一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方法，在PEI溶液中先加入活化后的mPEG?COOH溶液，再加入活化后的FA?PEG?COOH溶液，攪拌反應(yīng)得到PEI?mPEG?(PEG?FA)；然后在PEI?mPEG?(PEG?FA)溶液中加入FI溶液避光攪拌反應(yīng)最后加入三乙胺、乙酸酐攪拌，透析冷凍干燥得到FA?mPEI；在FA?mPEI的水溶液中加入預(yù)先脫酸的阿霉素·鹽酸鹽DOX·HCl，避光敞口攪拌，然后離心、選取上清液，干燥，即得；本發(fā)明采用價廉易得的PEI為基礎(chǔ)載體，F(xiàn)A為靶向試劑，降低了材料的成本，對生物體無不良影響，制備方法簡單，條件溫和，易于操作，具有良好的前景。
【專利說明】
一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于負載藥物緩釋體系的制備領(lǐng)域，特別涉及一種葉酸靶向的多功能超支 化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥一直被認為是人類需要攻克的重大難題之一?；瘜W(xué)藥物治療作為癌癥治療的 重要手段之一，長期以來倍受關(guān)注。然而常見的抗腫瘤藥物存在著水溶性差、毒副作用大， 藥物釋放快，抗腫瘤藥物隨血液運輸?shù)缴眢w的各個部位，造成患者正常組織和器官受到嚴 重損傷等問題。近年來，利用納米材料作為載體負載抗腫瘤藥物，可顯著增加藥物水溶性、 實現(xiàn)藥物緩釋;延長藥物在腫瘤部位的作用時間；同時通過修飾靶向分子，使藥物靶向識別 腫瘤部位，從而能有效的聚集在腫瘤部位，實現(xiàn)更好的腫瘤治療效果，減少毒副作用(ACS Appl.Mater. Interfaces,6(2014)16416-16425；Adv.Drug Delivery Rev.,55(2003)329-347)。因此，研究一種新型的納米藥物緩釋體系是目前納米醫(yī)學(xué)的研究熱點。
[0003] 超支化聚乙烯亞胺(PEI)是一種分子量較大的支鏈狀PEI，內(nèi)部有疏水的空腔，具 有支化的三維結(jié)構(gòu)，表面具有大量帶正電荷的氨基，為其進一步化學(xué)修飾提供了條件，而且 PEI商業(yè)化程度高，價格低廉，可以作為一種良好的藥物載體。Wen等系統(tǒng)地研究了支化PEI 的表面氨基的各種修飾，如乙?；⒘u基化、羧基化及聚乙二醇化 (J. Appl .Polym. Sci .2013,128(6) ,3807-3813)。聚乙二醇(PEG)是一種具有良好生物相容 性的鏈狀聚合物，將其修飾到PEI表面能夠提高材料的水溶性和生物相容性，同時能延長藥 物緩釋時間。Chen等用透明質(zhì)酸鏈接PEG修飾的PEI作為靶向藥物輸送的載體(RSC Adv.， 2016,6,9232-9239)，在體外具有較長的藥物緩釋時間和良好抗腫瘤細胞能力。但此工作僅 停留在細胞層面，沒有驗證動物體內(nèi)的抗腫瘤活性。葉酸(FA)是一種水溶性的維生素。此 外，F(xiàn)A可以作為一種生物靶向分子，能與腫瘤細胞表面過度表達的FA受體分子特異性結(jié)合。 通過FA與腫瘤細胞表面FA受體分子的特異性結(jié)合可實現(xiàn)藥物緩釋體系對腫瘤細胞的特異 性識別與主動富集，實現(xiàn)腫瘤的特異性的靶向治療。
[0004] 查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻或?qū)＠?，合成FA靶向的聚乙烯亞胺作為藥物載體用于抗腫瘤 藥物輸送與腫瘤靶向治療的研究尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負 載阿霉素的方法，本發(fā)明制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和，成本低廉，易于操作，具有產(chǎn)業(yè)化實 施的前景。
[0006] 本發(fā)明的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方法，包括：
[0007] (1)在超支化聚乙烯亞胺PEI溶液中逐滴加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞 胺鹽酸鹽H)C/N-羥基丁二酰亞胺NHS活化后的mPEG-COOH溶液，攪拌反應(yīng)60-80h，透析，冷凍 干燥，得到白色粉末，標(biāo)記為PEI -mPEG;其中EDC與mPEG-⑶OH的摩爾比為8-12:1 (最優(yōu)摩爾 比為IO: I); NHS與mPEG-COOH的摩爾比為8-12:1(最優(yōu)摩爾比為10:1); mPEG-COOH與PEI的摩 爾比為15-25:1;mPEG-COOH為一端單甲醚、另一端羧基的聚乙二醇；
[0008] (2)將EDC/NHS活化后的葉酸FA溶液加入NH2-PEG-⑶OH溶液中，攪拌反應(yīng)60-80h， 透析，冷凍干燥，得到淺黃色粉末，標(biāo)記為FA-PEG-C00H;其中EDC與NH 2-PEg-COOH的摩爾比 為1.5-2.1:1(最優(yōu)摩爾比為2:1) ;NHS與NH2-PEG-⑶OH的摩爾比為1.5-2.1:1(最優(yōu)摩爾比 為2:1); FA與NH2-PEG-C00H的摩爾比為2 · 2-2 · 8:1 (最優(yōu)摩爾比為2 · 5:1); NH2-PEG-C00H為一 端氨基、另一端羧基的聚乙二醇；
