專利名稱：花生四烯酸及其生產(chǎn)和使用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及花生四烯酸的生產(chǎn)，含有花生四烯酸的組合物及其用途。
背景技術：
花生四烯酸(ARA)是ω6類長鏈聚不飽和脂肪酸(PUFA)(5，8，11，14-二十碳四烯酸，204)。ARA是人體中含量最豐富的C20PUFA。它主要存在于器官、肌肉和血液組織中，在血液、肝臟、肌肉和其它器官系統(tǒng)中作為主要與磷脂結合的結構脂類起著重要作用。除了主要的結構脂類作用之外，ARA還是許多循環(huán)二十烯酸衍生的生物活性物質(zhì)(eicosenoid)，例如前列腺素E2(PGE2)，前列腺環(huán)素(PGI2)，血栓烷A2(TxA2)，和白細胞三烯leukotireneB4(LTB4)和C4(LTC4)的直接前體。這些eicosenoid具有對脂蛋白代謝，血液流變學，血管彈性，白細胞功能和血小板激活的調(diào)節(jié)作用。
盡管ARA對人體很重要，但是它不能在體內(nèi)從頭合成。ARA是通過必需脂肪酸亞油酸(LOA)的延長和去飽和來合成的。該過程需要酶Δ6-去飽和酶的存在，該酶在人體內(nèi)含量很低，Burre等，脂類(Lipids)，25354-356(1990)。所以，大多數(shù)ARA必須靠飲食提供，這一點在身體的快速成長期，例如嬰兒期，尤為重要。
嬰兒在第一年中其體重可增至2至3倍。所以，需要大量的飲食ARA。為了滿足這一需要的增長，母乳中含有大量的ARA。Sanders等，美國臨床營養(yǎng)學雜志(Am.J.Clin.Nutr.)，31805-813(1978)。ARA是母乳中主要的C20PUFA。那些母乳喂養(yǎng)嬰兒的母親，尤其是素食主義者其嬰兒可以通過附加的飲食ARA獲益。但是，許多母親不進行母乳喂養(yǎng)，或者不在整個嬰兒快速成長期進行母乳喂養(yǎng)，而選擇使用嬰兒配方食物。
在本申請人所知的市售嬰兒配方食物中都不含甘油三酯形式的ARA。再次引用參考的US4,670,285(Clandinin等)揭示了嬰兒對包括ARA在內(nèi)的脂肪酸的需求。為了提供這些脂肪酸，Clandinin等提出了一種蛋黃、魚油或血紅細胞磷酸酯和植物油的混合物，以此作為一種建議嬰兒配方食物。但是，魚油中含有大量的二十碳五烯酸(EPA)。已知EPA在嬰兒體內(nèi)抑制ARA的合成。Carlson等，INFORM，1306(1990)。所以，最好能夠提供ARA但不提供EPA。此外，蛋黃中的ARA含量較低，所以，Clandinin等的混合物在經(jīng)濟上并不可行。
由于ARA存在于動物油而不是植物油中，其工業(yè)量的生產(chǎn)仍然是一個希望但困難的目標。Shinmen等在微生物技術(Microbiol.Biotech.)3111-16(1989)中報道，利用常規(guī)的攪拌罐發(fā)酵，由一種分離出的真菌高山被孢霉(Morrierella alpina)生產(chǎn)ARA。(參見Shinmen等的日本專利1,215,245)。在培養(yǎng)之后，收獲微生物，干燥后用有機溶劑從真菌生物質(zhì)中萃取脂類，然后對脂類進行化學(共價)改性。例如，水解脂類混合物或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為醚酯，然后與環(huán)糊精混合，再用作食物補充。Shinmen等并沒有說明或建議使用未經(jīng)改性的微生物脂類。
Porphyridium cruentum，一種紅色的微藻，可以在池塘中大量種植，而且其脂含量中含有多至40％的ARA。Ahern等，生物技術與生物工程(Biotech.Bioeng)251057-1070(1983)。不巧的是，這些ARA主要與半乳糖脂結合，這是一種母乳中沒有的復合極性脂。這樣，不僅生成的可利用ARA僅占生物量的1％，而且ARA的形式如果不經(jīng)改性不適合用作嬰兒配方食物的添加劑。
US4,870,011(Suzuki等)公開了從被孢霉屬(Mortierella屬)真菌中獲得例如γ-亞油酸之類的脂類的方法。從真菌中含有的脂類混合物中純化得到γ-亞油酸。
DE3603000A1(Milupa)公開了一種高聚不飽和脂肪酸混合物，及其作為嬰兒配方食物中脂肪組份的用途。這種脂肪混合物中含有高含量的ARA和二十二碳六烯酸(DHA)，兩者之比為2.5∶1，還有大量膽固醇。列舉的脂肪酸來源是某些類型的巨藻，魚油，來自牛肉和豬肉的器官脂肪或高度提純的蛋黃油。DHA和ARA的一種來源據(jù)說是褐藻門和紅皂門的巨藻。從未有人提出將微生物用作油脂來源。藻類和魚油通常也含有抑制ARA體內(nèi)合成的EPA。此外，高度提純的蛋黃油并不是一種經(jīng)濟的ARA來源。而且，其中沒有有關用于補充已有嬰兒配方食物的含高濃度ARA添加劑的內(nèi)容。
所以，一直以來需要一種經(jīng)濟的，工業(yè)上可行的，最好不含EPA副產(chǎn)物的ARA生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的之一是滿足這一需求。
本發(fā)明的目的之二是提供用于嬰兒配方食物的添加劑和這種添加劑的來源，用以使這些配方食物中的ARA含量接近母乳中的含量。
本發(fā)明另一目是提供含ARA的真菌油，可用在腸用，非腸用或皮膚用產(chǎn)品中。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含花生四烯酸的真菌油(ARASCO)的生產(chǎn)與使用，以及含有這類油的組合物。可將這類油稱為單細胞油。在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)真菌，收獲真菌并萃取和回收油脂。這些油不需要進一步的化學改性即直接用于為需要ARA的人，包括新生兒，孕婦或哺乳期婦女，或是表現(xiàn)出ARA不足性疾病的人提供補充的ARA。本發(fā)明的優(yōu)點在于生產(chǎn)方便，純度高，而且沒有檢知量的EPA。
優(yōu)選實施方式的詳細說明“ARA”和“EPA”在本文中還分別指花生四烯酸和二十碳五烯酸的殘基，當這些殘基與甘油經(jīng)酯化反應成為脂肪酰甘油三酯或磷酸酯的組成部分時。在本文中，當將組合物用作營養(yǎng)補充時，其中EPA的殘留含量低于會抑制ARA合成的含量，則該組合物“基本上不含EPA”。本發(fā)明能夠提供經(jīng)濟的花生四烯酸(ARA)來源。
