專利名稱：包含枯草桿菌果膠酸裂解酶的洗滌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含果膠酸裂解酶(EC 4.2.2.2)或它的穩(wěn)定化變體的洗滌劑組合物，所述的果膠酸裂解酶分離自枯草桿菌(Bacillus subtilis)菌株，優(yōu)選克隆自枯草桿菌菌株；本發(fā)明還涉及存在于枯草桿菌DSM14218菌株的質(zhì)粒中的DNA序列編碼的果膠酸裂解酶，還提供了一種芽孢桿菌(Bacillus)表達載體和一種在芽孢桿菌宿主細胞中產(chǎn)生果膠酸裂解酶的方法。
背景技術(shù)：
果膠聚合物是植物細胞壁的重要組成成分。果膠是一種主鏈由交替的同聚半乳糖醛酸聚糖(平滑區(qū))和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(毛狀區(qū))組成的雜多糖，所述平滑區(qū)是1，4連接的α-D-半乳糖醛酸的直鏈聚合物。半乳糖醛酸殘基可以在羧基基團上被不同程度地甲酯化，通常是以非隨機方式將聚半乳糖醛酸嵌段完全甲酯化。
可以將果膠酶根據(jù)其優(yōu)選底物(高度甲酯化的果膠或低甲酯化的果膠和聚半乳糖醛酸(果膠酸))以及反應(yīng)機制(β-消除或水解)進行分類。果膠酶可以主要是內(nèi)切作用，即在鏈內(nèi)隨機位置切割聚合物產(chǎn)生寡聚物混合物，或者它們可以是外切作用，從聚合物的一端進行攻擊并產(chǎn)生單體或二聚體。酶命名法(1992)給出的酶分類中包括了幾種作用于果膠平滑區(qū)的果膠酶活性，例如果膠酸裂解酶(EC 4.2.2.2)、果膠裂解酶(EC4.2.2.10)、多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15)、外切多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.67)、外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)和外切多聚α-半乳糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.82)。
WO99/27083公開了一種克隆自地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的果膠酸裂解酶。WO99/27084公開了克隆自粘瓊脂芽孢桿菌(Bacillus agaradhaerens)、耐鹽芽孢桿菌(Bacillus halodarans)和其它芽孢桿菌的果膠酸裂解酶。
已克隆了來自枯草桿菌的一種果膠酸裂解酶(Nasser等(1993)FEBS335319-326)。所述的果膠酸裂解酶需要二價陽離子以達到最大活性，鈣離子是最具激活作用的。
JP2000-262292A公開了一種編碼芽孢桿菌屬原果膠酶的基因、一種包含所述基因的轉(zhuǎn)化體和使用該轉(zhuǎn)化體對纖維的精制。
US6,172,030公開了一種含有芽孢桿菌原果膠酶的洗滌劑組合物，所述的原果膠酶對原果膠和聚半乳糖醛酸底物具有7或更高的反應(yīng)最適pH。
本發(fā)明的目的是提供一種在洗滌劑組合物中具有高性能的果膠酸裂解酶。
發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新的具有果膠酸裂解酶(EC 4.2.2.2)活性的多肽并在芽孢桿菌宿主中成功地克隆和表達出該果膠酸裂解酶。
相應(yīng)地，本發(fā)明第一個方面涉及一種洗滌劑組合物，該組合物包含有表面活性劑和由枯草桿菌菌株的內(nèi)源DNA序列編碼的果膠酸裂解酶(EC 4.2.2.2)或其穩(wěn)定化變體，優(yōu)選由獲得自枯草桿菌DSM 14218的DNA序列編碼的果膠酸裂解酶或其定點穩(wěn)定化變體，例如由包含SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列編碼的多肽或由包含SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列編碼的果膠酸裂解酶的定點穩(wěn)定化變體。
本發(fā)明第二個方面涉及用本發(fā)明所提供的洗滌劑組合物來清潔織物、碗盤或硬表面以獲得優(yōu)良的清潔性能的方法。
本發(fā)明第三個方面涉及本發(fā)明所提供的洗滌劑組合物在織物清潔和/或織物去污和/或織物白度保持和/或織物軟化和/或織物顏色顯現(xiàn)和/或清潔硬表面如地板、墻壁、浴室瓷磚和類似物和/或手洗和機洗碗盤和/或口腔和/或牙齒應(yīng)用中的用途。
再一個方面，本發(fā)明涉及具有果膠酸裂解酶(EC4.2.2.2)活性的多肽，該多肽選自下列之一(a)由SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列編碼的多肽；(b)通過將包含SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列的細胞在可表達該序列的條件下培養(yǎng)而產(chǎn)生的多肽；和(c)(a)或(b)的定點變體，該變體通過改變一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸殘基為其它氨基酸殘基已獲得穩(wěn)定化。
再一方面，本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明果膠酸裂解酶的酶制品、一種分離的編碼本發(fā)明果膠酸裂解酶的多核苷酸分子、一種表達載體、一種能表達本發(fā)明果膠酸裂解酶的培養(yǎng)細胞和一種生產(chǎn)本發(fā)明果膠酸裂解酶的方法。
發(fā)明詳述為了達到本發(fā)明的目的，本文使用的術(shù)語“獲得自”或“可獲得自”與一個特定的來源有關(guān)時指酶由此特定的來源產(chǎn)生，或由已插入此來源的基因的細胞產(chǎn)生或能由它們產(chǎn)生。
術(shù)語“野生型酶”表示一種酶，所述的酶是天然存在的微生物，如在自然界發(fā)現(xiàn)的真菌或細菌的內(nèi)源酶。
本文使用的術(shù)語“親本酶”表示一種經(jīng)修飾可以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的酶。親本酶可以是一種分離自天然來源的酶，或一種已被預(yù)先修飾但仍保持了所討論的酶的特征活性的酶。本發(fā)明的親本果膠酸裂解酶可以是野生型的果膠酸裂解酶。
術(shù)語“酶變體”表示氨基酸序列與親本酶的氨基酸序列相比包含著差異的酶。與親本酶相比，該差異包括替換、缺失和/或插入。
本發(fā)明的果膠酸裂解酶可以獲得自枯草桿菌菌株。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的果膠酸裂解酶獲得自枯草桿菌。本發(fā)明人根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約于2001年4月5日，在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，聯(lián)邦德國)保藏了此枯草桿菌菌株，保藏號為DSM 14218。
在本發(fā)明文中，術(shù)語“酶制品”意味著常規(guī)的酶發(fā)酵產(chǎn)物，其可能分離并純化自一個微生物種，這樣的制品通常包含若干種不同酶活性；或者意味著單組分酶，優(yōu)選通過使用常規(guī)重組技術(shù)來源于細菌或真菌菌種的酶的混合物，這些酶已獨立地進行了發(fā)酵并且可能地進行了分離和純化并且它們可以來自不同的菌種，優(yōu)選真菌或細菌菌種；或者意味著作為宿主細胞表達重組果膠酸裂解酶的微生物的發(fā)酵產(chǎn)物，但是此微生物同時會產(chǎn)生其它酶，例如木葡聚糖酶、蛋白酶或纖維素酶，它們是該微生物天然的發(fā)酵產(chǎn)物，這樣該術(shù)語將意味著由此相應(yīng)天然微生物常規(guī)產(chǎn)生的酶復(fù)合物。
在本發(fā)明文中，術(shù)語“表達載體”表示線性或環(huán)狀DNA分子，其中包含編碼目的多肽的片段及與其可操作地連接在一起用于其轉(zhuǎn)錄的附加片段。所述附加片段可包括啟動子和終止子序列，還可任選包括一或多個復(fù)制起點，一或多個選擇標(biāo)記，增強子，多聚腺苷酸化信號等。表達載體通常來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可含有這兩者的元件。本發(fā)明的表達載體可以是能方便地進行重組DNA操作的任何表達載體，載體的選擇通常取決于該載體將要導(dǎo)入的宿主細胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即以染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒?？蛇x擇地，載體可以是這樣一種載體，當(dāng)其被導(dǎo)入宿主細胞中時，能整合到宿主細胞的基因組中并與所整合的染色體一起復(fù)制。
用于本文與多肽或蛋白質(zhì)的表達相關(guān)的術(shù)語“重組表達”或“重組表達的”是根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)定義來限定的。蛋白質(zhì)的重組表達通常使用上面剛剛描述的表達載體來進行。
術(shù)語“分離的”，用于多核苷酸分子時，表示該多核苷酸分子已被移離其天然遺傳環(huán)境，因此不含其它外源或不需要的編碼序列，并且該分子以一種適合用于基因工程化蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)的形式存在。這種分離的分子是與它們的天然環(huán)境相分離的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含在通常情況下與之相關(guān)聯(lián)的其它基因，但是可包括天然存在的5′和3非翻譯區(qū)，如啟動子和終止子。相關(guān)聯(lián)區(qū)域的鑒定對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的(參見例如，Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。術(shù)語“分離的多核苷酸”也可以稱為“克隆的多核苷酸”。
當(dāng)用于蛋白質(zhì)/多肽時，術(shù)語“分離的”表示該蛋白質(zhì)存在于非其天然環(huán)境的情況下。在優(yōu)選形式下，分離的蛋白質(zhì)實質(zhì)上不含其它蛋白質(zhì)，尤其是其它同源蛋白質(zhì)(即“同源的雜質(zhì)”，見下文)。優(yōu)選以純度在40％以上的形式，更優(yōu)選純度在60％以上的形式提供蛋白質(zhì)。
甚至更優(yōu)選的是以高度純化形式提供所述的蛋白質(zhì)，即通過SDS-PAGE測定該蛋白質(zhì)的純度在80％以上，更優(yōu)選95％以上，甚至更優(yōu)選99％以上。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)/多肽”也可以稱為“純化的蛋白質(zhì)/多肽”。
術(shù)語“同源雜質(zhì)”意味著任何來源于最初獲得本發(fā)明多肽的細胞的同源細胞的雜質(zhì)(如非本發(fā)明多肽的其它多肽)。
本文所用與特定的微生物源相關(guān)的術(shù)語“獲得自”意指該多核苷酸和/或多肽是由此特定來源或由如下細胞產(chǎn)生，其中所述細胞中已插入來自于該來源的基因。
當(dāng)涉及DNA片段時，術(shù)語“可操作地連接”表示這些片段被排列成能協(xié)同地發(fā)揮其預(yù)期目的的形式，如在啟動子內(nèi)開始轉(zhuǎn)錄并通過編碼片段到達終止子。
術(shù)語“多核苷酸”表示脫氧核糖核酸或核糖核酸堿基的從5′向3′閱讀的單鏈或雙鏈聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并可從天然來源分離得到或體外合成得到、或由天然和合成分子的組合來制備。
術(shù)語“多核苷酸分子的互補物”表示與參照序列相比，具有互補堿基序列并方向相反的多核苷酸分子。例如，序列5 ATGCACGGG3與序列5 CCCGTGCAT3互補。
術(shù)語“簡并核苷酸序列”表示包括一或多個簡并密碼子的核苷酸序列(與編碼多肽的多核苷酸參照序列相比)。簡并密碼子包含不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(即GAU和GAC三聯(lián)體都編碼Asp)。
術(shù)語“啟動子”表示基因的一部分，所述的部分含有提供RNA聚合酶結(jié)合和起始轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動子序列通常，但并不總是，位于基因的5非編碼區(qū)。
術(shù)語“分泌信號序列”表示編碼多肽(“分泌肽”)的DNA序列，其中所述多肽作為一更大多肽的一個組成成分將引導(dǎo)所述更大多肽通過細胞——合成此多肽的細胞——的分泌途徑。通常更大的多肽在通過此分泌途徑轉(zhuǎn)運的過程中被切割以去除分泌肽。
術(shù)語“同一性”表示兩個氨基酸序列或核苷酸序列之間的同源性。在本發(fā)明中，兩個氨基酸序列之間的同一性程度是通過Needleman-Wunsch序列比對(align)法來測定的，該法適用于蛋白和DNA序列比對。對于蛋白序列對比，所用默認(rèn)得分矩陣為BLOSUM50，缺口中第一個殘基的罰分為-12，而缺口中其它殘基的罰分為-2。所述的序列比對可用來自FASTA軟件包(版本號v20u6)的Align軟件來執(zhí)行(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“改進的生物學(xué)序列分析工具”，美國國家科學(xué)院院報(PNAS)852444-2448；和W.R.Pearson(1990)“用FASTP和FASTA進行快速和靈敏的序列比較”，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)，18363-98)。
兩個核苷酸序列之間的同一性程度可通過以同一性矩陣作為默認(rèn)得分矩陣?yán)蒙鲜鐾瑯拥乃惴ê蛙浖鼇泶_定。缺口(gap)的第一個殘基的罰分為-16，而缺口中的其它殘基的罰分為-4。
酶變體在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“酶變體”表示一種酶，該酶包含與標(biāo)準(zhǔn)酶的氨基酸序列不同的氨基酸序列。所述的不同包括與標(biāo)準(zhǔn)酶相比的替換、缺失和/或插入。
在本發(fā)明的上下文中，采用細胞壁降解酶，特別是果膠酸裂解酶中的氨基酸殘基位置的特定編號。例如，通過與已知的果膠酸裂解酶的氨基酸序列比對，可以明確地將氨基酸位置編號分配給任何果膠酸裂解酶中的任何氨基酸殘基，只要該果膠酸裂解酶的氨基酸序列是已知的。
使用來源于枯草桿菌菌株DSM 14218的質(zhì)粒中存在的多核苷酸序列編碼的果膠酸裂解酶的氨基酸序列(公開于SEQ ID NO2)的編碼系統(tǒng)，通過比對來自許多其它的果膠酸裂解酶的氨基酸序列，可明確地揭示一個氨基酸殘基在一個果膠酸裂解酶中的位置。
在描述本發(fā)明產(chǎn)生或考慮的多種果膠酸裂解酶變體時，采用以下的命名法以易于參照替換[原始的氨基酸；位置；替換的氨基酸]
相應(yīng)地，符號S72I意指72位的絲氨酸被異亮氨酸替換。
多重突變通過加號標(biāo)記(“+”)來分隔，如M169I+F198V，代表在169和198位分別用異亮氨酸(I)替換甲硫氨酸(M)及用纈氨酸(V)替換苯丙氨酸(F)的突變。
缺失195位的甘氨酸的缺失表示為Gly195*或G195*相應(yīng)地，一個以上氨基酸殘基的缺失，如195和196位甘氨酸和亮氨酸的缺失表示為Gly195*+Leu196*或G195*+L196*插入額外的氨基酸殘基的插入，如在G195后插入賴氨酸表示為Gly195GlyLys或G195GK；或者，當(dāng)插入一個以上的氨基酸殘基，如在G195后插入Lys和Ala時，這種插入表示為Gly195GlyLysAla或G195GKA在這些情況下，通過將小寫字母加到插入的氨基酸殘基之前的氨基酸殘基的位置號中來對插入氨基酸殘基進行編號。在以上的實例中，序列194-196因此將從194 195 196A-G-L變化到194 195 195a 195b 196A-G-K-A-L當(dāng)插入與所存在的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基時，顯然在命名法中出現(xiàn)了簡并性。例如，如果在以上的實例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，則這將表示為G195GG。對從194 195 196A-G-L到194 195 195a 196A-G-G-L或194 194a 195 196的事實上同樣的變化還可以表示為A194AG。
這些例子對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，因此表示法G195GG和用于此類插入的相應(yīng)表示法意在包含這些等價的簡并表示法。
除非另有規(guī)定，通過果膠酸裂解酶編號系統(tǒng)在本文中提及的所有位置均指上述編號，并相對于枯草桿菌DSM 14218的質(zhì)粒中存在的多核苷酸序列編碼的果膠酸裂解酶的氨基酸序列(公開于SEQ ID NO2)而確定。
術(shù)語“洗滌劑穩(wěn)定性”或“貯藏穩(wěn)定性”意指蛋白在包含洗滌劑(如陰離子表面活性劑)的制劑中的穩(wěn)定性。陰離子表面活性劑的特征是陰離子基團和疏水尾部的結(jié)合。當(dāng)與蛋白結(jié)合時，帶正電荷的氨基酸殘基(如賴氨酸或精氨酸)和疏水區(qū)域因此可能成為相互作用點。相似地，特別柔性的區(qū)域按動力學(xué)方式打開以使通常埋在蛋白內(nèi)部的氨基酸可被接近。這些所述的氨基酸殘基典型地是疏水的，因此對該表面活性劑的尾部具吸引力。酶和表面活性劑之間的化學(xué)相互作用極為肯定地將使酶失活。因此提高洗滌劑或貯藏穩(wěn)定性意味著在某個洗滌劑濃度和溫度下，經(jīng)過一段時間后較高的酶活性將被保留(較高的殘留活性)。相應(yīng)地，熱穩(wěn)定性和洗滌劑穩(wěn)定性是蛋白或酶的兩個相互獨立的特征。
多核苷酸在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸在至少中度嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO1中相似大小的區(qū)域或其互補序列雜交。
具體地說，本發(fā)明的多核苷酸在至少中度嚴(yán)格條件下，優(yōu)選高度嚴(yán)格條件(見下述)下可與下述探針雜交，所述探針為包含SEQ ID NO1所示的全長序列或SEQ ID NO1第1-1197位所示序列的變性雙鏈DNA探針或為含SEQ ID NO1中至少長大約100個堿基對的亞序列的任何探針。用于在中度或高度嚴(yán)格條件下確定核苷酸探針和同源DNA或RNA序列之間雜交的合適實驗條件包括將含有需雜交的DNA片段或RNA的濾膜預(yù)浸泡于5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉，Sambrook等，1989)中10分鐘，并于具有5×SSC、5×Denhardt’s溶液(Sambrook等，1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲處理的鮭魚精子DNA(Sambrook等，1989)的溶液中預(yù)雜交該濾膜，然后在含10ng/ml隨機引發(fā)的(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)1326-13)、32P-dCTP標(biāo)記的(比活性高于1×109cpm/μg)探針的同樣溶液中約45℃雜交12小時。濾膜隨后在2×SSC、0.5％SDS中洗兩次，30分鐘，洗滌溫度至少60℃(中度嚴(yán)格條件)，更優(yōu)選至少65℃(中度/高度嚴(yán)格條件)，甚至更優(yōu)選至少70℃(高度嚴(yán)格條件)，甚至更優(yōu)選至少75℃(極高嚴(yán)格條件)。
用X-射線膠片檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交上的分子。
如前面所提到的，本發(fā)明的分離多核苷酸包括DNA和RNA。分離DNA和RNA的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法從Gene Bank或DNA文庫中克隆編碼目的基因的DNA和RNA。
隨后用例如雜交或PCR方法鑒定和分離編碼具有本發(fā)明果膠酸裂解酶活性的多肽的多核苷酸。
本發(fā)明進一步提供了來自不同細菌菌株的多肽和多核苷酸對應(yīng)物(直向同系物(ortholog)或共生同系物(paralog))。特別感興趣的是來自枯草桿菌菌株，例如菌株DSM 14218的果膠酸裂解酶多肽。
將本發(fā)明提供的信息和組合物與常規(guī)克隆技術(shù)相結(jié)合可克隆具有本發(fā)明果膠酸裂解酶活性的多肽的物種同系物。例如，本發(fā)明的DNA序列可用來自表達該蛋白質(zhì)的細胞類型的染色體DNA進行克隆?？捎冒创颂幑_的序列設(shè)計的探針通過探測RNA印跡鑒別DNA的合適來源。隨后從陽性細胞系的染色體DNA制備文庫。編碼具有果膠酸裂解酶活性的多肽的本發(fā)明DNA序列可隨后用各種方法分離，諸如用按本說明書和權(quán)利要求書中公開的序列設(shè)計的探針進行探測，或用基于公開序列的一或多套簡并探針進行探測。本發(fā)明的DNA序列也可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR(Mullis，美國專利號4,683,202)，用基于本文公開序列設(shè)計的引物進行克隆。在另外的方法中，可用DNA文庫轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，并用針對果膠酸裂解酶的抗體(單克隆或多克隆抗體)檢測目的DNA的表達，所述酶按材料和方法及實施例中所述方法克隆自枯草桿菌，如DSM 14218、并表達和純化；或者可通過與具有果膠酸裂解酶活性的多肽有關(guān)的活性測定法檢測目的DNA的表達。
多肽SEQ ID NO2中氨基酸第1-399位的序列是包含本發(fā)明酶的催化活性結(jié)構(gòu)域的成熟果膠酸裂解酶序列。
本發(fā)明還提供了與SEQ ID NO2中氨基酸第1-399位的多肽及其物種同系物(直向同系物或共生同系物)基本同源的果膠酸裂解酶多肽。此處所用的術(shù)語“基本同源”表示多肽與SEQ ID NO2中氨基酸第1-399位的序列或它的直向同系物或共生同系物具有98.5％，優(yōu)選至少99％，更優(yōu)選至少99.5％的序列同一性。序列同一性百分率是通過如上所述的Needleman-Wunsch序列比對法來測定的。