[0009] (3)將PEI -mPEG溶液中逐滴加入EDC/NHS活化后的FA-PEG-C00H溶液，攪拌反應(yīng)60-80h，再逐滴加入異硫氰酸熒光素 FI溶液，攪拌反應(yīng)20-30h，透析，冷凍干燥，得到黃色粉末， 標(biāo)記為PEI-FI-mPEG-(PEG-FA);其中EDC與FA-PEG-C00H摩爾比為8-12:1;(最優(yōu)摩爾比為 10:1); NHS 與 FA-PEG-C00H 的摩爾比為 8-12:1(最優(yōu)摩爾比為 10:1) FA-PEG-C00H 與 PEI -mPEG 的摩爾比為8-12:1 ;FI與PEI-mPEG的摩爾比為5-7:1;
[0010] (4)將PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)的水溶液中加入三乙胺，攪拌20-40min，再加入乙酸 酐，繼續(xù)攪拌20-30h，透析，冷凍干燥，得到FA靶向的多功能PEIPEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)， 簡寫標(biāo)記為FA-mPEI;其中三乙胺與PEI的摩爾比為2800-3500 :1;乙酸酐與I3EI的摩爾比 2500-3000:1；
[0011] (5)將鹽酸阿霉素 DOX · HCl溶于甲醇溶液中，加入三乙胺，然后逐滴加入到FA- mPEI水溶液，避光敞口攪拌12-24小時，離心，冷凍干燥，得到葉酸靶向的多功能超支化聚乙 烯亞胺負載阿霉素的藥物緩釋體系FA-mPEI/D0X;其中FA-mPEI與鹽酸阿霉素 DOX · HCl的摩 爾比為1:8-20;其中三乙胺與甲醇的體積比為1:30-80。
[0012]步驟（I )-(3)中EDC/NHS活化羧基的方式:先在待活化材料的溶液中加入EDC溶液， 室溫攪拌20-40min，然后加入NHS溶液繼續(xù)攪拌2-4h，即得活化后的材料;其中EDC和NHS的 摩爾比為0.8-1:1 (最優(yōu)值為1:1)。
[0013] 步驟(I )-(3)中溶液中的溶劑均為二甲基亞砜DMS0。
[0014] 所述步驟（1)中超支化聚乙烯亞胺PEI的分子量為25000g/moI; mPEG-COOH的分子 量為 2000g/mol。
[0015] 所述步驟（1)中PEI溶液的濃度為2-8mg/mL，EDC/NHS活化后的mPEG-COOH溶液的濃 度為2-6mg/mL，EDC溶液的濃度為5-8mg/mL，NHS溶液的濃度為3-6mg/mL，其中EDC溶液的濃 度、NHS溶液的濃度為活化mPEG-COOH所用濃度。
[0016] 所述步驟（1) - (3)中EDC/NHS活化方式為先在待活化的物質(zhì)溶液中加入EDC溶液， 室溫攪拌20-40min，然后加入NHS溶液繼續(xù)攪拌2-4h，即得活化后的物質(zhì)。
[0017] 所述步驟（2)中NH2-PEG-⑶OH溶液的濃度為3-6mg/mL，EDC溶液的濃度為l-5mg/ mL，NHS溶液的濃度為I -5mg/mL，EDC/NHS活化后的FA溶液的濃度為I -3mg/mL，其中EDC溶液 的濃度、NHS溶液的濃度為活化葉酸FA所用濃度。
[0018] 步驟(2)中NH2-PEG-C00H 的分子量為 2000g/mol。
[0019]所述步驟⑵中透析為：透析膜為纖維素透析膜，其MCWO = 2000,先在PBS中透析 ld，再在去離子水中透析2d。
[0020] 所述步驟（3)中PEI-mPEG溶液的濃度為2-5mg/mL，EDC/NHS活化后的FA-PEG-C00H 溶液的濃度為〇. 5-1.5mg/mL，F(xiàn)I溶液的濃度為0.1-0.3mg/mL，E：DC溶液的濃度為2-5mg/mL， NHS溶液的濃度為2-5mg/mL，其中EDC溶液的濃度、NHS溶液的濃度為活化FA-PEG-COOH所用 濃度。
[0021]所述步驟（1 )、（3)、（4)中透析為:透析膜為纖維素透析膜，其MCWO為8000-14000， 先在PBS透析ld，再在去離子水中透析2d。
[0022] 所述步驟（5)中DOX · HCl溶液的濃度為8-12mg/mL，F(xiàn)A-mroi溶液的濃度為30-40mg/mL〇
[0023]所述步驟（5)中攪拌為磁力攪拌，攪拌速度為100-150轉(zhuǎn)/分鐘；離心的速率為 8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘，時間為8-10分鐘。
[0024] 所述步驟(5)中為預(yù)先脫酸的阿霉素·鹽酸鹽(D0X · HC1)。
[0025]支化聚乙烯亞胺(PEI)內(nèi)部有疏水的空腔，具有支化的三維結(jié)構(gòu)，表面具有大量帶 正電荷的氨基，為其進一步化學(xué)修飾提供了條件，而且PEI商業(yè)化程度高，價格低廉，可以作 為一種良好的藥物載體。聚乙二醇(PEG)是一種具有良好生物相容性的鏈狀聚合物，將其修 飾到PEI表面能夠提高材料的水溶性和生物相容性，同時能延長藥物緩釋周期。葉酸(FA)是 一種水溶性的維生素。此外，F(xiàn)A可以作為一種生物靶向分子，能與腫瘤細胞表面過度表達的 葉酸受體分子特異性結(jié)合。通過FA與腫瘤細胞表面葉酸受體分子的特異性結(jié)合可實現(xiàn)藥物 緩釋體系對腫瘤細胞的特異性識別與主動富集，實現(xiàn)腫瘤的特異性的靶向治療。