在一種實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)含花生四烯酸而基本上不含二十碳五烯酸(EPA)的真菌油(ARASCO)的方法。本文中，“基本上不含”指在油脂中，EPA的含量低于ARA含量的約1/5。這種油，單細胞油，可以以非改性形式直接使用。本文中，“非改性”指沒有共價改變脂肪酸或油本身的化學特性。這樣，例如對ARASCO或ARA的臨時改性，這種臨時改性能夠在油脂被吸收時恢復，也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的非改性真菌油提供的甘油三酯其脂肪酸殘基中相對較多的是ARA(至少40％的脂肪酸殘基是ARA為宜，50％更好)，ARA與EPA殘基之比也很高(至少5∶1，至少20∶1更好，w/w)。在本發(fā)明之前，還從未有過這種來自天然來源的油脂的報道。雖然如此組成的甘油三酯可以化學合成(例如，通過ARA高含量的游離脂肪酸混合物的酯化反應，或以這些脂肪酸混合物的乙酯進行轉(zhuǎn)酯反應)，對這些脂肪酸混合物的操作(例如純化，酯化等)會引入不需要的副產(chǎn)物。相反，本發(fā)明的方法能夠通過從天然來源中萃取來提供具有要求組成的甘油三酯。
表1.幾種真菌菌屬的脂肪酸組成
大多數(shù)其脂肪酸已經(jīng)鑒定過的真菌種類被發(fā)現(xiàn)不生產(chǎn)ARA。Weete，J.D.，真菌脂類的生物化學(Fungal Lipid Biochemistry)，Plenum Press，N.Y.(1974)。那些生產(chǎn)ARA的真菌種類中，包括先前鑒定的腐霉屬在內(nèi)的許多除ARA之外還生產(chǎn)大量的二十碳五烯酸(EPA)。表1給出了P.insidiosum和其它真菌的脂肪酸結構。出乎意料的是，P.insidiosum能夠生產(chǎn)的ARA不含EPA副產(chǎn)物。至于魚油，食物補充中的高含量EPA將導致對從飲食來源亞油酸(LOA)形成ARA能力的抑制。所以，雖然在本發(fā)明方法中可以使用同時生產(chǎn)ARA和EPA的真菌，但是以使用不產(chǎn)生大量EPA的真菌種類為佳。這些較好的菌種包括Pythium insidiosum和高山被孢霉。以上兩種都是能夠購買到的，而且保藏在Rockville，Maryland的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collective)，保藏號分別為28251和42430。在本文中，P.insidiosum和高山被孢霉被用作代表性的真菌種類。當然，如本文所述生產(chǎn)含ARA和少量EPA甘油三酯的其它真菌種類也在本發(fā)明考慮范圍內(nèi)。
本發(fā)明實施方式克服的主要問題之一是飲食來源EPA含量提高在兒童體內(nèi)引起的ARA生物合成抑制。這一問題可以通過提供ARA含量基本與母乳中相同的嬰兒配方食物來解決。在母乳中，ARA∶EPA之比典型地為約20∶1。本發(fā)明特別考慮了任何一種可提供足量ARA來克服食物EPA副作用的微生物油。較好的是，使用含ARA的油使得ARA∶EPA之比至少約5∶1。更好的是，至少約10∶1，最好至少約20∶1?？梢?，與EPA含量相比，最終成品中的ARA含量越高，結果越理想。
在本發(fā)明方法中，在適合于生產(chǎn)含ARA油的條件下培養(yǎng)真菌。一般，真菌培養(yǎng)技術是本領域技術人員所熟知的，這些技術可以用于本發(fā)明方法。例如，可以在搖瓶中進行真菌接種量的深層培養(yǎng)。搖瓶中裝有生長培養(yǎng)基，植入真菌菌絲，在往復式搖床上培養(yǎng)約3至4天。
生長培養(yǎng)基的組成可以不相同，但都含有碳源和氮源。較好的碳源是葡萄糖，其含量在約每升培養(yǎng)基10-100克。對于搖瓶培養(yǎng)，通常使用約15g/l。用量可隨要求的最終培養(yǎng)物密度而不同。可以使用的其它碳源包括糖蜜，高果糖玉米糖漿，水解淀粉或其它用于發(fā)酵的低成本常規(guī)碳源。此外，乳糖可用作P.insidiosum的碳源。這樣，乳清，作為一種富含乳糖的低成本碳源可被用作底物。本領域熟練技術人員很容易確定這些碳源的合適用量。通常，在培養(yǎng)過程中需要另外加入碳源。這是因為微生物對碳的消耗量很大，以致于一次性加入全部碳源是不可行的。
氮源的提供通常為酵母提取物，其濃度為約每升生長培養(yǎng)基2至15克提取物。較好的是，提供約4g/l?？梢允褂闷渌矗?，胰化蛋白胨，玉米浸出液，大豆粉，植物蛋白水解物等。本領域熟練技術人員很容易確定這些氮源的加量。氮源可以成批加入，即在培養(yǎng)前一次性全部加入。
在適宜溫度下，典型的是25至30℃培養(yǎng)3至4天后，長出的真菌量足以用作常規(guī)攪拌發(fā)酵罐(STF)的接種物。這種發(fā)酵罐是本領域技術人員已知的，而且是可以購買的?？梢园捶峙?、半連續(xù)或連續(xù)發(fā)酵模式進行發(fā)酵。較好的是，STF配有船用攪拌槳，但也可使用Rushton式渦流攪拌槳。
添加要求的碳源和氮源來準備發(fā)酵罐。例如，可通過每升自來水混合以50克葡萄糖和15克酵母來準備1.5升發(fā)酵罐。如前所述，可以使用其它碳源和氮源及其混合物。
含有營養(yǎng)液的反應器需要滅菌，例如通過在接種前的加熱。在冷卻至約30℃后，可以加入接種物，并開始培養(yǎng)。利用空氣噴射來進行氣體交換?？諝獾膰娚渌俣瓤梢圆煌且哉{(diào)節(jié)至約0.5至約4.0VVM(每分鐘單位體積發(fā)酵罐的空氣體積)為宜。較好的是將溶解氧濃度維持在溶液飽和氧濃度的約10％至約50％。所以，在培養(yǎng)過程中可能需要對噴射速度進行調(diào)節(jié)。需要進行攪拌。由攪拌槳進行攪拌。攪拌的槳外緣速度宜設定在約50cm/sec至約500cm/sec，約100至200cm/sec更好。
通常，接種量可以不相同。典型的是使用約2％至約10％體積的接種物。較好的是，可以在發(fā)酵罐中使用約5％體積的種子菌株。
必須對營養(yǎng)物水平進行監(jiān)測。當葡萄糖水平下降至低于5g/l時，應該另外添加葡萄糖。一個典型的培養(yǎng)周期使用每升約100克葡萄糖和約15克酵母提取物。在培養(yǎng)過程中要求將氮源耗盡，因為這樣能夠促進真菌生產(chǎn)油脂。這在以高山被孢霉作為生產(chǎn)微生物時尤為如此。
在一種特別好的實施方式中，可以對包含ARA的油脂含量很高的高山被孢霉使用很高的營養(yǎng)物含量進行發(fā)酵罐培養(yǎng)。出人意料地發(fā)現(xiàn)，可以在發(fā)酵開始時使用高于15g/l酵母提取物所提供的的含氮營養(yǎng)物濃度，只要在發(fā)酵過程中加入的含碳營養(yǎng)物總量也相應較高。含碳營養(yǎng)物總量，宜在發(fā)酵的前25-50％時間內(nèi)連續(xù)或間歇地加入，或者在上述時段內(nèi)的不同時刻等量添加，以相當于每升培養(yǎng)基75-300g葡萄糖(C∶N 5∶1，按w/w葡萄糖∶酵母提取物表示)為宜。在一具體的實施方式中，氮源是大豆粉，加量約每升培養(yǎng)基16克，碳源在開始時的含量相當于約80或80克以上葡萄糖。使用高含量的碳氮營養(yǎng)物時，最好對含有兩種營養(yǎng)物的溶液分別滅菌。還發(fā)現(xiàn)，對于高含量碳源發(fā)酵來說，部分限制氮源，然后在發(fā)酵的過程中連續(xù)，或一次或分多次加入其余氮源能夠提高生物質(zhì)產(chǎn)量。