對于基本同源的蛋白質(zhì)和多肽，其特征在于具有一或多個氨基酸替換、缺失或插入。這些改變優(yōu)選為性質(zhì)較小的那種，即保守氨基酸替換(見表2)和其它不會顯著影響蛋白質(zhì)或多肽的折疊或活性的替換；小的缺失，通常是1至約30個氨基酸的小缺失；及小的氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端甲硫氨酸殘基、長度不超過約20-25個殘基的小連接肽或利于純化的小延伸(親和標(biāo)記物)，如多聚組氨酸、蛋白A(Nilsson等，EMBO J，41075，1985；Nilsson等，酶學(xué)方法，1983，1991)。通常參閱，F(xiàn)ord等，蛋白質(zhì)表達和純化(Protein Expression and Purification)295-107，1991，該文獻在此引用作為參考。編碼親和標(biāo)記物的DNA可從產(chǎn)品供應(yīng)商(如，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New EnglandBiolabs，Beverly，MA)處購買到。
然而，即便上述的變化優(yōu)選是性質(zhì)較小的改變，這些改變也可以是性質(zhì)較大的改變，如將長達300個氨基酸或更長的較大多肽作為氨基或羧基末端延伸融合到本發(fā)明的具有果膠酸裂解酶活性的多肽上。
表1保守氨基酸替換堿性 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性 谷氨酸天冬氨酸極性 谷氨酰胺天冬酰胺疏水性 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸除了20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之外，也可用非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)替換本發(fā)明多肽的氨基酸殘基。也可用有限數(shù)量的非保守氨基酸、非遺傳密碼編碼的氨基酸及非天然氨基酸替換氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷币言诘鞍踪|(zhì)合成后被修飾，和/或在它們側(cè)鏈上有不同于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸可以化學(xué)合成，或優(yōu)選地購買得到，包括六氫吡啶羧酸、四氫噻唑羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3，3-二甲基脯氨酸。
本發(fā)明的果膠酸裂解酶多肽中的必需氨基酸可按本領(lǐng)域已知方法進行鑒別，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學(xué)(Science)2441081-1085，1989)。在后一技術(shù)中，在分子的每個殘基位置處導(dǎo)入單個丙氨酸突變，檢測所產(chǎn)生的突變分子的生物學(xué)活性(即果膠酸裂解酶活性)以鑒別對分子活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。也可參閱，Hilton等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)2714699-4708，1996。酶或其它生物學(xué)相互作用的活性位點也可通過對用諸如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記等技術(shù)測定進行結(jié)構(gòu)的物理分析以及對推定的接觸位點氨基酸進行突變而確定，參閱，例如，de Vos等，科學(xué)255306-312，1992；Smith等，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)224899-904，1992；Wlodaver等，F(xiàn)EBSLett.30959-64，1992。必需氨基酸的身份也可通過分析與本發(fā)明多肽相關(guān)的多肽的同源性來推斷。
可用已知的突變、重組和/或改組方法及隨后的相關(guān)篩選方法進行多個氨基酸替換和檢測，這些方法例如有Reidhaar-Olson和Saner(科學(xué)24153-57，1988)、Bowie和Sauer(美國國家科學(xué)院院報862152-2156，1989)、WO95/17413或WO95/22625所公開的技術(shù)。簡單地說，這些作者公開了使多肽中兩個或多個位置同時隨機發(fā)生不同突變或進行不同突變的重組/改組(WO95/17413，WO95/22625)、隨后選擇功能多肽、然后將誘變多肽確序以測定每個位置可允許的替換譜的方法。其它可用的方法包括噬菌體展示(如Lowman等，生物化學(xué)3010832-10837，1991；Ladner等，美國專利號5,223,409；Huse，WIPO出版物WO 92/06204)和區(qū)域定向誘變(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA 7127，1988)。
上面公開的誘變/改組方法可與高通量、自動化篩選方法結(jié)合，以測定宿主細胞中克隆的誘變多肽的活性。編碼活性多肽的誘變DNA分子可從宿主細胞中回收，并用現(xiàn)代化設(shè)備快速測序。這些方法可快速確定目的多肽中各個氨基酸殘基的重要性，并可用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了枯草桿菌DSM14218或其它枯草桿菌菌株的內(nèi)源果膠酸裂解酶的變體，該變體是定點變體，在其中有一、二、三、四或五個氨基酸殘基被改變成其它氨基酸殘基，因此所獲得的酶變體在洗滌劑組合物中具有增加的穩(wěn)定性。
SEQ ID NO2的果膠酸裂解酶的變體的實例包括，但不局限于，那些在如下實施例6和洗滌性能實施例C中所公開的變體。
免疫交叉反應(yīng)性用于測定免疫交叉反應(yīng)性的多克隆抗體，特別是單特異性多克隆抗體可以利用提純的具有果膠酸裂解酶活性的酶制備。更具體地說，可以參照N.Axelsen等，定量免疫電泳指南(A manual of Quantitative Immunoelectrophoresis)，Blackwell科學(xué)出版社，1973，第23章；或A.Johnstone和R.Thorpe，實用免疫化學(xué)(Immunochemistry in Practice)，Blackwell科學(xué)出版社，1982(具體是27-31頁)所述的方法，通過免疫兔子(或其它嚙齒類動物)，得到針對本發(fā)明果膠酸裂解酶的抗血清。純化的免疫球蛋白可以從抗血清獲得，例如通過鹽沉((NH4)2SO4)，然后透析并在如DEAE-Sephadex上進行離子交換層析。蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)鑒定可以利用Outcherlony雙向擴散分析(O.Ouchterlony，實驗免疫學(xué)手冊(Handbook ofExperimental Immunology)(D.M.Weir編)，Blackwell科學(xué)出版社，1967，655-706頁)，交叉免疫電泳(N.Axelsen等，出處同前，第3和4章)或火箭免疫電泳(N.Axelsen等，第2章)進行。
載體如以下進一步的描述，可以用包含編碼果膠酸裂解酶的DNA序列的載體轉(zhuǎn)化本發(fā)明的宿主。優(yōu)選地，此載體被整合入宿主基因組，更優(yōu)選地該載體已在宿主基因組上擴增。
本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，此載體以表達質(zhì)粒，優(yōu)選以多拷貝質(zhì)粒形式存在。
本發(fā)明的芽孢桿菌表達載體攜帶插入的編碼果膠酸裂解酶的DNA序列。優(yōu)選地，此載體的表達序列盒包含來自芽孢桿菌的調(diào)控區(qū)，更優(yōu)選地，此調(diào)控區(qū)為宿主的內(nèi)源調(diào)控區(qū)。
表達果膠酸裂解酶重組表達載體包含編碼本發(fā)明酶的DNA構(gòu)建體的重組載體可以是能夠方便地進行重組DNA操作的任何載體。載體的選擇常取決于它將被導(dǎo)入的宿主細胞。將載體導(dǎo)入宿主細胞常稱作轉(zhuǎn)化的宿主細胞。該轉(zhuǎn)化是指使用如原生質(zhì)體、天然感受態(tài)細胞、轉(zhuǎn)染、接合、電穿孔或任何其它等效的方法將DNA導(dǎo)入宿主細胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體而存在、復(fù)制獨立于染色體的復(fù)制的載體，如質(zhì)粒?；蛘撸d體可以是這樣一種類型，當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細胞中時，將會部分或全部整合到宿主細胞基因組中并與其所整合的染色體一起復(fù)制。
所述載體優(yōu)選為這樣的表達載體，其中編碼本發(fā)明的果膠酸裂解酶的DNA序列可操作地與該DNA轉(zhuǎn)錄所需的其它片段相連接。一般來說，表達載體來自質(zhì)?；虿《綝NA，或可以含有兩者的元件。術(shù)語“可操作地連接”指將諸片段以使其能按它們的預(yù)期目的協(xié)同發(fā)揮功能的方式排列，如轉(zhuǎn)錄在啟動子中引發(fā)并持續(xù)通過編碼CBD的DNA序列。
啟動子可以是任何在所選擇的宿主細胞內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并可以來自編碼宿主細胞的同源或異源蛋白質(zhì)的基因。
適用于細菌宿主細胞的啟動子的例子包括以下基因的啟動子嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因或λ噬菌體的PR或PL啟動子或大腸桿菌的lac、trp或tac啟動子?？蛇x擇地，可以設(shè)計整合型載體，以便只有在其適當(dāng)?shù)卣先胨拗骰蚪M中(如常駐(resident)啟動子的下游)時，編碼果膠酸裂解酶的DNA才能得以功能性表達。
如果需要，編碼本發(fā)明果膠酸裂解酶的DNA序列還可以可操作地連接到適當(dāng)?shù)慕K止子上。
本發(fā)明的重組載體還可包含能夠使載體在所討論的宿主細胞中復(fù)制的DNA序列。
所述載體還可包含可選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可彌補宿主細胞缺陷的基因，或編碼如對抗生素像卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等的抗性或?qū)χ亟饘倩虺輨┑目剐缘幕颉?br>
為了指導(dǎo)本發(fā)明的果膠酸裂解酶進入宿主細胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。可以將分泌信號序列在正確閱讀框中連接編碼果膠酸裂解酶的DNA序列。分泌信號序列一般位于編碼此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信號序列可以是通常與該果膠酸裂解酶相關(guān)的或可以來自編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。
分別用于連接編碼本發(fā)明的果膠酸裂解酶的DNA序列、啟動子和任選地終止子和/或分泌信號序列，或通過適宜的PCR擴增方案組裝這些序列和將它們插入含有復(fù)制或整合所需信息的適宜載體的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的(參見例如，Sambrook等人，前引書)。
宿主細胞導(dǎo)入到宿主細胞中的克隆DNA分子可以與所討論的宿主同源或異源。如果與所述宿主細胞同源，即由該宿主細胞天然產(chǎn)生，則該DNA序列一般可操作地與非其天然環(huán)境中存在的另一啟動子序列相連接，或者適當(dāng)時與另一分泌信號序列和/或終止序列相連接。術(shù)語“同源的”旨在包括編碼天然存在于所討論的宿主生物體中的酶的DNA序列。術(shù)語“異源的”旨在包括所述宿主細胞本身不表達的DNA序列。因此DNA序列可以來源于另一生物體或者是合成的序列。
導(dǎo)入了本發(fā)明的克隆DNA分子或重組載體的宿主細胞可以是任何能夠產(chǎn)生所期望酶的細胞，包括細菌、酵母、真菌和高等真核細胞。
通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細菌宿主細胞的實例是革蘭氏陽性細菌，如芽孢桿菌菌株，如嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(B.brevis)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、巨大芽孢桿菌(B.megatherium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，乳桿菌屬(lactobacillus)菌珠，鏈球菌屬菌株(Streptococcus)，或鏈霉菌菌株(Streptomyces)，尤其是變鉛青鏈霉菌(S.lividans)或鼠灰鏈霉菌(S.murinus)；該宿主細胞可以是革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌(Echerichiacoli)。
細菌的轉(zhuǎn)化可以通過已知的方式用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或使用感受態(tài)細胞進行(參見Sambrook等人，見上)。
當(dāng)在細菌如大腸桿菌中表達酶時，該酶一般以不可溶性顆粒駐留于細胞質(zhì)中(稱作包涵體)，或可以由細菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)間隙。在前一種情況下，將細胞裂解，回收所述顆粒，變性，其后通過稀釋變性劑使酶重新折疊。后一種情況下，該酶可以通過以下操作從周質(zhì)間隙中回收如超聲或滲透壓休克破壞細胞，使所述的周質(zhì)間隙的內(nèi)容物釋放，再回收該酶。
當(dāng)在革蘭氏陽性細菌如芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬菌株中表達該酶時，該酶可以駐留于細胞質(zhì)中，或由細菌分泌序列引導(dǎo)到胞外培養(yǎng)基中。
通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的真菌宿主細胞的實例是如曲霉屬(Aspergillus)或鐮刀菌屬(Fusarium)菌株，尤其是泡盛曲霉(A.awamori)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、和尖鐮孢(F.oxysporum)，和木霉菌屬菌株(Trichoderm)，優(yōu)選哈茨木霉(T.harzianum)、里氏木霉(T.reesei)和綠色木霉(T.viride)。
真菌細胞可通過以下過程轉(zhuǎn)化，所述過程包括原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及隨后以實質(zhì)上已知的方式再生細胞壁。曲霉屬菌株作為宿主細胞的用途可見于EP238023(Novo Nordisk A/S)，其內(nèi)容在此一并引用作為參考。
通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的酵母來源宿主細胞的實例是如漢遜酵母屬菌株(Hansenula sp.)；克魯維酵母屬菌株(Kluyveromyces sp.)，尤其是乳酸克魯維酵母(K.lactis)和馬克斯克魯維酵母(K.marcianus)；畢赤酵母屬菌株(Pichia sp)；酵母屬菌株(Saccharomyces)，尤其是卡爾酵母(S.carlsbergensis)、釀酒酵母(S.cerevisae)、克魯弗酵母(S.kluyveri)和葡萄汗酵母(S.uvarum)；裂殖酵母屬菌株(Schizosaccharomyces sp.)，尤其是栗酒裂殖酵母(S.pombe)；和耶氏酵母屬菌株(Yarrowia sp.)，尤其是解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)。
通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的植物來源宿主細胞的實例是如來自馬鈴薯(Solanum tuberosum)或煙草(Nicotiana tabacum)的植物細胞。
生產(chǎn)果膠酸裂解酶的方法另一方面，本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明的酶制品的方法，該方法包括在允許該酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)能產(chǎn)生該果膠酸裂解酶的微生物，并從培養(yǎng)物中回收該酶。培養(yǎng)可以采用常規(guī)的發(fā)酵方法進行，如在搖瓶或發(fā)酵罐中于確保足夠通氣的攪拌條件下在生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生該果膠酸裂解酶。生長培養(yǎng)基可包含常規(guī)的氮源，如蛋白胨、酵母抽提物或水解酪蛋白氨基酸；減少量的常規(guī)碳源如葡萄糖或蔗糖；和誘導(dǎo)物如果膠酶或復(fù)合植物底物如谷糠(如麥麩或米殼)?；厥湛梢圆捎贸Ｒ?guī)技術(shù)，例如可通過離心或過濾分離生物質(zhì)和上清液，回收上清液或如果目的酶在細胞內(nèi)裂解細胞，之后可以按EP 0406314所述方法進一步純化或按WO97/15660所述方法結(jié)晶。
更進一步地，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的分離酶的方法，其中在允許該酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化了編碼該酶的DNA序列的合適宿主細胞，并從培養(yǎng)物中回收得到的酶。
如本文中的定義，分離的多肽(如酶)是基本不含有其它多肽的多肽，如按SDS-PAGE測定，至少約20％純，優(yōu)選至少約40％純，更優(yōu)選約60％純，甚至更優(yōu)選約80％純，最優(yōu)選約90％純，再最優(yōu)選約95％純。
術(shù)語“分離的多肽”也可稱為“純化的多肽”。
當(dāng)將含有編碼該酶的DNA序列的表達載體轉(zhuǎn)化到異源宿主細胞中時，就有可能異源重組生產(chǎn)本發(fā)明的酶。
由此，有可能制備出高純度的或單組分的果膠酸裂解酶組合物，其特征在于不含同源雜質(zhì)。
本文中，同源雜質(zhì)是指來源于最初獲得本發(fā)明的酶的同源細胞的任何雜質(zhì)(例如除本發(fā)明的酶之外的其它多肽)。
本發(fā)明中，同源宿主細胞可以是枯草桿菌的菌株。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于所討論的宿主細胞生長的常規(guī)培養(yǎng)基。所表達的果膠酸裂解酶可方便地分泌到培養(yǎng)基中，然后可以通過眾所周知的方法回收，所述方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞，再利用鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接下來進行層析，如離子交換層析、親和層析等。
本發(fā)明也涉及轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞，所述的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細胞已被編碼本發(fā)明的果膠酸裂解酶的DNA序列所轉(zhuǎn)化，以致可以表達和產(chǎn)生可回收量的該酶。該酶可從植物或植物部分中回收。
所述轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉植物或單子葉植物，簡稱雙子葉或單子葉。單子葉植物的例子是牧草，如草地早熟禾(藍草，早熟禾屬(Poa))，飼料草如羊茅、黑麥草，溫帶牧草如剪谷穎屬(Agrostis)；以及谷類植物，如小麥、燕麥、黑麥、大麥、水稻、高粱和玉米。
雙子葉植物的例子是煙草、豆科植物如羽扇豆、馬鈴薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花科(Brassicaceae)的植物，如花椰菜、油籽油菜和近親模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的例子是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子和塊莖。在本發(fā)明文中，特殊的植物組織，如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體和細胞質(zhì)也被認(rèn)為是植物部分。而且，任何植物細胞，無論何種組織來源，也被認(rèn)為是植物部分。
在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的還包括這些植物、植物部分和植物細胞的后代。
可以用本領(lǐng)域已知的方法來構(gòu)建表達本發(fā)明的酶的轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞。簡而言之，所述植物或植物細胞通過將一或多個編碼本發(fā)明酶的表達構(gòu)建體引入植物宿主基因組中，并使所得的改變的植物或植物細胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細胞來構(gòu)建。
方便地，表達構(gòu)建體是DNA構(gòu)建體，其中包含編碼本發(fā)明酶的基因以及與之可操作地連接在一起的為在所選的植物或植物部分中表達該基因所需要的合適的調(diào)控序列。此外，該表達構(gòu)建體可包含用于鑒定其中已整合入表達構(gòu)建體的宿主細胞的選擇標(biāo)記和將構(gòu)建體導(dǎo)入被討論的植物所必要的DNA序列(后者取決于所用的DNA導(dǎo)入方法)。
調(diào)控序列如啟動子、終止序列和任選的信號或轉(zhuǎn)運序列的選擇是根據(jù)如希望何時、何處和如何表達酶來確定的。例如，編碼本發(fā)明的酶的基因的表達可以是組成型或誘導(dǎo)型的、或者可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可定向到特定組織或植物部分，如種子或葉子。如Tague等，植物生理學(xué)(Plant Phys.)，86，506，1988描述了這樣的調(diào)控序列。
