Gps2用于制備軟組織腫瘤預(yù)后、診斷或防治的藥物的用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及GPS2用于制備軟組織腫瘤預(yù)后、診斷或防治的藥物的用途。GPS2在脂肪肉瘤等軟組織肉瘤中低表達(dá)，抑制該分子可以促進(jìn)脂肪肉瘤的增殖。GPS2的表達(dá)和脂肪肉瘤病人的預(yù)后有明顯的相關(guān)性，提示可以用于該類(lèi)病人的臨床病理診斷。GPS2基因能夠在脂肪肉瘤中作為一種腫瘤抑制基因，并且能作為該疾病的一種可能的預(yù)后標(biāo)志物和治療分子。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
GPS2用于制備軟組織腫瘤預(yù)后、診斷或防治的藥物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及GPS2用于制備軟組織腫瘤預(yù)后、診斷或防治的藥 物的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪肉瘤(LPS)是最常見(jiàn)的軟組織肉瘤類(lèi)型，約占成人肉瘤類(lèi)型的20%。然而，這 種惡性腫瘤致病的分子機(jī)制尚未完全闡明。在過(guò)去幾十年中，新的方法，包括基因表達(dá)譜、 DNA擴(kuò)增譜、全基因組測(cè)序、miRNA譜和RNA測(cè)序等已經(jīng)成功擴(kuò)大了對(duì)脂肪肉瘤發(fā)病機(jī)制的理 解。12號(hào)染色體ql4_15的擴(kuò)增是在脂肪肉瘤中研究最多的分子變異，它可以導(dǎo)致接近90% 的高分化/未分化脂肪肉瘤病例里MDM2 (位于12ql 5)和CDK4基因的擴(kuò)增。這種擴(kuò)增曾被報(bào)道 過(guò)能引起細(xì)胞凋亡速度減慢和增殖速度加快，該結(jié)果可能是由于P53通路和Rb-E2F細(xì)胞周 期檢關(guān)卡調(diào)節(jié)異常引起。除了基因擴(kuò)增，其他機(jī)制也曾報(bào)道過(guò)和脂肪肉瘤的進(jìn)展有關(guān):包括 酪氨酸激酶受體(RTKs)的過(guò)度表達(dá)，染色體易位，PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)異常，C/ΕΒΡ-α和PPAR-γ低表達(dá)，某些miRNAs和表觀遺傳學(xué)的異常所引起。
[0003] G蛋白通路抑制基因2(GPS2)定位于17pl3.1，最初是由于它可在酵母中抑制Ras基 因的激活而被發(fā)現(xiàn)。隨后它被證實(shí)參與了許多病理和生理過(guò)程，包括增殖、凋亡、DNA修復(fù)、 腦組織發(fā)育和新陳代謝。GPS2基因的調(diào)節(jié)異常曾被報(bào)道和膠質(zhì)細(xì)胞瘤、未分化的梭形細(xì)胞 肉瘤(UDS)的腫瘤形成有關(guān)，然而GPS2基因在促進(jìn)腫瘤形成方面的機(jī)制仍有許多是未知的。 另外，GPS2基因在最常見(jiàn)的軟組織肉瘤即脂肪肉瘤當(dāng)中所起的作用。
[0004] 腹膜后脂肪肉瘤確診的金標(biāo)準(zhǔn)是術(shù)后病理診斷。術(shù)前主要依靠癥狀、體征及輔助 檢查來(lái)診斷。影像學(xué)檢查是腹膜后脂肪肉瘤診斷的重要方法。B超能夠顯示腫瘤的部位、數(shù) 目、大小、呈囊性或?qū)嵭?，且具有無(wú)創(chuàng)、價(jià)廉的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于術(shù)前檢查和術(shù)后復(fù)查。但B超 有時(shí)不易判斷周?chē)K器是否受侵，定性診斷率較低。B超引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢可以提高定性 診斷準(zhǔn)確率，但也增加了腫瘤沿針道播散、種植轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，不為多數(shù)人采用。CT、MRI圖像 分辨率高，能清晰顯示腫瘤及周?chē)D(zhuǎn)移淋巴結(jié)或遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移。經(jīng)過(guò)圖像重建，CT與MRI-樣，可 以顯示冠狀面、額狀面和矢狀面圖像，有助于判斷腫瘤與周?chē)K器、血管的毗鄰關(guān)系。對(duì)懷 疑血管受侵者，磁共振血管造影(MRA)或數(shù)字減影血管造影(DSA)均能顯示血管受侵的部 位、范圍。MRA三維血管成像直觀、清晰，創(chuàng)傷小。DSA可以顯示腫瘤血管來(lái)源及分布，如同時(shí) 進(jìn)行血管栓塞，有助于減少術(shù)中出血，利于腫瘤切除。此外，消化道鋇餐、鋇灌腸、靜脈腎盂 造影等檢查有助于了解消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)有無(wú)受壓、移位或梗阻，了解雙腎功能，評(píng)估切 除單側(cè)受累腎臟可能。
[0005] 上述技術(shù)和病理學(xué)檢查是臨床確診腹膜后脂肪肉瘤的臨床常用技術(shù)。但對(duì)于病人 治療效果的預(yù)后尚無(wú)有效手段。利用重要分子標(biāo)志對(duì)病人進(jìn)行分子檢測(cè)可以指導(dǎo)臨床精準(zhǔn) 治療和療效預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，驚奇地發(fā)現(xiàn)，GPS2基因在脂肪肉瘤中 表達(dá)下降并和這種疾病的預(yù)后相關(guān)，敲除脂肪肉瘤GPS2基因能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和迀移， GPS2基因在脂肪肉瘤中具有腫瘤抑制基因的作用。GPS2基因或GPS2蛋白能夠作為軟組織肉 瘤特別是脂肪肉瘤的預(yù)后或診斷的標(biāo)志物，具有應(yīng)用于制備軟組織肉瘤特別是脂肪肉瘤的 預(yù)后、診斷、治療和/或預(yù)防的藥物或者試劑的潛力。由此提供了下述發(fā)明：
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌 肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的預(yù)后的藥物中的用途。
[0008] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述預(yù)后是指預(yù)測(cè)患者的存活期。
[0009] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的用途，其中，
[0010]檢測(cè)GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達(dá)量A，以及GPS2基因在對(duì)象自身的正常皮下 組織中的表達(dá)量B:
[0011]如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則腫瘤分化程度低，預(yù)后較差;和/或 [0012] 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則該基因?qū)υ搶?duì)象的預(yù)后無(wú)顯著意義；
[0013 ] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)至少重復(fù)1次，例如重復(fù)1、2、3或4次。
[0014] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的用途，其中，
[0015] 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所述表達(dá)量A和表達(dá)量B，并按照如下公式計(jì)算：
[0016] 表達(dá)量 A 或表達(dá)量 B = 2-(GPS 鄉(xiāng)aGtinWACT)〇
[0017]本發(fā)明利用實(shí)時(shí)定量PCR、抗體免疫組化等方法證明了GPS2基因在脂肪肉瘤中低 表達(dá)(請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例1)。并且與病人的預(yù)后有明確的相關(guān)性(請(qǐng)參見(jiàn)實(shí)施例5)。
[0018] 本發(fā)明的再一方面涉及一種判斷軟組織肉瘤患者預(yù)后的方法，包括下述步驟：
[0019] 檢測(cè)GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達(dá)量A，以及GPS2基因在對(duì)象自身的正常皮下 組織中的表達(dá)量B:
[0020] 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則腫瘤分化程度低，預(yù)后較差;和/或
[0021] 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則腫瘤分化程度高，預(yù)后較好；
[0022] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)至少重復(fù)1次，例如重復(fù)1、2、3或4次。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的方法，其中，
[0024] 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所述表達(dá)量A和表達(dá)量B，并按照如下公式計(jì)算：
[0025] 表達(dá)量 A 或表達(dá)量 B = 2-(GPS 鄉(xiāng)aGtinWACT)〇
[0026]本發(fā)明的另一方面涉及GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌 肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的診斷的藥物中的用途。
[0027]本發(fā)明中依據(jù)本靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的基因檢測(cè)引物，抗體等，針對(duì)GPS2這一新的診斷和治 療靶點(diǎn)，可能成為腫瘤的診斷試劑。
[0028]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的用途，其中，
[0029]檢測(cè)GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達(dá)量A，以及GPS2基因在對(duì)象自身的正常皮下 組織中的表達(dá)量B:
[0030] 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則診斷為陽(yáng)性;和/或
[0031] 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則診斷為陰性；