[0026]本發(fā)明所得到的負載阿霉素的葉酸靶向聚乙烯亞胺的納米藥物緩釋體系FA-mPEI/DOX能夠有效控制阿霉素的釋放，并且通過葉酸的主動靶向功能，能顯著提高對特異 腫瘤細胞的抑制作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0027] 本發(fā)明使用核磁共振氫譜(1H NMR)、紫外一可見光分光光度計(UV-Vis)、動態(tài)光 散射(Dynamic Light Scattering，DLS)測量等方法表征本發(fā)明制備的葉酸革El向的多功能 支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的納米藥物緩釋體系，同時用CCK-8法、流式細胞術(shù)分析和激光 共聚焦顯微鏡來檢驗制備的納米藥物緩釋體系FA-mPEI/DOX對高葉酸受體表達的子宮頸癌 細胞(HeLa細胞）的毒性與靶向性，以及對接種腫瘤動物的治療效果做出詳細評價。具體測 試結(jié)果如下：
[0028] (I)1H NMR
[0029] 參見說明書附圖2(a)，6 · 5、7 · 5和8 · 5ppm是FA的特征質(zhì)子峰，3 · 4-3 · 6ppm是PEG的 結(jié)構(gòu)單元的亞甲基質(zhì)子峰，根據(jù)它們積分面積之比，計算出每個PEG上鏈接了0.73個FA分 子。同樣地，每個PEI (δ，2.2-3.4ppm)分子鏈接24.2個PEG，5.8個FA分子，和4.5個FI分子(參 見附圖2)。制備的PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)經(jīng)過乙酰化反應(yīng)之后，在1.9-2.1ppm之間出現(xiàn)兩 個峰，位于1.9ppm是二級酰胺的乙?；募谆|(zhì)子峰，2.05ppm是三級酰胺的乙?；募谆?質(zhì)子峰(參見附圖2d)。通常認為伯胺比仲胺更易乙?；?，基于部分仲胺已發(fā)生乙?；?，所以 PEI表面氨基已全部被乙酰。另外，乙?；腇A-mPEI的表面電勢為1.33mV(參見附表1)，基 本顯中性，也證實了PEI表面氨基全部被乙酰。
[0030] (2)UV-Vis 測試結(jié)果
[0031] UV-vis測試結(jié)果表明：FA的紫外吸收峰位于290nm左右，F(xiàn)I的紫外吸收峰位于 495nm左右，這些特征峰的出現(xiàn)說明我們成功制備FA-PEG-COOH，PEI-Ac-FI-mPEG(mPEI)和 FA-mPEI。載藥之后，在480nm處的吸收峰增強明顯（參見附圖3a)。說明我們成功包裹了DOX， 生成了 mPE I /DOX 和 FA-mPE I /DOX。
[0032] (3)Zeta表面電勢和水合粒徑
[0033] 參見附表1，乙?；蟮妮d體的電勢為l_3mV，基本為零，顯中性。載藥之后電勢會 增加，但依然小于15mV，這樣的電勢本身并不會對細胞造成明顯損傷。同時，載藥之后的水 合粒徑也會增大，但依然在200nm左右，這樣的尺寸有利于細胞吞噬。
[0034] (4)D0X 上載率
[0035] 將DOX · HCl脫酸形成難溶于水的D0X，純DOX以物理包裹的方式裝載到制備的FA- mPEI中，生成FA-mPEI/DOX納米藥物緩釋體系，然后取上清液進行紫外分析。DOX的紫外吸收 峰位于480nm，根據(jù)所制備的納米藥物緩釋體系在480nm的紫外吸光值與DOX · HCl標(biāo)準(zhǔn)曲線 作比較，可以計算出DOX的上載效率為69%，上載百分比為6.1%。
[0036] (5)體外釋放結(jié)果
[0037] 附圖3b為FA-mPEI/DOX的體外累積釋放曲線。在50小時中，DOX在弱酸性環(huán)境中（pH = 5.0)的釋放量為51 %，比在生理環(huán)境(pH = 7.4)中的31.5%要大。說明這種載藥體系具有 一定的pH響應(yīng)性，在腫瘤組織類似的弱酸性環(huán)境中的釋放速度比正常組織釋放速度快，一 定程度減少DOX對正常組織的毒性，提高對腫瘤細胞惡性增殖的抑制效果。
[0038] (5)細胞毒性實驗
[0039]將每孔8000個HeLa細胞種植于96孔板中培養(yǎng)過夜。倒掉原培養(yǎng)基，加入含不同材 料(FA-mPEI，F(xiàn)A-mPEI/D0X和純D0X)的培養(yǎng)液再共培養(yǎng)24小時。倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，加 入含CCK-8試劑的培養(yǎng)液(每孔20yL CCK-8試劑，180yL完全培養(yǎng)液)再孵育3h。之后用酶標(biāo) 儀上檢測各孔在λ = 450ηπι處的吸光值，并據(jù)此計算相應(yīng)的細胞活力，其中以生理鹽水處理 的細胞作為空白對照，細胞活力記為100%。附圖4結(jié)果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)載體材 料FA-mPEI處理的實驗組細胞活性均在80 %以上，說明載體材料FA-mPE I沒有明顯的細胞毒 性;制備的FA-mPEI/DOX和純DOX都具有明顯的細胞毒性，其半數(shù)致死量(IC5q)分別為5. Oyg/ mL和1.9yg/mL。可能的原因是，DOX是小分子易于快速穿透細胞膜，造成細胞損傷，而在納米 藥物緩釋體系中DOX是緩慢從FA-mPEI/DOX釋放出來的，因而在相同時間點下其藥學(xué)活性較 低。
[0040] (6)流式細胞儀檢測結(jié)果