有時，培養(yǎng)物會產(chǎn)生過量的泡沫?？梢钥蛇x性的添加本領域技術人員熟知的消泡劑，例如Mazu 310R或植物油來防止泡沫。
發(fā)酵溫度可以有所不同。但是，同時生產(chǎn)ARA和EPA的真菌在較高溫度培養(yǎng)時傾向于生產(chǎn)較少的EPA和較多的ARA。例如，高山被孢霉在18℃以下培養(yǎng)時開始產(chǎn)生EPA。所以，宜將溫度維持在誘導ARA優(yōu)先性生產(chǎn)的值。合適的溫度一般為約25℃至約30℃。
較好的是，將培養(yǎng)持續(xù)至要求的生物質(zhì)密度。要求的生物量是約25g/l的微生物。這樣的生物量一般可在接種后48至72小時內(nèi)達到。此時，生物質(zhì)通常含有約5至40％復合脂，即油脂，其中甘油三酯的組成中含約10-40％是ARA殘基，或者至少40％更好，至少50％還要好，此時可以收獲生物質(zhì)。
本發(fā)明的產(chǎn)ARA真菌發(fā)酵可以在約pH5至8的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行。但是，限制培養(yǎng)基的pH而不是任其無限制的上升可以提高高山被孢霉培養(yǎng)物的生物質(zhì)、油和ARA產(chǎn)量。在發(fā)酵過程中維持高氧水平也可以提高產(chǎn)量。在發(fā)酵罐中使用高營養(yǎng)物含量時，對發(fā)酵過程的這些改進尤為有效。
最初的氮源水平超過約15g/l酵母提取物當量，和/或碳源超過約150g/l葡萄糖時，真菌的生長會受到抑制?？梢酝ㄟ^分批發(fā)酵來克服這種生長抑制，例如，將發(fā)酵所需的營養(yǎng)物分成幾份，順次在先前加入的營養(yǎng)物部分或全部被代謝耗盡時先后加入。可以通過只加入碳源來克服生長抑制(參見Shinmen等)。還發(fā)現(xiàn)，可以通過將全部營養(yǎng)物分成等份后在發(fā)酵過程中加入，或連續(xù)加入營養(yǎng)物溶液來獲得上述效果。同樣，還出乎意料地發(fā)現(xiàn)，只在最初碳源水平很高的發(fā)酵反應中加入氮源可以獲得上述效果。
出乎意料的是還發(fā)現(xiàn)，限定發(fā)酵的pH，維持高的氧分壓，或兩者結合可以緩解生長抑制。在高營養(yǎng)物濃度、低pH(pH＝5-6)下進行的高山被孢霉發(fā)酵可促進生物體的生長(同時提高油脂產(chǎn)量)。但是，這種條件下產(chǎn)出的油，其中的ARA殘基含量較低。相反，高pH(pH＝7-7.5)發(fā)酵提高油脂中的ARA含量，但生長情況較差。在較好的方式中，本發(fā)明的方法涉及pH的限定，即pH在發(fā)酵的早期較低而在后期較高。早期包括快速(指數(shù))生長期，該階段中營養(yǎng)物代謝迅速；后期包括穩(wěn)定期，此時，細胞分裂被抑制，通常是由于一種或多種營養(yǎng)物質(zhì)不足，而富含ARA的油脂的生產(chǎn)得以加強?？梢酝ㄟ^在發(fā)酵過程中分兩次或多次調(diào)節(jié)pH水平來進行限定。
類似地發(fā)現(xiàn)，維持培養(yǎng)基中的高溶氧濃度(D.O.)(如，≥40％空氣飽和濃度)能夠緩解高營養(yǎng)物濃度引起的生長抑制和/或提高油脂中的ARA殘基的相對濃度。D.O.可以通過提高罐壓(在發(fā)酵罐頂部壓入更多的空氣)，加強攪拌(提高攪拌槳的外緣速度)，和提高通氣量(即提高給定時間內(nèi)通過發(fā)酵罐的空氣量，通常表示為提高VVM，每分鐘單位發(fā)酵罐體積的空氣量)和/或增加噴射氣體中O2含量。在此條件下的發(fā)酵被發(fā)現(xiàn)提高了碳利用率，結果在發(fā)酵罐中得到較高的生物質(zhì)濃度和較大的富ARA油脂生產(chǎn)能力。具體地說，進行一項或多項上述改進的發(fā)酵可生產(chǎn)至少含40％ARA殘基的可萃取甘油三酯類油脂，至少50％ARA殘基更好。
在特別好的實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基含有相當于≥80g/L葡萄糖的碳源和相當于≥16g/L酵母提取物的氮源，滅菌后將培養(yǎng)基調(diào)至pH5至6之間。接種后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH等于或略高于最初的水平。當碳源水平下降至≤60g/L葡萄糖當量時(通常約48小時后)，將pH調(diào)節(jié)的設定值改為pH≥6。在耗氧速度(和/或二氧化碳釋放速度CER)達到或接近最大時(通常約72小時后)，以約0.1pH/小時的速度將設定值升高至pH6.5至pH7之間。然后在發(fā)酵的最后階段，將pH控制在約pH＝7-7.5以下。
對這一實施方式來說，培養(yǎng)基中的溶氧濃度(D.O.)被維持接近或高于空氣飽和濃度的40％，最好是通過逐漸升高罐壓至11psi，加強攪拌至約300cm/sec攪拌槳外緣速度，和提高通氣速度至約0.5體積/發(fā)酵罐體積/分鐘。在一段快速生長期及O2高消耗發(fā)酵后，生長速度(O2消耗)下降。此時可減弱攪拌/通氣，只需維持高水平的D.O.，通常約40％空氣飽和濃度以上。
通過如上所述優(yōu)化高山被孢霉發(fā)酵，能夠獲得很高的生物質(zhì)產(chǎn)量，其中約含20-60％的油脂，油脂中按重量計25-70％是甘油三酯形式的ARA殘基。可以如本文所述收獲生物質(zhì)(和油)。較好的是，可以在達到最大生產(chǎn)能力的48小時內(nèi)，根據(jù)gARA/L/天測定，收獲生物質(zhì)。
可以用各種合適的方法進行收獲，例如過濾、離心或噴霧干燥。過濾因為其成本低而被優(yōu)選。
收獲后，可以對菌絲餅進行萃取。菌絲餅指收獲后得到的生物質(zhì)集合。菌絲餅可以是松散的或壓實的，粉碎的或未粉碎的。可任選的是，在萃取前，菌絲餅可以通過例如真空干燥、流化床干燥、噴霧干燥或冷凍干燥完全脫水。如果選擇這樣做，以使用非極性溶劑來萃取含ARA的油脂為宜。雖然任何非極性溶劑都適用，但以己烷為佳。
在一較好的實施方式中，用無水己烷濕磨或滲濾來從干生物質(zhì)中萃取油脂。通常以溶劑∶生物質(zhì)約為5∶1(w/w)的比例加入溶劑。濕磨后，通過傾析或離心將固體與濾液分離。最好保持含溶劑的萃取液(膠束)無氧，以防止油脂中不飽和脂肪酸殘基的氧化。膠束經(jīng)去溶劑化后生成粗真菌油。