[0032] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)至少重復(fù)1次，例如重復(fù)1、2、3或4次。
[0033]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的用途，其中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所述表達(dá) 量A和表達(dá)量B，并按照如下公式計(jì)算：
[0034] 表達(dá)量 A 或表達(dá)量 B = 2-(GPS 鄉(xiāng)actinWACT) 〇
[0035] 本發(fā)明的再一方面涉及一種診斷軟組織肉瘤的方法，包括下述步驟：
[0036]檢測(cè)GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達(dá)量A，以及GPS2基因在對(duì)象自身的正常皮下 組織中的表達(dá)量B:
[0037] 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則診斷為陽(yáng)性;和/或
[0038] 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則診斷為陰性；
[0039] 優(yōu)選地，所述檢測(cè)至少重復(fù)1次，例如重復(fù)1、2、3或4次。
[0040]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的診斷方法，其中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所述 表達(dá)量A和表達(dá)量B，并按照如下公式計(jì)算：
[0041 ]表達(dá)量 A 或表達(dá)量 B = 2-(GPS 鄉(xiāng)actinWACT) 〇
[0042]本發(fā)明的再一方面涉及GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌 肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤）的治療和/或預(yù)防的藥物或者抑制脂肪肉瘤細(xì)胞增 殖和/或迀移的藥物中的用途。
[0043]實(shí)施例2 - 4的數(shù)據(jù)表明，降低或者減少GPS2基因的表達(dá)能夠促進(jìn)脂肪肉瘤細(xì)胞增 殖和/或迀移，表明GPS2基因是一個(gè)抑制脂肪肉瘤侵襲和/或轉(zhuǎn)移的基因?？梢岳斫?，提高或 者增加 GPS基因的表達(dá)水平或者GPS蛋白的水平，則能夠抑制脂肪肉瘤細(xì)胞增殖和/或迀移， 能夠應(yīng)用于軟組織肉瘤的治療和/或預(yù)防。
[0044]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的用途，其中，所述藥物為提高GPS2基因的表達(dá) 水平的藥物。
[0045]根據(jù)本發(fā)明上面任一方面所述的用途，其中，所述GPS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0046] GPS2基因的序列：（984nt):
[0047] ATGCCCGCACTCCTGGAGCGCCCCAAGCTTTCCAACGCCATGGCCAGGGCGCTGCACCGGCACATTATGATGGAGCG GGAGCGCAAGCGGCAGGAGGAAGAAGAGGTGGATAAGATGATGGAACAGAAGATGAAGGAAGAACAGGAGAGAAGGA AGAAAAAGGAGATGGAAGAGAGAATGTCATTAGAGGAGACCAAGGAACAAATTCTGAAGTTGGAGGAGAAGCTTTTG GCTCTACAGGAAGAGAAGCACCAGCTTTTCCTGCAGCTCAAGAAAGTTTTACATGAGGAAGAAAAACGGAGGCGAAA GGAACAGAGTGACCTGACCACCCTAACATCAGCTGCATACCAGCAGAGCCTGACTGTTCACACAGGAACTCATCTCC TCAGCATGCAGGGGAGCCCTGGAGGACACAATCGCCCAGGCACCCTCATGGCAGCTGACAGAGCCAAACAAATGTTT GGACCCCAAGTGCTTACGACCCGGCACTACGTGGGCTCAGCAGCTGCTTTTGCAGGGACACCAGAGCATGGACAATT CCAAGGCAGTCCTGGTGGTGCCTATGGGACTGCTCAGCCCCCACCTCACTATGGGCCCACACAGCCAGCTTATAGTC CTAGTCAGCAGCTCAGAGCTCCTTCGGCATTCCCTGCAGTGCAGTACCTATCTCAGCCACAGCCACAGCCCTATGCT GTGCATGGCCACTTTCAGCCCACTCAGACAGGTTTCCTCCAGCCTGGTGGTGCCCTGTCCTTGCAAAAGCAGATGGA ACATGCTAACCAGCAGACTGGCTTCTCCGACTCATCCTCTCTGCGCCCCATGCACCCCCAGGCTCTGCATCCAGCCC CTGGACTCCTTGCTTCCCCCCAGCTCCCTGTGCAGATGCAGCCAGCAGGAAAGTCGGGCTTTGCAGCTACCAGCCAA CCTGGCCCTCGGCTCCCCTTCATCCAACACAGCCAGAACCCGCGATTCTACCACAAGTGA(SEQ ID NO：I)
[0048] 本發(fā)明的再一方面涉及GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤(例如脂肪 肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的預(yù)后的藥物中的用途。
[0049] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的用途，其中，
[0050] 以對(duì)象自身的正常皮下組織中GPS2蛋白表達(dá)量為參照，判斷該對(duì)象的軟組織肉瘤 或疑似軟組織肉瘤中GPS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量；
[0051 ]優(yōu)選地，GPS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)免疫組化結(jié)果來(lái)判讀;優(yōu)選地，根據(jù)FNCLCC (法國(guó)聯(lián)邦癌癥中心)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：代表無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；"+"代表1 % - 5 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng) 性；"+"代表+5%-25%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性；"+++"代表>25%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性；
[0052] 優(yōu)選地，結(jié)果為"+"者，生存期15 -20個(gè)月，優(yōu)選為17 -18個(gè)月（例如17.9個(gè)月）；結(jié) 果為"++"者，生存期25 - 35個(gè)月，優(yōu)選為30 - 35個(gè)月例如32 - 33個(gè)月（例如32.5個(gè)月）；和/ 或結(jié)果為"+++"者，生存期36 - 45個(gè)月，優(yōu)選為40 - 45個(gè)月例如42 - 43個(gè)月（例如42.2個(gè) 月）。優(yōu)選地，所述生存期為中位生存期。
[0053]本發(fā)明的再一方面涉及一種判斷軟組織肉瘤患者預(yù)后的方法，包括檢測(cè)其GPS2蛋 白相對(duì)表達(dá)量的步驟。GPS2蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)檢測(cè)或判斷方法如上所述。
[0054] 本發(fā)明的再一方面涉及GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤(例如脂肪 肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的診斷的藥物中的用途。
[0055] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的用途，其中，
[0056]以對(duì)象自身的正常皮下組織中GPS2蛋白表達(dá)量為參照，判斷該對(duì)象的軟組織肉瘤 或疑似軟組織肉瘤中GPS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量；
[0057]優(yōu)選地，GPS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)免疫組化結(jié)果來(lái)判讀；優(yōu)選地，根據(jù)FNCLCC (法國(guó)聯(lián)邦癌癥中心）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：-無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞;+1%-5%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;++5% - 25%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;+++>25 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性；
[0058]優(yōu)選地，結(jié)果為"+"者為低表達(dá);結(jié)果為"++"者為中表達(dá);和/或結(jié)果為"+++"者為 高表達(dá)。
[0059]本發(fā)明的再一方面涉及一種診斷軟組織肉瘤的方法，包括檢測(cè)GPS2蛋白相對(duì)表達(dá) 量的步驟。GPS2蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)方法或判讀方法如上所述。
[0060]本發(fā)明的再一方面涉及GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤(例如脂肪 肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的治療和/或預(yù)防的藥物或者抑制脂肪 肉瘤細(xì)胞增殖和/或迀移的藥物中的用途。
[0061 ]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述的用途，其中，所述藥物為提高GPS2蛋白表達(dá)水 平的藥物。
[0062]根據(jù)本發(fā)明上面任一方面所述的用途，其中，所述GPS2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0063] GPS2蛋白的氨基酸序列：（327aa):