[0041 ] 將每孔2\105此1^細胞種植于12孔板中，加入含有不同濃度的？六-1111^1/00父和 mPEI/DOX的培養(yǎng)液共培養(yǎng)4小時。之后倒掉培養(yǎng)液，經(jīng)I3BS洗3次，用胰酶將細胞消化下來，轉(zhuǎn) 移到5ml離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘去除上清液，加 PBS Iml吹勻，放入冰盒，用流式細胞儀 對經(jīng)FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX處理過的HeLa細胞的進行熒光檢測。附圖5結(jié)果顯示在不同的 DOX濃度條件下，經(jīng)FA-mPE I/DOX處理過He La細胞比經(jīng)mPE I/DOX處理過的HeLa細胞表現(xiàn)出更 強的熒光信號。說明通過FA介導(dǎo)的靶向能力，本發(fā)明制備的FA-mPEI/DOX能夠有效靶向識別 高葉酸受體表達的癌細胞。
[0042] (7)激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果
[0043] 將每孔5\104此1^細胞種在12孔板上培養(yǎng)過夜，然后加入含1(^/11^0(^的卩八-mPEI/DOX和mPEI/DOX的培養(yǎng)液共培養(yǎng)4小時。之后倒掉培養(yǎng)液，先用I 3BS洗3次，然后用戊二 醛固定，再用PBS溶液洗3次，最后用Hoescht 33342(-種染細胞核的染料)染色。然后用63 倍的油鏡觀察實驗結(jié)果。附圖6結(jié)果顯示經(jīng)FA-mPEI/DOX處理過的HeLa細胞比經(jīng)mPEI/DOX處 理過的HeLa細胞表現(xiàn)出更強的FI介導(dǎo)的綠色熒光和DOX介導(dǎo)的紅色熒光。說明本發(fā)明制備 的FA-mPEI/DOX能夠有效靶向識別高葉酸受體表達的癌細胞，其結(jié)果與流式細胞儀數(shù)據(jù)相 一致。
[0044] (8)體外抗腫瘤效果評價
[0045] 將每孔8000HeLa細胞種植于96孔板中，加入含有不同濃度的FA-mPEI/DOX和mPEI/ DOX的培養(yǎng)液共培養(yǎng)4小時。之后倒掉舊培養(yǎng)基更換新培養(yǎng)基再培養(yǎng)48小時。用CCK-8試劑處 理3h后，在酶標(biāo)儀上檢測各孔在λ = 450ηπι處的吸光值，并據(jù)此計算相應(yīng)的細胞活力，其中以 生理鹽水處理的細胞作為空白對照，細胞活力記為100%。附圖7和8說明，在相同的DOX濃度 下，經(jīng)FA-mPEI/DOX處理過的HeLa細胞，其細胞毒性明顯比經(jīng)mPEI/DOX處理過的要強，尤其 是在高濃度下。說明本發(fā)明制備的FA-mPEI/DOX具有良好的體外靶向抗腫瘤效果。
[0046] (9)體內(nèi)抗腫瘤效果評價
[0047] 所有動物實驗均嚴格按照動物保護協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)進行。實驗用的4-6周雌性BALB/c裸 鼠購自上海斯萊克實驗動物中心（中國，上海）。按照3X IO6HeLa細胞八鼠的劑量在裸鼠右背 部注射腫瘤細胞。在腫瘤體積達到0.5-1.2cm3(大約在注射腫瘤細胞三周后)時隨機將成瘤 裸鼠分為4組(每組裸鼠數(shù)量n = 6)。此時記作實驗開始的第0天，將IOOyL生理鹽水(NS)、純 D0X、FA_mPEI/D0X，或者mPEI/DOX的生理鹽水溶液(D0X的最終濃度為lmg/mL)通過尾靜脈注 射到各組裸鼠體內(nèi)。每3天給藥一次，總共給藥6次。腫瘤體積每3天測量一次，小鼠質(zhì)量每3 天稱一次。同時，長期觀察以記錄每組裸鼠的存活時間。腫瘤體積，相對腫瘤體積，以及相對 體重可以用下面的公式（1)-(3)分別計算。
[0048] 腫瘤體積（V)=aXb2/2 (1)
[0049] a和b分別代表腫瘤直徑的最大值和最小值。
[0050] 相對腫瘤體積= v/Vo (2)
[0051 ] V和Vo分別代表給藥后的腫瘤體積和給藥前的腫瘤體積。
[0052] 相對體重=m/m〇 (3)
[0053] m和mo分別代表給藥后的小鼠的體重和給藥前的小鼠體重。
[0054] 在給藥治療21天后，每組選出一只代表性的小鼠，將其處死取其主要器官和腫瘤， 用H&E和TUNEL染色觀察小鼠在經(jīng)21天的治療后對器官的影響，和腫瘤壞死情況進行分析。 附圖9說明，本發(fā)明制備的FA-mPEI/DOX組小鼠相對腫瘤體積變化最小，非靶向mPEI/DOX組 小鼠次之，純DOX組再次之，生理鹽水組小鼠相對腫瘤體積變化最大。但是，每組小鼠在經(jīng)過 21天的治療后期重量無明顯變化。給藥觀察87天后，生理鹽水組小鼠全部死亡，純DOX組的 生存率僅為40%，非靶向mPEI/DOX組的生存率為60%，靶向FA-mTOI/DOX組的生存率為 80 %。H&E染色實驗發(fā)現(xiàn)，純DOX對小鼠的心有一定的損傷，其他組對小鼠器官未發(fā)現(xiàn)明顯損 傷。腫瘤部位的H&E和TUNEL染色實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-mPEI/DOX組造成腫瘤部位大量壞死，非靶向 mPEI/DOX組次之，純DOX再次之，生理鹽水組未明顯造成腫瘤壞死(參見附圖10)。綜上所述， 本發(fā)明制備的FA-mPEI/DOX具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性和生物相容性。
[0055] 有益效果
[0056] (1)本發(fā)明的FA-MPEI/DOX載藥納米顆粒具有良好的水溶性和生物相容性，較好的 藥物緩釋效果與pH響應(yīng)性釋放特性，對高葉酸受體表達的腫瘤細胞具有靶向性和明顯的抑 制效果，可用于癌細胞的靶向化療；