以非極性溶劑萃取自真菌生物質(zhì)的粗油可能是渾濁的，尤其是在將生物質(zhì)磨碎時，因為磨碎可能釋放出例如細胞壁碎片和可溶性多糖之類的細小顆粒。這種渾濁油脂的澄清可以通過將粗油溶解在極性較強的溶劑中，例如丙酮或醇中。在一較好的實施方式中，萃取自真菌菌絲的粗油進一步經(jīng)丙酮萃取/沉淀澄清化?？稍跍啙岬拇钟洼腿∫褐屑尤氡?以使油含量約20％為佳，即每體積粗油加入4體積丙酮)，充份混合，然后將混合物靜置足夠長的時間以沉淀出細小顆粒(通常為室溫下1小時)來制備丙酮膠束。利用離心和/或過濾來澄清含油的丙酮膠束，然后除去溶劑將生成經(jīng)丙酮澄清的真菌油。最好將經(jīng)丙酮澄清的真菌油用于后加工(如利用常規(guī)技術脫膠，脫色和除臭)，因為萃取真菌生物質(zhì)過程中的細小顆粒如果不在丙酮處理步驟中被去除，會干擾精煉加工。
另一優(yōu)選實施方式涉及逆流萃取干生物質(zhì)，這種萃取可以在市售的萃取單元中進行，例如Crown Ironworks(Crown Mark IV)或French Inc.的產(chǎn)品，這些通常不用于萃取植物油，而是用于萃取灰塵和污泥。雖然，由于沒有將生物質(zhì)重新粉碎使得萃取效率不高，但逆流萃取過程的優(yōu)點在于產(chǎn)生的細小顆粒較少，因而降低了回收澄清的精制油的技術難度。
或者，濕的菌絲餅(一般含約30至50％的固體)可在粉碎后直接用極性溶劑，例如乙醇或異丙醇萃取，或用CO2或NO之類的溶劑進行超臨界流體萃取。最好在萃取前將菌絲餅粉碎。本發(fā)明的優(yōu)點在于能夠經(jīng)濟的利用超臨界流體萃取技術。McHugh等，超臨界流體萃取(Supercritical Fluid Extraction)，Butterworth(1986)。這些技術是本領域技術人員熟知的，其中包括現(xiàn)在用于對咖啡豆脫咖啡因的那些技術。
一種較好的水溶液萃取方法涉及在一合適的反應釜中將菌絲體與極性溶劑異丙醇混合。這樣的反應釜是已知的。對每份生物質(zhì)使用3至6份溶劑為宜。最好，在氮氣氛下或在抗氧化劑存在下混合，以防止脂萃取液中ARA的氧化。本文中，“脂萃取物”，“油”，“脂復合物”和“真菌油”被互換使用。
萃取后，可以過濾混合物以從含有脂萃取物的溶劑中濾出生物質(zhì)。此時，可回收生物質(zhì)用作食物補充劑。本文中，“食物補充劑”指可以提供給動物的，與谷類等一般飼料混合的飼料或添加劑。
將溶劑與脂萃取物分離，并且也可以將其回收再利用，例如通過蒸發(fā)到合適的收集器中，而留下本文所稱的“粗油”。使用異丙醇作為溶劑較好地去除了粗油中的所有水份，因為蒸發(fā)去除了自然形成的水/異丙醇共沸混合物。
雖然粗油可以不經(jīng)進一步處理而被使用，但是也可以將其進一步純化。在這一附加純化步驟中，可以使用本領域技術人員已知的，用于從植物性產(chǎn)物中制備卵磷脂的方法。這些方法對含ARA的質(zhì)或ARA本身并不進行化學或共價改性。
產(chǎn)量并不一定，但一般每100克干菌絲產(chǎn)約5克含ARA的磷脂。在使用高山被孢霉時，每100克干菌絲還可以再獲得10-15克甘油三酯。粗油或精制產(chǎn)品都可給人使用。以上兩者都包括在本文的ARASCO定義之內(nèi)。
本發(fā)明的最佳目的是提供一種用于嬰兒配方食物的添加劑，使得這種配方食物中的ARA含量接近母乳中的ARA含量。表2將ARASCO中的脂肪酸組成與母乳中的，以及含有和不含ARASCO的嬰兒配方食物中的進行了比較。
表2 真菌油產(chǎn)品與母乳中脂肪酸組成的比較脂肪酸ARASCO嬰兒配方食物1配方食物+油母乳
8:0-- 24.1 23.6 0.3510:0 -- 17.7 17.3 1.3912:0 -- 14.9 14.6 6.9914:0 4.6 5.8 5.8 7.9616:0 16.0 6.8 7.0 19.8016:1 3.2 0.2 0.3 3.2018:0 -- 2.3 2.3 5.9118:1 26.4 10.0 10.3 34.8218:2n6 9.9 17.4 17.3 16.0018:3n3 4.1 0.9 1.0 0.6220:1 2.2 0.1 0.14 1.1020:2n6 -- ----0.6120:3n6 1.4 --0.03 0.4220:4n6 32.0 --0.64 0.5920:5n3 -- ----0.0322:1 -- ----0.1022:4n6 -- ----0.2122:5n6 -- ----0.2222:6n3 -- ----0.191 Simopoulis，A.，w-3酸與健康與疾病(Omega-3 Acids in Health andDisease)，pp.155-156(1990)。
可以看到，用ARASCO補充的嬰兒配方食物中的ARA含量與母乳中的ARA水平很接近。此外，加入ARASCO并沒有明顯改變嬰兒配方食物中總脂肪酸組成。通常，每升嬰兒配方食物可使用約50至1000mg的ARASCO。具體的ARASCO需要量取決于其中的ARA含量。該含量可以占油中脂肪酸的約10％至約70％。但通常ARA含量為約30至50％。較好的是，用以補充嬰兒配方食物的油含有至少40％ARA脂肪酸殘基，至少50％更好。ARA含量約30％時，較好的補充配比是每升嬰兒配方食物約600至700mg的ARASCO。這樣的配比僅以一份ARASCO對50份配方油脂的比例稀釋了嬰兒配方食物中原有的脂肪成份，例如Similac(Ross Laboratories，Columbus，Ohio)。對于ARA含量更高的油也可計算得到類似的稀釋比。ARASCO以基本不含EPA為宜。
在上述方法中使用Pythium insidiosum時，萃取得到的含ARA的油脂主要是磷脂。但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，從如本文所述進行培養(yǎng)的Pythium insidiosum也可以回收到大量高ARA殘基含量的甘油三酯。在所述方法中使用高山被孢霉時，含ARA的油主要是甘油三酯。兩種形式的ARASCO都被用作嬰兒配方食物的添加劑。前者不僅為配方食物提供ARA，而且還提供乳化劑，即通常加在市售配方食物中的卵磷脂。高山被孢霉產(chǎn)生的油脂似乎生產(chǎn)起來更經(jīng)濟。
除了用作嬰兒配方食物添加劑之外，本發(fā)明的含ARA油脂還有許多其它用途。正如本領域技術人員已知的，許多疾病與缺乏ARA有關，例如消瘦(Vajreswari等，代謝(Metabolism)39779-782(1990))，皮膚病(Melnik，Bo，Monatsschr.Kinderheilta，138162-166(1990))，肝病，苯丙酮酸尿癥，精神分裂癥，慢性記憶障礙或各種過氧化酶疾病。在本發(fā)明的一種實施方式中，通過使用藥物有效量的本發(fā)明的油脂泊療上述疾病。藥物有效量一般指使得病人體內(nèi)的ARA血清水平達到正常所需的量。用于補充治療這些疾病尤其好的是上述高ARA含量的油，尤其是含至少40％ARA的油，50％ARA殘基更好。根據(jù)保健醫(yī)師來選擇，油脂可以經(jīng)腸給藥，外用或非經(jīng)腸給藥。