[0064] MPALLERPKLSNAMARALHRHIMMERERKRQEEEEVDKMMEQKMKEEQERRKKKEMEERMSLEETKEQILKLEEKLL ALQEEKHQLFLQLKKVLHEEEKRRRKEQSDLTTLTSAAYQQSLTVHTGTHLLSMQGSPGGHNRPGTLMAADRAKQMF GPQVLTTRHYVGSAAAFAGTPEHGQFQGSPGGAYGTAQPPPHYGPTQPAYSPSQQLRAPSAFPAVQYLSQPQPQPYA VHGHFQPTQTGFLQPGGALSLQKQMEHANQQTGFSDSSSLRPMHPQALHPAPGLLASPQLPVQMQPAGKSGFAATSQ PGPRLPFIQHSQNPRFYHK(SEQ ID N0：2)
[0065] 本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物I，其包含作為活性成分的GPS2基因、含有 GPS2基因的重組表達(dá)載體或含有該重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞，或者包含作為活性成分 的GPS2蛋白或含有GPS2蛋白的融合蛋白；可選地，還包含藥學(xué)上可接受的輔料。
[0066] 本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預(yù)防軟組織肉瘤的方法，包括給受試者施 用有效量的GPS2基因、GPS2蛋白或者本發(fā)明的藥物組合物1的步驟。
[0067] 本發(fā)明的再一方面涉及在體內(nèi)或體外一種抑制軟組織肉瘤細(xì)胞增殖和/或迀移的 方法，包括給細(xì)胞施用有效量的GPS2基因、GPS2蛋白或者本發(fā)明的藥物組合物1的步驟。
[0068] 在一個(gè)實(shí)施方案中，治療和/或預(yù)防有效量的本發(fā)明的藥物組合物以利于藥用的 方式配制和給藥，并需考慮到個(gè)體病人的臨床狀況、運(yùn)送位點(diǎn)、給藥方法、給藥日程安排和 醫(yī)生已知的其它因素。因此用于本文目的的"有效量"由這些方面的考慮決定。
[0069] 含治療和/或預(yù)防有效量的本發(fā)明多肽的藥物組合物非腸道給藥、口服、腦池內(nèi)給 藥、鞘內(nèi)給藥等。"藥學(xué)可接受輔料"指無(wú)毒的固體、半固體或液體填充物、稀釋液、膠囊材料 或任何類(lèi)型的配方輔助物。給藥方式包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)和關(guān) 節(jié)內(nèi)注射和輸注，還可通過(guò)緩釋系統(tǒng)恰當(dāng)?shù)亟o藥。
[0070] 發(fā)明藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和 嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重及個(gè)體反應(yīng)，所用的具體藥物，給藥途徑及給藥次 數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥。
[0071 ]本文所用的術(shù)語(yǔ)"組合物"意指包括包含指定量的各指定成分的產(chǎn)品，以及直接或 間接從指定量的各指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。
[0072] 可改變本發(fā)明藥物組合物中各活性成分的實(shí)際劑量水平，以便使活性成分的量能 有效針對(duì)具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應(yīng)。劑量水平須根據(jù)具體藥物組 合物或者活性成分的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴(yán)重程度以及待治療患者的病況和既 往病史來(lái)選定。但是，本領(lǐng)域的做法是，組合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的 水平開(kāi)始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明組合物的總?cè)沼昧宽?由主診醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)作出決定。對(duì)于任何具體的患者，具體的治療有效劑 量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴(yán)重程度;所采用的 具體藥物的活性;所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食;所 采用的具體組合物的給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄率;治療持續(xù)時(shí)間；與所采用的具體組合物 組合使用或同時(shí)使用的藥物;及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類(lèi)似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，藥物組 合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開(kāi)始，逐漸增加劑量，直到得到所需 的效果。一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明藥物組合物中的活性成分用于哺乳動(dòng)物特別是人的劑量可以介 于0.001-1000mg/kg體重/天，例如介于0.01-100mg/kg體重/天，例如介于0.01-10mg/kg體 重/天。
[0073] 本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物2,其包含檢測(cè)GPS2基因或者檢測(cè)GPS2蛋 白的試劑，可選地，還包含藥學(xué)上可接受的輔料;優(yōu)選地，所述檢測(cè)GPS2基因的試劑為能夠 特異擴(kuò)增GPS2基因的PCR引物;優(yōu)選地，所述GPS2蛋白的試劑為抗GPS2蛋白的抗體;優(yōu)選地， 為單克隆抗體;優(yōu)選地，所述抗體還連接有可檢測(cè)的標(biāo)記，例如放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā) 光物質(zhì)、有色物質(zhì)或酶。
[0074] 在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn) 室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供 相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。
[0075]如本文中所使用的，當(dāng)提GPS2基因時(shí)，包括但不限于其全長(zhǎng)(例如SEQ ID NO: 1)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，在GPS2的核苷酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包 括但不限于置換，缺失和/或添加），而不影響其生物學(xué)功能。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"GPS2 基因"應(yīng)包括所有此類(lèi)序列。
[0076] 如本文中所使用的，當(dāng)提GPS2蛋白時(shí)，包括但不限于其全長(zhǎng)(例如SEQ ID NO: 2)。 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，在GPS2的氨基酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異(包 括但不限于置換，缺失和/或添加），而不影響其生物學(xué)功能。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"GPS2 蛋白"應(yīng)包括所有此類(lèi)序列。
[0077] 本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"預(yù)后"是指，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)預(yù)測(cè)的疾病發(fā)展情況即可能的病程和結(jié)局， 它既包括判斷疾病的特定后果，也包括提供時(shí)間線索。
[0078] 術(shù)語(yǔ)"軟組織肉瘤"，包括但不限于，脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫 紋肌肉瘤，等。
[0079] 術(shù)語(yǔ)"重組表達(dá)載體"可以是任何便于進(jìn)行重組DNA操作并表達(dá)核酸序列的載體 (例如質(zhì)?；虿《荆］d體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞的相容性。載體 可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制型載體(即存在于染色體外的完整結(jié)構(gòu)，可獨(dú) 立于染色體進(jìn)行復(fù)制），例如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保 證自我復(fù)制的任何機(jī)制。或者，載體是一個(gè)當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，將整合到基因組中并與所整 合到的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可應(yīng)用單個(gè)載體或質(zhì)粒，或總體包含將導(dǎo)入宿主細(xì)胞 基因組的全部DNA的兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
[0080] 術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞"本發(fā)明是指包含可用來(lái)重組生產(chǎn)多肽或蛋白的本發(fā)明GPS2 核酸序列的重組宿主細(xì)胞。可將包含該核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而使該載體以上 述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋任何由于 復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞， 例如細(xì)菌或酵母細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