[0057] (2)本發(fā)明采用價廉易得的PEI為基礎(chǔ)載體，F(xiàn)A為靶向試劑，降低了材料的成本，對 生物體無不良影響；
[0058] (3)本發(fā)明制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和，成本低廉，易于操作，具有產(chǎn)業(yè)化實施的 前景。
【附圖說明】
[0059]圖1為本發(fā)明制備的FA-mPEI/DOX合成示意圖；
[0060]圖2為FA-PEG-COOH(a),PEI-mPEG(b)，PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)(c)和FA-mPEI(PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA，d)的核磁共振氫譜圖，（e)為FA-mPEI的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0061 ]圖3為不同樣品的紫外吸收光譜圖（a )，和體外不同pH條件下DOX從FA-mPE I /DOX中 的累積釋放曲線(b);
[0062] 圖4為經(jīng)FA-mPEI、D0X和FA-mPEI/DOX處理24小時后的HeLa細胞活力柱狀分析圖；
[0063] 圖5為經(jīng)不同DOX濃度下FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX處理4小時后的HeLa細胞流式檢 測分析圖，右下角為經(jīng)不同DOX濃度下FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX處理4小時后的HeLa細胞的 熒光強度與DOX的濃度之間的柱狀圖（***p〈0.001);
[0064] 圖6為經(jīng)FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX處理4小時后的HeLa細胞激光共聚焦顯微鏡成像 圖，其中材料DOX濃度為10yg/mL(標(biāo)尺為20μπι);
[0065] 圖7為經(jīng)FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX處理4小時后，分別用新培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時的細 胞活力柱狀分析圖（**p〈〇 · 005，***p〈0 · 001);
[0066] 圖8為經(jīng)FA-mPEI/DOX和mPEI/D0X(D0X的濃度為10yg/mL)處理4小時后，分別用新 培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時的細胞形貌圖，其中圖a、b為放大100倍的細胞形貌圖，圖c、d為放大200 倍的細胞形貌圖（標(biāo)尺均為IOOym);
[0067] 圖9為體內(nèi)抗腫瘤效果；（a)為經(jīng)21天不同藥物治療后小鼠相對體積變化圖，（b)為 藥物治療結(jié)束后一周選出的代表性小鼠的拍照圖，（c)為不同藥物治療后的小鼠生存率， (d)為小鼠經(jīng)21天不同藥物治療后體重變化圖；
[0068] 圖10為藥物治療結(jié)束后一周選出的代表性小鼠，然后將其處死，其主要器官和腫 瘤的H&E染色圖（a為NS組，b為純DOX組，c為mPEI/DOX組，d為FA-mPEI/DOX組），和腫瘤的 TUNEL染色圖（e為NS組，f為純DOX組，g為mPEI/DOX組，h為FA-mPEI/DOX組），圖中的標(biāo)尺均為 200μηι 〇
【具體實施方式】
[0069] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0070] 實施例1
[0071] (I )ΡΕΙ溶液（25 · Omg，5mL DMS0)中逐滴加入EDC/NHS活化后的mPEG-⑶OH溶液 (40mg，IOmL DMS0)，攪拌反應(yīng)72h，先用PBS溶液透析一天，再用水透析2天，冷凍干燥，得到 白色粉末，標(biāo)記為PEI-mPEG。
[0072] (2)在NH2-PEG-⑶OH溶液（20 . Omg，5mL DMSO)中加入EDC/NHS活化后的FA溶液 (IImg，IOmL DMSO)，攪拌反應(yīng)72h，先用PBS溶液透析一天，再用水透析2天，冷凍干燥，得到 淺黃色粉末，標(biāo)記為FA-PEG-C00H。
[0073] (3)在上述PEI-mPEG溶液（11. Omg，5mL DMSO)中逐滴加入EDC/NHS活化后的FA-PEG-⑶0H(4 · 64mg，5mL DMSO)攪拌反應(yīng)48h，再逐滴加入FI (0 · 39mg，2mLDMS0)，攪拌反應(yīng) 24h，再加入三乙胺（63.6yL)反應(yīng)30min后加入醋酸酐（53. OyL)反應(yīng)24h。反應(yīng)液先用I3BS溶 液透析一天，再用水透析2天，冷凍干燥，得到黃色粉末，標(biāo)記為PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA) (簡寫為FA-mPEI)。
[0074] (4)將鹽酸阿霉素 DOX · HCl(5.88mg)溶于500yL甲醇溶液中，后加入50yL的三乙 胺，逐滴加入到FA-mPEI水溶液（IOOmg，3mL)，敞口攪拌12小時，8000轉(zhuǎn)離心10min，取上清液 冷凍干燥得到FA靶向的多功能超支化PEI負載DOX的納米藥物緩釋體系FA-mPEI/DOX。