對于組成型表達，可使用35S-CaMV啟動子(Franck等，1980.細胞(cell)21285-294)。器官特異性啟動子可以是例如來自貯藏壑(sink)組織如種子、馬鈴薯塊莖和果實(Edwards和Coruzzi，1990，遺傳學(xué)年度評論(Annu.Rev.Genet.).24275-303)或代謝壑組織如分生組織(Ito等，1994.植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.).24863-878)的啟動子，種子特異性啟動子如來自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等.，植物和細胞生理學(xué)(Plant and Cell Physiology)Vol.39，No.8pp.885-889(1998))，來自于豆球蛋白B4和蠶豆的未知種子蛋白質(zhì)基因(Conrad U.等，植物生理學(xué)雜志(Journal of Pplant Physiology)Vol.152，No.6pp.708-711(1998))的蠶豆啟動子，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等。植物和細胞生理學(xué)vol.39，No.9 pp.935-941(1998))，來自歐洲油菜(Brassica napus)的貯藏蛋白napA啟動子，或本領(lǐng)域所知的其它任何種子特異性啟動子，如WO91/14772中所描述的。此外，所述啟動子也可以是葉特異性啟動子如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等.，植物生理學(xué)(Plant Physiology)Vol.102，No.3 pp.991-1000(1993))、小球藻病毒腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶基因啟動子(Mitra，A.和Higgins，DW，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)Vol.26，No.1pp.85-93(1994))或來自水稻的aldP基因啟動子(Kagaya等.，分子與普通遺傳學(xué)(Molecular and GeneralGenetis)Vol.248，No.6pp.668-674(1995))或創(chuàng)傷誘導(dǎo)的啟動子如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)Vol.22，No.4pp.573-588(1993))。
可以利用啟動子增強元件在植物中獲得更高的酶表達量。例如，啟動子增強元件可以是插在啟動子和編碼該酶的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。如Xu等，前引文章，公開了使用水稻肌動蛋白1基因的第一個內(nèi)含子來增強表達。
選擇標(biāo)記基因和表達構(gòu)建體的任何其它部分可從本領(lǐng)域現(xiàn)有的進行選擇。
可以根據(jù)本領(lǐng)域所知的常規(guī)技術(shù)，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、微粒轟擊、生物轟擊轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，科學(xué)，244，1293；Potrykus，生物/技術(shù)(Bio/Techn.).8,535，1990；Shimamoto等，自然(Natare)，338，274，1989)，將DNA構(gòu)建體引入植物基因組中。
目前，根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tamefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(綜述見Hooykas和Schilperoort，1992.植物分子生物學(xué).1915-38)是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的首選方法，但也可以利用它轉(zhuǎn)化單子葉植物，盡管對這些單子葉植物通常優(yōu)選其它轉(zhuǎn)化方法。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的首選方法是微粒轟擊(包被了轉(zhuǎn)化DNA的微小金顆?；蜴u顆粒)胚性愈傷組織或發(fā)育的胚(Christou，1992.植物雜志(Plant J.).2275-281；Shimamoto，1994.當(dāng)前生物技術(shù)觀點(Carr.Opin.Biotechnol.).5158-162；Vasil等，1992.生物/技術(shù)(Bio/Technology)10667-674)。另外可替代的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，該法描述于Omirulleh S，等，植物分子生物學(xué)Vol.21，No.3pp.415-428(1993)。
在轉(zhuǎn)化后，挑選出引入了表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法再生出完整植株。
酶組合物在再一方面，本發(fā)明涉及包含具有如上所述的果膠酸裂解酶活性的酶的酶組合物。
本發(fā)明的酶組合物除了包含本發(fā)明的果膠酸裂解酶之外，還可以包含一或多種其它類型的酶，例如半纖維素酶如木聚糖酶和甘露聚糖酶、纖維素酶或內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶組分、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶、酯酶、果膠酶、木葡聚糖酶、角質(zhì)酶、肌醇六磷酸酶、氧化還原酶(過氧化物酶、鹵素過氧化物酶、氧化酶、漆酶)、蛋白酶、淀粉酶、還原酶、酚氧化酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果膠裂解酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或它們的混合物。
酶組合物可以依照本領(lǐng)域已知的方法制備，可以是液態(tài)或干燥組合物。例如，該酶組合物可以是粒狀或微粒狀。包含在組合物中的酶可以用本領(lǐng)域已知的方法來穩(wěn)定化。
用途果膠酸裂解酶在許多的工業(yè)和應(yīng)用領(lǐng)域具有潛在的用途。然而，本發(fā)明的果膠酸裂解酶特別適用作洗滌劑組合物的成分。如下給出的例子是本發(fā)明的酶組合物的優(yōu)選用途。基于本領(lǐng)域的已知技術(shù)，本發(fā)明的酶組合物的用量和使用該組合物的其它條件可以被確定。
本發(fā)明的果膠酸裂解酶是本發(fā)明的洗滌劑組合物的基本成分，以純酶在組合物中的重量計算，優(yōu)選該酶占0.0001％到2％，更優(yōu)選占0.0005％到0.1％，最優(yōu)選占0.001％到0.02％。
除了包含催化結(jié)構(gòu)域的酶核心外，本發(fā)明的果膠酸裂解酶還可包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)，該纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和該酶的酶核心(催化活性結(jié)構(gòu)域)可操作地連接。纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)可作為該編碼酶的組成部分，或可將另一來源的CBD導(dǎo)入到該果膠酸裂解酶中，從而產(chǎn)生酶雜合體。在本文中，術(shù)語“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域”應(yīng)按Peter Tomme等(《不溶性碳水化合物的酶促降解》(Enzymatic Degradation of InsolubleCarbohydrates)一書中，“纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域分類和特性”，John N.Saddler和Michael H.Penner(編)，ACS Symposium Series，No.618，1996)的定義理解。這一定義將120多種纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域歸為10個家族(I-X)，并證實在諸如纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶和幾丁質(zhì)酶等多種酶中有CBD。在藻類如紅藻Porphyra purpurea中也已找到以非水解性多糖結(jié)合蛋白質(zhì)形式存在的CBD，參閱Tomme等，出處同前。然而，大部分的CBD是來自纖維素酶和木聚糖酶，CBD可存在于蛋白質(zhì)的N和C末端或在其內(nèi)部。酶雜合體是本領(lǐng)域已知的，參閱WO90/00609和WO95/16782，通過將含有纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的編碼DNA的至少一個片段及通過或不通過接頭與之相連的果膠酸裂解酶編碼DNA序列的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至宿主細胞中，并培養(yǎng)此宿主細胞以表達融合基因，可制備酶雜合體。酶雜合體可用如下公式描述CBD-MR-X其中CBD是相應(yīng)于至少纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)域；MR是中間區(qū)域(接頭)，可以是鍵或短的連接基團，優(yōu)選約2-100個碳原子長，更優(yōu)選2-40個碳原子長；MR或者優(yōu)選具有約2-100個氨基酸，更優(yōu)選2-40個氨基酸；而X是本發(fā)明的果膠酸裂解酶的N-末端或C-末端區(qū)域。
在洗滌劑工業(yè)中的用途在洗滌和穿著過程中，染色的織物或服裝上的染料通常會從織物上滲出，這使得織物看起來陳舊和褪色。除去織物表面上的纖維可部分恢復(fù)織物的原色和外觀。本文所用的術(shù)語“顏色澄清”是指通過多次洗滌循環(huán)而部分恢復(fù)織物或服裝的原色。
術(shù)語“去起球”是指除去織物表面上的纖維絨球。
術(shù)語“浸泡液”是指可在進行常規(guī)洗滌過程之前浸泡衣物的水溶液。浸泡液可含有洗滌或洗衣過程中常規(guī)使用的一種或多種成分。
術(shù)語“洗滌液”是指在其中洗滌衣物的水溶液，這種衣物洗滌通常是手工進行或在洗衣機中進行的化學(xué)和機械的混合作用。洗滌液通常是粉末狀或液態(tài)洗滌劑組合物的水溶液。
術(shù)語“漂洗液”是指通常在衣物洗滌之后立即用于浸泡或處理衣服以漂洗衣物(即基本上除去衣物上的洗滌劑溶液)的水溶液。漂洗液中可含有織物調(diào)理或軟化組合物。
可用本發(fā)明方法處理的衣物可以是常規(guī)的可洗滌的衣物。優(yōu)選衣物的主要部分是由棉花、混綿或者天然或人工纖維素(如來源于含木聚糖的纖維素纖維，如來自紙漿)或其混合物制成的紡織的或無紡的織物，包括針織物、機織物、粗斜棉布、紗線和毛巾布?；旌衔锏睦邮敲藁蛉嗽炖w維/粘膠纖維與一種或多種伴隨材料的混合物，所述的伴隨材料例如是羊毛、合成纖維(如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖維、聚偏氯乙烯纖維、聚氨基甲酸酯纖維、聚脲纖維、芳族聚酰胺纖維)和含纖維素的纖維(如人造纖維/粘膠纖維、苧麻、亞麻/亞麻紗線、黃麻、醋酸纖維素纖維、lyocell)。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的洗滌劑組合物通過果膠酸裂解酶水解來自織物纖維的半纖維素組分確實可提供顏色澄清、去起球和去除泥土污漬的功能。
去除來自于植物、木材、基于霉污物的污漬、泥漿和水果的污漬是當(dāng)今最困難的清洗任務(wù)之一，特別是在低溫洗滌中更有此趨勢。這些污漬通常含有主要基于碳水化合物和它們的衍生物(纖維和細胞壁成分)的纖維材料的復(fù)雜混合物。食物污跡常常很難從被污染物上被有效地去除。去除來自水果和/或蔬菜汁中的高著色的或“干的”污漬特別具有挑戰(zhàn)性。這樣的污漬的詳細例子包括橙汁、番茄汁、香蕉、芒果或花椰菜污漬。事實上，果膠聚合物是植物細胞壁的重要成分。在織物、碗盤和硬表面上通常能發(fā)現(xiàn)含有果膠的污漬物。
在包括衣物、碗盤和硬表面的清潔中已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的洗滌劑組合物可提供優(yōu)良的清潔和去污能力。盡管希望不受理論的限制，但據(jù)認(rèn)為包含在本發(fā)明洗滌劑組合物中的果膠酸裂解酶將十分有效地水解污漬中的果膠和果膠酸，從而對污漬的去除起作用。如上所述，事實上在來自植物和/或水果的污漬(如蘋果、香蕉、番茄、橙、芒果、鱷梨和草污漬)的植物細胞壁成分中均存在該果膠和果膠酸成分。果膠和果膠酸成分也廣泛地應(yīng)用于食物和美容護理工業(yè)中，如冰淇淋、果醬、洗發(fā)香波和唇膏。
此外，還發(fā)現(xiàn)當(dāng)本發(fā)明的洗滌劑組合物配制成洗衣組合物時，能提供織物軟化的功能。盡管希望不受理論的限制，但據(jù)認(rèn)為在織物污漬中存在的果膠和果膠酸成分由于它們的酸性性質(zhì)將牢固地結(jié)合鈣離子和陽離子，使得織物粗糙。除去這些果膠和果膠酸成分被認(rèn)為可以阻止那些鈣離子和陽離子的結(jié)合，因此可提供一定的軟化效果。
洗滌劑的公開和實施例表面活性劑體系本發(fā)明的洗滌劑組合物包含表面活性劑體系，其中表面活性劑可選自非離子的和/或陰離子的和/或陽離子的和/或兩性的和/或兩性離子的和/或半極性的表面活性劑。
表面活性劑通常以0.1％至60％重量的量存在。
表面活性劑優(yōu)選配制成與組合物中存在的酶成分相容的形式。在液體或凝膠組合物中表面活性劑最優(yōu)選配制成可促進或至少不降低組合物中的任何酶的穩(wěn)定性的形式。
根據(jù)本發(fā)明所用的優(yōu)選體系包含作為表面活性劑的一種或多種本文所述的非離子和/或陰離子表面活性劑。更優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包含高水平的陰離子表面活性劑，即以游離酸計多達30％，優(yōu)選10-25％重量。其中所用的優(yōu)選陰離子表面活性劑是如下所述的酸形式的烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸鹽和烷基乙氧基硫酸鹽。在再一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的高陰離子表面活性劑組合物還含有胺氧化物表面活性劑和/或酰氨基胺如酰氨基丙基二乙胺。已發(fā)現(xiàn)，在包括洗衣、洗碗和硬表面的清洗中，本發(fā)明洗滌劑組合物(還包括高水平的陰離子表面活性劑)可以提供優(yōu)良的清洗和去污能力。盡管不希望受到理論的限制，但認(rèn)為陰離子表面活性劑能夠幫助增溶本發(fā)明的酶所要水解的小果膠碎片并且阻止它們在清洗過的表面上再沉積。
可使用的適當(dāng)?shù)年庪x子表面活性劑是烷基酯磺酸鹽表面活性劑，其包括C8-C20羧酸(即脂肪酸)的直鏈酯類，該表面活性劑是由氣態(tài)SO3磺化而成的，參見“美國石油化學(xué)家協(xié)會雜志”(″The Journal of the American OilChemists Society″)，52(1975)，pp.323-329。適當(dāng)?shù)脑习ㄑ苌詣游镏?、棕櫚油等的天然脂肪物質(zhì)。
優(yōu)選的烷基酯磺酸鹽表面活性劑，尤其在洗衣應(yīng)用中，包括以下結(jié)構(gòu)式的烷基酯磺酸鹽表面活性劑 其中R3是C8-C20烴基，優(yōu)選烷基或其組合；R4是C1-C6烴基，優(yōu)選烷基或其組合；M為陽離子，其與烷基酯磺酸形成水溶性鹽。適當(dāng)?shù)男纬甥}的陽離子包括金屬諸如鈉、鉀和鋰以及取代或未取代的銨陽離子，諸如一乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺。優(yōu)選R3是C10-C16烷基，且R4是甲基、乙基或異丙基。尤其優(yōu)選的是甲基酯磺酸鹽，其中R3是C10-C16烷基。
其它適當(dāng)?shù)年庪x子表面活性劑包括烷基硫酸鹽表面活性劑，該表面活性劑是通式ROSO3M的水溶性鹽或酸，其中R優(yōu)選是C10-C24的烴基，優(yōu)選烷基或含有C10-C20烷基成分的羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，且M為H或陽離子，例如堿金屬陽離子(例如鈉、鉀、鋰)或銨或取代的銨(例如甲基-、二甲基-和三甲基銨陽離子和季銨陽離子如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子以及衍生自烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺及其混合物的季銨陽離子等)。通常C12-C16烷基鏈優(yōu)選用于低溫洗滌(例如低于約50℃)，而C16-C18烷基鏈優(yōu)選用于高溫洗滌(例如高于約50℃)。
其它可用于清潔目的的陰離子表面活性劑也可以包括在本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。它們可包括皂鹽(包括例如鈉、鉀、銨和取代的銨鹽如單-、二-和三乙醇胺鹽)、C8-C22伯型或仲型鏈烷磺酸鹽、C8-C24烯屬磺酸鹽、由堿土金屬檸檬酸鹽的熱解產(chǎn)物通過磺化反應(yīng)制備的磺化多羧酸(例如，英國專利說明書1,082,179所公開的)、C8-C24烷基聚乙二醇醚硫酸鹽(其含有最多10摩爾的環(huán)氧乙烷)；烷基甘油磺酸鹽、脂肪?；视突撬猁}、脂肪油基甘油硫酸鹽、烷基酚環(huán)氧乙烷醚硫酸鹽、鏈烷磺酸鹽、烷基磷酸鹽、羥乙基磺酸鹽如?；u乙基磺酸鹽、N-酰基?；撬猁}、烷基琥珀酰胺酸鹽和磺基琥珀酸鹽、磺基琥珀酸酯的單酯類(尤其是飽和和不飽和C12-C18單酯)和磺基琥珀酸酯的二酯類(尤其是飽和和不飽和C6-C12二酯)、?；“彼猁}、烷基多糖的硫酸鹽如烷基多葡萄糖苷(非離子非硫酸化的化合物，見下述)的硫酸鹽、支鏈伯烷基硫酸鹽和烷基聚乙氧基羧酸鹽諸如通式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的鹽(其中R是C8-C22烷基，k是從1到10的整數(shù)，M是形成可溶性鹽的陽離子。樹脂酸和氫化樹脂酸如松香、氫化松香和在松漿油內(nèi)的或衍生自松漿油的樹脂酸和氫化樹脂酸也是適當(dāng)?shù)摹?br>
烷基苯磺酸鹽是非常優(yōu)選的。尤其優(yōu)選的是直鏈(線性)烷基苯磺酸鹽(LAS)，其中烷基基團優(yōu)選包含10到18個碳原子。
其它實例在“表面活性劑和洗滌劑”(Surface Active Agents andDetergents)(Vol.I和II，Schwartz，Perrry和Berch)中描述。多種此類表面活性劑也一般性地公開于US 3,929,678(23欄，58行到29欄，23行，在本文中將其引入作為參考)。
其它優(yōu)選的陰離子表面活性劑包括烷基烷氧基化硫酸鹽表面活性劑。有關(guān)例子是通式RO(A)mSO3M的水溶性鹽或酸，其中R是未取代的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基成分的羥基烷基，優(yōu)選C12-C20烷基或羥基烷基，更優(yōu)選C12-C18烷基或羥基烷基，A是乙氧基或丙氧基單元，m大于0，通常在約0.5至約6之間，更優(yōu)選在約0.5至約3之間，M是H或陽離子并可以是例如金屬陽離子(例如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂等)、銨或取代的銨陽離子。烷基乙氧基化硫酸鹽和烷基丙氧基化硫酸鹽也包括在本發(fā)明中。取代的銨陽離子的具體例子包括甲基-、二甲基-、三甲基-銨陽離子和季銨陽離子如四甲基銨和二甲基哌啶鎓陽離子和衍生自烷基胺如乙胺、二乙胺、三乙胺及其混合物的那些物質(zhì)等等。示范性的表面活性劑是C12-C18烷基聚乙氧基化(1.0)硫酸鹽(C12-C18E(1.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化(2.25)硫酸鹽(C12-C18(2.25)M)和C12-C18烷基聚乙氧基化(3.0)硫酸鹽(C12-C18E(3.0)M)和C12-C18烷基聚乙氧基化(4.0)硫酸鹽(C12-C18E(4.0)M)，其中M適宜地選自鈉和鉀。當(dāng)此類陰離子表面活性劑被包括在其中時，本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物通常包含約1％至約40％、優(yōu)選約3％至約20％重量的此類陰離子表面活性劑。
烷基酚的聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷和聚環(huán)氧丁烷縮合物適合用作本發(fā)明表面活性劑體系中的非離子表面活性劑，優(yōu)選聚環(huán)氧乙烷縮合物。這些化合物包括烷基酚與環(huán)氧烷的縮合產(chǎn)物，其中烷基酚的烷基在直鏈或支鏈構(gòu)型中具有約6至14個碳原子，優(yōu)選約8至14個碳原子。在優(yōu)選的實施方案中，環(huán)氧乙烷相對于每摩爾烷基酚以約2至約25摩爾、更優(yōu)選約3至約15摩爾的量存在。這種類型的可購買的非離子表面活性劑包括IgepalTMCO-630，由GAF Corporation銷售；和TritonTMX-45、X-114、X-100和X-102，都由Rohm & Haas Company銷售。通常將這些表面活性劑稱作烷基酚烷氧基化物(例如烷基酚乙氧基化物)。