[0081] 術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或者"單抗"是指，來(lái)自一群高度同源的抗體分子中的一個(gè)抗體 或抗體的一個(gè)片斷，也即除可能自發(fā)出現(xiàn)的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對(duì) 抗原上的單一表位具有高特異性。多克隆抗體是相對(duì)于單克隆抗體而言的，其通常包含至 少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識(shí)別抗原上的不同表位。單克隆抗體通常 可采用Kohler等首次報(bào)道的雜交瘤技術(shù)獲得(Nature，256:495，1975)，但也可采用重組DNA 技術(shù)獲得(如參見(jiàn)U.S.P4,816,567)。
[0082] 術(shù)語(yǔ)"有效量"是指可在受試者中實(shí)現(xiàn)治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病 或病癥的劑量。
[0083] 術(shù)語(yǔ)"疾病和/或病癥"是指所述受試者的一種身體狀態(tài)，該身體狀態(tài)與本發(fā)明所 述疾病和/或病癥有關(guān)。
[0084] 術(shù)語(yǔ)"受試者"可以指患者或者其它接受本發(fā)明藥物組合物以治療、預(yù)防、減輕和/ 或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物，例如人、狗、猴、牛、馬等。
[0085]發(fā)明的有益效果
[0086] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，GPS2基因在脂肪肉瘤中低表達(dá)，在脂肪肉瘤中是一種腫 瘤抑制基因，并且能作為該疾病的一種可能的預(yù)后標(biāo)志物，同時(shí)該基因或其蛋白能夠成為 新的治療藥物。
【附圖說(shuō)明】
[0087] 圖1:GPS2在脂肪肉瘤病人標(biāo)本的表達(dá)檢測(cè)。
[0088] 1A，14例原代標(biāo)本中，脂肪肉瘤和自身正常皮下脂肪組織中GPS2基因相對(duì)表達(dá)量；
[0089] 1B，12例原代標(biāo)本中（取自前面的所述的14例），高分化脂肪肉瘤和未分化脂肪肉 瘤中GPS2基因相對(duì)表達(dá)量；
[0090] IC 一 IF，原代脂肪肉瘤病理切片行HE染色后結(jié)果；
[0091] IG - IJ，原代脂肪肉瘤病理切片行GPS2免疫組化染色后結(jié)果;其中，每一列（1C和 1G、ID和1H、IE和11、IF和1J)均為同一病人病理切片染色結(jié)果，一共是4例病人的染色結(jié)果。
[0092] 圖2 :GPS2基因敲除對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞增殖的影響。
[0093] 2A，QPCR比較Sh-ctrl和Sh-GPS2對(duì)SW872細(xì)胞系干涉效率；
[0094] 2B，western blotting檢測(cè)Sh-ctrl和Sh_GPS2對(duì)SW872細(xì)胞系干涉效率；
[0095] 2C，分析Sh-ctrl和Sh-GPS2兩組細(xì)胞DYE670增殖指數(shù)；
[0096] 2D - 2K，DYE670染色分析Sh-GPS2對(duì)SW872細(xì)胞增殖的影響;細(xì)胞增殖越快，熒光強(qiáng) 度越弱，峰值越往左移；其中，圖2D代表感染對(duì)照病毒的細(xì)胞標(biāo)記DYE670染料后的標(biāo)記效 率，圖2E代表感染對(duì)照病毒染色后繼續(xù)增殖了 24小時(shí)，圖2F代表增殖48小時(shí)，圖2G代表增殖 72小時(shí)。圖2H代表感染GPS2病毒的細(xì)胞標(biāo)記DYE670染料后的標(biāo)記效率，圖21代表感染GPS2 病毒染色后繼續(xù)增殖了 24小時(shí)，圖2J代表增殖48小時(shí)，圖2K代表增殖72小時(shí)。
[0097] 2L - 2M，BrdU染色析Sh-ctr 1和Sh-GPS2兩組細(xì)胞增殖情況；其中，圖2L是Sh-ctr 1 細(xì)胞，圖2M是Sh-GPS2細(xì)胞。
[0098] 2N，測(cè)定Sh-ctrl和Sh-GPS2兩組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度。
[0099] 圖3:GPS2基因敲除對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響。
[0100] 3A，Sh-ctrl 周期圖；
[0101] 3B，Sh-GPS2周期圖；
[0102] 3C，Sh-ctrl 和 Sh-GPS2 周期統(tǒng)計(jì)圖；
[0103] 3D，Sh-ctrl 24h凋亡圖；
[0104] 3E，Sh-GPS2 24h凋亡圖；
[0105] 3F，Sh-ctrl 48h凋亡圖；
[0106] 3G，Sh-GPS2 48h凋亡圖；
[0107] 3H，Sh-ctrl 和 Sh-GPS2 凋亡 24h 和 48h 統(tǒng)計(jì)圖。
[0108]圖4:GPS2基因敲除對(duì)脂肪肉瘤細(xì)胞迀移及分化的影響。
[0109] 4A，Sh-ctrl 劃痕 Oh 圖；
[0110] 4B，Sh-GPS2 劃痕 Oh 圖；
[0111] 4C，Sh-ctrl 劃痕 48h 圖；
[0112] 4D，Sh-GPS2 劃痕 48h 圖；
[0113] 4E，劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞迀移率統(tǒng)計(jì)圖；
[0114] 4F，Sh-ctrl 迀移 5h 圖；
[0115] 4G，Sh-GPS2 迀移 5h 圖；
[0116] 4H，Sh-ctrl和Sh-GPS2迀移細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；
[0117] 41，Sh-ctrl 和 Sh-GPS2 脂基因表達(dá)圖。
[0118] 圖5:根據(jù)病理免疫組化結(jié)果分析不同GPS2表達(dá)量其預(yù)后生存差異。注:坐標(biāo)點(diǎn)有 重疊，總例數(shù)為50例，其中32例陽(yáng)性，18例陰性(已排除）。
【具體實(shí)施方式】
[0119] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體 技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃 培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試 劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0120] 實(shí)施例1:GPS2在脂肪肉瘤和正常組織中的表達(dá)水平研究
[0121]本發(fā)明人分別對(duì)14例脂肪肉瘤患者手術(shù)后腫瘤組織（術(shù)后經(jīng)301醫(yī)院病理科確診 為脂肪肉瘤，并明確分化類(lèi)型)及同一位病人自身的正常皮下脂肪組織的RNA進(jìn)行了分離。 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GPS2mRNA的表達(dá)，結(jié)果證明腫瘤組織中GPS2基因表達(dá)量顯著低于對(duì) 照正常組織(P〈〇.05)。本發(fā)明人還利用免疫組化的研究方法，分析了 GPS2蛋白在脂肪肉瘤 組織中低表達(dá)。
[0122] 具體操作如下：
[0123] 1.實(shí)驗(yàn)材料、試劑和實(shí)驗(yàn)對(duì)象
[0124] I.IqRT-PCR
[0125] 實(shí)驗(yàn)材料、試劑：
[0126] 1)研缽，RNase free EP管，Trizol，乙醇，DEPC水，氯仿，異丙醇，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Thermo Scientific，威明頓，美國(guó)），.SYBH?Premix Ex Taq?II(Takara，日本），
[0127] 2)7500Fast Real-Time PCR System(ABI公司，美國(guó)）
[0128] 1.2HE 染色
[0129] 實(shí)驗(yàn)材料、試劑:蘇木素染液，伊紅染液，1%鹽酸酒精分化液，系列濃度的乙醇、二 甲苯、中性樹(shù)膠，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，眼科鑷，蓋玻片，載玻片，顯微鏡。
[0130] 1.3免疫組織化學(xué)染色
[0131] 實(shí)驗(yàn)材料、試劑:GPS2鼠單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室自己制備，枸櫞酸緩沖液，PBS緩沖 液，0.5 %DAB溶液，3 % H2O2溶液，羊血清，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，系列 濃度的乙醇、二甲苯、中性樹(shù)膠，培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，眼科鑷，蓋玻片，載玻片，顯微鏡。
[0132] 1.4實(shí)驗(yàn)對(duì)象
[0133] 收集2003年1月至2014年12月在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院院收治50例腹膜后脂肪肉 瘤患者的臨床資料和腫瘤蠟塊，并對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行隨訪。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)全部病理切片均有該 院病理科明確的診斷報(bào)告，且術(shù)后病理結(jié)果為高分化或未分化脂肪肉瘤(50例中有23例未 分化，27例高分化，由HE染色病理結(jié)果來(lái)判定），2)術(shù)前均未行放療或化療，3)有完備的臨床 病理資料及術(shù)后隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)未接受手術(shù)者，2)圍手術(shù)期死亡者，3)失訪者。其中本研 究所用的14例患者的脂肪肉瘤腫瘤組織和對(duì)照的正常皮下組織是從在此期間在該院行脂 肪肉瘤切除術(shù)中獲得，術(shù)后組織-80°C凍存，并有該院病理科明確的診斷報(bào)告。
[0134] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0135] 發(fā)明人分別對(duì)上述14例脂肪肉瘤患者手術(shù)后腫瘤組織及正常組織的RNA進(jìn)行了分 離。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)GPS2mRNA的表達(dá)。利用免疫組化的研究方法，分析了 GPS2蛋白在 脂肪肉瘤組織中低表達(dá)。