本領域技術人員已知的膠囊化是一種經(jīng)腸給藥的有效方法?？梢越o需要飲食補充ARA的人服用含有真菌油的膠囊。該方法對給孕婦或哺乳期婦女服用ARA尤為有效。
在使用ARASCO治療與缺乏ARA有關的疾病時，應該使用藥物有效量。本領域技術人員不經(jīng)毒性實驗就可以確定這一用量。通常，該量是0.5-2.0g/天，一般能夠使ARA血清水平達到正常。
本發(fā)明的其它實施方式提供了含有ARASCO，例如本文所述的高ARA含量的油的化妝品組合物?；瘖y品組合物指用作化妝品的那些化合物。這類組合物一個較好的實例是防皺霜。這類化妝品組合物提供了對皮膚局部使用ARA以有助于保持皮膚彈性的有效方法。
以上對本發(fā)明進行了全面的描述，以下的非限定性實施例用于進一步說明本發(fā)明。
實施例1.制備P.insidiosum脂并加入嬰兒配方食物在一80L(約略體積)的發(fā)酵罐中，混合51L自來水，1.2kg葡萄糖，240g酵母提取物和15ml MAZU 210S消泡劑。發(fā)酵罐在121℃滅菌45分鐘。在滅菌過程中另加入5L冷凝水。將pH調(diào)至6.2，然后加入約1L(細胞密度為5-10g/1)的Pythiuminsidiosum(ATCC#28251)接種物。將攪拌速度調(diào)節(jié)至125 RPM(250cm/sec外緣速度)，通氣速度設定為1SCFM(標準立方英尺/分鐘)。第24小時，將通氣速度增加至3SCFM。第48小時，另外加入50％葡萄糖漿2L(1kg葡萄糖)。第50小時，放罐收獲，產(chǎn)量約2.2kg濕重(約15g干重)/L。將收獲后的生物質(zhì)在吸濾機上擠壓成高固含量(50％固體)的餅狀，然后冷凍干燥。用研缽和研杵粉碎干燥后的生物質(zhì)，每200g干生物質(zhì)用1L己烷在室溫下連續(xù)攪拌萃取2小時。然后過濾混合物，蒸發(fā)濾液，每100g干生物質(zhì)得約5-6g粗油。然后再將每20g干生物質(zhì)用1L的乙醇在室溫下萃取1小時，過濾后蒸發(fā)掉溶劑，每100g干生物質(zhì)另外得到22g粗油。第二份中主要是磷脂，而第一份含磷脂和甘油三酯的混合物。合并后得到的油含約30-35％花生四烯酸，沒有檢知量的EPA。可將這種油滴加到市售的嬰兒配方食物產(chǎn)品Similac(Ross Laboratories，Columbus，Ohio)中，補充比為每L己制備基質(zhì)含60mg。
實施例2.制備高山被孢霉脂并加入嬰兒配方食物在一個2L搖瓶中培養(yǎng)高山被孢霉(ATCC#42430)，前者含有1L自來水和2g土豆葡萄糖培養(yǎng)基。搖瓶保溫于25℃回轉(zhuǎn)攪拌7天。離心收獲生物質(zhì)后，將其冷凍干燥，得約8g富含脂體的菌絲。如實施例1所述用己烷萃取菌絲，得到約2.4g粗油。此油中含有約23％花生四烯酸，按100mg/L的濃度加入到市售的嬰兒配方食物產(chǎn)品Similac中。
實施例3.利用高山被孢霉大量生產(chǎn)花生四烯酸在含有GYE培養(yǎng)基(50g/L葡萄糖和6g/L Tastone 154)的接種罐中接入高山被孢霉。發(fā)酵溫度設定在28℃，最初攪拌速度為130-160cm/sec，最初罐壓為6psi，最初通氣速度為0.25VVM。在滅菌前將pH調(diào)節(jié)至5.0，滅菌后的最初發(fā)酵pH調(diào)節(jié)至5.5。用8N的NaOH維持培養(yǎng)基的pH≥5.5。按以下順序調(diào)節(jié)攪拌/通氣，將氧水平維持在D.O.≥40％將罐壓增加至11psi；提高攪拌的槳葉外緣速度至175cm/sec；將通氣速度提高至0.5VVM。根據(jù)需要加入Dow 1520-US來控制泡沫。(在滅菌前需加入約0.1ml/L消泡劑來幫助防止發(fā)泡)。
pH升至6.0以上后的12小時內(nèi)，將接種物從種子發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移到主發(fā)酵罐中。
主發(fā)酵罐含有GYE培養(yǎng)基(50g/L葡萄糖和6g/L Tastone154)；葡萄糖單獨滅菌，滅菌后加入主發(fā)酵罐中。將發(fā)酵溫度設定在28℃，最初攪拌速度為160cm/sec，最初罐壓為6psi，最初通氣速度為0.15VVM。滅菌后的最初pH設定在5.5，用8N的NaOH維持培養(yǎng)基的pH≥5.5。在穩(wěn)定期(接種后約24小時以后開始)允許pH升高，但通過添加H2SO4維持在pH6.8以下。通過逐步地將罐壓增加至11pis，提高攪拌的槳葉外緣速度至175cm/sec，將通氣速度提高至0.5VVM來將氧水平維持在D.O.≥40％。根據(jù)需要加入Dow 1520-US來控制泡沫。(在滅菌前需加入約0.1ml/L消泡劑來幫助防止發(fā)泡)。
培養(yǎng)物每12小時采樣作生物質(zhì)及脂肪酸分析。在pH升至6.5以后的3-4天開始收獲。干燥的生物質(zhì)密度應≥8.5g/L。在發(fā)酵液中葡萄糖濃度應從50g/L下降至25g/L。在收取時，全部培養(yǎng)的發(fā)醇液用盒式離心機從廢培養(yǎng)基中分離出菌絲體，并將此生物質(zhì)干燥。
實施例4.高山被孢霉產(chǎn)生的生物質(zhì)的產(chǎn)量提高-第一批根據(jù)實施例3的方法，接種以搖瓶中的培養(yǎng)物，將高山被孢霉培養(yǎng)在20L的攪拌發(fā)酵罐中。在65g/L葡萄糖(Staleydex)，和6g/L酵母提取物(Tastone 154)培養(yǎng)高山被孢霉產(chǎn)生12g/L生物質(zhì)。在第16小時另外加入6g/L Tastone 154，結果產(chǎn)生18g/L生物質(zhì)。
實施例5.高山被孢霉產(chǎn)生的生物質(zhì)的產(chǎn)量提高-第二批為了通過追加Tastone 154來進一步增加生物質(zhì)而進行了一系列實驗。這些實驗為2×20L發(fā)酵，停留時間為168小時。兩者的最初葡萄糖濃度都是100g/L(與實施例4的65g/L相比)。一罐添加3×6g/L的Tastone 154，另一罐添加4×6g/L。將酵母提取物配制成濃溶液，高壓滅菌，在滅菌后的不同時刻加入。