伯型和仲型脂肪族醇與約1至約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物適合用作本發(fā)明的表面活性劑體系中的非離子表面活性劑。脂肪醇的烷基鏈可以是直鏈或支鏈、伯型或仲型的，并且通常包含約8至約22個碳原子。優(yōu)選的是其烷基基團含有約8至約20個碳原子、更優(yōu)選約10至約18個碳原子的醇類按每摩爾與約2至約10摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物。相對于每摩爾的醇，約2至約7摩爾的環(huán)氧乙烷、最優(yōu)選2至5摩爾的環(huán)氧乙烷存在于所述的縮合產(chǎn)物中?？少徺I的該類非離子型表面活性劑的例子包括TergitolTM15-S-9(C11-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、TergitolTM24-L-6NMW(C12-C14伯醇與6摩爾環(huán)氧乙烷的窄分子量分布的縮合產(chǎn)物)，兩者都由Union Carbide Corporation銷售；NeodolTM45-9(C14-C15直鏈醇與9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM23-3(C12-C13直鏈醇和3.0摩爾的環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-7(C14-C15直鏈醇和7摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)、NeodolTM45-5(C14-C15直鏈醇和5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，其由Shell Chemical Company銷售；KyroTMEOB(C13-C15醇和9摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，由The Procter & Gamble Company銷售；和Genapol LA 050(C12-C14醇和5摩爾環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物)，由Hoechst銷售。上述產(chǎn)物的優(yōu)選HLB范圍為8-11，最優(yōu)選8-10。
也可用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑的是US4,565,647中公開的烷基多糖，其具有包含約6至約30個碳原子、優(yōu)選約10至約16個碳原子的疏水基團和含有約1.3至約10個、優(yōu)選約1.3至約3個、最優(yōu)選約1.3至約2.7個糖單元的多糖，例如聚苷親水基團。任何包含5或6個碳原子的還原糖都可使用，例如，葡萄糖、半乳糖，并且半乳糖基部分可被替代為葡糖基部分(疏水基團任選地連接在2-、3-、4-等位置上，由此相對于葡糖苷或半乳糖苷產(chǎn)生葡萄糖或半乳糖)。糖間鍵可以例如在附加糖單元的1個位置和之前糖單元的2-、3-、4-和/或6-位之間。
優(yōu)選的烷基聚苷具有以下通式R2O(CnH2nO)t(糖基)x其中R2選自烷基、烷基苯基、羥基烷基、羥基烷基苯基及其混合物，其中烷基包括約10至約18，優(yōu)選約12至約14個碳原子；n是2或3，優(yōu)選2；t是0至約10，優(yōu)選0；且x是約1.3至約10，優(yōu)選約1.3至約3，最優(yōu)選約1.3至約2.7。糖基優(yōu)選衍生自葡萄糖。為了制備這些化合物，首先形成醇或烷基聚乙氧基醇，然后與葡萄糖或葡萄糖源反應(yīng)形成葡糖苷(連接在1位上)。附加糖基單元可在其1位和之前述糖基單元的2-、3-、4-和/或6-位，優(yōu)選主要2-位之間形成連接。
環(huán)氧乙烷與由環(huán)氧丙烷和丙二醇的縮合物形成的疏水堿性化合物的縮合產(chǎn)物也適宜用作本發(fā)明的另外的非離子表面活性劑體系。這些化合物的疏水部分優(yōu)選具有約1500至約1800的分子量并且不溶于水。向該疏水部分中加入聚氧乙烯部分趨于提高分子的整體水溶性，并且將產(chǎn)物的液體特征維持在聚氧乙烯含量最多占縮合產(chǎn)物總重的約50％的水平，即相當(dāng)于與不超過約40摩爾的環(huán)氧乙烷縮合。這類化合物的例子包括由BASF銷售的某些可購買的PluronicTM表面活性劑。
還適宜用作本發(fā)明非離子表面活性劑體系的非離子表面活性劑的是環(huán)氧乙烷與環(huán)氧丙烷和乙二胺的反應(yīng)產(chǎn)物的縮合產(chǎn)物。這些產(chǎn)物的疏水部分由乙二胺和過量環(huán)氧丙烷的反應(yīng)產(chǎn)物組成，通常分子量為約2500至約3000。此疏水部分與環(huán)氧乙烷縮合的程度使得縮合產(chǎn)物含有約40％至約80％重量的聚氧乙烯、并且分子量約為5,000至約11,000。這類非離子表面活性劑的例子包括由BASF銷售的某些可購買的TetronicTM化合物。
優(yōu)選用作本發(fā)明表面活性劑體系的非離子表面活性劑是烷基酚的聚環(huán)氧乙烷縮合物、伯型和仲型脂肪醇與約1至約25摩爾環(huán)氧乙烷的縮合物、烷基多糖及其混合物。最優(yōu)選的是具有3到15個乙氧基的C8-C14烷基酚乙氧化物以及具有2到10個乙氧基的C8-C18(優(yōu)選平均為C10)醇乙氧化物及其混合物。
非常優(yōu)選的非離子表面活性劑是下式的多羥基脂肪酰胺表面活性劑 其中R1是H或R1是C1-4烴基、2-羥乙基、2-羥丙基或其混合物，R2是C5-31烴基，Z是多羥基烴基(具有至少3個直接連接到鏈上的羥基的直鏈烴基鏈)或其烷氧基化衍生物。優(yōu)選，在還原性胺化反應(yīng)中，R1是甲基，R2是直鏈C11-15烷基或C16-18烷基或鏈烯基如椰油烷基或其混合物，Z衍生自還原糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖或乳糖。
本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物也可包含陽離子、兩性、兩性離子、半極性的表面活性劑和/或輔助表面活性劑，以及那些沒有在前文中描述的非離子和/或陰離子表面活性劑。當(dāng)被包括在其中時，本發(fā)明的洗滌劑組合物通常包含0.2％至約25％、優(yōu)選約1％至約8％重量的此類陽離子表面活性劑、兩性、兩性離子和/或半極性的表面活性劑。
適合用于本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物的陽離子清潔表面活性劑具有一個長鏈烴基。此陽離子表面活性劑的例子包括銨表面活性劑如烷基三甲基銨鹵化物和通式[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-的表面活性劑，其中R2是在烷基鏈中含有約8至約18個碳原子的烷基或烷基芐基基團，每個R3選自-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、-CH2CH2CH2-及其混合物；每個R4選自C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、通過連接兩個R4基團形成的芐基環(huán)結(jié)構(gòu)、-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是分子量小于約1000的任何己糖或己糖聚合物)和氫(當(dāng)y非零時)；R5與R4相同或是烷基鏈，其中總碳原子個數(shù)或R2加R5不超過約18；每個y從0至約10，并且y值總和為0至約15；且X是任何相容的陰離子。
非常優(yōu)選的陽離子表面活性劑是用于該組合物中的水溶性季銨化合物，該化合物具有通式R1R2R3R4N+X-(i)，其中R1是C8-C16烷基，R2、R3和R4各獨立地是C1-C4烷基、C1-C4羥基烷基、芐基和-(C2H40)xH，其中x的值為2到5，且X是陰離子。R2、R3和R4中最多一個為芐基。
優(yōu)選的R1烷基鏈長度為C12-C15，尤其是當(dāng)該烷基基團衍生自椰子或棕櫚核脂肪并具有混合鏈長度時，或當(dāng)該烷基基團通過烯烴聚合或羰基合成醇合成而衍生得到時。
優(yōu)選的R2、R3和R4基團是甲基和羥乙基，且陰離子X可選自鹵離子、甲基硫酸根離子、醋酸根離子和磷酸根離子。
適用于這里的通式(i)的季銨化合物的實例有椰油三甲基銨氯化物或溴化物；椰油甲基二羥乙基銨氯化物或溴化物；癸基三乙基銨氯化物；癸基二甲基羥乙基銨氯化物或溴化物；C12-15二甲基羥乙基銨氯化物或溴化物；椰油二甲基羥乙基銨氯化物或溴化物；肉豆蔻基三甲基銨甲基硫酸鹽；月桂基二甲基芐基銨氯化物或溴化物；月桂基二甲基(氧乙烯基)4銨氯化物或溴化物；膽堿酯(通式(i)的化合物，其中R1是 烷基，且R2、R3、R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[通式(i)的化合物]。
可用于本文的其它陽離子表面活性劑也記載于US 4,228,044和EP 000224中。
兩性表面活性劑也適合用于本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。這些表面活性劑可寬泛地描述為仲或叔胺的脂族衍生物或雜環(huán)伸和叔胺的脂族衍生物，其中脂族基團可以是直鏈或支鏈。其中一個脂族取代基包含至少約8個碳原子，通常約8至約18個碳原子，而至少一個包含陰離子水溶性基團，例如羧基、磺酸根、硫酸根。兩性表面活性劑的實例見US 3,929,678(19欄，18-35行)。
兩性離子表面活性劑也適合用于洗衣洗滌劑組合物中?？梢詫⑦@些表面活性劑寬泛地描述為仲胺和叔胺的衍生物、雜環(huán)仲胺和叔胺的衍生物或季銨、季鏻或叔硫鎓化合物的衍生物。關(guān)于兩性離子表面活性劑的例子可以參見US 3,929,678(第19欄，第38行至第22欄第48行)。
半極性非離子表面活性劑是非離子表面活性劑的特殊類型，其包括含有1個具有約10至約18個碳原子的烷基部分和2個選自含有約1至約3個碳原子的烷基和羥基烷基的部分的水溶性胺氧化物；含有1個具有約10至約18個碳原子的烷基部分和2個選自含有約1至約3個碳原子的烷基和羥基烷基的的水溶性氧化膦；和含有1個具有約10至約18個碳原子的烷基部分和選自含有約1至約3個碳原子的烷基和羥基烷基的部分的水溶性亞砜。
半極性非離子洗滌劑表面活性劑包括具下式的胺氧化物表面活性劑 其中R3是含有約8至約22個碳原子的烷基、羥基烷基或烷基苯基或其混合物；R4是含有約2至約3個碳原子的亞烷基或羥基亞烷基或其混合物；x為0至約3每個R5各是含有約1至約3個碳原子的烷基或羥基烷基或含有約1至約3個環(huán)氧乙烷的聚環(huán)氧乙烷基團。R5可以相互連接，例如通過氧或氮原子連接成環(huán)結(jié)構(gòu)。
這些胺氧化物表面活性劑尤其包括C10-C18烷基二甲基胺氧化物和C8-C12烷氧基乙基二羥基乙基胺氧化物。
適當(dāng)?shù)妮o助表面活性劑選自伯胺和叔胺。
用于這里的適當(dāng)?shù)牟钒ㄍㄊ絉1NH2的胺，其中R1是C6-C12，優(yōu)選C6-C10烷基鏈或通式R4X(CH2)n，X是-O-、-C(O)NH-或-NH-、R4是C6-C12烷基鏈，n為1到5，優(yōu)選3。R1烷基鏈可以是直鏈或支鏈并以可以用不超過12個，優(yōu)選小于5的環(huán)氧乙烷部分?jǐn)嚅_。
優(yōu)選的根據(jù)上述通式的胺是正烷基胺。這里適用的胺可選自1-己胺，1-辛胺，1-癸胺和月桂胺。其它優(yōu)選的伯胺包括C8-C10氧基丙基胺，辛氧基丙基胺，2-乙基己基氧基丙基胺，月桂基酰氨基丙胺和酰氨基丙胺。
用于這里的適當(dāng)?shù)氖灏钒ň哂型ㄊ絉1R2R3N的叔胺，其中R1和R2是C1-C8烷基鏈或 R3是C6-C12，優(yōu)選C6-C10烷基鏈，或R3是R4X(CH2)n，其中X是-O-、-C(O)NH-或-NH-，R4是C4-C12，n是1到5，優(yōu)選2-3。R5是H或C1-C2烷基且x是1到6。
R3和R4可以是直鏈或支鏈；R3烷基鏈可以用不超過12個，優(yōu)選少于5個的環(huán)氧乙烷部分?jǐn)嚅_。優(yōu)選的叔胺是R1R2R3N，其中R1是C6-C12烷基鏈，R2和R3是C1-C3烷基或 其中R5是H或CH3，且x＝1-2。
還優(yōu)選下式的酰胺胺 其中R1是C6-C12烷基；n是2-4，優(yōu)選n是3；R2和R3是C1-C4。
最優(yōu)選的胺包括1-辛胺、1-己胺、1-癸胺、1-十二烷基胺、C8-10氧基丙胺、N-椰油1，3-二氨基丙烷、椰油烷基二甲胺、月桂基二甲胺、月桂基二(羥乙基)胺、椰油二(羥乙基)胺、2摩爾丙氧基化的月桂胺、2摩爾丙氧基化的辛胺、月桂基酰氨基丙基二甲胺、C8-10酰氨基丙基二甲胺和C10酰氨基丙基二甲胺。
最優(yōu)選的用在本發(fā)明組合物中的胺是1-己胺、1-辛胺、1-癸胺、1-十二烷基胺。尤其期望的是正十二烷基二甲基胺和二羥基乙基椰油烷基胺和油胺的7倍乙氧基化物、月桂基酰氨基丙胺和椰油酰氨基丙胺。
助洗劑體系根據(jù)本發(fā)明的組合物可以進一步包含助洗劑體系。任何常規(guī)的助洗劑體系都適合用于這里，包括硅鋁酸鹽材料、硅酸鹽、多羧酸酯和脂肪酸、如乙二胺四乙酸鹽等材料、金屬離子螯合劑如氨基多膦酸酯，尤其是二乙胺四亞甲基膦酸和二亞乙基三胺五亞甲基膦酸。盡管由于環(huán)境原因較不優(yōu)選磷酸鹽助洗劑，但其仍可以用在此處。
適當(dāng)?shù)闹磩┛梢允菬o機離子交換材料，通常是無機水合硅鋁酸鹽材料，更特別的是水合的合成沸石，如水合沸石A、X、B、HS或MAP。
另一適合的無機助洗劑材料為層狀硅酸鹽，例如SKS-6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸鈉(Na2Si2O5)組成的晶體層狀硅酸鹽。
適宜的含有一個羧基基團的多羧酸酯包括其乳酸、甘醇酸和醚衍生物，公開在比利時專利Nos.831，368，821，369和821，370中。包含兩個羧基基團的多羧酸酯包括丁二酸、丙二酸、(亞乙二氧基)雙乙酸、馬來酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富馬酸的水溶性鹽，以及在德國Offenle-enschrift 2,446,686和2,446,487、US 3,935,257中公開的醚羧酸酯和在比利時專利No.840,623中公開的亞硫?；人狨ァ：腥齻€羧酸基團的多羧酸酯包括尤其是水溶性檸檬酸酯、烏頭酸酯和檸康酸酯以及丁二酸酯衍生物如英國專利No.1,379,241中公開的羧甲基氧基丁二酸酯，在荷蘭申請7205873中公開的2-羥基丙氧基丁二酸酯(lactoxysuccinates)和在英國專利No.1,387,447中公開的氧化多羧酸酯材料如2-氧雜-1，1，3-丙烷三羧酸酯。
包含四個羧基基團的多羧酸酯包括在英國專利No.1,261,829中公開的氧聯(lián)二丁二酸酯、含有磺基取代基的1，1，2，2，-乙烷四羧酸酯、1，1，3，3-丙烷四羧酸酯，包括在英國專利Nos.1,398,421和1,398,422以及US 3,936,448中公開的磺基琥珀酸酯衍生物，和在英國專利No.1,082,179中公開的磺化熱解檸檬酸酯，而英國專利No.1,439,000公開了包含膦基取代基的多羧酸酯。
脂環(huán)族的和雜環(huán)的多羧酸酯包括環(huán)戊烷-順，順，順-四羧酸酯、環(huán)戊二烯五羧酸酯、2，3，4，5-四氫呋喃順，順，順-四羧酸酯、2，5-四氫呋喃-順-二羧酸酯、2，2，5，5，-四氫呋喃四羧酸酯、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸酯和多元醇如山梨醇、甘露糖醇和木糖醇的羧甲基衍生物。芳族多羧酸酯包括在英國專利No.1,425,343中公開的苯六甲酸、1，2，4，5-苯四酸和鄰苯二甲酸衍生物。
上述中優(yōu)選的多羧酸酯是每個分子包含多達3個羧基基團的羥基-羧酸酯，更優(yōu)選的是檸檬酸酯。
優(yōu)選的用于本發(fā)明組合物中的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑如沸石A或?qū)訝罟杷猁}(SKS-6)和水溶性羧酸酯螯合劑如檸檬酸的混合物。
適合包含在本發(fā)明洗滌劑組合物中的螯合劑是乙二胺-N，N′-二琥珀酸(EDDS)或其堿金屬、堿土金屬、銨或取代銨鹽，或它們的混合物。優(yōu)選的EDDS化合物是游離酸形式和其鈉或鎂鹽。這些優(yōu)選的EDDS鈉鹽的實例包括Na2EDDS和Na4EDDS。優(yōu)選的EDDS鎂鹽的實例包括MgEDDS和Mg2EDDS。鎂鹽最優(yōu)選包含在本發(fā)明組合物中。
優(yōu)選的助洗劑體系包括水不溶性硅鋁酸鹽助洗劑如沸石A和水溶性羧酸酯螯合劑如檸檬酸的混合物。
其它可以形成用于粒狀組合物中的助洗劑體系的一部分的助洗劑材料包括無機材料如堿金屬碳酸鹽、碳酸氫鹽、硅酸鹽，和有機材料如有機膦酸酯、氨基聚亞烷基膦酸酯和氨基多羧酸酯。
其它適宜的水溶性有機鹽是均聚酸或共聚酸或它們的鹽，其中聚羧酸包含至少兩個被不多于兩個碳原子相分隔的羧基基團。
GB-A-1,596,756公開了此類聚合物。此類鹽的實例是MW 2000-5000的聚丙烯酸酯和它們與馬來酸酐的共聚物，該共聚物的分子量是20,000到70,000，尤其約40,000。
組合物中通常包括5％到80％重量的洗滌助洗劑鹽。液體洗滌劑中優(yōu)選包括5％到30％的助洗劑。
酶優(yōu)選的洗滌劑組合物，除了包含本發(fā)明的酶制品外，還包含其它可提供清潔性能和/或織物養(yǎng)護益處的酶。
這些酶包括蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶，淀粉酶、纖維素酶、過氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)蛋白酶任何適合用于堿性溶液的蛋白酶都可以使用。合適的蛋白酶包括來自動物、植物或微生物的蛋白酶。來源于微生物的蛋白酶是優(yōu)選的。也包括經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾的突變體。所述的蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例為枯草桿菌蛋白酶，特別是來自芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例為胰蛋白酶(例如來自豬或牛的)和如WO89/06270所公開的鐮刀菌屬蛋白酶。
優(yōu)選的可購買的蛋白酶包括商品名為Alcalase，Savinase，Primase，Durazym，Esperase(Novozymes A/S，丹麥出售)；Maxatase，Maxacal，Maxapem，Properase，Purafect，Purafect OxP，(Genencor InternationalInc.出售)；Opticlean和Optimase(Solvay Enzymes出售的那些)。以酶蛋白質(zhì)在組合物中的重量計，混合在本發(fā)明洗滌劑組合物中的蛋白酶可以占0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。
脂肪酶適用于堿性溶液的任何脂肪酶均可以使用。合適的脂肪酶包括那些來源于細菌或真菌的脂肪酶。也包括經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾的突變體。
有用的脂肪酶的實例包括來自Humicola lanuginosa的脂肪酶，如EP 258 068和EP 305 216中所述，來自Rhizomucor miehei的脂肪酶，如EP238 023所述，來自假絲酵母菌屬(Candida)的脂肪酶，例如南極假絲酵母(C.antarctica)脂肪酶，如EP214 761中所述的南極假絲酵母脂肪酶A或B，來自假單胞菌屬(Pseudomonas)的脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(見例如EP 218 272)，洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(見例如EP 331376)，施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，熒光假單胞菌(P.fluorescens)的脂肪酶，來自芽孢桿菌屬的脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等人(1993)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochemica et Biophysica acta)，1131，253-260)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)和短小芽孢桿菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)的脂肪酶。
此外，一些克隆的脂肪酶也可以使用，包括在Yamaguchi等，(1991)，基因(Gene)103，61-67中公開的沙門柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)脂肪酶，白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(Schimada，Y.等.，(1989)，生物化學(xué)雜志(J.Biochem.).，106，383-388)，和各種根霉菌屬(Rhizopus)脂肪酶如R.delemar脂肪酶(Hass，M.J等.，(1991)，基因109，117-113)，雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya etal.，(1992)，生物化學(xué)生物技術(shù)生物科學(xué)(Biosci.Biotech.Biochem.)56，716-719)和米根霉(R.oryzae)脂肪酶。
其它類型的脂解酶如角質(zhì)酶也可以使用，例如，在WO 88/09367中公開的衍生自門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)的角質(zhì)酶，或衍生自腐皮鐮孢菌(Fusarium solani pisi)的角質(zhì)酶(例如在WO 90/09446中公開的)。
特別適合的脂肪酶是脂肪酶如M1 LipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Genencor)、LipolaseTM和Lipolase UltraTM(NovozymesA/S)，和脂肪酶P″Amano″(Amano Pharmaceutical Co.Ltd.)。
以酶蛋白質(zhì)在組合物中的重量計，混合在本發(fā)明洗滌劑組合物中的脂肪酶通常占0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。
淀粉酶適用于堿性溶液的任何淀粉酶(a和/或b)均可使用。合適的淀粉酶包括那些來源于細菌或真菌的淀粉酶。也包括經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾的突變體。淀粉酶包括例如，例如來自地衣芽孢桿菌的特定菌株的α-淀粉酶，詳細內(nèi)容參見GB 1,296,839。可購買的淀粉酶是DuramylTM，TermamylTM，F(xiàn)ungamylTM和BANTM(可來自Novozymes A/S)，RapidaseTM和MaxamylTM(可來自Genencor)。
以酶蛋白質(zhì)在組合物中的重量計，混合在本發(fā)明洗滌劑組合物中的淀粉酶通常占0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。