[0075] 參見說明書附圖2，6 · 5、7 · 5和8 · 5ppm是FA的特征質(zhì)子峰，3 · 4-3 · 6ppm是PEG的結(jié)構(gòu) 單元的亞甲基質(zhì)子峰，根據(jù)它們積分面積之比，計算出每個PEG上鏈接了0.73個FA分子。同 樣地，每個PEI (δ，2.2-3.4ppm)分子鏈接24.2個PEG，5.8個FA分子，和4.5個FI分子(參見附 圖2)。制備的PEI-FI -mPEG- (PEG-FA)經(jīng)過乙酰化反應(yīng)之后，在1.9-2.1 ppm之間出現(xiàn)兩個峰， 位于1.9ppm是二級酰胺的乙酰基的甲基質(zhì)子峰，2.05ppm是三級酰胺的乙?；募谆|(zhì)子 峰(參見附圖2d)。通常認為伯胺比仲胺更易乙?；诓糠种侔芬寻l(fā)生乙?；訮EI 表面伯胺已全部被乙酰。另外，乙?；蟮腇A-mPEI的表面電勢為1.33mV，基本顯中性，也證 實了PEI表面氨基全部被乙酰(參加表1)。另外FA的紫外吸收峰位于290nm左右，F(xiàn)I的紫外吸 收峰位于495nm左右（參見附圖3a )，這些特征峰的出現(xiàn)說明我們成功制備FA-PEG-C00H， PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)，和PEI-Ac-FI-mPEG。
[0076]載藥之后，在480nm處的吸收峰增強明顯。說明我們成功包裹了DOX，制備了FA-mPEI/DOX納米藥物緩釋體系，其DOX的上載效率為69%，上載百分比為6.1 %。
[0077]表1.不同樣品水溶液的表面電勢和水合粒徑
[0079] 實施例2
[0080] 將實施例1制備的FA-mPEI/DOX分別用pH=7.0和pH = 5.4的緩沖液溶解成濃度為 lmg/mL的溶液，取ImL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同pH的緩沖液的容器中，放在37 °C 搖床中振蕩。在不同的時間點取樣。每次取透析袋外液體ImL，測量其在480nm處吸光度值， 再向透析袋外加入對應(yīng)的緩沖溶液lmL。用此方法得到體外不同pH條件下DOX從FA-mPEI/ DOX中釋放的釋放曲線。參見附圖3b，在50小時中，DOX在弱酸性環(huán)境中（pH=5.0)的釋放量 為51 %，比在生理環(huán)境(pH = 7.4)中的31.5%要大。說明這種載藥體系具有一定的pH響應(yīng) 性，在腫瘤組織類似的弱酸性環(huán)境中的釋放速度比正常組織釋放速度快，一定程度減少DOX 對正常組織的毒性，提高對腫瘤細胞惡性增殖的抑制效果。
[0081 ] 實施例3
[0082] 將每孔8000個HeLa細胞種植于96孔板中培養(yǎng)過夜。倒掉原培養(yǎng)基，加入含不同材 料(FA-mPEI，F(xiàn)A-mPEI/D0X和純D0X)的培養(yǎng)液再共培養(yǎng)24小時。倒掉培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，加 入含CCK-8試劑的培養(yǎng)液(每孔20yL CCK-8試劑，180yL完全培養(yǎng)液)再孵育3h。之后用酶標(biāo) 儀上檢測各孔在λ = 450ηπι處的吸光值，并據(jù)此計算相應(yīng)的細胞活力，其中以生理鹽水處理 的細胞作為空白對照，細胞活力記為100%。附圖4結(jié)果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)載體材 料FA-mPEI處理的實驗組細胞活性均在80 %以上，說明載體材料FA-mPEI沒有明顯的細胞毒 性;制備的FA-mPEI/DOX和純DOX都具有明顯的細胞毒性，其半數(shù)致死量(IC 5q)分別為5. Oyg/ mL和1.9yg/mL?？赡艿脑蚴?，DOX是小分子易于快速穿透細胞膜，造成細胞損傷，而在納米 藥物緩釋體系中DOX是緩慢從FA-mPEI/DOX釋放出來的，因而在相同時間點下其藥學(xué)活性較 低。
[0083] 實施例4
[0084] 將每孔2\105此1^細胞種植于12孔板中，加入含有不同濃度的？六-1111^1/00父和 mPEI/D0X(D0X的濃度為0-10yg/mL)的培養(yǎng)液共培養(yǎng)4小時。之后倒掉培養(yǎng)液，經(jīng)I3BS洗3次， 用胰酶將細胞消化下來，轉(zhuǎn)移到5ml離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘去除上清液，加 PBS Iml吹 勻，放入冰盒，用流式細胞儀對經(jīng)FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX處理過的HeLa細胞的進行熒光檢 測。附圖5結(jié)果顯示在不同的DOX濃度條件下，經(jīng)FA-mPEI/DOX處理過HeLa細胞比經(jīng)mPEI/DOX 處理過的HeLa細胞表現(xiàn)出更強的熒光信號。說明通過FA介導(dǎo)的靶向能力，本發(fā)明制備的FA-mPEI/DOX 能夠有效靶向高葉酸受體表達的細胞。
[0085] 實施例5