為了制備接種物，將使用的種子(1ml浸漬后的菌絲)接種在2個含50ml GYE培養(yǎng)基(100g/L Staleydex，6g/L Tastone 154)的燒瓶中，在28℃、150rpm培養(yǎng)4天。生長4天后，發(fā)酵液中含有球結的生物質(zhì)；球的直徑為2-5mm。在這些燒瓶中的生長比預計的慢，可能是由于高葡萄糖濃度。生物質(zhì)在Waring混合儀中浸漬2×3秒，取25ml浸漬液接種到2個2.8L的Fernbach接種燒瓶中，凈體積為800ml。(在先前的實驗中曾使用10ml的浸漬液。提高接種量是因為種子瓶中生物質(zhì)的密度較低，而且估計在Fernbach中的生長會因高葡萄糖濃度而較慢。)Fernbach中的培養(yǎng)基為葡萄糖(Staleydex)100g/L和酵母提取物(Tastone 154)8g/L。葡萄糖和酵母提取物分別經(jīng)40分鐘滅菌。種子的發(fā)酵溫度維持在28℃，攪拌速度維持在100至150rpm。
在Fernbach燒瓶中培養(yǎng)44小時后，接種物被轉(zhuǎn)移至2個20L的發(fā)酵罐中。接種物的形式為十分松散的菌絲聚集體，生物質(zhì)密度約5.2g/L。
含有1.6kg(10％)葡萄糖(Staleydex)和Mazu204消泡劑(1.6g，溶解在12.5LR.O.H2O中)的14和15號發(fā)酵罐在122℃滅菌45分鐘。然后在每個罐中(在0時刻)加入800ml(5％)接種物。發(fā)酵罐的操作參數(shù)如下溫度28℃，pH用2N NaOH和2N H2SO4維持在5.5，通氣0.5VVM，背壓0.2bar攪拌(最初)80cm/sec，
D.O.控制在40％以上。
14號3×6g/L Tastone 154將酵母提取物(Tastone 154)溶解成96g/L的濃度并高壓滅菌1小時。分3次在第0，20和26小時每次加入1L(1.8％)。
第15小時，DO跌至40％以下，從第15小時至第22小時將攪拌速度升高至175cm/sec。然后通過用氧氣改變氣流量來調(diào)節(jié)DO；從第23小時至72小時，在氣流中加入氧氣。從第36小時開始，進一步提高攪拌速度以保證充分混合。至第48小時，攪拌速度已升高至200cm/sec；至第72小時，升高至250cm/sec；至第80小時，升高至280cm/sec。在第120小時，將攪拌速度提高至290cm/sec以加強溫度控制。在第144小時，將攪拌速度降低至280cm/sec。
15號4×6g/L Tastone 154將酵母提取物(Tastone 154)384g溶解成96g/L的濃度并高壓滅菌1小時。分4次在第0，20，26和32小時每次加入1L(2.4％)。
第16小時，DO跌至40％以下，將攪拌速度升高至175cm/sec，直至第23小時。然后通過用氧氣改變氣流量來調(diào)節(jié)DO于40％以上；從第23小時至72小時，在氣流中加入氧氣。從第36小時開始，進一步提高攪拌速度以保證充分混合。至第48小時，攪拌速度已升高至210cm/sec；至第72小時，升高至260cm/sec；至第80小時，升高至290cm/sec。在第90小時，將攪拌速度降低至280cm/sec。在第144小時，將攪拌速度降低至260cm/sec。
過程觀察在接種時，兩罐中的生物質(zhì)都是十分松散的羽毛狀菌絲聚集體。至24小時，開始形成球。球很小(1-3mm)，具有小的內(nèi)核和寬而松的外緣。在第48小時，球體變大，形狀更清晰。至72小時，外緣變窄，出現(xiàn)許多松散的菌絲片段，這說明球開始解體。至168小時，球核直徑達0.5至2mm，外緣因菌絲聚集而縮成粗線，并且形成了許多菌絲聚集體。
發(fā)酵罐只在最初的24小時略微發(fā)泡。此后，泡沫量增加，并通過在泡頭高于2-4cm時人工加入消泡劑得以控制。至48小時前，泡沫略有下降，但時有間歇性的爆發(fā)。在發(fā)酵過程中，兩罐的泡沫都有一次到達出口濾網(wǎng)。發(fā)酵約需150ml消泡劑。
兩個發(fā)酵罐的頭部都積累了大量增殖的生物質(zhì)。對于利用表面積/體積比很大的小罐進行真菌發(fā)酵來說，這是一個常見問題。在罐15中，增殖生物質(zhì)量似乎是在最后的24小時內(nèi)增加的，期間，體積下降導致了大量的爆濺物(液位接近攪拌槳的頂部)。168小時后發(fā)酵罐中的最終體積是13L。
顯微鏡檢顯示，至72小時，在培養(yǎng)物發(fā)酵液中有許多碎片，而且發(fā)現(xiàn)有損傷和萎縮的真菌端部。在第168小時的尼羅紅染色顯示在細胞質(zhì)中有油滴。與有時可見的大油滴相比。油滴很小但很多，表3顯示了生物質(zhì)和油產(chǎn)量，以及碳氮源的利用率。
表3 發(fā)酵過程
實施例6.高山被孢霉產(chǎn)生的生物質(zhì)的產(chǎn)量提高-第三批這一組實驗是為了通過增加磷酸鹽和無機鹽的水平來進一步提高產(chǎn)量。過程與實施例5基本相同，但葡萄糖和消泡劑Mazu204溶解在11.5L而不是12.5L的R.O.H2O中，為在第30小時添加的鹽溶液留出空余體積。14號罐添加Fe，Zn，和Cu；罐15添加Fe，Zn，和Cu的磷酸鹽。
罐143×6g/L Tastone 154將酵母提取物溶解成96g/L濃度，分成1L的3份，高壓滅菌1小時。在第0，22和28小時加入1L等份。在第22和28小時，二氧化碳釋放速度(CER，指示發(fā)酵罐中的代謝速度)呈指數(shù)增長，發(fā)酵液開始需要加堿。
加入的鹽包括FeCl36H2O 480mgZnSO47H2O 240mgCuSO45H2O 16mg將FeCl3溶解在1L 5g/L的檸檬酸溶液中。加入其余的鹽，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至4.5。將溶液高壓滅菌1小時。在第30小時將鹽加入。
發(fā)酵罐最初的攪拌速度是50cm/sec而不是原先計劃的80cm/sec，因為發(fā)酵罐中的最初液位(13L)剛好浸沒攪拌槳的端部，較高的攪拌速度會導致嚴重的噴濺。在第16小時，D.O.降至40％以下，由此至第28小時將攪拌速度提高至175cm/sec。然后用氧氣改變氣體流量來將D.O.控制在40％以上。在第46小時，為了混合而將攪拌速度提高至190cm/sec。攪拌速度被進一步升高，第48小時為200cm/sec，至51小時為220cm/sec，至53小時為235cm/sec，至56小時為250cm/sec，至57小時為260cm/sec，至70小時為280cm/sec。即使在這樣的攪拌速度(450rpm)下，混合情況仍然較差。雖然維持著最低標準的“略有移動”，但生物質(zhì)的翻動非常緩慢，有些地方幾乎靜止。加入數(shù)滴消泡劑降低了泡頭，消除了靜止區(qū)。在第116小時，將攪拌速度降低到265cm/sec，在第120小時，進一步降低到250cm/sec。