纖維素酶任何適合用于堿性溶液的纖維素酶都可使用。合適的纖維素酶包括來源于細菌或真菌的纖維素酶。也包括經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾或的突變體。合適纖維素酶公開在如下文獻中在US 4,435,307和WO91/17243中公開了產(chǎn)生自Humicola insolens的真菌纖維素酶，在WO96/34108和WO 96/34092中公開了來自芽孢桿菌屬的細菌嗜堿纖維素酶(BCE 103)，在WO 94/21801、US 5,475,101和US 5,419,778中公開了來自木霉菌屬(Trichoderma)的EG III纖維素酶。特別適合的纖維素酶是有利于顏色養(yǎng)護的纖維素酶。這種纖維素酶實例是公開在歐洲專利申請No.0 495 257中的纖維素酶?？少徺I的纖維素酶包括由Humicola insolens菌株產(chǎn)生的CelluzymeTM和CarezymeTM(Novozymes A/S)，KAC-500(B)TM(Kao Corporation)和PuradaxTM(Genencor International)。
以酶蛋白質(zhì)在組合物中的重量計，混合在本發(fā)明洗滌劑組合物中的纖維素酶通常占0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。
過氧化物酶/氧化酶過氧化物酶與過氧化氫或過氧化氫源(例如過碳酸鹽、過硼酸鹽或過硫酸鹽)結(jié)合使用。氧化酶與氧氣結(jié)合使用。兩種類型的酶都用于“溶液漂白”，即防止當(dāng)兩種織物在洗滌液(優(yōu)選含有如在WO94/12621和WO 95/01426中公開的增強劑)中一起洗滌的時候染色織物上的紡織品染料轉(zhuǎn)移到另一織物上。合適的過氧化物酶/氧化酶包括來源于植物、細菌或真菌的過氧化物酶/氧化酶。也包括經(jīng)化學(xué)或遺傳修飾的突變體。
以酶蛋白質(zhì)在組合物中的重量計，混合在本發(fā)明洗滌劑組合物中的過氧化物酶和/或氧化酶通常占0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。
以上提到的酶的混合物都包括在本文中，特別是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和/或纖維素酶的混合物。
以酶蛋白質(zhì)在組合物中的重量計，混合在洗滌劑組合物中的本發(fā)明的酶或其它任何酶通常占0.00001％到2％，優(yōu)選占組合物重量的0.0001％到1％，更優(yōu)選占組合物重量的0.001％到0.5％，甚至更優(yōu)選占組合物重量的0.01％到0.2％。
漂白劑另外可選擇的可包括在本發(fā)明洗滌劑組合物中的洗滌劑組分包括漂白劑。這些漂白劑成分可以包括一種或多種氧漂白劑和根據(jù)選擇的漂白劑而不同的一種或多種漂白活化劑。如果存在，氧漂白化合物通常以約1％至約25％的水平存在。優(yōu)選用于本發(fā)明組合物中的漂白劑是以下所述的大多環(huán)剛性配體的過渡金屬絡(luò)合物，特別是二氯二甲基亞乙基橋接的Cyclam合錳和/或二氯二乙基亞乙基橋接的Cyclam合錳；以及過氧化氫釋放劑與漂白活化劑4-[N-(壬?；?氨基己酰基氧基]-苯磺酸鈉(NACA-OBS)的組合。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)還包括漂白劑的本發(fā)明洗滌劑組合物在包括洗衣、洗碗和硬表面的清洗中可以提供出色的清潔和去污性能。不希望受到理論的限制，但認(rèn)為漂白劑可以進一步氧化果膠/果膠酸成分中的羥基基團，使它們更加可溶和更易于去除。
已驚奇地發(fā)現(xiàn)漂白體系能夠使果膠酸裂解酶的清潔效率最大化。此外，還驚奇地發(fā)現(xiàn)包含本發(fā)明果膠酸裂解酶和漂白體系的洗滌劑組合物由于漂白體系與果膠酸裂解酶的協(xié)同作用而提供了優(yōu)良的清潔作用，其中漂白體系提供出眾的清洗能力、去污能力及衣物的白度保持能力，而果膠酸裂解酶降解污物的果膠成分和/或在衣物中能結(jié)合污物的織物上的果膠成分。這些漂白體系-酶混合體系提供出色的清洗效果，特別是對食物的有色污漬和身體污物。此外，當(dāng)配制成衣物和/或織物養(yǎng)護組合物，本發(fā)明的組合物提供了協(xié)同的白度保持能力。
不希望受到理論的限制，但認(rèn)為存在于許多通常的水果和蔬菜基污物以及棉織物的初生壁中的天然果膠會吸引并留住污物殘渣，特別是高著色的污物成分。通過果膠酸裂解酶除去果膠成分可以將這些有色體暴露于漂白體系。這種協(xié)同作用的原因被認(rèn)為是這些漂白體系通過漂白強硬有色成分以去除食物污漬和身體污物，而果膠酸裂解酶降解污物的果膠成分和/或在衣物中存在于織物上的果膠成分，織物上的果膠成分可與這些污物結(jié)合或相互作用從而使所述污物難以去除。
用于這里的漂白劑組分可以是任何可以用于洗滌劑組合物的漂白劑，包括氧漂白劑以及其它本領(lǐng)域已知的漂白劑如粒徑為400-800微米的一水合或四水合過硼酸鹽和過碳酸鹽。
適用于本發(fā)明的漂白劑可以是活化的或未活化的漂白劑。
一種可用的氧漂白劑包括過羧酸漂白劑和其鹽。此類漂白劑的適當(dāng)實例包括單過氧鄰苯二甲酸鎂六水合物、間氯過苯甲酸鎂，4-壬氨基-4-氧代過氧丁酸和二過氧十二烷二酸。US 4,483,781、US 740,446、EP 0 133 354和US 4,412,934中公開了這些漂白劑。非常優(yōu)選的漂白劑也包括在US4,634,551中公開的6-壬氨基-6-氧代過氧己酸。
可使用的其它種類漂白劑包括鹵素漂白劑。次鹵酸鹽漂白劑的實例包括例如三氯異氰脲酸，二氯異氰脲酸鈉和鉀及N-氯和N-溴烷烴磺酰胺。這些材料通常占成品的0.5-10％重量，優(yōu)選1-5％重量。
過氧化氫釋放劑可與漂白活化劑結(jié)合使用，漂白活化劑如四乙?；叶?TAED)，壬酰基氧基苯磺酸鹽(NOBS，在US 4,412,934中公開)，3，5-三甲基-hexsanol氧基苯磺酸鹽(ISONOBS，在EP 120 591中公開)或五乙酰基葡萄糖(PAG)，它們在過水解后形成作為活性漂白物的過酸，從而使漂白效果得到提高。另外，非常適合的漂白活化劑是C8(6-辛酰氨基-己?；?氧基苯磺酸鹽，C9(6-壬酰氨基己?；?氧基苯磺酸鹽和C10(6-癸酰氨基己酰基)氧基苯磺酸鹽或及其混合物。其它疏水性漂白活化劑包括，但并不局限于，4-[N-(壬?；?氨基己酰氧基]-苯磺酸鈉(NACA-OBS)(其一個實例在美國專利No.5,523,434中公開)、十二碳酰基氧基苯磺酸鹽(LOBS或C12-OBS)、10-十一碳烯酰氧基苯磺酸鹽(UDOBS或在位置10處不飽和的C11-OBS)和癸酰氧基苯甲酸(DOBA)。同樣適當(dāng)?shù)幕罨瘎┦酋；瘷幟仕狨ィ缭贓P 624 154中公開的?；瘷幟仕狨?。
在本發(fā)明的洗滌劑組合物中有用的漂白劑(包括過氧酸)和漂白體系(包含漂白活化劑和過氧漂白化合物)在WO95/10592中公開。
過氧化氫也可在開始或在洗滌和/或漂洗過程中通過添加能夠產(chǎn)生過氧化氫的酶體系(即酶及其底物)而存在。這種酶體系公開于歐洲專利申請EP 0 537 381中。
非氧漂白劑的其它漂白劑也是本領(lǐng)域已知的并可在此利用。一種特別有意義的非氧漂白劑包括光活化漂白劑如磺化酞菁鋅和/或鋁。這些材料在洗滌過程中可以沉積到底物上。在光的輻射下，在氧氣中，如在白天通過懸掛衣物干燥，此磺化酞菁鋅將被活化，導(dǎo)致底物被漂白。
優(yōu)選的酞菁鋅和光活化漂白方法公開于US 4,033,718。通常，洗滌劑組合物包含約0.025％至約1.25％重量的磺化酞菁鋅。漂白劑也可包含錳和鈷催化劑，例如錳基催化劑公開于美國專利Nos.5,576,282、5,246,621、5,244,594、5,194,416、5,114,606和歐洲專利申請公開文本Nos.549,271 A1、549,272 A1、544,440 A2和544,490 A1；例如鈷漂白催化劑公開于例如美國專利Nos.5,597,936、5,595,967、5,703,030和M.L.Tobe，“過渡金屬絡(luò)合物的堿水解”(″Base Hydrolysis of Transition-Metal Complexes″)，Adv.Inorg.Bioinorg.Mech.，(1983)，2，1-94頁。
這里的組合物還可適當(dāng)包括大多環(huán)剛性配體的過渡金屬絡(luò)合物作為漂白催化劑。使用量是催化有效量，適當(dāng)?shù)丶s1ppb或更多，例如多達至約99.9％，更通常地約0.001ppm或更多，優(yōu)選約0.05ppm至約500ppm。
適用于本發(fā)明組合物中的具有大環(huán)剛性配體的過渡金屬漂白催化劑可以通過如下非限制性例子說明二氯-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)二氯-4，11-二甲基-1，4，8，11-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)二氯-5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)二氯-4，11-二乙基-1，4，8，11-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)二水-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)-六氟磷酸鹽一水-羥基-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(III)-六氟磷酸鹽二水-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(III)-四氟硼酸鹽二氯-5，12-二甲基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)-六氟磷酸鹽二氯-5，12-二正丁基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)二氯-5，12-二芐基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)二氯-5-正丁基-12-甲基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)二氯-5-正辛基-12-甲基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)二氯-5-正丁基-12-甲基-1，5，8，12-四氮雜雙環(huán)[6.6.2]十六烷合錳(II)。
泡沫抑制劑另一可選組分是泡沫抑制劑，例如硅氧烷和二氧化硅-硅氧烷混合物。硅氧烷通?？梢杂赏榛酃柩跬椴牧洗?，而二氧化硅通常以細碎形式使用，例如各種類型的二氧化硅氣凝膠和干凝膠及疏水二氧化硅。這些材料可以以微粒的形式摻入，在其中泡沫抑制劑可有利地釋放混合到水溶性的或水可分散的、實質(zhì)上不可透過非表面活性洗滌劑的載體中。
備選地，泡沫抑制劑可以溶解或分散在液體載體中并通過噴涂到一種或多種其它成分上而使用。
優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑公開于US 3,933,672。其它特別有用的泡沫抑制劑有自乳化硅氧烷泡沫抑制劑，在德國專利申請DTOS 2,646,126中公開。這種化合物的一個實例是DC-544，為硅氧烷-乙二醇共聚物，可從DowCorning購買。
特別優(yōu)選的泡沫控制劑為包含硅氧烷油和2-烷基-鏈烷醇的混合物的泡沫抑制劑體系。適合的2-烷基-鏈烷醇為2-丁基-辛醇，其可購買得到，商業(yè)名是Isofol 12R。
此泡沫抑制劑體系在歐洲專利申請EP 0 593 841中公開。
特別優(yōu)選的硅氧烷泡沫控制劑在歐洲專利申請No.92201649.8中公開。所述組合物可以包含硅氧烷/二氧化硅混合物與火成無孔二氧化硅如AerosilR。
上述泡沫抑制劑通常為組合物的0.001％到2％重量，優(yōu)選0.01％到1％重量。
其它成分其它可用于洗滌劑組合物中的成分是如污物懸浮劑、污物釋放劑、熒光增白劑、磨料、殺細菌劑、晦暗抑制劑、著色劑和/或包囊化或未包囊化的香料。
特別適合的包囊化材料是水溶性膠囊，該膠囊由多糖和多羥基化合物組成，如GB1,464,616中的公開。
其它適合的水溶性包囊化材料包含糊精，如在US 3,455,838中的公開，其衍生自取代的二羧酸的未膠化淀粉酯。這些酸-酯糊精優(yōu)選制備自淀粉如蠟質(zhì)種玉米、蠟質(zhì)種高梁、西米、木薯和馬鈴薯的淀粉。所述包囊化材料的適當(dāng)實例包括National Starch生產(chǎn)的N-Lok。N-Lok包囊化材料由改性玉米淀粉和葡萄糖組成。淀粉通過添加單官能取代基團如辛烯基丁二酸酐改性。
在這里適合的抗再沉淀劑和污物懸浮劑包括纖維素衍生物如甲基纖維素、羧甲基纖維素和羥基乙基纖維素和均-或共-聚多羧酸或它們的鹽。這類聚合物包括在前作為助洗劑描述的聚丙烯酸酯和馬來酸酐-丙烯酸共聚物，以及乙烯馬來酸酐與乙烯、甲基乙烯基醚或甲基丙烯酸的共聚物，馬來酸酐占共聚物的至少20摩爾％。這些材料通常以組合物的0.5％到10％重量，更優(yōu)選0.75％到8％，最優(yōu)選1％到6％重量使用。
優(yōu)選的熒光增白劑在性質(zhì)上是陰離子的，其例子是4，4′-二-(2-二乙醇氨基-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′二磺酸二鈉、4，4′-二-(2-嗎啉代-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)-二苯乙烯-2，2′-二磺酸二鈉、4，4′-二-(2，4-二苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二鈉、4′，4″-二-(2，4-二苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2-磺酸鈉、4，4′-二-(2-苯氨基-4-(N-甲基-N-2-羥基乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二鈉、4，4′-二-(4-苯基-2，1，3-三唑-2-基)-二苯乙烯-2，2′-二磺酸二鈉、4，4′-二-(2-苯氨基-4-(1-甲基-2-羥基乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二鈉、2-(二苯乙烯基-4″-(萘并-1′，2′4，5)-1，2，3-三唑-2″-磺酸鈉和4，4′-二-(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯。
其它可用的聚合材料有聚乙二醇，特別是分子量1000-10000，更優(yōu)選2000到8000且最優(yōu)選約4000的聚乙二醇。這些材料以0.20％到5％，更優(yōu)選0.25％到2.5％重量使用。這些聚合物和在前提到的均聚-或共聚-多羧酸鹽對于在過渡金屬雜質(zhì)存在時粘性、蛋白質(zhì)性和可氧化的污物上白度維護、織物灰沉積和清潔性能的提高是有價值的。
本發(fā)明組合物中可用的污物釋放劑通常是具有不同排列的乙二醇和/或丙二醇單元與對苯二酸的共聚物或三元共聚物。此聚合物的實例公開于US 4,116,885和4,711,730和EP 0 272 033。根據(jù)EP 0 272 033的特別優(yōu)選的聚合物具有以下通式(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)且T是(pOOC6H4CO)。
另外非常有用的是作為對苯二甲酸二甲酯、磺基間苯二甲酸二甲酯、乙二醇和1，2-丙二醇的隨機共聚物的改性聚酯，端基主要由磺基苯甲酸酯以及其次由乙二醇和/或1，2-丙二醇的單酯構(gòu)成。目標(biāo)是得到一種兩端都被磺基苯甲酸酯基團封端的聚合物，在本上下文中，“主要”是指大部分所述共聚物被磺基苯甲酸酯基團封端。然而，有些共聚物未被完全封端，因此它們的端基可由乙二醇和/或1，2-丙二醇的單酯構(gòu)成，即“其次”由該類物質(zhì)構(gòu)成。
這里選擇的聚酯包含約46％重量的二甲基對苯二甲酸、約16％重量的1，2-丙二醇，約10％重量的乙二醇，約13％重量的二甲基磺基苯甲酸和約15％重量的磺基間苯二甲酸，并且其分子量為約3,000。聚酯和它們的制備方法參見EP 311 342中的公開。
軟化劑織物軟化劑也可混合到本發(fā)明的洗衣洗滌劑組合物中。這些軟化劑可以是無機或有機類型。無機軟化劑可舉例的有如在GB-A-1 400898和US5,019,292中公開的綠土粘土(smectite clay)。有機織物軟化劑包括在GB-A1514 276和EP 0 011 340中公開的水不溶性叔胺和在EP-B-0 026 528中公開的它們同單C12-C14季銨鹽的聯(lián)合和在EP 0 242 919中公開的雙長鏈酰胺。其它可用的織物軟化體系的有機成分包括在EP 0 299 575和0 313146中公開的高分子量聚環(huán)氧乙烷材料。
綠土粘土的水平通常是5％到15％，更優(yōu)選8％到12％重量，該材料以干燥混合成分加入到制劑的剩余組分中。有機織物軟化劑如水不溶性叔胺或雙長鏈酰胺材料的摻入水平為0.5％到5％重量，通常為1％到3％重量，而高分子量聚環(huán)氧乙烷材料和水溶性陽離子材料的加入水平為0.1％到2％，通常為0.15％到1.5％重量。這些材料通常加入到組合物的噴霧干燥部分中，盡管在一些情況下可能更適合將它們以干燥混合顆粒形式添加到其中，或?qū)⑺鼈円匀刍芤盒问絿姷浇M合物的其它固體組分上。
聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑本發(fā)明的洗滌劑組合物也可包含0.001％到10％，優(yōu)選0.01％到2％，更優(yōu)選0.05％到1％重量的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑。所述聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑通?；旌系较礈靹┙M合物中用以抑制染料從有色織物轉(zhuǎn)移到同時洗滌的其它織物上。這些聚合物能夠在從染色織物洗出的易褪色染料有機會接觸洗滌中的其它織物之前結(jié)合或吸收該染料。
特別適合的聚合染料轉(zhuǎn)移抑制劑是多胺N-氧化化物聚合物、N-乙烯基-吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物，聚乙烯基噁唑烷酮和聚乙烯基咪唑或它們的混合物。
添加這些聚合物也可提高本發(fā)明酶的性能。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可為液體、漿狀、凝膠、棒狀或顆粒形式。
無塵顆?？刹捎美缭赨S 4,106,991和4,661,452(兩者都是NovoIndustri A/S的)公開的方法生產(chǎn)，并可任擇性地通過本領(lǐng)域已知方法加包衣。蠟質(zhì)包衣材料的實例是平均分子量為1000到20000聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)的；具有16到50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化壬基酚；具有15到80個環(huán)氧乙烷單元的乙氧基化脂肪醇，其中醇包含12到20個碳原子；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-和雙-和三甘油酯。適用于流化床技術(shù)的膜形成包衣材料的實例在GB 1483591中給出。
本發(fā)明顆粒組合物也可以采取“致密形式”，即，它們可以具有比通常的顆粒洗滌劑更高的密度，即550到950g/l；在此情況下，本發(fā)明的顆粒洗滌劑組合物可包括較通常的顆粒洗滌劑較小量的“無機填料鹽”；典型的填料鹽是堿土金屬的硫酸鹽和氯化物，典型地為硫酸鈉；“致密”洗滌劑通常包含至多10％的填料鹽。本發(fā)明的液體組合物也可是“致密形式”，在此情況下，本發(fā)明的液體洗滌劑組合物可包括較通常的液體洗滌劑較小量的水。通常，濃縮的液體洗滌劑的水含量占洗滌劑組合物重量的不到30％，更優(yōu)選不到20％，最優(yōu)選不到10％。
本發(fā)明的組合物可以例如配制成手洗和機洗洗衣洗滌劑組合物(其中包括洗衣添加劑組合物和適合用于污染織物的預(yù)處理的組合物)，漂洗時添加的織物柔軟組合物，和用于普通家庭清洗硬表面和洗碗操作的組合物。
下述實施例旨在舉例說明本發(fā)明組合物，而非旨在對本發(fā)明范圍進行限定或定義。在洗滌劑組合物中，簡寫的成分標(biāo)識符的意義如下LAS 直鏈C12烷基苯磺酸鈉TAS 牛油烷基硫酸鈉XYASC1x-C1y烷基硫酸鈉ABEY與平均Y摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的主要為C1A-C1B的直鏈伯醇XYEZS每摩爾與平均Z摩爾的環(huán)氧乙烷縮合的C1x-C1y烷基硫酸鈉非離子表面活劑平均乙氧基化程度為3.8而平均丙氧基化程度為4.5的C13-C15混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，由BASFGmbH售出，商品名為PlurafaxLF404CFAAC12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺TFAAC16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
QAS R2.N+(CH3)2(C2H4OH)，其中R2＝C12-C14DTPA亞乙基三胺五乙酸SADS式2-R.C4H7.-1，4-(SO4)2-(其中R＝C10-18)的C14-22烷基二硫酸鈉MESx-磺基C18脂肪酸甲酯皂衍生自牛油和椰子油脂肪酸的80/20混合物的直鏈烷基羧酸鈉硅酸鹽無定型硅酸鈉(SiO2∶Na2O比率＝2.0)NaSKS-6式d-Na2Si2O5的晶狀多層硅酸鹽碳酸鹽無水碳酸鈉MA/AA1∶4馬來酸/丙烯酸共聚物，平均分子量約為80,000沸石A基本顆粒大小在1-10微米范圍內(nèi)的式Na12(AlO2SiO2)12·27H2O的水合硅鋁酸鈉檸檬酸鹽二水合檸檬酸三鈉PB1無水過硼酸鈉一水合物漂白劑過碳酸鹽 經(jīng)驗式為2Na2CO3·3H2O2的無水過碳酸鈉漂白劑TAED乙?；叶種ACA-OBS4-[N-(壬?；?氨基己酰氧基]-苯磺酸鈉NOBS壬酰氧基苯磺酸鈉鹽CMC羧甲基纖維素鈉HEDP羥基乙烷二亞甲基膦酸DETPMP二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)，由Monsanto售出，商品名為Dequest2060TEPAE亞乙基五胺乙氧基化物PVP聚乙烯吡咯烷酮聚合物PVPVI聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共聚物PVNO平均分子量為50,000的聚乙烯基吡啶-N-氧化物增白劑4，4′-二(2-磺基苯乙烯基)聯(lián)苯二鈉和/或4，4′-二(4-苯氨基-6-嗎啉代-1，3，5-三嗪-2-基)二苯乙烯-2，2′-二磺酸二鈉EDDS鈉鹽形式的乙二胺-N，N′-二琥珀酸[S，S]異構(gòu)體泡沫抑制劑MPT(熔點)為50℃的25％石蠟，17％疏水二氧化硅，58％石蠟油顆粒泡沫抑制劑12％硅氧烷/二氧化硅、18％十八烷醇、70％顆粒形式的淀粉硫酸鹽無水硫酸鈉HMWPEO高分子量的聚環(huán)氧乙烷酶說明書中以上所述的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶金屬催化劑二氯二乙基亞乙基橋接的Cyclam合錳胺C8-10酰氨基丙基二乙胺SRP陰離子封端的聚酯STPP三磷酸鈉碳酸氫鹽碳酸氫鈉PAAC五氨合醋酸鈷(III)鹽石蠟石蠟油，由Wintershall售出，商品名為Winog70BTA苯并三唑三乙酸鹽三水合乙酸鈉PEGX分子量約為X的聚乙二醇SKTP三磷酸鈉鉀SLF18購自O(shè)lin Corporation的低泡沫型表面活性劑ACNI式C9/11H19/23EO8-環(huán)己基縮醛的烷基封端的非離子表面活性劑PA30購自BASF的分子量約為8,000的聚丙烯酸酯均聚物聚凝膠預(yù)混物購自3V Inc.的5％活性聚凝膠DKP的水溶液BTA苯并三唑