[0136] 2.1 總 RNA 抽提
[0137] 1)組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol溶液，混勻，室溫放置5min使其充分 裂解；
[0138] 2)加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置3-5min；
[0139] 3)4°C下，12000rpm離心15min，可見(jiàn)分為三層，RNA在上層水相，移至另一個(gè)新的 RNase free EP管；
[0140] 4)沉淀RNA:加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻(顛倒6-8次），室溫靜置IOmin;
[0141] 5)4°C 下，12000rpm 離心 15min，收集 RNA 沉淀，去上清；
[0142] 6)加入1ml 75%冰乙醇洗滌，4°C下1000 Orpm離心10min，超凈臺(tái)風(fēng)干；
[0143] 7)加入DEPC水30μ1溶解沉淀。
[0144] 總RNA純度和完整性檢測(cè)：
[0145] 1)純度檢測(cè)：取ΙμL RNA樣品50倍稀釋?zhuān)诤怂岬鞍讬z測(cè)儀上測(cè)定OD值，0D260/ 0D280的比值大于1.8，說(shuō)明制備的RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染。
[0146] 2)總RNA完整性檢測(cè)：取RNA樣品ΙμL，1 %瓊脂糖凝膠電泳80V X 20min，EB染色 lOmin，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶 完整的話即可證明總RNA抽提比較完整。
[0147] 2.2逆轉(zhuǎn)錄
[0148] 1)取Iyg RNA，加入DEPC水配成 11μ1，加入oligo(dT)primerlyl混勻，65°C水浴 5min〇
[0149] 2)加入4μ1 5xbuffer，2yl dNTPC，lyl RI，lyl RT，42°C水浴lh。
[0150] 2.3qPCR 檢測(cè)
[0151] 體系配制:20μ1體系
[0152] H2O 7μ1
[0153] SYBR Green PCR Premix ΙΟμΙ
[0154] 上游引物0·8μ1(10μΜ)
[0155] 下游引物0·8μ1(10μΜ)
[0156] ROX2 0.4μ1
[0157] cDNA 模板 ΙμL
[0158] 正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行qPCR測(cè)試溶解曲線以檢測(cè)引物特異性和擴(kuò)增效率，每個(gè)樣本設(shè) 三個(gè)副孔，使用7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量，內(nèi)參為β-actin， PCR引物的由AUGCT生物科技有限公司（北京，中國(guó)）設(shè)計(jì)與合成，引物序列如下。
[0159] β-actin：
[0160] 正義序列5，GACATGCCGCCTGGAGAAAC3，（SEQ ID N0:3)
[0161] 反義序列5'AGCCCAGGATGCCCTTTAGT3'（SEQ ID N0:4)
[0162] GPS2：
[0163] 正義序列5'ACATTATGATGGAGCGGGAG 3'（SEQ ID N0:5)
[0164] 反義序列5'GCTGGTGCTTCTCTTCCTGTAG 3'（SEQ ID NO:6)
[0165] 2.4HE 染色
[0166] 整個(gè)染色過(guò)程包括五個(gè)內(nèi)容:脫蠟，染色，脫水，透明和封固。
[0167] 1)脫蠟：
[0168] 1 ·組織蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度3μπι;
[0169] 2.將切片在溫箱中烤干后，立即投入二甲苯中脫蠟IOmin;
[0170] 3.移入無(wú)水酒精中，約2minx2次；
[0171] 4.移入90%酒精中，約2minx2次；
[0172] 5.移入80%酒精中，約2minx2次；
[0173] 6.移入70%酒精中，約2min;
[0174] 7.移入水中，洗去酒精，約2~3min;
[0175] 8.移入蒸餾水中，約2min。
[0176] 2)染色：
[0177] 1.移入蘇木素中，浸染IOmin，以稍深染為宜；
[0178] 2.移入水中，洗去蘇木素和浮色，約1~2min;
[0179] 3.移入分化液（1 %鹽酸酒精）中，分化幾秒至30秒鐘，使切片褪色至淡藍(lán)紅色即 可；
[0180] 4.移入流水中，洗滌30~60min，使組織呈鮮藍(lán)色或天藍(lán)色；
[0181] 5.移入伊紅液中，浸染2~5min;
[0182] 6.移入水中，洗去伊紅浮液，并用紗布擦凈玻片上的多余染料。
[0183] 3)脫水：
[0184] 1.吸去玻片上的水分后多入80%酒精中脫水約2minx2次；
[0185] 2.移入90%酒精中脫水，約4minx2次；
[0186] 3.移入無(wú)水酒精（100 %酒精)徹底脫水，約5minx2次。
[0187] 4)透明
[0188] 1.移入二甲苯I中透明3 - 5min；
[0189] 2.移入二甲苯Π 中透明5 -IOmin;
[0190] 5)封固
[0191] 用樹(shù)膠封固，先從二甲苯Π 中取出切片，將組織外圍的二甲苯迅速擦去，在滴上一 滴樹(shù)膠于組織片上，然后取干凈的蓋玻片，仔細(xì)加在封固劑上，慢慢壓平，使蓋片位置適中。 切片封固后，放在溫箱中烤干后觀察。
[0192] 2.5免疫組化染色
[0193] 取常規(guī)石蠟切片(厚度3μπι)后烤片，68°C，20min，
[0194] 1)常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水:二甲苯I 20min-二甲苯II 20min-100%酒精I(xiàn) 10min-100% II 10min-95%5min-80%5min-70%5min；
[0195] 2)阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:3%H202 37°C孵育10min，PBS沖洗5min x3次；
[0196] 3)抗原修復(fù):置0 .OlM枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸（95°C，15-20min)，自然冷 卻20min以上，再用冷水沖洗片子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗5minx3次。
[0197] 4)正常羊血清工作液封閉，37 °C IOmin;
[0198] 5)滴加一抗4°C冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗5minx3次（用I3BS緩沖液代替一抗作陰性對(duì) 照）；滴加生物素標(biāo)記二抗，37°C孵育30min，PBS沖洗5minx3次；
[0199] 6)滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 °C孵育30min，PBS沖洗 5minx3 次；
[0200] 7 )DAB/H202反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封 片。
[0201] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0202] GPS2 基因表達(dá)量=2-(GPS2 秘 actinlSACT) SP 2-z^ct 〇
[0203] 腫瘤細(xì)胞GPS2基因表達(dá)量與正常細(xì)胞GPS2表達(dá)量差別統(tǒng)計(jì)值>0.05時(shí)，為高表達(dá) 量，腫瘤分化程度高，腫瘤細(xì)胞GPS2基因表達(dá)量與正常細(xì)胞GPS2表達(dá)量差別統(tǒng)計(jì)值〈0.05 時(shí)，為低表達(dá)量，腫瘤分化程度低。
[0204] 免疫組化染色結(jié)果根據(jù)FNCLCC(法國(guó)聯(lián)邦癌癥中心)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞； +1 % - 5%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;++5% - 25%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;+++>25%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性。 [0205] 患者脂肪肉瘤組織GPS2mRNA的相對(duì)表達(dá)明顯低于正常組織（圖lAhGPSSmRNA的相 對(duì)表達(dá)在DDLPS(dedifferentiated Iiposarcoma，是指未分化脂肪肉瘤）中明顯減低（圖 1B)。其中，圖 IB表明GPS2在WDLPS(well differentiated liposarcoma，是指高分化脂肪肉 瘤）中的表達(dá)高于未分化脂肪肉瘤，說(shuō)明GPS2和患者預(yù)后相關(guān)(分化程度越低患者預(yù)后越 差)。
[0206] he染色的圖IC 一 IF確定分化類(lèi)型。50例中有23例未分化，27例高分化。
[0207] 免疫組化的結(jié)果顯示，GPS2蛋白在脂肪肉瘤組織中低表達(dá)，分化程度越高表達(dá)量 越高(圖1G -1J)。
[0208] 實(shí)施例2:降低GPS2基因水平促進(jìn)脂肪肉瘤細(xì)胞的增殖的研究
[0209] 1.實(shí)驗(yàn)材料、試劑和實(shí)驗(yàn)對(duì)象
[0210] 1 · IWestern Blotting檢測(cè)
[0211] 實(shí)驗(yàn)材料:30%丙烯酰胺，硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜液，TBST，10%脫脂奶粉，一抗和二 抗(TBST稀釋?zhuān)鰪?qiáng)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(ECL，Amersham Pharmacia)，Tanon 5200成像系統(tǒng) (Tanon有限公司，上海，中國(guó)）。
[0212] 1.2DYE670染色
[0213] 實(shí)驗(yàn)材料：Cell Proliferation Dyeeflu〇r?)670(eBioscience，美國(guó)），含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，含5 %FBS的DMEM培養(yǎng)基，胰酶，F(xiàn)ACS流式細(xì)胞儀(BD，Cal ibur，美國(guó)）。
[0214] 1.3BrdU 染色
[0215] BrdU試劑盒(凱基生物技術(shù)有限公司，南京，中國(guó)），倒置顯微鏡成像(奧林巴斯，漢 堡，德國(guó)），含1 〇 % FBS的DMEM培養(yǎng)基。