發(fā)酵罐在約第18小時開始產(chǎn)生泡沫。泡沫通過人工加入消泡劑來控制。第一次加入消泡劑在第20小時。至24小時，發(fā)酵反應大量產(chǎn)生泡沫，需要經(jīng)常性的添加消泡劑。至72小時，大多數(shù)泡沫下降。但是，發(fā)酵反應仍然需要在有時加入消泡劑。
至24小時，生物質(zhì)呈非常松散的球狀(1-2mm)和松散的菌絲聚集體。有大量的細胞碎片存在。至48小時，生物質(zhì)呈十分松散的菌絲聚集體，很小的球狀(1-2mm)，球的內(nèi)核很小而外周松散，以及沒有松散外周的緊縮球狀(1-3mm)。至96小時，生物質(zhì)成緊縮園球狀(1-2mm)，針狀顆粒(0.5m以下)和疏松的菌絲聚集體。第144小時的尼羅紅染色顯示在菌絲中存在著大量非常小的油滴。
罐153×6g/L Tastone 154
將酵母提取物溶解成96g/L濃度，高壓滅菌1小時。在第0，22和26小時3次加入1L等份。在第22和26小時，二氧化碳釋放速度呈指數(shù)增長，發(fā)酵液開始需要加堿。
加入的鹽包括KH2PO477gFeCl36H2O 480mgZnSO47H2O 240mgCuSO45H2O 16mg將FeCl3溶解在500ml 5g/L的檸檬酸溶液中。加入其余的鹽，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至4.5。將KH2PO4溶解在500ml R.O.水中。將兩種溶液高壓滅菌1小時，然后冷卻至23℃，然后在第30小時混合加入發(fā)酵罐。
發(fā)酵罐最初的攪拌速度是50cm/sec而不是原先計劃的80cm/sec，因為發(fā)酵罐中的最初液位(13L)剛好沒過攪拌槳的端部，較高的攪拌速度會導致嚴重的噴濺。在第16小時，D.O.降至40％以下，由此至第27小時將攪拌速度提高至175cm/sec。然后用氧氣改變氣體流量來將D.O.控制在40％以上。在第41小時，為了進行至少最小量的混合而將攪拌速度提高至200cm/sec。攪拌速度被進一步升高，第42小時為220cm/sec，至46小時為230cm/sec，至51小時為235cm/sec，至70小時為240cm/sec。即使在這樣的攪拌速度(410rpm)下，混合情況仍然為較差至中等。維持著最低程度的生物質(zhì)移動。在第80小時，將攪拌速度降低到205cm/secc。
發(fā)酵罐在約第18小時開始產(chǎn)生泡沫。泡沫通過人工加入消泡劑來控制。第一次加入消泡劑在第17小時。至20小時，發(fā)酵反應大量產(chǎn)生泡沫，需要經(jīng)常性的添加消泡劑。至72小時，大多數(shù)泡沫下降。但是，發(fā)酵反應仍然需要在有時加入消泡劑。
至24小時，生物質(zhì)呈非常松散的球狀(1-2mm)和松散的菌絲聚集體。有大量的細胞碎片存在。至48小時，生物質(zhì)呈十分松散的菌絲聚集體，很小的球狀(1-2mm)，球的內(nèi)核很小而外周松散，以及沒有松散外周的緊縮球狀(1-3mm)。至96小時，生物質(zhì)呈園球狀，直徑1-2mm，其中許多具有松散的發(fā)絲狀的外周，以及許多疏松的菌絲片段。第144小時的尼羅紅染色顯示在菌絲中存在著大量非常小的油滴，而且在其它菌絲充滿了很大的油滴。
罐15與罐14的區(qū)別僅在于添加了磷酸鹽的罐15在整個發(fā)酵過程中，在較低的攪拌速度下顯示出較好的混合情況。罐15中生物質(zhì)的形態(tài)更“松散”。表4列出了生物質(zhì)和油脂的產(chǎn)量，以及碳的利用率。高磷酸鹽含量發(fā)酵的特征在于，高葡萄糖利用率(罐15為82g/L，而罐14為64g/L)，高生物質(zhì)積累和存在于部分菌絲中的大油滴。
表4 發(fā)酵過程
實施例7.大規(guī)模生產(chǎn)含有花生四烯酸的高山被孢霉生物質(zhì)從增殖罐向含有GYE培養(yǎng)基(50g/L葡萄糖和6g/L Tastone 154)的種子罐接種。溫度維持在28℃，最初攪拌速度設定在130至160cm/sec之間(約43rpm)。最初罐壓為6psi，最初通氣速度為0.25VVM。滅菌前的pH調(diào)節(jié)至5.0，滅菌后的最初pH設定在5.5。按照以下順序?qū)⑴囵B(yǎng)基中的氧濃度維持在D.O.≥40％(i)將罐壓升至11psi，(ii)將攪拌速度提高至156-175cm/sec攪拌槳外緣速度，(iii)將通氣速度提高至0.5VVM。根據(jù)需要添加消泡劑Dow 1520-US來控制泡沫。(為了有助于防止發(fā)泡，應該在滅菌前加入約0.1ml/L消泡劑)。接種后，用8N的NaOH維持培養(yǎng)pH≥5.5。
pH升至6.0以上后的12小時內(nèi)，將種子罐中發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至主罐中。主罐培養(yǎng)基含有80g/L葡萄糖(ADM)16g/L大豆粉(ADM nutrisoy)30mg/L FeCl36H2O(Sigma/Aldrich)1.5mg/L ZnSO47H2O(Sigma/Aldrich)0.1mg/L CuSO45H2O(Sigma/Aldrich)1mg/L生物素(Sigma/Aldrich)2mg/L鹽酸硫胺(Sigma/Aldrich)2mg/L泛酸(半鈣鹽)(Sigma/Aldrich)(滅菌前調(diào)節(jié)至pH4.8-5.0)用種子罐基質(zhì)接種主罐(11.8％)。將發(fā)酵罐溫度維持在28℃。最初攪拌速度設定在162cm/sec(約23rpm)，最初罐壓為6psi，最初的通氣速度為0.15VVM(約300scfh)。
將培養(yǎng)基中的氧濃度維持在D.O.≥40％(i)將罐壓升至11psi，(ii)將攪拌速度提高至300cm/sec攪拌槳外緣速度(約增加了30cm/sec)，(iii)將通氣速度提高至0.5VVM。
根據(jù)以下pH調(diào)節(jié)方法來控制pH將滅菌后的最初pH設定為5.5。用8N的NaOH維持pH≥5.5。
在接種后24至36小時，加入2g/L KH2PO4(110kg溶于約700L水中)。
第48小時，如果葡萄糖濃度≤60g/L，將pH設定值改為≥6.1。
第72小時，以每小時約0.1pH的速度緩慢地將pH升至≥6.6。
在必要時添加H2SO4維持pH低于7.3。
每隔12小時對發(fā)酵罐取樣一次進行生物質(zhì)和脂肪酸的分析，在pH升至≥6.6約3天后(約接種6天后)開始收獲。干生物質(zhì)的密度應≥24g/L。發(fā)酵液中葡萄糖濃度應從80g/L下降至≤14g/L。
將全部發(fā)酵液通過旋轉(zhuǎn)真空過濾器過濾，將菌絲與廢培養(yǎng)基分離，如此進行收獲。
根據(jù)本實施例進行的兩批典型發(fā)酵的結果列于表5和表6。
表5 高山被孢霉的發(fā)酵過程
表6 高山被孢霉的發(fā)酵過程