MEA單乙醇胺酶組分以純酶占總組合物重量的百分?jǐn)?shù)包含在實施例中。
下列非限制性實施例用來對本發(fā)明進行舉例說明。
材料和方法菌株和供體生物枯草桿菌DSM 14218包含含有編碼本發(fā)明果膠酸裂解酶的DNA(SEQID NO1)的質(zhì)粒。該基因也可克隆自菌株ATCC 23857(枯草桿菌PL2306)或該DNA可來自于同樣的菌株ATCC 23857D(兩者都可以獲得自ATCC，LGC Promochem AB，PO Box 1737，SE-501 17 Boras，瑞典)。
枯草桿菌PL 1801。該菌株是具有被破壞的apr和npr基因的枯草桿菌DN 1885(Diderichsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjфholm，C.(1990)，編碼來自于短芽孢桿菌的胞外酶α-乙酰乳酸脫羧酶的aldB的克隆，細菌雜志(J.Bacteriol.)，172，4315-4321)，這種破壞發(fā)生于已知枯草桿菌纖維素基因的轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)，導(dǎo)致產(chǎn)生纖維素酶陰性細胞?；旧先?Eds.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick(1993)枯草桿菌和其它革蘭氏陽性細菌(Bacillus substillis and other Gram-PositiveBacteria)，美國微生物學(xué)會，p.618)所述進行這種基因破壞。
按Yasbin，R.E.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.(1975)枯草桿菌溶原性菌株的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染證明感受態(tài)細胞中原噬菌體的選擇性誘導(dǎo).細菌學(xué)雜志，(J.Bacteriol.)121296-304)所述的方法制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。
常規(guī)分子生物學(xué)方法除非另作說明，所有的DNA操作和轉(zhuǎn)化都采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法(Sambrook等.(1989)分子克隆實驗指南，(Molecular cloningAlaboratory manual)冷泉港實驗室，冷泉港，NY；Ausubel，F(xiàn).M.等.(編)“最新分子生物學(xué)手冊”(Current Botocots in Molecular Biology).John Wileyand Sons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(編)“芽孢桿菌分子生物學(xué)方法”(Molecular Biological Methods for Bacillus).John Wiley和Sons，1990)。
按制造商說明書使用用于DNA操作的酶(如可從New England Biolabs，Inc獲得限制性內(nèi)切酶、連接酶等)。
基因組DNA制備按ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，USA)的詳細說明，在液體培養(yǎng)基3中進行用作供體生物的枯草桿菌菌株的增殖。37℃以300rpm溫育18小時后，回收細胞，按Pitcher等[Pitcher，D.G.，Saunders，N.A.，Owen，R.J；用硫氰酸胍快速抽提細菌基因組DNA；應(yīng)用微生物學(xué)通訊(lett ApplMicrobiol)1989，8151-156]的方法分離基因組DNA。
質(zhì)粒pMOL995該質(zhì)粒是pUB110的衍生物，基本上包含使該質(zhì)粒能在枯草桿菌內(nèi)增殖的元件、卡那霉素抗性基因，并有克隆自解淀粉芽孢桿菌amyQ基因的強啟動子和信號肽。該信號肽包含一個Sac II位點，這便于克隆與信號肽融合的蛋白質(zhì)成熟部分的編碼DNA。這就導(dǎo)致前蛋白的表達，該蛋白質(zhì)被導(dǎo)向細胞外部。
該質(zhì)粒用普通的基因工程方法構(gòu)建而成，簡述如下。
質(zhì)粒DMOL995的描述以質(zhì)粒pUB110(McKenzie，T.等.，1986，質(zhì)粒(Plasmid)1593-103)為基礎(chǔ)，構(gòu)建pMOL995。在幾個克隆步驟中將不同的特征導(dǎo)入pUB110的限制酶切位點NciI。
pMOL995(SEQ ID NO3)的特征是堿基4076-6661和1-1962編碼質(zhì)粒pUB110。
堿基1963-2305編碼來自地衣芽孢桿菌ATCC 14580的amyL基因的轉(zhuǎn)錄終止子和一些導(dǎo)入的單限制性酶切位點(EagI、SalI等)。
堿基2306-3766(反向)編碼來自WO95/26397(公開于WO95/26397的SEQ ID NO4)的α-淀粉酶成熟部分。
堿基3767-4705(反向)編碼克隆自解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶的啟動子和信號肽(見于WO95/10603并用作啟動子)和在堿基4075位附近導(dǎo)入的單SacI和XmaI位點及在堿基3769位附近導(dǎo)入的單Sac II位點，所述位點用于隨后在符合讀框中克隆信號肽。
pMOL944該質(zhì)粒是pUB110的衍生物，基本上包含使該質(zhì)粒能在枯草桿菌內(nèi)增殖的元件、卡那霉素抗性基因，并具有克隆自地衣芽孢桿菌ATCC14580的amyL基因的強啟動子和信號肽。該信號肽包含一個Sac II位點，這便于克隆與信號肽融合的蛋白質(zhì)成熟部分的編碼DNA。這就導(dǎo)致前蛋白的表達，該蛋白質(zhì)被導(dǎo)向細胞外部。
該質(zhì)粒用普通的基因工程方法構(gòu)建而成，簡述如下。
pMOL944的構(gòu)建用單限制性內(nèi)切酶NciI消化pUB110質(zhì)粒(McKenzie，T等，1986，質(zhì)粒1593-103)。將擴增自質(zhì)粒pDN1981(P.L.Jorgensen等.，1990，基因，96，p37-41.)上之a(chǎn)myL啟動子的PCR片段用NciI消化，并插入NciI消化的pUB110中，產(chǎn)生質(zhì)粒pSJ2624。
所用的兩個PCR引物具有如下序列引物C(SEQ ID NO8)5′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACIGTATCTCAGC-3引物D(SEQ ID NO9)5′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCIGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′引物C向質(zhì)粒中插入一個NotI位點。
質(zhì)粒pSJ2624隨后用SacI和NotI消化，且用SacI和NotI消化擴增自pDN1981上的amyL啟動子的新PCR片段(所述片段用引物E和F合成)，將該DNA片段插入SacI-NotI消化的pSJ2624，從而產(chǎn)生質(zhì)粒
pSJ2670。
該克隆步驟將第一次克隆的amyL啟動子替換為方向相反的同一啟動子。用于PCR擴增的兩個引物具有如下序列引物E(SEQ ID NO10)5′-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′引物F(SEQ ID NO11)5′-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′質(zhì)粒pSJ2670用限制性內(nèi)切酶PstI和BclI消化，將用兩個引物G和H擴增自編碼堿性淀粉酶SP772(見WO9526397A1)的克隆DNA序列的PCR片段用PstI和BclI消化后插入上述質(zhì)粒，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pMOL944。用于PCR擴增的兩個引物具有如下序列引物G(SEQ ID NO12)5′-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′引物H(SEQ ID NO13)5′-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′引物H向質(zhì)粒中插入一個SacII位點。
培養(yǎng)基TY(如Ausubel，F(xiàn).M.等.(編.)″最新分子生物學(xué)手冊″.John Wiley和Sons，1995中所述)。
LB瓊脂(如Ausubel，F(xiàn).M.等.(編.)″最新分子生物學(xué)手冊″.JohnWiley和Sons，1995中所述)。
LBPG是補充有0.5％葡萄糖和0.05M磷酸鉀，pH7.0的LB瓊脂。
BPX培養(yǎng)基描述于EP 0 506 780(WO 91/09129)中。
終點裂解酶試驗(于235nm)，果膠酸活力單位為了測定β-消除，用溶解在0.1M EPPS緩沖液(pH8)中的1.0％多聚半乳糖醛酸鈉鹽(Sigma P-1879)作為底物測量235nm處吸光值的增加。70℃溫育20分鐘。添加5倍體積的0.02M H3PO4停止反應(yīng)。計算催化速率時，每分鐘235nm處吸光值增加5.2相應(yīng)于形成1μmol不飽和產(chǎn)物(Nasuna和Starr(1966)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.).Vol 241 5298-5306頁；以及Bartling，Wegener和Olsen(1995)微生物學(xué)(Microbiology)Vol 141873-881頁)。
一個果膠酸活力單位定義為在pH8.0和70℃下，每分鐘導(dǎo)致一微摩爾量切割產(chǎn)物形成所需要的酶量。
實施例1克隆枯草桿菌果膠酸裂解酶基因在枯草桿菌中亞克隆和表達成熟果膠酸裂解酶用以下兩個寡核苷酸組成的PCR引物組對編碼本發(fā)明的果膠酸裂解酶的DNA序列做PCR擴增SEQ ID NO4(引物A)5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG-3’SEQ ID NO5(引物B)5’-GTA CCT CGC GAG TCG ACT TCT TAA TTT AAT TTA CCC GCA CCC GC-3’限制性位點Sac II和Sal I加有下劃線。
上述寡核苷酸用于PCR反應(yīng)，該反應(yīng)于補充有dNTP各200μM、2.6單位的HiFidelityTMExpand酶混合物及引物各200pmol的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國)中進行。將分離自枯草桿菌菌株的基因組DNA作為模板添加入該PCR反應(yīng)?；蚪MDNA按如上所述分離。
用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)進行PCR反應(yīng)。94℃溫育1分鐘進行1個循環(huán)；然后進行10個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃變性15秒，60℃退火60秒，72℃延伸120秒；然后進行20個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃變性15秒，60℃退火60秒及70℃延伸120秒(在此延伸步驟，每個循環(huán)增加20秒)。在0.7％瓊脂糖凝膠(Nusieve，F(xiàn)MC)上電泳分析5μl擴增產(chǎn)物。大小為1.2kb的DNA片段的出現(xiàn)表明基因片段得到正確擴增。
亞克隆PCR片段按制造商說明書用QIA快速PCR純化試劑盒(Qiagen，USA)純化上述產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的45μl等分試樣。純化的DNA洗脫于50μl、pH8.5的10mM Tris-HCl中。用Sac II和Sal I消化5μg pMOL995和25μl純化的PCR片段，在0.7％瓊脂糖凝膠(Nusieve，F(xiàn)MC)上電泳，將相關(guān)片段從膠上切下，按制造商說明書用QIA快速凝膠抽提試劑盒(Qiagen，USA)進行純化。隨后將分離的PCR DNA片段連接到經(jīng)Sac II-Sal I消化并純化的pMOL995上。用各0.5μg的每種DNA片段、1U T4 DNA連接酶和T4連接酶緩沖液(Boehringer Mannheim，德國)16℃過夜完成連接。
連接混合物被用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草桿菌PL2306。將轉(zhuǎn)化細胞鋪于含10μg/ml卡那霉素的LBPG瓊脂平板上。37℃溫育18小時后，菌落出現(xiàn)于平板上。幾個克隆通過從過夜肉湯培養(yǎng)液分離質(zhì)粒DNA來分析。
一個這樣的陽性克隆重劃線幾次于如上所用的瓊脂平板上，該克隆被稱為MB331。MB331克隆在含10μg/ml卡那霉素的TY中，37℃培養(yǎng)過夜，第二天按制造商為枯草桿菌質(zhì)粒制備推薦的方法，用Qiaprep Spin質(zhì)粒小量制備試劑盒#27106從1ml細胞中分離質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA進行測序并揭示和SEQ ID NO1中編碼成熟果膠酸裂解酶的果膠酸裂解酶基因的一部分具有同一性的DNA序列。
實施例2表達、純化和鑒定枯草桿菌果膠酸裂解酶在500ml帶擋板的錐形瓶里將如實施例1所述獲得的MB331克隆(保藏為DSM 14218)在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培養(yǎng)基中37℃，300rpm培養(yǎng)5天，得到4550ml肉湯培養(yǎng)液。用醋酸將培養(yǎng)液的pH調(diào)節(jié)到6.1，然后，在攪拌中加入25ml的陽離子試劑(C521 10％)和60ml陰離子試劑(A130 0.1％)用于產(chǎn)生絮凝。利用Sorval RC 3B離心機，在6℃，10000rpm離心30分鐘分離絮凝的物質(zhì)。產(chǎn)生的上清液總體積為3750ml。
利用Whatman GF/D和C號玻璃濾器澄清上清液，最后在截留分子量為10kDa的Filtron UF膜上濃縮，總體積為1500ml，將pH調(diào)至6.0。
為了獲得高純度的果膠酸裂解酶，最后一步進行S-Sepharose陽離子交換層析。將1500ml溶液上樣于用50mmol pH6.0的醋酸鈉緩沖液平衡好的800ml含S-Sepharose(Pharmacia)的柱中。果膠酸裂解酶發(fā)生結(jié)合，之后用0.5M NaCl梯度洗脫。
鑒定純酶在SDS-PAGE上為44kDa的單一條帶，等電點約為7.6。
測定蛋白質(zhì)的濃度時使用摩爾消光系數(shù)71950(基于推斷自該序列的氨基酸組成)。
果膠酸裂解酶的活性可被EDTA抑制。
差示掃描量熱法(DSC)顯示純酶在pH8的0.1M Tris緩沖液中的熔解溫度為58.8℃。
實施例3克隆枯草桿菌168果膠酸裂解酶基因在枯草桿菌中亞克隆和表達成熟果膠酸裂解酶用以下兩個寡核苷酸組成的PCR引物組對編碼本發(fā)明的果膠酸裂解酶的DNA序列做PCR擴增SEQ ID NO14(引物J)5′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG-3′
SEQ ID NO15(引物K)5′-GTA CCT CGC GAG CGG CCG CTT CTT AAT TTA ATT TAC CCG CAC CCG C-3′限制性位點Sac II和Not I加有下劃線。
上述寡核苷酸用于PCR反應(yīng)，該反應(yīng)于補充有dNTP各200μM、2.6單位的HiFidelityTMExpan酶混合物及引物各200pmol的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國)中進行。如上所述方法分離自枯草桿菌菌株的基因組DNA作為模板添加入該PCR反應(yīng)。
用DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)進行PCR反應(yīng)。94℃溫育1分鐘進行1個循環(huán)；然后進行10個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃變性15秒，60℃退火60秒，72℃延伸120秒；之后進行20個循環(huán)，各為94℃變性15秒、60℃退火60秒及70℃延伸120秒(在此延伸步驟，每個循環(huán)增加20秒)。在0.7％瓊脂糖凝膠(Agarose，SIGMA)上電泳分析5μl擴增產(chǎn)物。大小為1.2kb的DNA片段的出現(xiàn)表明基因片段得到正確擴增。
亞克隆PCR片段按制造商說明書用QIA快速PCR純化試劑盒(Qiagen，USA)純化上述產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的45μl等分試樣。純化的DNA洗脫于50μl、pH8.5的10mM Tris-HCl中。用Sac II和Sal I消化5μg pMOL944和25μl純化的PCR片段，在0.7％瓊脂糖凝膠(NuSieve，F(xiàn)MC)上電泳，將相關(guān)片段從膠上切下，按制造商說明書用QIA快速凝膠抽提試劑盒(Qiagen，USA)進行純化。隨后將分離的PCR DNA片段連接到經(jīng)Sac II-Sal I消化并純化的pMOL944上。用各0.5μg的每種DNA片段、1U T4 DNA連接酶和T4連接酶緩沖液(Boehringer Mannheim，德國)16℃過夜完成連接。
連接混合物被用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草桿菌PL1801。將轉(zhuǎn)化細胞鋪于含10μg/ml卡那霉素的LBPG瓊脂平板上。37℃溫育18小時后，菌落出現(xiàn)于平板上。幾個克隆通過從過夜肉湯培養(yǎng)液分離質(zhì)粒DNA來分析。
一個這樣的陽性克隆重劃線幾次于如上所用的瓊脂平板上，該克隆被稱為MB1306。MB1306克隆在含10μg/ml卡那霉素的TY中，37℃培養(yǎng)過夜，第二天按制造商為枯草桿菌質(zhì)粒制備推薦的方法，用Qiaprep Spin質(zhì)粒小量制備試劑盒#27106從1ml細胞中分離質(zhì)粒。質(zhì)粒DNA進行測序并揭示了和SEQ ID NOxx中編碼成熟果膠酸裂解酶的果膠酸裂解酶基因的一部分具有同一性的DNA序列。
實施例4表達枯草桿菌168的果膠酸裂解酶在500ml帶擋板的錐形瓶里將如實施例3所述獲得的MB1306克隆在含10μg/ml卡那霉素的25×200ml BPX培養(yǎng)基中37℃，300rpm培養(yǎng)5天，得到4550ml肉湯培養(yǎng)液。
實施例5克隆枯草桿菌DSM 14979的果膠酸裂解酶基因用如下寡核苷酸組成的PCR引物組對編碼果膠酸裂解酶的來自枯草桿菌DSM 14979的DNA序列做PCR擴增SEQ ID NO16(引物L(fēng))5 ′-CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT GAT TTA GGC CAC CAG ACG-3’SEQ ID NO17(引物M)5’-GTA CCT CGC GAG CGG CCG CTT CTT AAT TTA ATT TAC CCG CAC CCG C-3’限制性位點Sac II和Not I加有下劃線。
寡核苷酸各50pmol用于PCR反應(yīng)，該反應(yīng)于含有dNTP各200μM、3.5mM MgCl2、2.5單位的AmpliTaq GoldTM(Perkin-Elmer)的PCR緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl)中進行，大約100到200ng按如上所述方法分離的基因組DNA作為PCR擴增反應(yīng)的模板?？傮w積為50μl。該PCR反應(yīng)在Perkin-Elmer GeneAmp PCR系統(tǒng)2400中進行。
該PCR反應(yīng)的循環(huán)方案為94℃-10分鐘；1個循環(huán)
94℃-1分鐘，55℃-30秒，72℃-1分30秒；25個循環(huán)72℃-7分鐘；1個循環(huán)。
在1.0％瓊脂糖凝膠(Agarose，SIGMA)上電泳分析5μl擴增產(chǎn)物。大小為1.2kb的DNA片段的出現(xiàn)表明基因片段得到正確擴增。片段測序結(jié)果揭示了編碼來自枯草桿菌DSM 14979的成熟果膠酸裂解酶(顯示于SEQ IDNO19中)的DNA序列(顯示于SEQ ID NO18中)。
實施例6測定果膠酸裂解酶在液體洗滌劑中的穩(wěn)定性本發(fā)明的果膠酸裂解酶變體的洗滌劑穩(wěn)定性是通過按如下所述方法在溫育酶和洗滌劑混合物后測定變體的活性來確定的。
殘留活性測定在兩個樣品管中分別裝入30微升酶溶液(培養(yǎng)物上清液或純酶)與1ml典型的歐洲或美國強效型液體洗滌劑的混合物。其中一管貯藏在冰上，另一管于40℃溫育90分鐘。將30微升的水與1ml的洗滌劑混合并在冰上溫育，作為參照物。
溫育后，9ml的冰冷的水加入樣品中，劇烈混合并貯藏在冰上待進一步的分析。
