腫瘤有效,而且對大體積腫瘤治療也效果顯著。
      [0125]4、IDO或者AhR抑制劑對NOD-SCID小鼠腫瘤的治療實(shí)驗(yàn)(參見圖7H和圖71)
      [0126]I)實(shí)驗(yàn)步驟
      [0127]構(gòu)建荷瘤NOD-SCID小鼠:為證實(shí)是否IDO或者AhR抑制劑對腫瘤的抑制作用是通過調(diào)節(jié)全身的免疫反應(yīng),6周NOD-SCID小鼠20只,每只小鼠皮下接種2 X 105B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞,8天后,觀察到腫瘤形成,將荷瘤NOD-SCID小鼠隨機(jī)分為三組,在接種腫瘤細(xì)胞第3天開始以下述不同方式給藥:
      [0128]對照組(Con):對荷瘤NOD-SCID小鼠進(jìn)行尾靜脈注射PBS;
      [0129]實(shí)驗(yàn)組(l-MT/IFN-γ ):對荷瘤NOD-SCID小鼠進(jìn)行尾靜脈注射IFN-γ,每三天注射一次,共注射三次,其中IFN- γ為I X 15U/小鼠/次,同時(shí)給藥1-MT,按照5mg/mL的劑量溶于小鼠的飲用水,每只老鼠每天約飲用3-4mL飲用水,給藥10天。
      [0130]黑色素瘤細(xì)胞接種后第8天,開始測量腫瘤大小。
      [0131]2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
      [0132]在觀測的將近三周期間,聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和1-MT明顯抑制腫瘤生長,相比對照組P〈0.001 (見圖7H)。我們將人的2 X 106MCF-7人乳腺癌細(xì)胞注射到NOD-SCID小鼠皮下構(gòu)建荷瘤小鼠,6天后觀察到腫瘤形成,在第6天開始測量腫瘤大小,在接種腫瘤細(xì)胞第3天開始給藥,給藥方式同上,也得到類似結(jié)果,表現(xiàn)為IFN-γ和1-MT聯(lián)合用藥顯著抑制MCF-7人乳腺癌細(xì)胞導(dǎo)致的腫瘤生長(見圖71)。說明IDO或者AhR抑制劑抑制腫瘤生長不是通過調(diào)節(jié)全身免疫反應(yīng)進(jìn)行的。
      【主權(quán)項(xiàng)】
      1.一種抗腫瘤藥物制劑組合,其特征在于,包括IFN- γ與IDO抑制劑,或者IFN- γ與AhR抑制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥物制劑組合,其特征在于,所述腫瘤包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌或前列腺癌。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥物制劑組合,其特征在于,所述IDO抑制劑包括1-ΜΤ。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥物制劑組合,其特征在于,所述AhR抑制劑包括DMF。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗腫瘤藥物制劑組合,其特征在于,所述抗腫瘤藥物制劑組合中的IFN-γ、IDO抑制劑以及AhR抑制劑為單位制劑。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤藥物制劑組合,所述IFN-γ單位制劑中包括I X 17?4X 17U的 IFN-γ。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤藥物制劑組合,所述IDO抑制劑單位制劑中包括4?Sg的IDO抑制劑。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤藥物制劑組合,所述AhR抑制劑中包括27-50mg的AhR抑制劑。
      【文檔編號】A61P35/00GK106075453SQ201610547827
      【公開日】2016年11月9日
      【申請日】2016年7月12日
      【發(fā)明人】黃波, 劉玉英, 尹曉南, 梁曉雨, 呂家迪
      【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
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