[0216] 1.4培養(yǎng)基上清葡萄糖的濃度采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定，委托北京北方生物技術(shù) 有限公司進(jìn)行。
[0217] I. 5實(shí)驗(yàn)對(duì)象：
[0218] 轉(zhuǎn)染了Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細(xì)胞。Sh-ctrl代表感染空白病毒的細(xì)胞，Sh-GPS2代表感染GPS2干涉病毒的細(xì)胞）。
[0219] 本研究中用pSicoR-GFP質(zhì)粒（購(gòu)自addgene公司）攜帶有GPS2shRNA序列 GAGGAGACCAAGGAACAAA，通過(guò)與慢病毒載體psPAX2和pMD2.G(均購(gòu)自addgene公司）共轉(zhuǎn)染至 293T細(xì)胞中來(lái)包裝慢病毒。流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)，評(píng)價(jià)慢病毒載體的基因轉(zhuǎn)染效率。將 SW872細(xì)胞以2 X IO5個(gè)/孔的密度接種至6孔板中，然后按感染復(fù)數(shù)(Μ0Ι ) = 10感染慢病毒載 體 48h。
[0220] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0221] 2 · IWestern Blotting實(shí)驗(yàn)方法 [0222] (1)收集蛋白樣品
[0223] 使用適量的蛋白裂解液(RIPA)在冰上裂解貼壁SW872細(xì)胞，收集裂解液后采用碧 云天蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量并用蛋白裂解液配平。
[0224] (2)電泳
[0225] ①根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版配制SDS-PAGE凝膠；
[0226] ②樣品處理
[0227] 在收集的蛋白樣品中加入5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100°C水浴加熱3 - 5min， 以充分變性蛋白；
[0228] ③上樣與電泳
[0229] 冷卻到室溫后，在SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)加入marker蛋白和蛋白樣品。采用Bio-Rad 的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置，低電壓設(shè)置在80V，高電壓設(shè)置在160V左右，根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量 (GPS2:37KD)預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后停止電泳。
[0230] (3)轉(zhuǎn)膜
[0231]選用硝酸纖維素膜，使用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為400mA，根 據(jù)目的蛋白分子量確認(rèn)轉(zhuǎn)膜時(shí)間，在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中，將轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
[0232] (4)封閉
[0233]轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的TBST中，漂洗l-2min，以洗去膜上 的轉(zhuǎn)膜液，注意膜的保濕，避免膜的干燥。加入10%脫脂奶粉，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉 3h〇
[0234] (5) -抗孵育
[0235] 參考一抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用10%脫脂奶粉稀釋一抗。
[0236] 室溫在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育2h后加入TBST，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌7min x4次。
[0237] (6)二抗孵育參考二抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用TBST稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的二抗。室溫在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育Ih。加入TBST，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌 7min x4次(每次7分鐘，共洗4次）。
[0238] (7)蛋白檢測(cè)
[0239] 利用化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯影。GAPDH作為內(nèi)參。顯影儀器為T(mén)anon 5200成像 系統(tǒng)成像。
[0240] 2.2DYE670染色實(shí)驗(yàn)方法：
[0241] 1)用胰酶消化收集感染Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細(xì)胞后用I3BS(預(yù)熱到室溫）制 成IOxlO 5A). 5ml的細(xì)胞懸液；
[0242] 2)499ylPBS加入ΙμL細(xì)胞增殖DYE 670染液并與細(xì)胞懸液混合，避光37°C孵育 IOmin;
[0243] 3)加4到5倍體積的低溫含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在冰上孵育5min終止標(biāo)記；
[0244] 4)用含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次；
[0245] 5)用含5 %血清的DMEM重懸細(xì)胞，按IxlO5/孔鋪入6孔板，在37 °C，5 %C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng) 0h，48h，72h，96h;
[0246] 6)每天同一時(shí)間點(diǎn)用胰酶收集細(xì)胞并在2%多聚甲醛中固定，4°C保存，所有樣本 收集完畢后用流式細(xì)胞儀收集、分析數(shù)據(jù)。
[0247] 2.3BrdU 染色
[0248] BrdU測(cè)定，細(xì)胞接種至6孔板，用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24h，然后加 ΙΟμΜ BrdlKBrdU試劑盒，南京，中國(guó)），7 - 8h后，清洗細(xì)胞兩次，然后在工作液中37°C孵育30分鐘。 最后，在4°C下，用200yL含5yL PE-BrdU抗體的染色緩沖液培制成細(xì)胞懸液，避光孵育30分 鐘，用1X70倒置顯微鏡成像(Olympus ,Hamburg,Germany)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次并從三個(gè)位置上對(duì) 至少10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析。
[0249] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [0250]結(jié)果如圖2所示。
[0251]圖2A-2B為敲低GPS2的效果。
[0252]圖2C為GPS2敲低后促進(jìn)細(xì)胞增殖的結(jié)果。
[0253] 圖2D - 2K，DYE670染色分析Sh-GPS2對(duì)SW872細(xì)胞增殖的影響。圖2L-2M，BrdU染色 析Sh-ctrl和Sh-GPS2兩組細(xì)胞增殖情況。
[0254]圖2N，測(cè)定Si-Ctrl和Sh-GPS2兩組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度。結(jié)果顯 示，GPS2敲低后，增加培養(yǎng)基糖耗量。
[0255]以上結(jié)果表明，利用干涉GPS2基因表達(dá)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，敲低GPS2表達(dá)后 細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。
[0256] 實(shí)施例3:降低GPS2基因后影響脂肪肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的研究
[0257] 1.實(shí)驗(yàn)材料、試劑
[0258] 1.1細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)材料:細(xì)胞凋亡試劑盒(三箭生物技術(shù)有限公司，天津，中國(guó)），含 10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。
[0259] 1.2細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)材料:細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(三箭生物技術(shù)有限公司，天津，中 國(guó)），PBS，含5 %FBS的PBS，無(wú)水乙醇，胰酶，F(xiàn)ACS流式細(xì)胞儀(BD，Cal ibur，美國(guó)）。
[0260] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0261] 2.1細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)方法：
[0262] 1)用胰酶消化收集感染Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細(xì)胞后按3父105個(gè)/孔用正常 培養(yǎng)基重懸后鋪入6孔板；
[0263] 2)待細(xì)胞貼壁后換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h和48h;
[0264] 3)用凋亡緩沖液洗滌細(xì)胞兩次后用100μΙ凋亡緩沖液重懸細(xì)胞；
[0265] 4)加入AnnexinV 5μ1 避光染色 15min然后；
[0266] 5)加入PI避光染色5min;
[0267] 6)補(bǔ)充凋亡緩沖液300μ1，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)和分析。凋亡細(xì)胞為 AnnexinV+/PI_〇