對于酶活性的測定，首先混合50微升酶-洗滌劑混合物和5ml檢測緩沖液(100mM Tris-HCl，0.68mM CaCl2，pH8.0)，其次從該溶液中取出75微升與75微升新鮮制備的底物溶液(含1％多聚半乳糖醛酸的檢測緩沖液)混合并于40℃溫育10分鐘。再后，將100微升的溫育混合物加入在UV-透明微量滴定板中的100微升終止緩沖液(50mM H3PO4)內(nèi)，并用分光光度計測量235nm處的吸光值。水-洗滌劑樣品用來調(diào)節(jié)分光光度計的零點。
此時，通過計算在40℃溫育90分鐘的樣品的活性(A235吸收值)與貯藏在冰上的樣品的活性的相對值，得到殘留活性值殘留活性(RA)＝吸收值[溫育在40℃的樣品]/吸收值[溫育在0℃的樣品]因此，殘留活性等價于酶的洗滌劑穩(wěn)定性。
圖1列出了溫育在典型的歐洲強效型液體洗滌劑中的MB331果膠酸裂解酶的一些替代變體的提高的殘留活性。相對于親本果膠酸裂解酶，大多數(shù)替代變體的洗滌劑穩(wěn)定性提高了50％以上。等同地，在圖2中列出的MB331果膠酸裂解酶的替代變體當(dāng)溫育于典型的美國強效型液體洗滌劑中時也明顯地提高了酶的穩(wěn)定性。
圖1.導(dǎo)致在歐洲強效型液體洗滌劑中溫育后殘留活性增加的SEQ ID NO2果膠酸裂解酶中的替代。
圖2.導(dǎo)致在美國強效型液體洗滌劑中溫育后殘留活性增加的SEQ ID NO2果膠酸裂解酶中的替代。
洗滌性能實施例洗滌性能實施例A以全規(guī)模(fullscale)測試本發(fā)明果膠酸裂解酶。
來自克隆MB331的果膠酸裂解酶(SEQ ID NO2)(以下表示為MB331酶)在歐洲強效型液體洗滌劑中使用一系列不同測試樣品于全規(guī)模洗滌中進行行評價。所使用的酶水平是0.05mg MB331酶/每升洗滌水。在許多不同的水果或蔬菜基污漬上以此劑量水平發(fā)現(xiàn)非常高的洗滌性能，見下表所示。
方法描述使用下列設(shè)備和洗滌條件。
洗滌器AEG kolavamat 86820(最新式)洗滌程序40℃短洗滌洗滌劑5g/l歐洲強效型液體洗滌劑水硬度15°dH(4∶1 Ca/Mg；2.14mM CaCl2和0.54mM MgCl2)酶每升洗滌水0.05mg MB331果膠酸裂解酶蛋白樣品來自Equest的預(yù)制備食物污漬評估用Elrepho 2000反射率分光光度計在460nm處測定反射率。
Δ反射率根據(jù)如下計算R酶-R無酶，其中R是在460nm處的反射率。
洗滌性能實施例B在小規(guī)模洗滌中果膠酶對香蕉樣品的洗滌性能。
在使用耐洗牢度試驗儀(Laundermeter)和香蕉樣品在小規(guī)模洗滌試驗中，于歐洲強效型液體洗滌劑中將來自克隆MB331的果膠酸裂解酶(SEQID NO2)與其它果膠酸裂解酶作比較。結(jié)果見下表，其中將MB331的洗滌性能效果調(diào)到100％。
來自枯草桿菌DSM14218的果膠酸裂解酶(SEQ ID NO2，來自克隆MB331)和來自枯草桿菌A168的果膠酸裂解酶(SEQ ID NO7，來自克隆MB1306)觀察到具有最佳的洗滌性能，然而來自地衣芽孢桿菌(SP958)和B.agaradherens(SP956)的果膠酸裂解酶顯示出低于50％的洗滌性能。
方法描述制備香蕉樣品將三個香蕉搗碎并在攪拌機內(nèi)加入70ml去離子水勻漿3-4分鐘。懸浮液被倒入盤中并放置約2小時。清潔的棉布樣品(來自Testfabrics Inc.，型號400)浸泡在該懸浮液中，在兩個軋輥之間擠壓并干燥過夜。
洗滌性能測定香蕉樣品用耐洗牢度試驗儀(Laundermeter)在歐洲強效型液體洗滌劑和15°dH水(4∶1Ca/Mg)中洗滌。水的硬度通過添加CaCl2(2.14mM)和MgCl2(0.54mM)調(diào)節(jié)。每個燒杯(500ml)加入20個鋼球，200ml洗滌劑溶液，0.05mg/l果膠酶和3個香蕉樣品(5cm×5cm)。洗滌程序是從25℃到40℃加熱10分鐘，隨后在40℃洗滌20分鐘。樣品在自來水中漂洗并在室溫中干燥過夜。
評估樣品的反射率用MacBeth ColorEye 7000反射率分光光度計在440nm處測定。
洗滌性能實施例C在液體洗滌劑中具有提高的穩(wěn)定性的MB331變體已制造出在強效型液體洗滌劑中具有改善穩(wěn)定性的MB331果膠酸裂解酶變體。通過在液體洗滌劑中35℃下儲藏果膠酸裂解酶7天來測定其穩(wěn)定性，隨后使用香蕉樣品在耐洗牢度試驗儀(Laundermeter)測試中評估洗滌性能。下表顯示4種不同的MB331變體在儲藏穩(wěn)定性上具有強的改善。MB331-varl47和168的洗滌性能沒有改變，然而MB331-varl 35和137的洗滌性能比MB331的洗滌性能略低。
方法描述果膠酶在歐洲強效型液體洗滌劑內(nèi)在35℃水浴中溫育7天。儲藏的樣品和新鮮的酶用購買自Equest的香蕉污漬樣品和0.01mg/l果膠酶在耐洗牢度試驗儀(Laundermeter)，洗滌性能分析(見洗滌性能實施例B中所述)中測試。新鮮的MB331的洗滌性能調(diào)節(jié)到100％。儲藏七天后，酶的儲藏穩(wěn)定性用與新鮮的酶相比殘留的洗滌性能％來計算。
洗滌劑實施例洗滌劑實施例I本發(fā)明顆粒織物洗滌劑組合物可如下制備A BCLAS 6.5 8.0 8.0硫酸鈉 15.020.0 20.0沸石A 26.020.0 25.0次氮基三乙酸鈉 5.0 -2.0本發(fā)明的酶 0.010.0010.05PVP 0.5 -0.5TAED3.0 -2.0硼酸4.0 --PB1 18.015.0015.00NACA-OBS- -1.0金屬催化劑 0.02--酚磺酸鹽0.1 --微量物質(zhì)(其它酶、增白劑、香料、染料...)達到100
洗滌劑實施例II本發(fā)明致密顆粒織物洗滌劑組合物(密度800g/l)可如下制備A B45AS 8.0 8.025E3S 2.0 2.025E5 3.0 3.025E3 3.0 3.0TFAA 2.5 2.5沸石A 17.017.0NaSKS-6 12.012.0檸檬酸3.0 3.0碳酸鹽7.0 7.0MA/AA 5.0 5.0CMC 0.4 0.4酶0.050.05本發(fā)明的酶0.010.001TAED 6.0 6.0過碳酸鹽 22.022.0EDDS 0.3 0.3顆粒泡沫抑制劑3.5 3.5水/微量物質(zhì)(增白劑、香料、染料...)達到100％洗滌劑實施例III尤其可用于洗滌有色織物的本發(fā)明的顆?？椢锵礈靹┙M合物，制備如下A BLAS 10.7 -TAS 2.4 -TFAA - 4.0
45AS 3.110.045E7 4.0-25E3S - 3.068E11 1.8-25E5 - 8.0檸檬酸鹽 15.0 7.0碳酸鹽 - 10檸檬酸 2.53.0沸石A 32.1 25.0Na-SKS-6 - 9.0MA/AA 5.05.0DETPMP 0.20.8本發(fā)明的酶 0.10 0.05硅酸鹽 2.5-硫酸鹽 5.23.0PVP0.5-PVPVI - 0.2PB11.0-酚磺酸鹽 0.2-水/微量物質(zhì) 達到100％洗滌劑實施例IV可在洗滌過程中提供軟化能力的本發(fā)明顆?？椢锵礈靹┙M合物可如下制備A B45AS- 10.0LAS 7.6-68AS1.3-45E74.0-
25E3 - 5.0椰油烷基-二甲基羥乙基 1.4 1.0銨氯化物檸檬酸鹽 5.0 3.0Na-SKS-6 - 11.0沸石A 15.0 15.0MA/AA 4.0 4.0DETPMP0.4 0.4PB1 15.0 -過碳酸鹽 - 15.0TAED 5.0 5.0綠土粘土 10.0 10.0HMWPEO- 0.1本發(fā)明的酶0.10 0.05硅酸鹽3.0 5.0碳酸鹽10.0 10.0顆粒泡沫抑制劑1.0 4.0CMC 0.2 0.1水/微量物質(zhì)達到100％洗滌劑實施例V以下洗衣組合物可以是顆粒狀或片狀，其根據(jù)本發(fā)明制備。
A B C D E基礎(chǔ)產(chǎn)物C45AS/TAS 8.05.03.03.03.0LAS 8.0- 8.0- 7.0C25AE3S 0.52.01.0- -C25AE5/AF32.0- 5.02.02.0
QAS -- - 1.01.0沸石A20.0 18.0 11.0- 10.0SKS-6(I)(干燥加入) -- 9.0 - -MA/AA2.0 2.02.0 - 4.0檸檬酸鹽 -2.0- - -檸檬酸 2.0 - 1.5 2.0-DTPA 0.2 0.2- - -EDDS -- 0.5 0.1-HEDP -- 0.2 0.1-PB1 3.0 5.010.0- 4.0過碳酸鹽 -- - 18.0 -NOBS 3.0 4.0 - - 4.0NACAOBS -- 2.0- -TAED -- 2.05.0-金屬催化劑 -0.02- - -碳酸鹽 15.0 18.08.015.0 15.0硫酸鹽 5.0 12.02.017.0 3.0硅酸鹽 -1.0 - - 8.0本發(fā)明酶 0.0010.002 0.02 0.05 0.005水分和雜質(zhì) 達到100％洗滌劑實施例VI以下顆粒洗滌劑根據(jù)本發(fā)明制備A B C D E F G H基礎(chǔ)顆粒STPP - 22.0 - 15.0 - 22.0- 15.0沸石A 30.0- 24.0 5.030.0 - 24.0 5.0硫酸鹽5.5 5.07.07.05.55.0 7.07.0MA/AA3.0 12 - 6.0- 3.012.02.06.0LAS 14.010.0 9.020.0 14.0 10.09.020.0
C45AS 8.07.09.07.08.07.09.07.0C45AE11S - 1.0- 1.0- 1.0- 1.0MES0.54.06.0- 0.54.06.0-SADS 2.5- - 1.02.5- - 1.0硅酸鹽 - 1.00.510.0 - 1.00.510.0皂 - 2.0- - - 2.0- -增白劑 0.20.20.20.20.20.20.20.2碳酸鹽 6.09.08.010.0 6.09.08.010.0PEG4000- 1.01.5- - 1.01.5-DTPA - 0.4- - - 0.4- -噴涂到C25E9 - - - 5.0- - - 5.0C45E7 1.01.0- - 1.01.0- -C23E9 - 1.02.5- - 1.02.5-香料 0.20.30.3- 0.20.30.3-干燥添加劑碳酸鹽 5.010.0 13.0 8.05.010.0 13.0 8.0PVPVI/PVO 0.5- 0.3- 0.5- 0.3-酶 0.04 0.03 0.03 .040.04 0.03 0.03 0.01本發(fā)明的酶 0.001 0.02 0.03 0.015 0.001 0.02 0.03 0.015DTPA 0.50.30.51.00.50.30.51.0PB15 3.010 4.05 3.010 4.0NOBS/TAED 0.50.30.50.60.50.30.50.6硫酸鹽 4.05.0- 5.04.05.0- 5.0SRP- 0.4- - - 0.4- -顆粒泡沫抑制劑 - 0.5- - - 0.5- -染斑(speckle) 0.9- 2.71.20.9- 2.71.2水分和雜質(zhì) 達到100％
洗滌劑實施例VII以下液體洗滌劑制劑根據(jù)本發(fā)明制備A B C D ELAS 11.59.0- 4.0-C25E2.5S - 3.018.0- 16.0C45E2.25S11.53.0- 16.0 -C23E9- 3.02.0 2.01.0C23E73.2 - - - -CFAA - - 5.0 - 3.0TopPalmKernel脂肪酸 2.0 - 2.0 0.52.0檸檬酸(50％) 6.5 1.02.5 4.02.5Ca和/或Ca甲酸鹽 0.6 0.70.2 0.05 0.05SCS 4.0 1.03.0 1.2-硼酸鹽 0.6 - 3.0 2.03.0氫氧化鈉 6.0 2.03.5 4.03.0乙醇 2.0 1.04.0 4.03.01，2-丙二醇 3.0 2.08.0 8.05.0一乙醇胺 3.0 1.51.0 2.51.0TEPAE2.0 - 1.0 1.01.0本發(fā)明的酶 0.001 0.002 0.010.01 0.005酶 0.030.01 0.030.02 0.02SRP 0.2 - 0.1 - -DTPA - - 0.3 - -PVNO - - 0.3 - 0.2增白劑 0.2 0.07 0.1 - -泡沫抑制劑 0.040.02 0.1 0.10.1雜質(zhì)和水洗滌劑實施例VIII本發(fā)明強效液體織物洗滌劑組合物可如下制備A B酸形式的LAS - 25.0檸檬酸 5.02.0酸形式的25AS8.0-酸形式的25AE2S 3.0-25AE7 8.0-CFAA5 -DETPMP 1.01.0脂肪酸 8 -油酸- 1.0乙醇4.06.0丙二醇 2.06.0本發(fā)明的酶 0.10 0.05椰油烷基二甲基羥乙基銨氯化物- 3.0綠土粘土- 5.0PVP 2.0-水/微量物質(zhì) 達到100％洗滌劑實施例IX本發(fā)明強效液體織物洗滌劑組合物可如下制備A B CC25AES18.0 15.014.0LAS 5.85.0 4.0C810胺1.42.0 -NI24-72.82.0 3.0檸檬酸2.53.0 3.0
脂肪酸8.5 3.0 3.0酶0.020.020.006硼酸 2.0 2.0 2.0乙氧基化四亞乙基五胺0.9 1.0 1.0聚乙烯亞胺乙氧基化物0.7 - 1.0DETPMP0.3 - -HEDP 0.35- -乙醇 1.0 3.0 3.01，2-丙二醇 8.0 4.0 5.0MEA 9.8 2.0 2.0NaCS 2.0 - -泡沫抑制劑0.250.010.01微量物質(zhì)(香料、增白劑等)和水 達到100％洗滌劑實施例X以下舉例說明適合用于洗碗機的本發(fā)明片狀洗滌劑。
A B C D E F第一相STPP 5.09.6 10.07.106.011.5硅酸鹽1.70.671.6 1.0 1.02.4SKS-6 2.51.5 - 2.3 2.25碳酸鹽5.00 2.743.5 3.594.10 5.25HEDP 0.25 0.180.180.280.28 0.28PB1 3.52.452.453.683.68 3.68PAAC 0.002 0.002 0.002 0.003 0.004 0.004檸檬酸- 0.5 - 0.2 - -
纖維素 - - 0.65 0.8 - -酶 0.010.008 0.008 0.020.010.01非離子表面活性劑 0.900.800.80 1.201.201.20PEG4000 0.4 0.360.26 0.380.390.39BTA 0.010.040.04 - 0.060.06石蠟 0.160.170.10 0.150.150.15香料 0.020.020.02 0.013 0.013 0.013硫酸鹽 - - - 0.502 0.052.838總量19.65g 19.7g 19.77g 21.54g 19.43g 28.0g第二相酶 0.030.030.03 0.030.030.03本發(fā)明的酶 0.010.020.005 0.001 0.003 0.005檸檬酸和/或檸檬酸鹽 0.3 0.200.30.3 0.200.3氨基磺酸 - 0.30- - 0.30-二碳酸鹽 0.920.250.45 1.090.300.45碳酸氫鹽 - 0.55- - 0.55-硅酸鹽 - - 0.64 - - 0.64CaCl2- 0.07- - 0.07-PEG400 0.15- - - - -PEG4000 0.080.060.06 0.060.060.06總量2.0g2.0g2.0g 2.0g2.0g2.0g
洗滌劑實施例XI以下舉例說明適合用于洗碗機的本發(fā)明液體洗滌劑組合物
序列表序列表<110>諾和酶股份有限公司<120>包含枯草桿菌果膠酸裂解酶的洗滌劑組合物<130>10171.204-WO<160>19<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1200<212>DNA<213>枯草桿菌(Bacillus subtilis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1200)<223>
<400>1gct gat tta ggc cac cag acg tta gaa tca aat gat ggc tgg ggc gcg 48Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Glu Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala1 5 10 15tac tcg acc ggc aca aca ggc gga tca aaa gct tcg tca tcc cac gtg 96Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser His Val20 25 30tat acc gtc agc aac aga aac cag ctt gtc tcg gca tta ggc aag gac144Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Asp35 40 45acc aac aca acg cca aaa atc att tat att aag gga acg att gac atg192Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met50 55 60aac gtc gat gac aat ctg aag ccg ctt ggt cta aat gat tat aaa gat240Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp65 70 75 80cca gag tac gat ttg gac aaa tat ttg aaa gcc tat gac cct agc aca288Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr85 90 95tgg ggc aaa aag gag ccg tcg ggg aca cta gaa gag gcg aga gca cga336Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Leu Glu Glu Ala Arg Ala Arg100 105 110tct cag aaa aat caa aaa gca cga gtc atg gtg gat att ccg gca aac384Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn115 120 125acg acg atc gtc ggt tca ggg aca aat gcc aaa atc gtg ggc gga aat432Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ile Val Gly Gly Asn130 135 140
ttc cag atc aag agt gat aat gtc atc atc cgc aac atc gaa ttc cag480Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln145 150 155 160gat gct tat gat tat ttt ccg caa tgg gat ccg act gac ggc agc tca528Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser165 170 175gga aac tgg aac tca caa tac gac aac atc aca ata aac ggc ggc acg576Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr180 185 190cat ata tgg att gat cat tgt aca ttt aat gac ggt tcc cgt ccg gac624His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp195 200 205agc aca tcg cca aag tat ttc ggc aga aaa tat cag cac cat gac ggc672Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly210 215 220caa acc gat gct tct aac ggc gct aac tat atc acg atg tct tac aac720Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn225 230 235 240tat tat cac gat cat gat aaa agc tcc att ttc gga tca agc gac agc768Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser245 250 255aaa aca tct gat gac ggc aaa tta aaa atc acg ctc cat cat aac cgc816Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg260 265 270tat aaa aat atc gtc cag cgc gca ccg aga gtc cgc ttc ggg cag gtg864Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val275 280 285cac gtt tac aac aac tat tat gaa ggc agc aca agc tcc tcg gat tat912His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asp Tyr290 295 300gcc ttc agc tat gcg tgg gga atc gga aaa tca tct aaa atc tac gct960Ala Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala305 310 315 320caa aac aat gtc att gac gtg cct gga ctg tca gcc gct aaa acg atc 1008Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile325 330 335agc gta ttc agc ggg gga acg gct tta tat gac tca ggc aca ttg ctg 1056Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu340 345 350aat ggc acg cag atc aac gca tcg gct gca aac ggg ctg agt tct tct 1104Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser355 360 365gtc ggc tgg aca ccg tct ctg cac ggc aca atc gat gct tcc gcg cat 1152Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ala His