權利要求
1.一種非改性的真菌產(chǎn)甘油三酯類油脂，所述甘油三酯中ARA的含量至少約40％，EPA的含量不超過ARA的十分之一。
2.根據(jù)權利要求1所述的非改性真菌產(chǎn)甘油三酯類油脂，所述甘油三酯中ARA的含量至少約40％，而且基本上不含EPA。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的非改性真菌產(chǎn)甘油三酯類油脂，所述油脂包含至少50％的ARA。
4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的油脂，所述真菌是被孢霉屬(Mortierella sp)。
5.根據(jù)權利要求4所述的油脂，其中的真菌是高山被孢霉(M.alpina)。
6.生產(chǎn)含有花生四烯酸的油脂的方法，所述的油脂中含有甘油三酯，甘油三酯中至少25％的脂肪酸殘基是ARA，油脂中EPA殘基的含量不超過ARA殘基的五分之一，所述的方法包括(a)在含有培養(yǎng)基的通以空氣的發(fā)酵罐中培養(yǎng)被孢霉菌，在發(fā)酵的全過程中向培養(yǎng)基加入相當于至少80g/L葡萄糖的碳源和相當于至少15g/L酵母提取物的氮源；(b)在培養(yǎng)的開始階段將pH維持在5至6之間；(c)在培養(yǎng)的最后階段將pH維持在7至7.5之間；(d)從發(fā)酵罐中收獲生物質(zhì)，從所述的生物質(zhì)中回收含有花生四烯酸的油脂。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中培養(yǎng)基中的溶氧水平至少為空氣飽和值的35％。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其中的氮源等分成兩次或更多次在不同時刻加入發(fā)酵罐，至少有一份不與碳源同時加入。
9.根據(jù)權利要求6至8中任一項所述的方法，其中的被孢霉菌是高山被孢霉。
10.根據(jù)權利要求6至9中任一項所述的方法，還包括通過非極性溶劑萃取從生物質(zhì)中回收含花生四烯酸的粗油，并通過極性有機溶劑萃取將粗油澄清化。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中的非極性溶劑是己烷。
12.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中的極性溶劑選自丙酮，乙醇和異丙醇。
13.向嬰兒配方食物提供含ARA的甘油三酯的方法，包括在嬰兒配方食物中加入足量的非改性真菌產(chǎn)甘油三酯油脂，所述油脂含有至少40％ARA而且EPA的含量不超過ARA的五分之一，足量的加入使得配方食物中的ARA含量與母乳中的相當。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述的油脂是被孢霉菌產(chǎn)生的。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中所述的油脂是由高山被孢霉產(chǎn)生的。
16.根據(jù)權利要求13至15中任一項所述的方法，其中所述油脂含有的EPA不超過ARA的十分之一。
17.根據(jù)權利要求13至16中任一項所述的方法，其中所述的油脂基本上不含EPA。
18.根據(jù)權利要求13至17中任一項所述的方法，其中所述的油脂含50％的ARA。
19.含有與母乳中含量相當?shù)暮珹RA甘油三酯的嬰兒配方食物，其中通過向嬰兒配方食物中加入足量的非改性真菌產(chǎn)油脂來提供ARA，油脂中含有至少含40％ARA的甘油三酯且EPA含量不超過ARA的五分之一。
20.根據(jù)權利要求19所述的嬰兒配方食物，其中的非改性真菌產(chǎn)油脂含有不超過ARA十分之一的EPA。
21.根據(jù)權利要求20所述的嬰兒配方食物，其中所述的真菌產(chǎn)油脂基本上不含EPA。
22.根據(jù)權利要求19至21中任一項所述的嬰兒配方食物，其中的非改性真菌產(chǎn)油脂含有至少含50％ARA的甘油三酯。
23.一種給人補充花生四烯酸(ARA)的方法，包括給需要補充ARA的人使用含有非改性真菌產(chǎn)油脂的組合物，所述油脂中含有甘油三酯形式的ARA，所述油脂含有至少40％的ARA和不超過ARA五分之一的EPA，其中所述的油脂含量足以有效地為所述的人補充ARA。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中的油脂含有至少50％的ARA。
25.根據(jù)權利要求23或24所述的方法，其中所述的組合物給人使用的量為0.2-0.8g ARA/天。
26.根據(jù)權利要求23至25中任一項所述的方法，其中所述的組合物是經(jīng)腸使用的。
27.根據(jù)權利要求23至25中任一項所述的方法，其中所述的組合物是非經(jīng)腸使用的。
28.根據(jù)權利要求23至25中任一項所述的方法，其中所述的組合物是局部使用的。
29.根據(jù)權利要求23至25中任一項所述的方法，其中所述的人是孕婦或哺乳期婦女。
30.根據(jù)權利要求23至25中任一項所述的方法，其中所述的需要補充ARA的人患有神經(jīng)疾病。
31.根據(jù)權利要求30所述的方法，其中所述的神經(jīng)疾病是慢性記憶障礙，精神分裂或過氧化酶類疾病。
32.根據(jù)權利要求23至25中任一項所述的方法，其中所述的需要補充ARA的人患有與ARA血清水平下降相關的疾病。
33.根據(jù)權利要求32所述的方法，其中所述的疾病是肝病，苯丙酮酸尿癥或囊性纖維變性。
34.含有非改性真菌產(chǎn)油脂的化妝品組合物，油脂中含有甘油三酯形式的ARA，所述的油脂含有至少40％的ARA和不超過ARA五分之一的二十碳五烯酸(EPA)，其中所述的油脂含量可以在局部使用所述組合物時有效地幫助保持皮膚彈性。
35.根據(jù)權利要求34所述的組合物，其中的油脂含有至少50％ARA。
全文摘要
本發(fā)明涉及含花生四烯酸油脂的生產(chǎn)方法，其中基本上不含二十碳五烯酸。本發(fā)明還涉及含油組合物，油中含有高含量的甘油三酯形式的花生四烯酸，以及這類油脂的使用方法。在一種較好的實施方式中，在適宜條件下培養(yǎng)高山被孢霉(Mortierella a1pina)，該條件下能夠生產(chǎn)出花生四烯酸殘基含量特別高的甘油三酯，然后收獲生物質(zhì)，油脂經(jīng)萃取、回收后用作嬰兒配方食物中的添加劑。
文檔編號C11B1/10GK1696300SQ20051007129
公開日2005年11月16日 申請日期1996年1月3日 優(yōu)先權日1995年1月3日
發(fā)明者D·J·凱爾 申請人:馬泰克生物科學有限公司