[0086] 將大小合適的處理過的圓形蓋玻片以每孔1片的密度放入12孔板中，每孔加入 1.0 mL培養(yǎng)液浸泡過夜。棄掉浸泡培養(yǎng)液后，收集對數(shù)生長期HeLa細胞，按照5 X IO4Cel Is/ 孔接種在圓形載玻片上，置于5%C02,37°C條件下培養(yǎng)24小時。棄掉培養(yǎng)液后，每孔更換900 yL培養(yǎng)液，并添加 IOOyL含F(xiàn)A-mPEI/DOX和mPEI/DOX的培養(yǎng)液共培養(yǎng)4小時。之后倒掉培養(yǎng) 液，先用PBS洗3次，然后每孔加2.5%戊二醛的I 3BS溶液800yL，靜置于4°C條件下固定30分 鐘。棄掉戊二醛溶液，用無菌I3BS洗1-2遍，加 Hoechst 33342(lμg/ml)，覆蓋細胞即可，靜置 于37°C染色15分鐘。將Hoechst 33342液吸出，用無菌I3BS洗3遍，在載玻片上滴加一滴熒光 封閉劑，將蓋玻片從12孔板中勾出，將有細胞的一面壓到載玻片上，用激光掃描共焦顯微鏡 觀察細胞形態(tài)及細胞內(nèi)熒光分布。參見附圖6,發(fā)現(xiàn)經(jīng)FA-mTOI/DOX處理過HeLa細胞比經(jīng) mPEI/DOX處理過的HeLa細胞表現(xiàn)出較強的FI介導(dǎo)的綠色熒光和DOX介導(dǎo)的紅色熒光。說明 本發(fā)明制備的材料能夠靶向識別高葉酸受體表達的細胞，其結(jié)果與流式細胞儀數(shù)據(jù)相一 致。
[0087] 實施例6
[0088]收集對數(shù)生長期HeLa細胞，按8000ce 11 s/孔接種在96孔細胞培養(yǎng)板上，置于5 % ⑶2，37°C條件下培養(yǎng)24小時。棄掉培養(yǎng)液后，每孔更換180yL培養(yǎng)液，并加20yL FA-mPEI/ DOX或mPEI/DOX，每組設(shè)6個平行樣。繼續(xù)置于5 % CO2，37 °C條件下培養(yǎng)4小時。棄掉培養(yǎng)液， 更換新的不含材料的培養(yǎng)液，將細胞培養(yǎng)板繼續(xù)放置在5%C02,37°C條件下分別培養(yǎng)24小 時和48小時。然后加入含CCK-8試劑的培養(yǎng)液(每孔20yL CCK-8試劑，180yL完全培養(yǎng)液)再 孵育3h。之后用酶標(biāo)儀上檢測各孔在λ = 450ηπι處的吸光值，并根據(jù)此值計算細胞的存活率。 參見附圖7和8，我們發(fā)現(xiàn)在相同的DOX濃度下，經(jīng)FA-mPEI/DOX處理過的細胞，其細胞毒性明 顯比經(jīng)mPE I /DOX處理過的要強，尤其是在高濃度下。說明本發(fā)明制備的FA-mPE I /DOX具有良 好的體外靶向治療效果。
[0089] 實施例7
[0090] 所有動物實驗均嚴格按照動物保護協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)進行。實驗用的4-6周雌性BALB/c裸 鼠購自上海斯萊克實驗動物中心（中國，上海）。按照3X IO6HeLa細胞八鼠的劑量在裸鼠右背 部注射腫瘤細胞。在腫瘤體積達到0.5-1.2cm3(大約在注射腫瘤細胞三周后)時隨機將成瘤 裸鼠分為4組(每組裸鼠數(shù)量n = 6)。此時記作實驗開始的第0天，將IOOyL生理鹽水(NS)、純 D0X、FA_mPEI/D0X，或者mPEI/DOX的生理鹽水溶液(D0X的最終濃度為lmg/mL)通過尾靜脈注 射到各組裸鼠體內(nèi)。每3天給藥一次，總共給藥6次。腫瘤體積每3天測量一次，小鼠質(zhì)量每3 天稱一次。同時，長期觀察以記錄每組裸鼠的存活時間。腫瘤體積，相對腫瘤體積，以及相對 體重可以用下面的公式（1)-(3)分別計算。
[0091] 腫瘤體積（V)=aXb2/2 (1)
[0092] a和b分別代表腫瘤直徑的最大值和最小值。
[0093] 相對腫瘤體積= v/Vo (2)
[0094] V和Vo分別代表給藥后的腫瘤體積，給藥前的腫瘤體積。
[0095] 相對體重=m/m〇 (3)
[0096] m和mo分別代表給藥后的小鼠的體重和給藥前的小鼠體重。
[0097] 在給藥治療21天后，每組選出一只代表性的小鼠，將其處死取其主要器官和腫瘤， 用H&E和TUNEL染色觀察小鼠在經(jīng)21天的治療后對器官的影響，和腫瘤壞死情況進行分析。 參見附圖9,我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明制備的FA-mPEI/DOX組小鼠相對腫瘤體積變化最小，非靶向 mPEI /DOX組小鼠次之，純DOX組再次之，生理鹽水組小鼠相對腫瘤體積變化最大。但是，每組 小鼠在經(jīng)過21天的治療后期重量無明顯變化。給藥觀察87天后，生理鹽水組小鼠全部死亡， 純DOX組的生存率僅為40%，非靶向mPEI/DOX組的生存率為60%，靶向FA-mPEI/DOX組的生 存率為80 %。參見附圖10，H&E染色實驗說明純DOX對小鼠的心有一定的損傷，其他組對小鼠 器官未發(fā)現(xiàn)明顯損傷。腫瘤部位的H&E和TUNEL染色實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-mPEI/DOX組造成腫瘤部位 大量壞死，非靶向mPEI/DOX組次之，純DOX再次之，生理鹽水組未明顯造成腫瘤壞死。綜上所 述，本發(fā)明制備的FA-mPEI/DOX具有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性和生物相容性。
【主權(quán)項】