[0268] 2.2細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)方法：
[0269] 1)用胰酶消化收集感染Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細(xì)胞于EP管中，I X 106個(gè)/管； [0270] 2)冰PBS洗滌收集的細(xì)胞，1000 rpm離心沉淀細(xì)胞，棄上清。
[0271] 3)用300μ1含5%FBS的PBS重懸細(xì)胞后加入再700μ1冰無(wú)水乙醇吹打均勻，-20°C儲(chǔ) 存過(guò)夜。
[0272] 4)離心乙醇固定過(guò)的細(xì)胞，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞3次以去除殘留的乙醇。
[0273] 5)加入0.5ml PI/Rnase 37Γ避光染色30min。
[0274] 6)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析細(xì)胞周期。
[0275] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0276]結(jié)果如圖3A - 3H所示。利用干涉GPS2基因表達(dá)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，敲低GPS2 表達(dá)后測(cè)定細(xì)胞周期，細(xì)胞周期Gl期明顯縮短，S期細(xì)胞明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明了細(xì)胞增殖速度快， DNA拷貝數(shù)多。另外，結(jié)果還表明敲低GPS2表達(dá)后對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。
[0277] 實(shí)施例4:降低GPS2基因促進(jìn)脂肪肉瘤細(xì)胞的迀移的研究
[0278] 1.實(shí)驗(yàn)材料、試劑
[0279] 實(shí)驗(yàn)材料:8 · Ομπι孔徑Transwell小室(Costar，紐約，美國(guó)），含10%FBS的DMEM培養(yǎng) 基，DMEM培養(yǎng)基，胰酶。
[0280] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0281] 2.1細(xì)胞迀移能力檢測(cè)
[0282] 1)用胰酶消化收集感染Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重 懸至IX IOfVmL;
[0283] 2)在24孔板中置入Transwell小室，小室下方加入600μ1含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基；
[0284] 3)向小室內(nèi)加入100μΙ細(xì)胞懸液，將板置于含5%C02,37°C的培養(yǎng)箱中孵育5h;
[0285] 4)用600μ1 PBS沖洗上室下壁細(xì)胞兩次；
[0286] 5)用600μ1 2%多聚甲醛固定20min;
[0287] 6)棉簽擦拭上室上壁未迀徙的細(xì)胞，然后用600μ1結(jié)晶紫對(duì)迀移到上室下壁的細(xì) 胞染色I(xiàn)Omin;
[0288] 7)流水沖洗上室內(nèi)部，洗凈多余的結(jié)晶紫燃料，用棉簽將上室上壁擦拭干凈；
[0289] 8)光學(xué)顯微鏡下拍照，每個(gè)孔隨機(jī)選擇6個(gè)區(qū)域（Χ100)并計(jì)數(shù)，取平均值和標(biāo)準(zhǔn) 差。用顯微鏡自帶標(biāo)尺來(lái)計(jì)算劃痕寬度所占劃痕總寬度比率，作為迀移率。
[0290] 2.2成脂分化檢測(cè)
[0291 ] 總RNA抽提
[0292] 1)用胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取I * IO6細(xì)胞加入1ml Tr i ZO1溶液，混勻，室溫放置5min 使其充分裂解；
[0293] 2)加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置3 - 5min；
[0294] 3)4°C下，12000rpm離心15min，可見(jiàn)分為三層，RNA在上層水相，移至另一個(gè)新的 RNase free EP管；
[0295] 4)沉淀RNA:加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻(顛倒6-8次），室溫靜置IOmin;
[0296] 5)4°C 下，12000rpm 離心 15min，收集 RNA 沉淀，去上清；
[0297] 6)加入1ml 75%冰乙醇洗滌，4°C下1000 Orpm離心10min，超凈臺(tái)風(fēng)干；
[0298] 7)加入DEPC水30μ1溶解沉淀。
[0299] 總RNA純度和完整性檢測(cè)：
[0300] 1)純度檢測(cè)：取ΙμL RNA樣品50倍稀釋?zhuān)诤怂岬鞍讬z測(cè)儀上測(cè)定OD值，0D260/ 0D280的比值大于1.8，說(shuō)明制備的RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染。
[0301] 2)總RNA完整性檢測(cè)：取RNA樣品ΙμL，1 %瓊脂糖凝膠電泳80V X 20min，EB染色 lOmin，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶 完整的話即可證明總RNA抽提比較完整。
[0302] 逆轉(zhuǎn)錄
[0303] 1)取Iyg RNA，加入DEPC水配成 11μ1，加入oligo(dT)primerlyl混勻，65°C水浴 5min〇
[0304] 2)加入4μ1 5xbuffer，2yl dNTPC，lyl RI，lyl RT，42°C水浴lh。
[0305] qPCR 檢測(cè)
[0306] 體系配制：20μ1體系
[0307] H2O 7μ1
[0308] SYBR Green PCR Premix ΙΟμΙ
[0309] 上游引物0·8μ1(10μΜ)
[0310]下游引物〇·8μ1(10μΜ)
[0311] ROX2 0.4μ1
[0312] cDNA 模板 ΙμL
[0313]正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行qPCR測(cè)試溶解曲線以檢測(cè)引物特異性和擴(kuò)增效率，每個(gè)樣本設(shè) 三個(gè)副孔，使用7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量，內(nèi)參為β-actin， PCR引物的由AUGCT生物科技有限公司（北京，中國(guó)）設(shè)計(jì)與合成，引物序列如下。
[0314] β-actin：
[0315] 正義序列5'GACATGCCGCCTGGAGAAAC3'（SEQ ID N0:3)
[0316] 反義序列5'AGCCCAGGATGCCCTTTAGT3'（SEQ ID N0:4)
[0317] C/ΕΒΡα：
[0318] 正義序列5'GTCCAAACCAACCGCACAT3'（SEQ ID N0:5)
[0319] 反義序列5'GAAACAACCCCGTAGGAACAT3'（SEQ ID N0:6)
[0320] LPL：
[0321] 正義序列5，ACTGCCACTTCAACCACAGC3，（SEQ ID N0:7)
[0322] 反義序列5，AATACTTCGACCAGGCGACC3，（SEQ ID NO: 8)
[0323] Prefl：
[0324] 正義序列5，GCGCGGGACTCCAGCCCTAAGT3，（SEQ ID N0:9)
[0325] 反義序列5，GCGGTGCAGGGGCTGCTCCGGG3，（SEQ ID N0:10)
[0326] PPAR γI：
[0327] 正義序列5'GTTGATTTCTCCAGCATTTCCA3'（SEQ ID Ν0:11)
[0328] 反義序列5'GGCTCTTCGTGAGGTTTGTTG3'（SEQ ID N0:12)
[0329] PPAR γ 2
[0330] 正義序列5，GAACTTAACTGCAGGACCTGCG3，（SEQ ID N0:13)
[0331] 反義序列5，AACTGATGCTGACGAGTGCCT3，（SEQ ID N0:14)。
[0332] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0333] 相同劃痕寬度下，細(xì)胞迀移能力越強(qiáng)，劃痕愈合越快。
[0334]結(jié)果如圖4A-41所示。結(jié)果表明，利用干涉GPS2基因表達(dá)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞， 敲低GPS2表達(dá)后進(jìn)行細(xì)胞迀移能力檢測(cè)，細(xì)胞迀移能力明顯增強(qiáng)。還促進(jìn)脂肪肉瘤細(xì)胞成 脂分化，意味著將GPS2敲除后細(xì)胞分化能力減弱，側(cè)面反映出GPS2表達(dá)量越低，細(xì)胞分化程 度越低，惡性程度越高。
[0335] 實(shí)施例5 :GPS2在脂肪肉瘤中低表達(dá)并與病人預(yù)后有關(guān)
[0336] 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象
[0337] 本研究中所用的50例患者的腫瘤組織（脂肪肉瘤）和對(duì)照的自身正常皮下組織是 從2003年1月到2014年12月在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院普外科行脂肪肉瘤切除術(shù)術(shù)中獲得， 50例患者均得到告知和隨訪，術(shù)前均未行放療或化療，患者的臨床資料，包括:年齡、性別、 組織類(lèi)型。
[0338] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0339] 通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)50例患者的腫瘤組織（脂肪肉瘤)和對(duì)照的自身正常皮下 組織中為GPS2蛋白的表達(dá)。免疫組化的具體操作步驟參照實(shí)施例1。病理切片后在顯微鏡下 計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。
[0340] 染色評(píng)分:-無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞;+1 % - 5 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;++5 % - 25 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng) 性;+++>25 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性。