370 375 380gta aaa tcg aat gtt ata tct caa gcg ggt gcg ggt aaa tta aat taa 1200Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn385 390 395<210>2<211>399<212>PRT<213>枯草桿菌<400>2Ala Asp Leu Gly His Gln Thr Leu Glu Ser Asn Asp Gly Trp Gly Ala1 5 10 15Tyr Ser Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ser Lys Ala Ser Ser Ser His Val20 25 30Tyr Thr Val Ser Asn Arg Asn Gln Leu Val Ser Ala Leu Gly Lys Asp35 40 45Thr Asn Thr Thr Pro Lys Ile Ile Tyr Ile Lys Gly Thr Ile Asp Met50 55 60Asn Val Asp Asp Asn Leu Lys Pro Leu Gly Leu Asn Asp Tyr Lys Asp65 70 75 80Pro Glu Tyr Asp Leu Asp Lys Tyr Leu Lys Ala Tyr Asp Pro Ser Thr85 90 95Trp Gly Lys Lys Glu Pro Ser Gly Thr Leu Glu Glu Ala Arg Ala Arg100 105 110Ser Gln Lys Asn Gln Lys Ala Arg Val Met Val Asp Ile Pro Ala Asn115 120 125Thr Thr Ile Val Gly Ser Gly Thr Asn Ala Lys Ile Val Gly Gly Asn130 135 140Phe Gln Ile Lys Ser Asp Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile Glu Phe Gln145 150 155 160Asp Ala Tyr Asp Tyr Phe Pro Gln Trp Asp Pro Thr Asp Gly Ser Ser165 170 175Gly Asn Trp Asn Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Thr Ile Asn Gly Gly Thr180 185 190His Ile Trp Ile Asp His Cys Thr Phe Asn Asp Gly Ser Arg Pro Asp195 200 205Ser Thr Ser Pro Lys Tyr Phe Gly Arg Lys Tyr Gln His His Asp Gly210 215 220Gln Thr Asp Ala Ser Asn Gly Ala Asn Tyr Ile Thr Met Ser Tyr Asn225 230 235 240
Tyr Tyr His Asp His Asp Lys Ser Ser Ile Phe Gly Ser Ser Asp Ser245 250 255Lys Thr Ser Asp Asp Gly Lys Leu Lys Ile Thr Leu His His Asn Arg260 265 270Tyr Lys Asn Ile Val Gln Arg Ala Pro Arg Val Arg Phe Gly Gln Val275 280 285His Val Tyr Asn Asn Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Ser Ser Ser Asp Tyr290 295 300Ala Phe Ser Tyr Ala Trp Gly Ile Gly Lys Ser Ser Lys Ile Tyr Ala305 310 315 320Gln Asn Asn Val Ile Asp Val Pro Gly Leu Ser Ala Ala Lys Thr Ile325 330 335Ser Val Phe Ser Gly Gly Thr Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Thr Leu Leu340 345 350Asn Gly Thr Gln Ile Asn Ala Ser Ala Ala Asn Gly Leu Ser Ser Ser355 360 365Val Gly Trp Thr Pro Ser Leu His Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ala His370 375 380Val Lys Ser Asn Val Ile Ser Gln Ala Gly Ala Gly Lys Leu Asn385 390 395<210>3<211>6661<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>質(zhì)粒pMOL995<400>3gaattcctta gtgctttcat agattaaact cacatcacgc tttaaatcgc ttattttaga 60ctttaaagac ttgttttctt caagcaactc attataatca tttacatttt cattaaatcg 120ctctacaaga ccactatatt tttctttaac ttgcccatgt tctttactta attttttata 180ttctctcgcc atatcagtac tcatgagatt tctaacatgc tgttttaacc tatcgttatc 240tctcgcagca gtcactaagt ttttataatc acgctccgat ataacaacat ttttggttgg 300tttcttttct gttttcatta tttcttttcc caaaccaaac atggactttt cacccgttgg 360cacttcaaca cttttcatgt gtcgtttcgc tggtacttct aaatctgatt taactttatc 420gctataagca gtccattcat cttttttaac tgctaaattt ttttctagaa aatcaatctc 480tttttccaaa gtttgttttt taaatttagc tgtctcaata tgtttacggt cagagccacg 540ttcaccacgc ttcaactcaa aaccctgttt tttcatatgc tcggggaatt tatcttgtag 600
ccataacagt tcttgacgat taaacacatt ttttccttgc agttttccat cacgcatagg 660cacaacacct aaatgcatgt gaggggtttg ctcatcatta tgaactgttg cataagcaat 720attttgcttg ccatatcgtt cggaaaataa tttataactt tcctcaaaaa atcgtttttg 780ttctcctgga tccagttgct caaaaaaatc tcggtcagat gttactagca actcatttac 840aagaacagca tctttcctcg tttttcttgt acctgttttt tgtgattcaa taatttcttt 900gacacgttcg ttgtaatcaa tatttttatc atttttcaaa tcataatttt cacgtgttcg 960ctcatggtca atatcatcat tcgttctact ttttcgctct ctttgattat gaaattgcat1020gccttttagt ccagctgatt tcactttttg cattctacaa actgcataac tcatatgtaa1080atcgctcctt tttaggtggc acaaatgtga ggcattttcg ctctttccgg caaccacttc1140caagtaaagt ataacacact atactttata ttcataaagt gtgtgctctg cgaggctgtc1200ggcagtgccg accaaaacca taaaaccttt aagacctttc ttttttttac gagaaaaaag1260aaacaaaaaa acctgccctc tgccacctca gcaaaggggg gttttgctct cgtgctcgtt1320taaaaatcag caagggacag gtagtatttt ttgagaagat cactcaaaaa atctccacct1380ttaaaccctt gccaattttt attttgtccg ttttgtctag cttaccgaaa gccagactca1440gcaagaataa aatttttatt gtctttcggt tttctagtgt aacggacaaa accactcaaa1500ataaaaaaga tacaagagag gtctctcgta tcttttattc agcaatcgcg cccgattgct1560gaacagatta ataatagatt ttagcttttt atttgttgaa aaaagctaat caaattgttg1620tcgggatcaa ttactgcaaa gtctcgttca tcccaccact gatcttttaa tgatgtattg1680gggtgcaaaa tgcccaaagg cttaatatgt tgatataatt catcaattcc ctctacttca1740atgcggcaac tagcagtacc agcaataaac gactccgcac ctgtacaaac cggtgaatca1800ttactacgag agcgccagcc ttcatcactt gcctcccata gatgaatccg aacctcatta1860cacattagaa ctgcgaatcc atcttcatgg tgaaccaaag tgaaacctag tttatcgcaa1920taaaaaccta tactcttttt aatatccccg actggcaatg ccggggcggc cgacatacat1980tcgctttgcc ccaccgggtc cgtctgttat taatgccgcc aaacctgaat ttgcaaccga2040gctgtcgcct tcccttgtcc agccgacaat gtcatggtgg tcgaaataat catgctgtgc2100tccgtacgca tactgttttc tcgcttttaa gatcggttca attttgtgtt tcaaggcagg2160aatttcgcgc tgggagtctc ctttcgtccc gtacatatcc ccgtagaaaa cctgagggta2220tccagattcc cttgtgagaa taaaagcgta agcaagcggc ttaaaccatg tttggacagt2280cgaccccttc cctcttatcc aacctttatt gcttcaccca aaccgaaacg gaccctccat2340
taacagagaa attaccccat ccgtctgcat taattgtgac ggtgcctgtc ctatttccgg2400taatatctct ccaaacttgt cccgctttat ttttccccac atacatccat ttgttaccac2460ctggaccatc tgacataatg gtggcaaggc ctgaatttgg atgggagcta tttccctctc2520ttgtccaacc gataatatca tgatgatcaa agtaatcatg ctgcgtacca taggcaaaag2580tttgacgtgc ctgcagaaga gggtctattt tagatttcat agccggaaca ccatgggttg2640ggataccgta gtaatcccca taaaatacgg aaggataacc ttgttccctt gtcagaacca2700atgcatatgc aagtggttta aaccattgtt gaacaaagga ttccaatgct tccccgggct2760gagaatcatg gttatcaaca aaagtaacgg catgtgttgg atgtttttgc accacagaac2820catttaaaat atttctcata tcataataac caccgctatt agatgcattg tacaaattat2880agtggagagg aacatcaaac accgagtgat tccaacttgt tttattcaaa tagttttcaa2940ttgcaccaag gtcatttttc caaaactcag ccactgcaaa cattggttta cctgtggtgt3000tacgcacatg tgtaagccaa tctctcgtaa agctatattt tatatgtttc actgcatcta3060ttctaaatcc atcaaggttc agtgtattcg tataccacac tccccagttt ctaagttcat3120gtattacttc tgggtgatcc atatccacgt ctgcatacat aagatagtca tagttgccat3180tctctgtatc gacttcccag tcccaggcct tgcctgttcc cctgaattta tatattttgt3240tttgaagctg gcgtgactga tcccaatctg tcccatcaaa atgataccag cgccacttaa3300agctggaatg gttatttcct cttccaggaa aatcaaactt tgtccacgct tctattgcat3360actctcctga ggtttcctgg tttcggttgc tccgattcac ttctaccgca tttacaattt3420ccgtaccatc tgctccacct ttatgattca tgacgacatc accatatacc tgaatgccgt3480tattttttaa agaggtcacc gcagcctgta gctggttgcg tgttccatat tttgtacgaa3540ccgtcccctt ctggttaaac tctccaagat catataaatc ataggctcca taacctacat3600cattctggga agtccccttc catgcaggtg ggatccatac agctgttatc cctttactct3660ttaagttagc tgcgtcatcc ctcaacctgt tccaatgatt cccgtcattt ggcaaatacc3720attcgaaata ttgcatcata gtaccatttg ttccattatg atgggccgcg gatgtttttg3780taatcggcaa actgacaaat aacagcgtgc acataagcac aagtctgaac gaaactgtcc3840gctttcgttt ttgaatcatg tttcctctcc ctctcatttt cttatacaaa ttatatttta3900catatcagta aaataataac aacccccctt tattccttat ttttacacag cggacagtct3960ggacagcata aaaaataccc tgtctgatga cagacaaggt atttttatgg tcttcttctt4020ttctcaaaca atcgatccac ttcttcagcc aaatcatcag tcatcaagag ctcccgggat4080agactgtaac attctcacgc ataaaatccc ctttcatttt ctaatgtaaa tctattacct4140
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<223>引物F
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<223>引物G<400>12aacagctgat cacgactgat cttttagctt ggcac 35<210>13<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>引物J<400>14cattctgcag ccgcggcagc tgatttaggc caccagacg39<210>15<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.一種洗滌劑組合物，其包含表面活性劑和果膠酸裂解酶(EC 4.2.2.2)或它的穩(wěn)定化變體，其中所述果膠酸裂解酶由枯草桿菌菌株的內(nèi)源DNA序列編碼。
2.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽由獲得自枯草桿菌DSM 14218的DNA序列編碼。
3.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽由包含SEQ IDNO1的1-1197位的DNA序列編碼。
4.如權(quán)利要求1所述的洗滌劑組合物，其中所述多肽是包含SEQ IDNO1的1-1197位的DNA序列編碼的果膠酸裂解酶的穩(wěn)定化變體。
5.如前述權(quán)利要求任意一項的洗滌劑組合物，其中果膠酸裂解酶按純酶占整個組合物的重量百分?jǐn)?shù)計算，以0.0001％到2％，優(yōu)選0.0005％到0.5％，更優(yōu)選0.001％到0.02％的水平存在。
6.如前述權(quán)利要求任意一項的洗滌劑組合物，其還包含一種或多種選自以下的酶蛋白酶、纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角質(zhì)酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果膠裂解酶、其它甘露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、和它們的混合物。
7.如前述權(quán)利要求任意一項的洗滌劑組合物，其還包含漂白劑，優(yōu)選大多環(huán)剛性配體的過渡金屬絡(luò)合物、過氧化氫釋放劑與4-[N-(壬?；?氨基己酰氧基]-苯磺酸鈉的組合和/或它們的混合物。
8.如前述權(quán)利要求任意一項的洗滌劑組合物，其中表面活性劑是陰離子表面活性劑，其含量不超過洗滌劑組合物總重量的30％，優(yōu)選10％到25％。
9.用如前述權(quán)利要求任意一項的洗滌劑組合物清潔織物、碗盤或硬表面以獲得優(yōu)良的清潔性能的方法。
10.如前述權(quán)利要求任意一項的洗滌劑組合物在織物清潔和/或織物去污和/或織物白度保持和/或織物軟化和/或織物顏色顯現(xiàn)和/或織物染料轉(zhuǎn)移抑制中的用途。
11.如權(quán)利要求1-8任意一項的洗滌劑組合物在清潔硬表面如地板、墻壁、浴室瓷磚和類似物中的用途。
12.如權(quán)利要求1-8任意一項的洗滌劑組合物在手洗和機洗碗盤中的用途。
13.如權(quán)利要求1-8任意一項的洗滌劑組合物在口腔和/或牙齒應(yīng)用中的用途。
14.具有果膠酸裂解酶(EC 4.2.2.2)活性的多肽，該多肽選自以下之一(a)由SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列編碼的多肽；(b)通過將含有SEQ ID NO1的1-1197位的DNA序列的細胞在可表達該DNA序列的條件下進行培養(yǎng)而產(chǎn)生的多肽；(c)(a)或(b)的多肽的定點變體，該變體通過改變一、二、三、四或五個氨基酸殘基為其它氨基酸殘基已獲得穩(wěn)定化。
15.如權(quán)利要求14的多肽，該多肽獲得自或可獲得自細菌，優(yōu)選屬于枯草桿菌種的菌株，優(yōu)選枯草桿菌DSM 14218。
16.如權(quán)利要求14的多肽，該多肽是分離的且不含有同源雜質(zhì)。
17.一種酶制品，其包含如權(quán)利要求14-16任意一項的酶和常規(guī)的填充劑或穩(wěn)定劑。
18.如權(quán)利要求17的制品，其還包含一種或多種選自以下的酶蛋白酶、纖維素酶(內(nèi)切葡聚糖酶)、β-葡聚糖酶、半纖維素酶、脂肪酶、過氧化物酶、漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角質(zhì)酶、果膠酶、還原酶、氧化酶、酚氧化酶、木質(zhì)素酶、支鏈淀粉酶、果膠酸裂解酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、果膠乙酰酯酶、聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸聚糖酶、果膠裂解酶、其它甘露聚糖酶、果膠甲酯酶、纖維二糖水解酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、和它們的混合物。
19.編碼具有果膠酸裂解酶活性的多肽的分離的多核苷酸分子，該多核苷酸分子在中度嚴(yán)格條件下與變性的雙鏈DNA探針雜交，其中該探針選自包含SEQ ID NO1的1-1197位所示序列的DNA探針和包含SEQ IDNO1的1-1197位的子序列的DNA探針，該子序列具有至少約100個堿基對的長度。
20.表達載體，其包含如下可操作地連接的元件轉(zhuǎn)錄啟動子；選自(a)包含SEQ ID NO1第1-1197位核苷酸所示的核苷酸序列的編碼具有果膠酸裂解酶活性的多肽的多核苷酸分子和(b)(a)的簡并核苷酸序列的DNA片段；和轉(zhuǎn)錄終止子。
21.已導(dǎo)入權(quán)利要求20的表達載體的培養(yǎng)細胞，其中所述細胞表達該DNA片段編碼的多肽。
22.生產(chǎn)具有果膠酸裂解酶活性的多肽的方法，該方法包括培養(yǎng)已導(dǎo)入權(quán)利要求20的表達載體的細胞，由此所述細胞表達該DNA片段編碼的多肽；和回收該多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及洗滌劑組合物，該組合物包含表面活性劑和果膠酸裂解酶(EC 4.2.2.2)或它的穩(wěn)定化變體，所述果膠酸裂解酶由枯草桿菌菌株的內(nèi)源DNA序列編碼，該洗滌劑組合物提供優(yōu)良的清潔和去污性能。
文檔編號C11D3/386GK1527877SQ02809936
公開日2004年9月8日 申請日期2002年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月14日
發(fā)明者M·B·埃斯克隆, M·許萊因, V·S·尼爾森, J·斯梅茨, M B 埃斯克隆, 反, 尼爾森, 騁 申請人:諾和酶股份有限公司