1. 一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方法，包括： (1) 在超支化聚乙烯亞胺PEI溶液中逐滴加入EDC/NHS活化后的mPEG-COOH溶液，攪拌反 應(yīng)60-80h，透析，冷凍干燥，得到PEI-mPEG;其中EDC與mPEG-COOH的摩爾比為8-12:1; NHS與 mPEG-C00H的摩爾比為8-12:l;mPEG-C00H與PEI的摩爾比為15-25:l; (2) 將EDC/NHS活化后的葉酸FA溶液加入NH2-PEG-C00H溶液中，攪拌反應(yīng)60-80h，透析， 冷凍干燥，得到FA-PEG-C00H;其中EDC與NH2-PEG-⑶0H的摩爾比為1.5-2.1:1; NHS與NH2-PEG-C00H 的摩爾比為1 · 5-2 · 1:1 ;FA 與 NH2-PEG-C00H 的摩爾比為 2 · 2-2 · 8:1; (3) 將PEI-mPEG溶液中逐滴加入EDC/NHS活化后的FA-PEG-C00H溶液，攪拌反應(yīng)60-80h， 再逐滴加入異硫氰酸熒光素 FI溶液，攪拌反應(yīng)20-30h，透析，冷凍干燥，得到PEI-FI-mPEG-(PEG-FA);其中EDC與FA-PEG-C00H摩爾比為8-12:1 ;NHS與FA-PEG-C00H的摩爾比為8-12:1; FA-PEG-C00H 與 PEI-mPEG 的摩爾比為 8-12:1 ;FI 與 PEI-mPEG 的摩爾比為 5-7:1; (4) 將PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)的水溶液中加入三乙胺，攪拌20-40min，再加入乙酸酐， 繼續(xù)攪拌20_30h，透析，冷凍干燥，得到FA靶向的多功能PEI，標(biāo)記為FA-mPEI;其中三乙胺與 PEI的摩爾比為2800-3500:1;乙酸酐與PEI的摩爾比為2500-3000:1; (5) 將鹽酸阿霉素 D0X · HC1溶于甲醇溶液中，加入三乙胺，然后逐滴加入到FA-mPEI水 溶液，避光敞口攪拌12-24小時，離心，冷凍干燥，得到葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺 負載阿霉素的藥物緩釋體系FA-mPEI/DOX;其中FA-mPEI與鹽酸阿霉素 D0X · HC1的摩爾比為 1:8-20;其中三乙胺與甲醇的體積比為1:30-80。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于:步驟(1)-(3)中溶液中的溶劑均為二甲基亞砜DMS0。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于:所述步驟（1)中超支化聚乙烯亞胺PEI的分子量為25000g/mol;mPEG-C00H 的分子量為2000g/mol。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于:步驟（1)中PEI溶液的濃度為3-7mg/mL，EDC/NHS活化后的mPEG-COOH溶液的 濃度為2_6mg/mL，EDC的溶液濃度為5-8mg/mL，NHS溶液的濃度為3-6mg/mL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于:步驟(2)中NH2-PEG-C00H的溶液濃度為3-6mg/mL，EDC溶液的濃度為l-5mg/ mL，NHS溶液的濃度為1 -5mg/mL，EDC/NHS活化后的葉酸FA溶液的濃度為1 -3mg/mL。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于：所述步驟（2)中透析為：透析膜為纖維素透析膜，其截留分子量MCW0為 2000,先在磷酸緩沖溶液PBS中透析ld，再在去離子水中透析2d。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于：所述步驟（3)中PEI-mPEG溶液的濃度為2-5mg/mL，EDC/NHS活化后的FA-PEG-⑶0H溶液的濃度為0.5-lmg/mL，F(xiàn)I溶液的濃度為0.1-0.3mg/mL，EDC溶液的濃度為2-5mg/mL，NHS 溶液的濃度為 2-5mg/mL。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于:所述步驟（1)、（3)、（4)中透析為:透析膜為纖維素透析膜，其MCW0 = 8000-14000,先在PBS透析ld，再在去離子水中透析2d。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于：步驟(5)中DOX · HC1溶液的濃度為8-12mg/mL，F(xiàn)A-mPEI溶液的濃度為30-40mg/mL〇10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸靶向的多功能超支化聚乙烯亞胺負載阿霉素的方 法，其特征在于:所述步驟(5)中攪拌為磁力攪拌，攪拌速度為100-150轉(zhuǎn)/分鐘;離心的速率 為8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘，時間為8-10分鐘。
【文檔編號】A61K47/22GK106075459SQ201610420925
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月14日 公開號201610420925.0, CN 106075459 A, CN 106075459A, CN 201610420925, CN-A-106075459, CN106075459 A, CN106075459A, CN201610420925, CN201610420925.0
【發(fā)明人】史向陽, 周本青, 趙晉華, 趙凌舟
【申請人】東華大學(xué), 上海市第一人民醫(yī)院