[0341] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0342] 患者的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)表1。
[0343] 表1:免疫組織化學(xué)染色結(jié)果
[0345] 將病人按照GPS2蛋白表達(dá)量分為高、中、低三組。免疫組化結(jié)果根據(jù)病理切片后在 顯微鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例即可判斷表達(dá)強(qiáng)弱，排除18例陰性病人，+為低表達(dá)。++為 中表達(dá)，+++為高表達(dá)。
[0346] 表2:GPS2蛋白表達(dá)量、生存時(shí)間和生存狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

[0349] 上面的表2中，生存狀態(tài)0代表生存，1代表死亡）。
[0350] GPS2蛋白表達(dá)量由免疫組化結(jié)果來(lái)判定，預(yù)后生存期來(lái)自對(duì)患者的長(zhǎng)期隨訪。
[0351] 患者的預(yù)后生存曲線列在圖5(priSm5.0制作）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同組別預(yù)后與GPS2蛋 白表達(dá)呈明顯相關(guān)性。圖5顯示，GPS2表達(dá)量越高，患者術(shù)后生存時(shí)間越長(zhǎng)，GPS2表達(dá)量越 低，患者術(shù)后生存時(shí)間越短。GPS2蛋白高表達(dá)組病例存活期明顯延長(zhǎng)。
[0352] 低表達(dá)組中位生存期17.93月，中表達(dá)組中位生存期32.5月，高表達(dá)組中位生存期 42.15月。可看出GPS2表達(dá)越高，患者的中位生存期越長(zhǎng)，預(yù)后越好。
[0353]盡管本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根 據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保 護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或 橫紋肌肉瘤)的預(yù)后的藥物中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中， 檢測(cè)GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達(dá)量A，以及GPS2基因在對(duì)象自身的正常皮下組織 中的表達(dá)量B: 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則腫瘤分化程度低，預(yù)后較差;和/或 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則該基因?qū)υ搶?duì)象的預(yù)后無(wú)顯著意義； 優(yōu)選地，所述檢測(cè)至少重復(fù)1次，例如重復(fù)1、2、3或4次。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所述表達(dá)量A和表達(dá)量B，并 按照如下公式計(jì)算： 表達(dá)量 A 或表達(dá)量 B = 。 4. GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或 橫紋肌肉瘤)的診斷的藥物中的用途。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中， 檢測(cè)GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達(dá)量A，以及GPS2基因在對(duì)象自身的正常皮下組織 中的表達(dá)量B: 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則診斷為陽(yáng)性;和/或 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則診斷為陰性； 優(yōu)選地，所述檢測(cè)至少重復(fù)1次，例如重復(fù)1、2、3或4次。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)所述表達(dá)量A和表達(dá)量B，并 按照如下公式計(jì)算： 表達(dá)量 A 或表達(dá)量 B = 。 7. GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或 橫紋肌肉瘤)的治療和/或預(yù)防的藥物或者抑制脂肪肉瘤細(xì)胞增殖和/或迀移的藥物中的用 途。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述藥物為提高GPS2基因的表達(dá)水平的藥物。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述GPS2基因的核苷酸序列 如SEQ ID ΝΟ:1 所示。 10. GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜 肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的預(yù)后的藥物中的用途。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中， 以對(duì)象自身的正常皮下組織中GPS2蛋白表達(dá)量為參照，判斷該對(duì)象的軟組織肉瘤或疑 似軟組織肉瘤中GPS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量； 優(yōu)選地，GPS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)免疫組化結(jié)果來(lái)判讀;優(yōu)選地，根據(jù)FNCLCC(法國(guó) 聯(lián)邦癌癥中心)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：代表無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；"+"代表1% - 5%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性；"+ +"代表5%-25 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;+++>25 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性； 優(yōu)選地，結(jié)果為"+"者，生存期15 -20個(gè)月，優(yōu)選為17 -18個(gè)月（例如17.9個(gè)月）；結(jié)果為 "++"者，生存期25 - 35個(gè)月，優(yōu)選為30 - 35個(gè)月或32 - 33個(gè)月（例如32.5個(gè)月）；和/或結(jié)果 為"+++"者，生存期36 -45個(gè)月，優(yōu)選為40 -45個(gè)月或42 -43個(gè)月（例如42.2個(gè)月）；優(yōu)選地， 所述生存期為中位生存期。 12. GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜 肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的診斷的藥物中的用途。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的用途，其中， 以對(duì)象自身的正常皮下組織中GPS2蛋白表達(dá)量為參照，判斷該對(duì)象的軟組織肉瘤或疑 似軟組織肉瘤中GPS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量； 優(yōu)選地，GPS2蛋白的相對(duì)表達(dá)量根據(jù)免疫組化結(jié)果來(lái)判讀;優(yōu)選地，根據(jù)FNCLCC(法國(guó) 聯(lián)邦癌癥中心)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：代表無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；"+"代表1% - 5%的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性；"+ +"代表5%-25 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性;+++>25 %的腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性。 14. GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜 肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤）的治療和/或預(yù)防的藥物或者抑制脂肪肉瘤細(xì)胞增殖和/或迀 移的藥物中的用途。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中，所述藥物為提高GPS2蛋白表達(dá)水平的藥物。16. 根據(jù)權(quán)利要求10至15中任一權(quán)利要求所述的用途，其中，所述GPS2蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO:2所示。17. -種藥物組合物，其包含GPS2基因、含有GPS2基因的重組表達(dá)載體或含有該重組表 達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞，或者包含GPS2蛋白或含有GPS2蛋白的融合蛋白；可選地，還包含藥 學(xué)上可接受的輔料。18. -種藥物組合物，其包含檢測(cè)GPS2基因或者檢測(cè)GPS2蛋白的試劑，可選地，還包含 藥學(xué)上可接受的輔料;優(yōu)選地，所述檢測(cè)GPS2基因的試劑為能夠特異擴(kuò)增GPS2基因的PCR引 物;優(yōu)選地，所述GPS2蛋白的試劑為抗GPS2蛋白的抗體;優(yōu)選地，為單克隆抗體;優(yōu)選地，所 述抗體還連接有可檢測(cè)的標(biāo)記，例如放射性同位素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、有色物質(zhì)或酶。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106075468SQ201610402505
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】王立生, 肖鳳君, 吳祖澤, 楊曉明, 黃曉東, 尹榮華, 王 華, 楊月峰
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所